Ćwizenie 9 Zastosowanie modelowania molekularnego do oeny właśiwośi fizykohemiznyh substanji leznizyh Cel ćwizenia: 1. Zapoznanie się z metodami modelowania molekularnego na przykładzie programu Marvin: Oblizone zostaną parametry geometryzne i fizykohemizne ząstezki wykorzystywane w analizie QSAR oraz zostanie wykonana oena wpływu budowy ząstezki na właśiwośi fizykohemizne leku. 2. Analiza widma 1 H NMR prostego związku organiznego. Wymagane zagadnienia: podstawowe pojęia stosowane w spektroskopii molekularnej (promieniowanie elektromagnetyzne i jego ehy, rodzaje energii ząstezek, kwantowanie energii, warunek zęstośi Bohra; polaryzaja, polaryzowalność, moment dipolowy; refrakja molowa), magnetyzny rezonans jądrowy (podstawowe informaje, analiza widma 1 H NMR), metody modelowania molekularnego (ab initio, first priniple, półempiryzne, empiryzne), projektowanie i optymalizaja struktury leków, reguła Lipińskiego, SAR i QSAR. Wstęp Modelowanie molekularne Poszukiwanie nowyh leków syntetyznyh wymaga długoletnih i kosztownyh badań prowadzonyh w warunkah in vitro, a następnie in vivo z udziałem zwierząt doświadzalnyh (badania przedklinizne) i ludzi (badania klinizne). Przedmiotem doświadzeń in vitro jest określenie właśiwośi fizykohemiznyh szeregu związków hemiznyh oraz wstępne oszaowanie ih aktywnośi biologiznej, służąe wyselekjonowaniu jednego lub kilku najbardziej obieująyh związków, które dalej są kierowane do doświadzeń na modelu zwierzęym. Wykorzystanie hemii oblizeniowej do modelowania molekularnego w nowozesnym projektowaniu leków, tzw. badania in silio lub komputerowe wspomaganie projektowania leków (CADD, ang. omputer aided drug design), odgrywa oraz większą rolę. Ih elem jest zastąpienie zęśi badań in vitro, a przez to przyspieszenie selekji najlepszyh kandydatów na lek. CADD jest szzególnie enne podzas analizy nowyh związków, tj. nieistniejąyh w przyrodzie lub jeszze niezsyntezowanyh, gdyż pozwala objąć skriningiem większą grupę związków hemiznyh, przy jednozesnym obniżeniu kosztów badań. Podstawą działania wszystkih metod modelowania molekularnego, niezależnie od stopnia ih złożonośi, jest znalezienie takiej struktury ząstezki, której odpowiada najniższa energia (globalne minimum energetyzne). Na ałkowitą energię ząstezki składa się energia translayjna, osylayjna, rotayjna i elektronowa. Wśród nih jedynie energia translayjna jest energią nieskwantowaną, tzn. może zmieniać się w sposób iągły (średnia energia translayjna ząstezki rośnie proporjonalnie do temperatury i wynosi 3/2 kt, gdzie k oznaza stałą Boltzmanna). Pozostałe trzy typy energii są skwantowane, o oznaza, że mogą osiągać tylko śiśle określone wartośi, zyli zmieniają się w sposób skokowy. Metody modelowania molekularnego można podzielić na: 1. Metody oparte na mehanie kwantowej (metody kwantowo-hemizne), które bazują na wyznazeniu funkji falowej stanowiąej rozwiązanie równania Shrödingera a) Metody ab initio (ła. od pozątku) opisują energię ząstezki za pomoą wieloelektronowej funkji falowej uwzględniająej wkład wszystkih elektronów. 1
Ponieważ analityzne rozwiązanie równania Shrödingera jest możliwe tylko dla układu jednoelektronowego (np. kationu ząstezki wodoru H 2 + ), funkję tę uzyskuje się jedynie metodami numeryznymi, stosują lizne przybliżenia, m.in. przybliżenie Borna-Oppenheimera (zaniedbanie ruhu jąder atomowyh) i przybliżenie jednoelektronowe (założenie o niezależnośi ruhu elektronów względem siebie). Najbardziej powszehną wersją praktyznej realizaji tyh założeń jest metoda pola samouzgodnionego (SCF, ang. self-onsistent field), zwana również metodą Hartree- Foka. Niekwestionowaną zaletą metod ab initio jest możliwość wyznazenia ogromnej puli danyh dotyząyh właśiwośi strukturalnyh, spektroskopowyh, termodynamiznyh ząstezek, opisu efektów środowiskowyh, np. solwataji, zy nawet śieżek reakji hemiznyh. Dodatkowo uzyskane przy ih pomoy wyniki są najzęśiej bardzo zbliżone do wartośi eksperymentalnyh. Wadą metod ab initio jest fakt, że wymagają one znaznyh