Ćwiczenie nr B2 OZNACZANE ZAWARTOŚC PROWTAMNY A W SUPLEMENTACH DETY METODĄ SPEKTROFOTOMETRYCZNĄ. Cel ćwiczenia Celem ćwiczenia jest znaczanie zawartści β-kartenu metdą spektrftmetrii absrpcyjnej w suplementach diety: 1. Tabletki "Relastan Sun" (Nvascn), 60 tabletek/800 µg 2. Kapsułki "Beta-karten" (WALMARK), 100 szt./6 mg. Zagadnienia wprwadzające 1. Właściwści ptyczne substancji 2. Absrpcja prmieniwania elektrmagnetyczneg 3. Oddziaływanie prmieniwania elektrmagnetyczneg z materią 4. Prawa Lamberta-Beera 5. Charakterystyka β-kartenu Literatura bwiązująca: 1. E. Szyszk, nstrumentalne metdy analityczne, PZWL, W-wa 1964 2. J. Minczewski, Z. Marczenk, Chemia analityczna, PWN, W-wa 1965 3. Praca zbirwa, Chemia Fizyczna, PWN, W-wa 2001 4. G. M. Barrw, Chemia fizyczna, PWN, W-wa, 1973 5. E. Szymański, Ćwiczenia labratryjne z chemii fizycznej, Wyd. UMCS, Lublin 1991
. Cześć teretyczna. 1. Wprwadzenie Oddziaływanie światła (rzumianeg jak strumień ftnów) z materią (zbirem atmów lub cząsteczek) wywłuje następujące zjawiska: emisję spntaniczną, w wyniku której ftn emitwany jest samrzutnie przez wzbudzny atm, emisję wymuszną, w wyniku której ftn ddziałujący ze wzbudznym atmem wymusza emisję identyczneg ftnu przez ten atm, absrpcję, w wyniku której ftn zstaje pchłnięty przez atm, a ten przechdzi w stan wzbudzny. Aby światł był absrbwane przez materię energia ftnów musi dpwiadać różnicy energii pzimów energetycznych w atmach lub cząsteczkach, z którymi ddziałuje. Energia ftnów jest bezpśredni związana z długścią fali światła, inaczej mówiąc, z jeg barwą. Wykrzystuje się t d identyfikacji nieznanych substancji, badając absrpcję światła różnych długściach fali przez daną substancję - jest t tzw. absrpcyjna analiza spektrskpwa. Absrpcja (pchłanianie) światła przez daną substancję zależy zarówn d właściwści tej substancji (zdlnści pchłaniania światła danej długści fali) jak i jej stężenia. Pierwszy czynnik pisywany jest tzw. współczynnikiem absrpcji a, natmiast drugi (stężenie c) - liczbą atmów lub cząsteczek znajdujących się w kreślnej bjętści. Mżemy t sbie wybrazić na przykładzie barwnika rzpuszczneg w bezbarwnej cieczy (np. wdzie): rztwór taki będzie tym ciemniejszy (czyli tym bardziej będzie absrbwał światł) im silniej sam barwnik absrbuje światł raz im więcej barwnika rzpuścimy. Fakt ten pzwala mierzyć stężenia różnych substancji rzpuszcznych w cieczach (np. zanieczyszczeń wdy) pprzez pmiar absrpcji światła. lść materii, z którą ddziałuje światł zależy również d drgi, którą światł pknuje w śrdku. Jeśli światł przechdzi przez śrdek pewnej grubści, t im grubszy jest ten śrdek, tym więcej światła zstanie zaabsrbwane. Wielkścią, która pzwala jednznacznie kreślać ilść światła", jest jeg natężenie. Natężenie światła definiujemy jak mc fali świetlnej padającej na jednstkę pwierzchni. Zazwyczaj (t jest, nie przy bardz dużych natężeniach światła) mamy d czynienia z tzw. liniwą absrpcją światła, t znaczy - natężenie światła zaabsrbwaneg przez śrdek danej grubści jest wprst prprcjnalne d natężenia światła padająceg na ten śrdek. Analiza klrymetryczna wykrzystuje zjawisk pchłaniania światła przez rztwry d ilściweg znaczania substancji barwnych, które