BADANIA STRUKTUR MOLEKULARNYCH NOCYCEPTYNY I JEJ FRAGMENTÓW TECHNIKAMI SPEKTROSKOPII ROZPROSZENIA RAMANA MARIA KOSIOR 1, EDYTA PODSTAWKA 2, LEONARD M. PRONIEWICZ 1,2 1 Zakład Fizyki Chemicznej, Wydział Chemii Uniwersytetu Jagiellońskiego, ul. Ingardena 3, 30-060 Kraków, e-mail: stasiek@chemia.uj.edu.pl i proniewi@chemia.uj.edu.pl 2 Środowiskowe Laboratorium Analiz Fizykochemicznych i Badań Strukturalnych, ul. Ingardena 3, 30-060 Kraków, e-mail:podstawk@chemia.uj.edu.pl Hasła do zapamiętania: nocycepyna, OFQ/N; fourierowska spektroskopia rozproszenia Ramana, FT-RS; powierzchniowo wzmocniony efekt Ramana, SERS. Wstęp Neuropeptydy to substancje związane z procesami regulacyjnymi, takimi jak: czynności hormonalne i ruchowe, przekazywanie bodźców czuciowych i bólowych, regulacja temperatury, procesów emocjonalnych, uczenia się i pamięci. Biorą one również udział w procesach związanych z reakcją organizmu na bodźce stresowe wywołując efekt przeciwlękowy i przeciwbólowy. Nocyceptyna OFQ/N (orfanina FQ) jest to 17-aminokwasowy peptyd wyizolowany, w 1995 roku przez dwa niezależne zespoły, z ośrodkowego układu nerwowego [1,2]. Wykazuje ona podobieństwo strukturalne do dynorfin, szczególnie dynorfiny A - naturalnego antagonisty receptorów κ-opioidowych. OFQ/N nie oddziałuje z receptorami opioidowymi, lecz przyłącza się do receptora OP4 (ORL-1, LC132) [3,4]. Odgrywa ona ważną rolę w mechanizmie przewodzenia bólu. Początkowo powoduje znaczne obniżenie progu pobudliwości na bodziec bólowy, a następnie zmienia charakter działania wywołując zmniejszenie intensywności odczuwania bólu (analgezję). Wynika to z faktu, iż enzymatyczna fragmentacja peptydu powoduje powstawanie fragmentów: OFQ/N(1-11) i OFQ/N(1-6) o zmienionej aktywności w porównaniu z OFQ/N [5]. Stwierdzono również wpływ OFQ/N na procesy uzależnienia od leków (np. od morfiny) [6]. Ponadto, jest ona zaangażowana w procesy uczenia się i pamięci, stany emocjonalne, procesy ruchowe, homeostazę, wydzielanie neuroendokrynowe oraz aktywację kanałów K + i inhibicję kanałów Ca 2+ [7-9]. Jakkolwiek fizjologiczna funkcja OFQ/N i jej fragmentów: OFQ/N(1-13), OFQ/N(1-11) i OFQ/N(1-6) otrzymanych w wyniku enzymatycznej lizy została poznana (potencjalne inhibitory i substraty proteinaz i leków peptydowych), tak mechanizm ich działania nie jest jeszcze w pełni wyjaśniony. Co więcej, struktura drugorzędowa tych peptydów i ich ewentualne oddziaływania z jonami metali, które koordynując z ligandem mogą zmieniać jego aktywność, są wciąż przedmiotem badań. Spektroskopia rozproszenia Ramana (RS) jest znakomitą metodą służącą do badań konformacji peptydów, protein oraz innych związków o potencjalnym znaczeniu biologicznym [10]. Dodatkowo, technika powierzchniowo wzmocnionego efektu Ramana (ang. Surface-Enhanced Raman Scattering, SERS) pozwala na wyznaczenie mechanizmu oddziaływania badanych biomolekuł z powierzchnią metalu podczas aktu adsorpcji, jak również określeniu ich orientacji na badanej powierzchni [11]. Dlatego też, w niniejszej pracy użyto metody FT-RS i SERS do wyznaczenia struktur molekularnych: OFQ/N, OFQ/N(1-13), OFQ/N(1-11) i OFQ/N(1-6) oraz sposobu ich adsorpcji na powierzchni koloidalnego srebra. Część eksperymentalna Synteza peptydów. Peptydy: OFQ/N, OFQ/N(1-13), OFQ/N(1-11) i OFQ/N(1-6) zsyntezowano na ziarnach fazy stałej używając odczynników do syntezy typu Fmoc 173 174