nakładów oblizeniowyh, przez o ogranizają się do analizy układów zawierająyh do około kilkunastu atomów i wiążą się z ponoszeniem wysokih kosztów zakupu odpowiednih systemów komputerowyh. b) Metody first priniple, zwane zęsto metodami funkjonałów gęstośi (DFT, ang. density funtional theory) opierają się na zastąpieniu skomplikowanyh wieloelektronowyh funkji falowyh konepją gęstośi elektronowej. Dzięki takiemu uproszzeniu, efektywność oblizeń prowadzonyh metodami DFT jest większa niż metodami ab initio. Pozwala to analizować ząstezki złożone z około 0 atomów, przy niewielkiej utraie dokładnośi oblizeń wyników w porównaniu do danyh eksperymentalnyh. ) Metody półempiryzne opierają się na tyh samyh zasadah, o metody ab initio i DFT, z tą różnią, że w oblizeniah kwantowyh uwzględniane są tylko elektrony walenyjne. Udział elektronów rdzenia atomowego w energii ząstezki jest określony odpowiednimi wartośiami stałymi lub pomijany. Jest to po zęśi usprawiedliwione faktem, że elektrony walenyjne harakteryzują się największą energią i to one deydują o właśiwośiah hemiznyh ząstezki. Główną zaletą metod półempiryznyh jest ih szybkość i możliwość analizy bardziej skompilowanyh układów, takih jak entra aktywne i enzymy, liząe nawet do tysięy atomów. Z drugiej strony, rezultatem stosowanyh w tyh metodah uproszzeń jest nierzadko uzyskiwanie wyników niezgodnyh z danymi doświadzalnymi. Z tej przyzyny metody te muszą być stosowane z dużą ostrożnośią. Najbardziej dokładnymi, a przez to najpowszehniej stosowanymi metodami półempiryznymi są metody AM1 oraz PM3. 2. Metody oparte na mehanie molekularnej (klasyznej, newtonowskiej): Metody empiryzne pola siłowe. W metodah tyh ząstezki traktuje się jako zespoły sztywnyh kul (atomów) połązonyh sprężynami imitująymi wiązanie hemizne, zyli, innymi słowy, jako zbiór osylatorów harmoniznyh. Istnienie elektronów jest zaniedbywane ze względu na ih bardzo małą masę w stosunku do jąder atomowyh. W metodah empiryznyh zakłada się, że ałkowita energia potenjalna ząstezki jest sumą wszystkih potenjałów występująyh w ząsteze, mianowiie energii zmiany długośi wiązań, kątów płaskih i torsyjnyh względem wartośi równowagowyh (optymalnyh), energii oddziaływań elektrostatyznyh, wodorowyh, oddziaływań miedzy dipolami, itd. Stosowanie pól siłowyh opiera się na założeniu, że poszzególne grupy atomów mają podobne własnośi w różnyh związkah hemiznyh. Tworzenie optymalnej struktury ząstezki polega na dodawaniu do siebie egiełek (ugrupowań hemiznyh), któryh właśiwośi zostały już wześniej określone na podstawie analizy innyh związków hemiznyh (stąd określenie empiryzne). Szzególną odmianą metod 2
empiryznyh jest dynamika molekularna, dzięki której możliwa jest analiza zasowej ewoluji układu, np. osylaji i rotaji wiązań hemiznyh. Ze względu na traktowanie ząstezki jako złożonego osylatora harmoniznego, metody empiryzne, w przeiwieństwie do metod mehaniki kwantowej, nie pozwalają jednak przewidywać jakihkolwiek reakji hemiznyh. Ih zaletą jest jednak prostota, krótki zas przeprowadzania oblizeń i możliwość analizy bardzo złożonyh układów, składająyh się z kilkuset tysięy atomów, np. wirusów. Projektowanie leków Z punktu widzenia projektowania leków praktyzne znazenie ma podział struktury ząstezki na dwa główne elementy: Farmakofor zęść ząstezki odpowiedzialna za jej interakję z biologiznym punktem uhwytu (np. białkiem, reeptorem, enzymem, DNA). Farmakofor warunkuje aktywność biologizną leku (liganda). Tworzy go zazwyzaj kilka ugrupowań hemiznyh (np. pierśień aromatyzny, hydrofobowa grupa alkilowa, grupa hydrofilowa, grupa funkyjna będąa donorem lub akeptorem jonów H +, itp.), które mogą tworzyć z reeptorem wiązania typu jon jon, jon dipol, dipol dipol indukowany, dipol indukowany dipol indukowany oraz oddziaływania hydrofobowe. Interakja leku z entrum aktywnym reeptora wymaga ih komplementarnośi steryznej, elektrostatyznej oraz hydrofobowej. Interakja leku z reeptorem za pośrednitwem farmakofora może powodować jego aktywaję (wówzas