mgą pwstać w wyniku reakcji znaczaneg składnika z dpwiednim dczynnikiem. Jeżeli światł pchłaniane dpwiada długści fali z zakresu 400-760 nm, t rztwór pchłaniający jest barwny. Jak wspmnian wcześniej, intensywnść zabarwienia zależy d stężenia rztwru i jest wykrzystywana d znaczania ilści substancji rzpuszcznej w badanym rztwrze. stnieje wiele spsbów pmiaru intensywnści zabarwienia rztwrów. We wszystkich tych przypadkach wykrzystuje się te same prawa absrpcji światła przez rztwór. 2
. 2. Prawa absrpcji światła Pdczas badania pchłaniania światła przez rztwór, ten statni umieszcza się w przezrczystym naczyńku zwanym kuwetą. Najczęściej kuweta ma przekrój prstkątny a jej ścianki są d siebie równległe. Jeżeli załżymy, że na jedną ze ścianek kuwety pada strumień światła natężeniu, t światł t zstaje częściw dbite d pwierzchni kuwety ( r ), częściw zaabsrbwane przez substancję rzpuszczną w rztwrze znajdującym się w kuwecie ( a ), a pzstała jeg część () przechdzi przez kuwetę z rztwrem. Tak więc mżemy przyjąć, że: = + + (1) Pnieważ kuwety są wyknane z bardz przezrczystych materiałów (szkł lub kwarc), t dbicie światła d pwierzchni kuwet jest bardz małe i mżna załżyć, że r =0. Wówczas równanie (1) mżna uprścić d pstaci: r a a = + (2) Z wielkści występujących w tym równaniu, zmierzyć mżna i. Część światła, które zstał zaabsrbwane, mżna bliczyć z różnicy -. Wcześniej zauważn, że pchłanianie światła zależy d grubści warstwy pchłaniającej. Pdstawwym prawem frmułującym tę zależnści jest praw pdane przez Lamberta. Zgdnie z tym prawem, warstwy takieg sameg rztwru jednakwej grubści, w identycznych warunkach pchłaniają zawsze taką samą część padająceg na nie prmieniwania. Praw Lamberta wyrażamy wzrem: e al = (3) gdzie znacza natężenie prmieniwania przepuszczneg, t natężenie prmieniwania padająceg, 1 t grubść warstwy absrbującej, a jest współczynnikiem absrpcji charakterystycznym dla substancji pchłaniającej światł a e t pdstawa lgarytmów naturalnych. Absrpcja światła zależy również d stężenia substancji absrbującej w rztwrze. Beer, bserwując absrpcję światła przez rztwry barwne różnym stężeniu stwierdził, że absrpcja światła jest prprcjnalna d stężenia substancji pchłaniającej w rztwrze. Zależnść między natężeniem ( ) światła padająceg na warstwę rztwru grubści l i stężeniu c mżna przedstawić wzrem: e ε cl = (4) gdzie c t stężenie mlwe substancji absrbującej światł w rztwrze, l t grubść warstwy rztwru a ε ' t współczynnik absrpcji, charakterystyczny dla substancji. Równanie 4 znacza, że natężenie światła przechdząceg przez próbkę rztwru () uzależnine jest d grubści warstwy pchłaniającej (l), d stężenia substancji pchłaniającej (c), d natężenia prmieniwania padająceg na próbkę ( ) raz właściwści substancji pchłaniającej (ε ' ). Równanie t jest znane jak praw Lamberta-Beera. 3