(blokowanie wolnego końca łańcucha grupą fluorenylometylokarbonylową) według standardowego protokołu [12]. Syntezę prowadzono z zastosowaniem automatycznego normalnym zebrano w tabeli 2. Przypisanie pasm Ramana i SERS dokonano w oparciu o wcześniejsze dane dla wybranych dipeptydów [11,13] i niskocząsteczkowych białek [14]. syntetyzera peptydów (Advanced ChemTech, Anglia). Otrzymane peptydy oczyszczano na kolumnie preparatywnej typu RP, a czystość kontrolowano przez analizę z użyciem spektrometru masowego z jonizacją electrospray (model Esquire 3000, firmy Brucker). Fourierowska spektroskopia rozproszenia Ramana, FT-RS. Widma FT-RS wykonano na spektrometrze FT-Raman firmy Bio-Rad, model FT 6000, wyposażonym w detektor germanowy chłodzony ciekłym azotem. Do wzbudzenia próbek użyto lasera Nd +3 :YAG (granat itrowo-glinowy domieszkowany jonami Nd +3 ) o linii 1064 nm. Widma rejestrowano w geometrii 180 o przy rozdzielczość 4 cm -1 i liczbie 512 skanów. Spektroskopia powierzchniowo wzmocnionego efektu Ramana, SERS. Roztwory koloidalnego srebra przygotowano według standardowej procedury [11]. Kroplę wodnego roztworu badanych peptydów o stężeniu ~10-5 M dodano do 0.5 ml koloidu srebra. Widma SERS wykonano na trójsiatkowym spektrometrze Ramana NRS-2100 (JASCO, Japonia) wyposażonym w detektor CCD chłodzony ciekłym azotem (model LN-CCD1100, Princeton Instruments). Jako źródła promieniowania użyto lasera Ar-jonowego emitującego linię ciągłą 514.5 nm (model 2016, Spectra-Physics). Moc promieniowania przy wyjściu z lasera wynosiła 100 mw. Widma rejestrowano przy rozdzielczość 4 cm -1. Dyskusja wyników Tabela 1 podaje strukturę pierwszorzędową nocyceptyny i jej fragmentów: OFQ/N(1-13), OFQ/N(1-11) i OFQ/N(1-6). Widma FT-RS: OFQ/N, OFQ/N(1-13), OFQ/N(1-11) i OFQ/N(1-6) w zakresie częstości od 1750 do 900 cm -1 przedstawiono na rysunku 1. Natomiast na rysunku 2 zaprezentowano widma SERS (w tym samym obszarze częstości) tych peptydów. Częstości obserwowanych pasm wraz z ich proponowanym przypisaniem odpowiednim drganiom Tabela 1. Struktura pierwszorzędowa OFQ/N i jej wybranych fragmentów. Nazwa Sekwencja OFQ/N Phe-Gly-Gly-Phe-Thr-Gly-Ala-Arg-Lys-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Ala-Asn-Gln OFQ/N(1-13) Phe-Gly-Gly-Phe-Thr-Gly-Ala-Arg-Lys-Ser-Ala-Arg-Lys OFQ/N(1-11) Phe-Gly-Gly-Phe-Thr-Gly-Ala-Arg-Lys-Ser-Ala OFQ/N(1-6) Phe-Gly-Gly-Phe-Thr-Gly Analiza widm FT-RS Prezentowane widma FT-RS (Rys. 1) czterech badanych peptydów zdominowane są przez pasma charakterystycznych drgań pierścienia aromatycznego fenyloalaniny (Phe), które obserwowane są przy około 1003, 1032, 1184, 1202, i 1605 cm -1 (Tab. 2). Pasmom tym odpowiadają kolejno drgania: drganie symetryczne oddychające pierścienia fenylowego (ν 12 ), drganie zginające C-H w płaszczyźnie pierścienia fragmentów (ν 18a ), drganie kombinacyjne (drgania rozciągające pierścienia aromatycznego Phe z drganiami zginającymi grup C-H tego pierścienia) (ν 9a ), drganie rozciągające wiązania C-C 6 H 5 (ν 7a ) i dwa drgania rozciągające w płaszczyźnie wiązań C=C w pierścienia aromatycznego (ν 8b i ν 8a ). Dodatkowo, w widmach tych, w obszarze częstości 900-1150 cm -1, występują pasma drgań rozciągających wiązań C-C (ν(c-c)) i C-N (ν(c-n)) (Tab. 2). Częstości tych pasm nie są zbyt czułe na zmiany konformacyjne łańcucha peptydowego, ν(c-c) obserwowane jest przy około 939 cm -1, podczas gdy ν(c-n) pojawia się w widmach Ramana przy około 1100 cm -1. Intensywne, poszerzone pasmo obserwowane przy 1444 cm -1 w widmie FT- RS OFQ/N przypisano do drgań deformacyjnych grup -CH 2 (δ(ch 2 )). Dwa inne, w miarę intensywne pasma występujące przy około 1318 i 1334 cm -1 pochodzą od drgań wahadłowych grup -CH 2 - i -CH 3. 175 176