lek jest tzw. agonistą) lub jedynie blokowanie dostępu naturalnyh agonistów do reeptora (np. noradrenaliny do reeptorów β-adrenergiznyh) wówzas lek jest tzw. antagonistą. Grupy wektorowe fragmenty ząstezki odpowiedzialne za właśiwośi farmakokinetyzne i toksyzność leku, wśród któryh wyróżnia się: grupy warunkująe jonizaję i lipofilowość leku a w konsekwenji jego whłanianie, dystrybuję i wydalanie (arrier groups) grupy podatne na działanie enzymów, regulująe metabolizm leku (vulnerable groups). Przez wiele lat poszukiwanie nowyh leków opierało się na badaniu aktywnośi substanji występująyh w przyrodzie lub związków o przypadkowej strukturze zsyntezowanyh w laboratorium. Obenie największe znazenie ma tzw. rajonalne projektowanie leków, które obejmuje następująe etapy: a. Identyfikaję elu molekularnego (np. reeptora, białka, enzymu), który bierze udział w mehanizmie rozwoju horoby lub znoszeniu jej objawów b. Ustalenie budowy farmakofora, wykazująego odpowiednie powinowatwo i selektywność względem elu molekularnego, na podstawie: znajomośi trójwymiarowej struktury entrum aktywnego reeptora lub enzymu (RBD, and. reeptor based design) analizy budowy o najmniej kilku ligandów wiążąyh się z danym reeptorem (LBD, ang. ligand based design), jeżeli trójwymiarowa budowa reeptora nie jest znana. Zaprojektowanie metodą modelowania molekularnego tzw. związku wiodąego lub wybranie go z szerokiej puli już zsyntezowanyh substanji. Związek wiodąy zawiera ustalony wześniej farmakofor, przez o wykazuje pewną aktywność biologizną, i stanowi punkt wyjśia do zaprojektowania ostateznej struktury leku. d. Optymalizaja struktury związku wiodąego, polegająa na modyfikaji jego grup wektorowyh: polepszenie parametrów farmakokinetyznyh (whłaniania, dystrybuji, metabolizmu i wydalania) 3
zwiększenie selektywnośi zmniejszenie toksyznośi e. Synteza i testy in vitro analogów związku wiodąego. Analogami są związki hemizne posiadająe identyzny lub bardzo podobny farmakofor o związek wiodąy, lez inną strukturę grup wektorowyh. Kolejne analogi mogą tworzyć serię homologizną, zyli różnić się miedzy sobą o powtarzalny fragment, np. grupę metylenową (CH 2 ) f. Wybranie analogu o najlepszyh właśiwośiah, który będzie przedmiotem dalszyh badań in vivo na zwierzętah. Na etapie optymalizaji struktury związku wiodąego kluzowe znazenie mają reguła Lipińskiego oraz metody SAR i QSAR. Reguła Lipinskiego jest regułą empiryzną służąą do przewidywania, zy dany związek (kandydat na lek) może wykazywać pożądane właśiwośi farmakokinetyzne pod kątem jego whłaniania, dystrybuji, metabolizmu i wydalania. Podstawą opraowania tej reguły była analizy statystyzna właśiwośi fizykohemiznyh ponad 2000 leków o różnej budowie farmakofora i mehanizmie działania, które były przedmiotem badań kliniznyh II fazy. Reguła ta stwierdza, że słabe whłanianie lub przenikanie związku hemiznego przez błony biologizne jest prawdopodobne, gdy posiada on następująe właśiwośi fizykohemizne: masa molowa > 500 logarytm dziesiętny współzynnika podziału n-oktanol/woda (logp ) > 5 lizba donorów dla wiązań wodorowyh (suma grup OH i NH) > 5 lizba akeptorów dla wiązań wodorowyh (suma atomów O i N) >. Możliwość wyznazenia powyższyh parametrów za pomoą modelowania molekularnego sprawia, że reguła Lipinskiego jest najpowszehniej stosowanym kryterium selekji związków o korzystnyh właśiwośiah farmakokinetyznyh, zwłaszza tyh, które mają być podawane drogą doustną. W toku wielu badań potwierdzono słuszność reguły Lipinskiego w odniesieniu do większośi substanji leznizyh. Wyjątkiem od niej wśród leków doustnyh są substraty transporterów błonowyh: antybiotyki, leki przeiwgrzybize, witaminy i glikozydy naserowe. Metoda SAR (ang. struture ativity relationship) polega na określaniu zależnośi między budową związków strukturalnie pokrewnyh a ih aktywnośią biologizną. Zależność ta może dotyzyć właśiwośi fizykohemiznyh (rozpuszzalnośi, trwałośi), farmakokinetyznyh (whłaniania, dystrybuji, metabolizmu, wydalania) oraz farmakodynamiznyh (interakje leku z reeptorami). Związek między budową i aktywnośią substanji może być określony w sposób jakośiowy (simple SAR) lub ilośiowy (QSAR, ang. quantitative SAR). Najważniejszą zaletą tyh metod, zwłaszza QSAR, w kontekśie projektowania leków jest przewidywanie aktywnośi biologiznej nowyh substanji podzas optymalizaji związku wiodąego oraz tworzenia jego analogów. Metoda QSAR opiera się na 4 podstawowyh założeniah: 1. Właśiwośi ząstezki opisują mierzalne parametry fizykohemizne zwane deskryptorami lub indeksami 2. Aktywność biologizna jest wielkośią mierzalną, najzęśiej za pomoą minimalnego stężenia danej substanji wywołująej określony efekt biologizny 3. Substanje tworząe daną serię (klasę) mają ten sam mehanizm działania 4. Związek między deskryptorami a mierzalną aktywność biologizną opisuje równanie matematyzne typu aktywność biologizna = f(struktura hemizna). Celem QSAR jest uzyskanie równania liniowego opisująego aktywność biologizną określonej serii strukturalnie pokrewnyh związków jako funkję deskryptorów. Powyższe 4
deskryptory mogą być wyznazane na sposób eksperymentalny, jednak oraz zęśiej są one oblizane metodami modelowania molekularnego. Z tej przyzyny QSAR stanowi obenie jedno z głównyh narzędzi rajonalnego projektowania leków. Wśród ponad 1500 deskryptorów stosowanyh obenie w metodzie QSAR wyróżnia się następująe ih grupy: 1. Deskryptory molekularne masa molowa, długość i szerokość ząstezki. 2. Deskryptory konstytuyjne harakteryzują budowę związku hemiznego, np. lizba atomów, lizba wiązań wielokrotnyh, promienie atomowe i jonowe, lizba pierśieni. 3. Deskryptory podstawnikowe opisują wpływ podstawnika na właśiwośi ałej ząstezki, np. stała Hammetta określa wpływ podstawnika na dysojaję kwasową analogów kwasu benzoesowego. 4. Deskryptory geometryzne i topologizne harakteryzują odległośi międzyatomowe, odległość od środka masy, lizbę wiązań hemiznyh, wartośi kątów między wiązaniami. 5. Deskryptory konformayjne opisują m.in. energię danej konformaji ząstezki i lizbę atomów węgla o hybrydyzaji sp 3 umożliwiająyh swobodną rotaję fragmentów ząstezki. 6. Deskryptory steryzne stanowią miarę wielkośi i kształtu ałej ząstezki lub poszzególnyh grup funkyjnyh: refrakja molowa (R) parametr harakteryzująy objętość ałej ząstezki (m 3 /mol). Zgodnie ze wzorem Lorenza-Lorentza: 2 n 1 M R = 2 n + 2 ρ gdzie: n współzynnik załamania światła przez daną substanję; M masa molowa; ρ gęstość substanji; iloraz M/ρ odpowiada objętośi molowej substanji. stała Tafta określa efekt steryzny danego podstawnika. 7. Deskryptory elektrostatyzne (elektronowe) należą tu m.in.: sumaryzna elektroujemność atomów, polaryzowalność molowa, moment dipolowy, ładunki i wartośiowość atomów, lizba donorów i akeptorów wiązań wodorowyh, energia obsadzonego orbitalu molekularnego o najwyższej energii (HOMO), energia nieobsadzonego orbitalu molekularnego o najniższej energii (LUMO): moment dipolowy harakteryzuje ząstezki nieposiadająe środka symetrii. Dipol elektryzny tworzą dwa jednakowej wielkośi ładunki o przeiwnym znaku (+q i q) rozsunięte na odległość r. Elektryzny moment dipolowy jest wielkośią wektorową, tzn. opróz wartośi posiada również kierunek i zwrot (zgodnie z konwenją skierowany od ładunku ujemnego do dodatniego). Wartość momentu dipolowego pojedynzego wiązania spolaryzowanego opisuje równanie: µ = q r Wypadkowy moment dipolowy ząstezki wieloatomowej stanowi wektorową sumę momentów dipolowyh wszystkih wiązań. Im większa wartość momentu dipolowego, tym ząstezka jest bardziej polarna. Jednostką momentu dipolowego w układzie SI jest kulombometr (C m), a jednostką tradyyjną jest debaj (1 D = 3,33 30 C m). Zaletą stosowania momentu dipolowego wyrażonego w debajah jest fakt, iż jego wartość jest zbliżona do różniy elektroujemnośi atomów tworząyh dane wiązanie hemizne. W konsekwenji, przybliżona wartość momentu dipolowego tego wiązania może być 5