P przekształceniu pwyższej zależnści trzymujemy: lub: ln = ε cl (5) ln = ε cl (6) Wprwadzając lgarytm dziesiętny trzymujemy następującą zależnść: lg = ε cl (7), w której c jest stężeniem mlwym a ε t mlwy współczynnik absrbancji (ekstynkcja). Równanie (7) definiuje pjęcie absrbancji (A): A = lg (8) Absrbancja A służy d ilściweg pisu zjawiska absrpcji prmieniwania, czyli zmiany jeg natężenia p przejściu przez jakiś śrdek. Łącząc równania (7) i (8) trzymujemy zależnść zwaną prawem Lamberta-Beera: A = εcl (9) Stsunek natężenia prmieniwania przepuszczneg przez rztwór () d natężenia prmieniwania padająceg ( ) na ten rztwór nazywamy transmitancją i znaczamy jak T, czyli: Z prównania równań (8) i (10) wynika, że T = (10) A = lgt (11) Praw Lamberta-Beera dnsi się d przypadku, gdy w rztwrze znajduje się jedna substancja absrbująca, światł jest mnchrmatyczne i sklimwane. Praw addytywnści absrbancji dtyczy przypadku, gdy w próbce znajduje się n różnych substancji stężeniach c 1, c 2,... i c n, charakteryzujących się mlwymi współczynnikami absrbancji ε 1, ε 2,... i ε n. Absrbancja próbki jest wtedy równa sumie absrbancji jej pszczególnych składników: Prawa dtyczące absrpcji światła przez rztwór są spełniane tylk wtedy, kiedy w tych rztwrach nie zachdzą żadne reakcje między substancją absrbującą a rzpuszczalnikiem raz między cząsteczkami substancji absrbującej. Gdy spełnine jest praw Lamberta- Beera, zależnść między absrbancją A i stężeniem rztwru c przedstawia linia prsta, 4 = A = ε 1 c1l + ε 2c2l +... + ε ncnl ε ic1l (12) i
przechdząca przez pczątek układu współrzędnych (linia 1 na rysunku 1). Otrzymanie w wyniku pmiarów krzywych typu 2 lub 3 wskazuje, że układ w danych warunkach pmiarwych nie stsuje się d prawa Lamberta-Beera. Odstępstwa mgą być spwdwane alb zmianami chemicznymi zachdzącymi w rztwrze, alb warunkami pmiaru wyknaneg za pmcą nie dść precyzyjneg przyrządu. Chemiczne dstępstwa wynikają z reakcji przebiegających w rztwrze w miarę wzrstu stężenia składnika znaczaneg. Mgą t być reakcje plimeryzacji lub kndensacji cząsteczek lub jnów absrbujących, reakcje między jnem (cząsteczką) absrbującym i rzpuszczalnikiem alb, w przypadku układów wielskładnikwych, ddatkwe reakcje między pszczególnymi składnikami. Rys. 1. Krzywe A = f(c) w zależnści d stswania lub niestswania się układu d prawa Lamberta-Beera.. 3. β-karten Karteny są barwnikami występującymi w żółtych i zielnych częściach rślin. Z materiału rślinneg ekstrahuje się je mieszaniną acetnu i eteru naftweg. W tych warunkach d wyciągu przechdzi α-, β- i γ-karten, a pnadt chlrfil, ksantfil i likpen. β-karten mżna ddzielić na klumnie chrmatgraficznej stsując jak eluent eter naftwy. W suplementach diety najczęściej stsuje się β-karten w pstaci rztwru lejweg lub krystalicznej. Zawartść β-kartenu w uzyskanym rztwrze znacza się klrymetrycznie. Krzywą wzrcwą wyknuje się stsując jak wzrce wdne rztwry dichrmianu ptasweg różnych stężeniach dpwiadających kreślnemu stężeniu β-kartenu. Rys. 2. Struktura chemiczna β-kartenu. 5
V. Część dświadczalna V. 1. Aparatura i dczynniki 1. Aparatura: spektrftmetr wirówka kuwety grubści d =1 cm klby miarwe pj. 10 cm 3-6 szt. klba miarwa pj. 100 cm 3 pipety miarwe pj. 2 cm 3-2 szt. pipety miarwe pj. 20 cm 3-3 szt. zlewki pj. 25 cm 3-2 szt. strzykawki - 2 szt. 2. Odczynniki: krystaliczny dichrmian ptasu eter naftwy Tabletki "Relastan Sun" (Nvascn), 60 tabletek / 800 µg Kapsułki "Beta-karten" (Walmark), 100 szt. / 6 mg V. 2. Przygtwanie rztwrów 1. Rztwór pdstawwy dichrmianu ptasu stężeniu 0,72 g/100 cm 3 Odważyć 0,72 g krystaliczneg dichrmianu ptasu i przenieść d klby miarwej pjemnści 100 cm 3. Dpełnić wdą destylwaną d kreski. 