łatwo oszaowana na podstawie skali elektroujemnośi Paulinga. Ponadto, używanie debaja jest wygodne, gdyż momenty dipolowe większośi ząstezek są właśnie rzędu 1 D. polaryzowalność (α) harakteryzuje zdolność danej ząstezki do ulegania zjawisku polaryzaji, zyli ustawianiu się zgodnie z kierunkiem zewnętrznego pola elektryznego. Wyróżnia się dwa typy polaryzowalnośi i polaryzaji: - orientayjną dotyzy tylko ząstezek polarnyh, zyli posiadająyh trwały moment dipolowy. Polaryzowalność orientayjna (α orient ) jest wprost proporjonalna do kwadratu momentu dipolowego i odwrotnie proporjonalna do temperatury bezwzględnej, gdyż ruh termizny molekuł przeszkadza w ih ustawieniu się równolegle do linii pola elektryznego: α orient = µ 2 /(3kT). - indukowaną dotyzy wszystkih ząstezek, zarówno polarnyh, jak i niepolarnyh. Jej istnienie wynika z faktu, że zewnętrzne pole elektryzne, np. generowane przez sąsiedni jon lub polarną ząstezkę, powoduje deformaję powłok elektronowyh i przesunięie jąder atomowyh danej ząstezki. W ten sposób powstaje tymzasowy indukowany moment dipolowy, który jest wprost proporjonalny do wartośi polaryzowalnośi indukowanej (α ind ). Wartośi polaryzowalnośi α zęsto wyraża się w jednostkah objętośi (tzw. polarizability volume α ), zazwyzaj w Å 3 (1 Å (angstrem) = m). Co warto podkreślić, polaryzowalność (wielkość mikroskopowa) danej doskonale homogeniznej i izotropowej substanji powiązana jest z jej względną przenikalnośią elektryzną (wielkośią makroskopową) za pomoą równania: ε r 1 M N A ( α orient + α ind ) = ε r + 2 ρ 3ε o gdzie: ε r względna przenikalność elektryzna (stała dielektryzna) substanji. Prawa strona powyższego równania określa tzw. polaryzowalność molową (P) Zależność analogizna do równania (3), lez bez uwzględnienia udziału polaryzowalnośi orientayjnej nazywana jest równaniem Clausiusa-Mossottiego: ε r 1 M N Aα ind = ε r + 2 ρ 3ε o gdzie ε r jest w tym przypadku mierzona w warunkah, w któryh nie istnieje polaryzowalność orientayjna, tzn. kiedy ząstezki są niepolarne albo zewnętrzne pole elektryzne ma wysoką zęstotliwość (wyjaśnienie poniżej). Całkowita polaryzowalność substanji polarnyh stanowi sumę polaryzowalnośi orientayjnej i polaryzowalnośi indukowanej. Samą polaryzowalność indukowaną substanji polarnyh można wyznazyć mierzą ih względną przenikalność elektryzną w zmiennym, a nie stałym, polu elektryznym o zęstotliwośi powyżej 12 Hz. Wówzas polarne ząstezki nie nadążają z reorientają za zmianą kierunku pola elektryznego, o skutkuje zanikiem polaryzowalnośi orientayjnej. Co iekawe, na podobnej zasadzie opiera się działanie kuhenek mikrofalowyh, w któryh polarne ząstezki wody, które nie są w stanie nadążyć za szybkimi zmianami zęstotliwośi pola elektryznego, uwalniają do otozenia zęść energii w postai iepła. 8. Deskryptory termodynamizne np. molowa entalpia tworzenia, molowa entalpia swobodna solwataji, logp, stała lipofilowośi podstawnika (π), logd: logp logarytm współzynnika podziału n-oktanol/woda, zyli stosunku stężeń niezdysojowanyh ząstezek substanji w n-oktanolu i wodzie w stanie równowagi. Stanowi on miarę lipofilowośi ałej ząstezki. 6
logp = log (n oktanol) (woda) stała lipofilowośi podstawnika (π) określa wpływ danego podstawnika na lipofilowość ząstezki: PX π = logpx logph = log PH gdzie: P X współzynnik podziału n-oktanol/woda związku zawierająego podstawnik X; P H współzynnik podziału n-oktanol/woda związku wzorowego zawierająego atom wodoru zamiast podstawnika X. logd logarytm współzynnika dystrybuji n-oktanol/woda, zyli stosunku ałkowityh stężeń ząstezek (niezdysojowanyh i zdysojowanyh) danej substanji w n-oktanolu i wodzie w stanie równowagi: (n oktanol) logd = log (woda) Parametr logd stanowi wskaźnik rozkładu ząstezek słabego elektrolitu (kwasu lub zasady) między fazę niepolarną (n-oktanol) i polarną (woda) w danyh warunkah ph. Zdysojowane ząstezki elektrolitu (jony) gromadzą się tylko w fazie wodnej, natomiast rozkład ząstezek niezdysojowanyh pomiędzy obie fazy wynika z wartośi logp. Z kolei proporję ząstezek niezdysojowanyh do zdysojowanyh determinuje harakter słabego elektrolitu (kwas, zasada), wartość jego stałej dysojaji oraz wartość ph fazy wodnej. Na przykład, przy wysokih wartośiah ph, kwas występuje głównie w formie zdysojowanej i gromadzi się w fazie wodnej, natomiast dominująą formą zasady są ząstezki niezdysojowane, które z reguły wykazują większe powinowatwo do n-oktanolu. W związku z tym wartość logd słabyh kwasów maleje ze wzrostem ph fazy wodnej, a słabyh zasad rośnie. Praktyzne znazenie logd sprowadza się do oeny whłaniania słabyh elektrolitów z różnyh odinków przewodu pokarmowego oraz przewidywania, w którym kompartmenie ustroju będą one ulegać kumulaji. Piśmiennitwo: 1. Hermann T.W. (Red.): Chemia fizyzna. Wydawnitwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2007. 2. Pandit NK: Introdution to the Pharmaeutial Sienes. Lippinott Williams & Wilkins, Philadelphia 2007. 3. Atkins P., de Paula J.: Physial Chemistry, 8 th Ed., Oxford University Press In., Oxford 2006. 4. Atkins P., de Paula J.: Elements of Physial Chemistry, 5 th Ed., Oxford University Press In., Oxford 2009. 5. Lipinski C.A. et al.: Experimental and omputational approahes to estimate solubility and permeability in drug disovery and development settings. Adv. Drug Deliv. Rev. 1997, 3, 3-25. 7
Część praktyzna Aparatura: oprogramowanie MarvinSuite 6.2 (ChemAxon, Budapeszt, Węgry). Wykonanie A. Analiza struktury i właśiwośi związków leznizyh 1. Uruhomić program MarvinSketh, którego ikona znajduje się na pulpiie. 2. Po konsultaji z asystentem prowadząym wybrać dwie ząstezki, które zostaną poddane analizie w niniejszym ćwizeniu. 3. Przy pomoy narzędzi programu MarvinSketh narysować strukturę ząstezki: a. Pojedynze atomy dodaje się poprzez pojedynze kliknięie w oknie programu. Rodzaj atomu można zmienić korzystają z tabliy układu okresowego lub poszzególnyh ikon, umieszzonyh w prawej zęśi okna. b. Wiązania hemizne wprowadza się przeiągają kursorem w oknie programu przy wiśniętym lewym klawiszu myszy lub korzystają z narzędzia Bond, umieszzonego na pasku narządzi w lewej górnej zęśi okna. Wiązania wielokrotne dodaje się przez kliknięie na narysowane wześniej wiązanie. Opja ta pozwala również na wprowadzanie wiązań hemiznyh z uwzględnieniem ih orientaji w przestrzeni. Jest to niezwykle istotne w przypadku leków posiadająyh entrum hiralne, ponieważ ih poszzególne stereoizomery zęsto różnią się właśiwośiami farmakokinetyznymi i farmakodynamiznymi. Podzas rysowania ząstezki takih związków należy uwzględnić konfiguraję entrum stereogeniznego.. Łańuhy węglowe mogą być wprowadzone przez skorzystanie z narzędzia Chain. d. Błędnie umieszzone wiązania i atomy można usunąć przy pomoy gumki, która znajduje się w lewej górnej zęśi ekranu. e. W przypadku bardziej rozbudowanyh struktur można wykorzystać wzory wprowadzone do bazy programu. Ikony poszzególnyh struktur znajdują się na pasku narzędzi w dolnej zęśi ekranu. 4. Po zakońzeniu rysowania ząstezki należy z paska menu wybrać opję Struture>Clean 2D. Dzięki temu struktura ząstezki zostanie uporządkowana. 5. Końowy trójwymiarowy obraz ząstezki uzyskuje się z menu Clean 3D. Aby wykonać optymalizaję struktury, z menu Struture>Clean 3D>Cleaning Method należy wybrać najpierw opję Fast Build, która pozwala odnaleźć konformer o najniższej energii, a następnie Gradient Optimize. Program MarvinSketh przeprowadza oblizenia służąe optymalizaji geometrii ząstezki zgodnie z teorią pól siłowyh, przy wykorzystaniu metody DREIDING. 6. Uzyskaną ząstezkę można przestawić w programie na różne sposoby: a. Pierśień benzenowy można przedstawić za pomoą układu aromatyznego lub struktury Kekulego (wzoru kreskowego) (Struture>Aromati Form>Convert to Aromati Form/Convert to Kekulé Form) 8
b. W menu View>Struture Display można wybrać wiele sposobów wizualizaji ząstezki. Cząstezkę można swobodnie obraać po wyborze opji View>Mouse Mode>Rotate in 3D. Opja Struture>Add>Add Expliit Hydrogens pozwala na dodanie ukrytyh atomów wodoru. 7. Cząstezkę o zoptymalizowanej strukturze należy przerysować do protokołu. Rysunek powinien być duży i przejrzysty. 8. Z menu View należy wybrać opję Open MarvinSpae. Program ten pozwala na odzytanie długośi wiązań pomiędzy atomami, a także pomiar kątów, w tym kątów torsyjnyh. a. Długość wiązań odzytuje się po wybraniu opji z paska narzędzi i kliknięiu dwóh kolejnyh atomów. Długość wiązania wyrażona jest w Å. b. Kąty płaskie oblizane są po wybraniu opji. Kursorem należy wskazać trzy kolejne atomy.. Wartość kąta torsyjnego wyświetlana jest po wybraniu opji i wskazaniu ztereh kolejnyh atomów. 9. Oblizenia parametrów fizykohemiznyh należy wykonać w programie MarvinSketh, przy wykorzystaniu narzędzi znajdująyh się w menu Calulations. Wyniki oblizeń należy zamieśić w protokole. a. Elemental Analysis odzytać masę ząstezkową (przybliżoną) oraz proentowy udział poszzególnyh pierwiastków ałkowitej masie związku. b. Protonation oblizyć wartość pk a leku. Dla większośi ząstezek zostanie wskazana więej niż jedna wartość pk a, odpowiednio do ilośi ugrupowań zdolnyh do dysojaji. W takim przypadku należy zaznazyć, któryh ugrupowań dotyzą odpowiednie wartośi.. Partitioning oblizyć współzynniki logp i logd. Wartośi logd należy oblizyć dla ph 1,5 oraz 7,4. d. Charge - ten moduł pozwala na estymaję właśiwośi ząstezek związanyh z ih ładunkiem i. Charge obliza ładunki na poszzególnyh atomah (wartośi są wyrażone w e, które jest wielkośią ładunku przenoszonego przez pojedynzy proton lub elektron, zwanego ładunkiem elementarnym; 1 e = 1,6 19 C) ii. Polarizability obliza polaryzowalność ząstezki wyrażoną w Å 3 polarizability volume α ) (tzw. iii. Dipole Moment Calulation zwraa wektor momentu dipolowego oraz jego wartość wyrażoną w D. Moment dipolowy należy zaznazyć na umieszzonym w protokole wzorze strukturalnym ząstezki e. Geometry ten moduł obliza parametry geometryzne ząstezki i. Polar Surfae Area obliza powierzhnię tworzoną przez polarne atomy 9
ii. Moleular Surfae Area obliza ałkowitą powierzhnię ząstezki, wyrażoną w Å 2. Wynik może być podany jako powierzhnia van der Waalsa lub jako powierzhnia dostępna dla rozpuszzalnika. Domyślnie wprowadzona wartość 1,4 Å jest promieniem ząstezki wody. Uzyskane wyniki oznazają kolejno: ASA ałkowitą powierzhnię dostępną dla rozpuszzalnika, ASA - /ASA + - powierzhnię dostępną dla rozpuszzalnika, tworzoną przez atomy obdarzone ujemnym/dodatnim ładunkiem, ASA_H/ASA_P powierzhnię dostępną dla rozpuszzalnika, tworzoną przez atomy hydrofobowe/polarne. f. Other i. H Bond Donor/Aeptor obliza ilość miejs w ząsteze, będąyh donorami lub akeptorami wiązań wodorowyh (należy wybrać opję donor/aeptor ount ) ii. Refrativity obliza współzynnik refrakji molowej w m 3 /mol; wyświetlona wartość jest wynikiem pomnożenia rzezywistej refrakji molowej przez 6.. Na podstawie oblizonyh parametrów oenić, zy dana ząstezka spełnia regułę Lipinskiego ( regułę pięiu ). Wyiągnąć odpowiedni wniosek. 11. Przy wykorzystaniu baz internetowyh (np. drugbank.a) odszukać dane eksperymentalne dotyząe pk a oraz logp i porównać je z wartośiami oblizonymi przy pomoy programu Marvin. 12. Powyższe proedury należy wykonać dla drugiej wybranej ząstezki. 13. Z asystentem prowadząym omówić podobieństwa i różnie w budowie obu analizowanyh leków oraz wywnioskować, jak zmiana struktury wpływa na ih własnośi fizykohemizne. Wnioski powinny być umieszzone w protokole. B. Analiza widma 1 H NMR dla wybranej prostej ząstezki 1. Z pomoą asystenta należy wybrać do analizy ząstezkę prostego związku organiznego. 2. Na podstawie posiadanyh wiadomośi przewidzieć, jakie sygnały występują w widmie 1 H NMR wybranego związku. 3. Narysować i zoptymalizować budowę analizowanej ząstezki w programie MarvinSketh. 4. Z menu Calulations > NMR należy wybrać opję HNMR Predition. W nowym oknie zostanie otworzone widmo 1 H NMR związku. Po najehaniu kursorem na dany pik, podświetlane są atomy wodoru, które są źródłem sygnału. Wynik omówić z asystentem. 5. W protokole należy zamieśić wzór ząstezki i shemat widma 1 H NMR oraz opisać, które atomy wodoru generują poszzególne sygnały.