2. Wyknanie rztwrów d krzywej kalibracyjnej D sześciu klbek miarwych pjemnści 10 cm 3 dmierzyć klejn: 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,8 i 1,0 cm 3 rztwru pdstawweg i uzupełnić wdą destylwaną d kreski. Obliczyć stężenia dichrmianu ptasu w uzyskanych rztwrach - wyrazić je w mg/ cm 3. Zmierzyć wartści absrbancji dla każdeg rztwru. Pmiar przeprwadza się za pmcą spektrftmetru Spekl, przy długści fali 450 nm, wbec wdy jak dnśnika. V. 3. Preparatyka kapsułki i pmiar absrbancji UWAGA! UŻYWAĆ SUCHYCH NACZYŃ, PPET KUWET! W przypadku gdy są ne mkre należy przemyć je niewielka ilścią acetnu i wysuszyć w strumieniu zimneg pwietrza. 1. Nalać d zlewki 10 cm 3 eteru naftweg. 2. Kapsułkę masie 210 mg przekłuć (OSTROŻNE!) igłą ze strzykawką. Kapsułka pwinna mieć dwa twry. Przesunąć igłę tak, aby jej kniec znajdwał się w kapsułce. 6
3. Włżyć kapsułkę d klbki z eterem i kilka razy, pruszając tłkiem strzykawki, wypłukiwać zawartść kapsułki eterem z klbki. 4. Zlać zawartść zlewki nr 1 zawierającej β-karten d klbki miarwej pjemnści 25 cm 3. Kilka razy wypłukać. zlewkę nr 1 niewielką ilścią eteru. Łączna bjętść ekstraktu eterweg nie mże przekrczyć 25 cm 3. Uzupełnić eterem klbę d kreski. 5. Pbrać 0,1 cm 3 tak przygtwaneg rztwru i przenieść d klby miarwej pjemnści 10 cm 3. Objętść klby miarwej uzupełnić eterem d 10 cm 3 (rztwór rzcieńczny). 6. Zmierzyć wartść absrbancji kńcweg rztwru β-kartenu (rztwru rzcieńczneg) na spektrftmetrze Spekl, przy długści fali 450 nm, stsując jak dnśnik eter naftwy. 7. Pustą kapsułkę rzciąć i pzstawić d wyschnięcia. Zważyć suchą kapsułkę. V. 4. Preparatyka tabletki i pmiar absrbancji 1. Rzgnieciną tabletkę masie k. 400 mg przenieść d klby miarwej pjemnści 25 cm 3. Zawartść zalać wdą temperaturze 30 C. Wytrząsać aż d całkwiteg przejścia barwnika d rztwru. 2. Pbrać 1 cm 3 zawiesiny i przenieść d prbówki. 3. Prbówkę umieścić w wirówce i wirwać 5 minut. 4. Otrzymany rztwór zlać d klby miarwej pjemnści 25 cm 3 i dpełnić bjętść klby wdą destylwaną d kreski. 5. Zmierzyć absrbancję trzymaneg rztwru na spektrftmetrze, przy długści fali 450 nm, wbec wdy jak dnśnika. V. 5. Opracwanie wyników Wiedząc, że rztwór wdny dichrmianu ptasu stężeniu 0,36 mg/cm 3 dpwiada barwie eterweg rztwru β-kartenu stężeniu 2,08 µg/cm 3, uzupełnić dane w tabeli 1. 1. Na pdstawie danych zawartych w tabeli 1 sprządzić krzywą kalibracyjną, tj. zależnść absrbancji (rztwrów dichrmianu ptasweg) d stężenia β- kartenu. 2. Obliczyć parametry regresji liniwej krzywej kalibracyjnej i wartść współczynnika dpaswania R 2. 3. Obliczyć zawartść β-kartenu w badanej próbce (w mg) uwzględniając rzcieńczenie rztwrów. 4. Otrzymany wynik zawartści β-kartenu (w mg) przeliczyć na ekwiwalent witaminy A wiedząc, że 10 mg β-kartenu jest równe 500 µg eqv. witaminy A. 7
Tabela 1. Skala wzrców d znaczania β-kartenu. Lp. Objętść pdstawweg rztwru dichrmianu ptasu [cm 3 ] Stężenie dichrmianu ptasu [mg/ cm 3 ] Odpwiadające wartści stężenia β-kartenu [µg/ cm 3 ] Absrbancja wdnych rztwrów dichrmianu ptasu 1 0,2 2 0,3 3 0,4 4 0,5 5 0,8 6 1,0 8