PROTOKÓŁ Imię i nazwisko:... Data:... Ćwizenie 9 Zastosowanie modelowania molekularnego do oeny właśiwośi fizykohemiznyh substanji leznizyh Cel ćwizenia:............ Wyniki A. Analiza struktury i właśiwośi fizykohemiznyh związków leznizyh Cząstezka 1 1. Nazwa leku:. 2. Rysunek ząstezki z zaznazniem: - długośi 5 wiązań różnego typu - wartośi 5 kątów płaskih różnego typu - wartośi 2 kątów torsyjnyh - wartośi ładunku dodatniego i ujemnego na 8 wybranyh atomah - wektora momentu dipolowego ząstezki 11
3. Analiza właśiwośi ząstezki: Masa molowa [g/mol]:.. Czy większa od 500 g/mol? TAK NIE Lizba donorów wiązań wodorowyh: Czy większa od 5? TAK NIE Lizba akeptorów wiązań wodorowyh:.. Czy większa od? TAK NIE LogP:. Czy większy od 5? TAK NIE Czy substanja spełnia regułę Lipinskiego? TAK NIE Powierzhnia van der Waalsa:. [...] Powierzhnia ząstezki dostępna dla wody:... [...] Refrakja molowa:.. [.] Polaryzowalność: [ ] Moment dipolowy:...[d] =...[Cm] LogD ph=1,5 : LogD ph=7,4 :.. Charakter substanji: NIEELEKTROLIT ELEKTROLIT (słaby kwas słaba zasada ) pk a = lub pk a (kwasu sprzężonego z zasadą) = (pk b = 14 pk a = ) Oena whłaniania substanji z przewodu pokarmowego: phx pka x 1+ = phy pka y 1+ Wzór dla słabego kwasu x y 1+ = 1+ pk a ph x pk a ph y Wzór dla słabej zasady Oena whłaniania substanji z żołądka (ph 1,5) do krwioobiegu (ph 7,4) Oena whłaniania substanji z jelita ienkiego (ph 7) do krwioobiegu (ph 7,4)...... krew 1+ krew 1+ = = = =...... 1+ 1+ żołądek Wniosek końowy dotyząy whłaniania analizowanej substanji w żołądku i jeliie ienkim: 4. Wybrane dane eksperymentalne znalezione w bazie internetowej drugbank.a: jelito pk a :.. LogP:. 12
Cząstezka 2 1. Nazwa leku:. 2. Rysunek ząstezki z zaznazniem: - długośi 5 wiązań różnego typu - wartośi 5 kątów płaskih różnego typu - wartośi 2 kątów torsyjnyh - wartośi ładunku dodatniego i ujemnego na 8 wybranyh atomah - wektora momentu dipolowego ząstezki 3. Analiza właśiwośi ząstezki: Masa molowa [g/mol]:.. Czy większa od 500 g/mol? TAK NIE Lizba donorów wiązań wodorowyh: Czy większa od 5? TAK NIE Lizba akeptorów wiązań wodorowyh: Czy większa od? TAK NIE LogP:. Czy większy od 5? TAK NIE Czy substanja spełnia regułę Lipinskiego? TAK NIE Powierzhnia van der Waalsa:. [...] Powierzhnia ząstezki dostępna dla wody:... [...] Refrakja molowa:.. [.] 13
Polaryzowalność: [ ] Moment dipolowy:...[d] =...[Cm] LogD ph=1,5 : LogD ph=7,4 :.. Charakter substanji: NIEELEKTROLIT ELEKTROLIT (słaby kwas słaba zasada ) pk a = lub pk a (kwasu sprzężonego z zasadą) = (pk b = 14 pk a = ) Oena whłaniania substanji z przewodu pokarmowego: phx pka x 1+ = phy pka y 1+ Wzór dla słabego kwasu x y 1+ = 1+ pk a ph x pk a ph y Wzór dla słabej zasady Oena whłaniania substanji z żołądka (ph 1,5) do krwioobiegu (ph 7,4) Oena whłaniania substanji z jelita ienkiego (ph 7) do krwioobiegu (ph 7,4)...... krew 1+ krew 1+ = = = =...... 1+ 1+ żołądek Wniosek końowy dotyząy whłaniania analizowanej substanji w żołądku i jeliie ienkim: 4. Wybrane dane eksperymentalne znalezione w bazie internetowej drugbank.a: jelito pk a :.. LogP:. Wnioski: 14
B. Analiza widma 1 H NMR wybranej ząstezki 1. Wzór ząstezki: 2. Widmo 1 H NMR: Wnioski:..................... 15