1003 struktura typu β daje pasmo amidu I powyżej 1680 cm -1 i intensywne pasmo amidu III w zakresie częstości 1230-1240 cm -1. 1674 1672 1671 1659 1605 1605 1606 1605 1440 1442 1443 1444 1347 1326 1286 1700 1600 1500 1400 1300 1200 1100 1000 900 Przesuniecie ramanowskie [cm-1] 1247 1320 1295 1279 1240 1334 1318 1278 1205 1184 1158 1245 1203 1184 1158 1206 1182 1202 1159 1118 1094 1184 1158 1103 1088 1105 1099 Rys. 1. Widma FT-RS OFQ/N(1-6) (A), OFQ/N(1-11) (B), OFQ/N(1-13) (C) i OFQ/N 1031 1032 1032 1032 (D) w zakresie częstości od 1750 do 900 cm -1. Strukturę przestrzenną wiązania peptydowego, CO-NH-, można scharakteryzować w oparciu o tzw. pasma amidowe nazwane odpowiednio: A, B i I-VII. Spośród tych drgań, najbardziej charakterystyczne w widmach Ramana do określenia struktury drugorzędowej peptydów i białek są drgania amidu I (ν(c=o)+δ(nh)) i amidu III (ν(cn)+δ(nh)+ν(c=o)) [15]. Często ze względu na złożoność struktury drugorzędowej widma Ramana peptydów i białek wykazują kilka składowych drgań amidowych. Analiza ich częstości i intensywności pozwala na scharakteryzowanie różnych konformacji łańcucha polipeptydowego [16]. Zazwyczaj, strukturze α-helikalnej odpowiadają niskiej intensywności pasma amidów I i III obserwowane w zakresach, odpowiednio, 1640-1658 cm -1 974 946 939 939 A B C D i 1265-1300 cm -1. Struktura nieregularna (nieuporządkowana) charakteryzuje się pasmem amidu I występującym przy około 1660-1670 cm -1 i poszerzonym pasmem amidu III przy 1243-1253 cm -1. Natomiast, Tabela 2. Częstości obserwowanych pasm w widmach FT-RS i SERS OFQ/N, OFQ/N(1- cm -1 13), OFQ/N(1-11) i OFQ/N(1-6) wraz z ich proponowanym przypisaniem odpowiednim drganiom. Częstość (cm -1 ) OFQ/N OFQ/N(1-13) OFQ/N(1-11) OFQ/N(1-6) Przypisanie FT-RS SERS FT-RS SERS FT-RS SERS FT-RS SERS 1671 1672 1674 Amid I (nieregularna) 1659 1624 1625 1625 Amid I (α-helisa) 1605 1606 1601 1605 1605 Phe (ν 8a ) 1585 1580 1584 1582 Phe (ν 8b ) 1565 1571 1564 ν as (COO - ) 1538 1534 1541 1536 Amid II 1444 1446 1443 1443 1442 1440 1429 δ(ch 2 ) 1403 1384 1403 1408 ν s (COO - ) 1358 1354 1361 1362 ν(c α -NH 2 ) lub/i δ(ch) 1334 1320 1326 1347 ω(ch 2 /CH 3 ) 1318 1302 1295 1303 1293 1278 1279 1277 1288 1286 1286 Amid III (α-helisa) lub/i δ(cc α H) 1252 1245 1247 Amid III (nieregularna) 1240 Amid III (β-kartka) 1202 1218 1206 1208 1203 1218 1205 1214 Phe (ν 7a ) 1184 1182 1184 1184 Phe (ν 9a ) 1158 1159 1158 1158 ν(c α -N) 1172 1164 1170 1170 ν(c α -N) lub/i Phe (ν 9a ) 1103 1118 1094 1088 1105 ν(c-n) 1099 1081 1065 1079 1077 τ(nh 2 ) 1042 1044 1044 ν(c-c) 1032 1032 1031 1032 1031 Phe (ν 18a ) 1003 998 1004 1002 1002 998 1003 997 Phe (ν 12 ) 939 939 974 946 ν(c-c) 932 927 934 934 ν(c-coo - ) W widmie FT-RS OFQ/N (Rys. 1) obserwowane są szerokie pasma przy 1659 i 1278 odpowiadające drganiom amidu I i III. Położenie tych pasm sugeruje, iż OFQ/N przyjmuje głównie konformację α-helisy, jakkolwiek przy obliczeniu II-pochodnej widoczny jest udział zarówno struktury nieuporządkowanej, jak i pofałdowanej typu β. Natomiast, w 177 178
widmach OFQ/N(1-13), OFQ/N(1-11) i OFQ/N(1-6) pasmo amidu I obserwowane jest, odpowiednio, przy 1671, 1672 i 1674 cm -1, co jednoznacznie wskazuje na dominację powierzchni srebra, albo oddziałuje z powierzchnią srebra przyjmując względem niej prawie prostopadłe ułożenie. Dodatkowo, tylko w widmie SERS OFQ/N(1-13) obserwowane są konformacji nieregularnej łańcucha peptydowego. Wynika zatem, iż im krótszy łańcuch pasma drgań pierścienia Phe przy 1031 i 1601 cm -1 (drgania ν 18a i ν 8a ). Pasma przy polipeptydowy, tym większa jego tendencja do przyjmowania struktury nieuporządkowanej. Jednakże w wypadku OFQ/N(1-13) obserwuje się trzy pasma amidu III przy 1279, 1252 i 1240 cm -1, które odpowiadają, odpowiednio, strukturze α-helikalnej, nieregularnej i pofałdowanej typu β. Jakkolwiek struktury α i β stanowią jedynie niewielką część IIrzędowej struktury tego peptydu. Analiza widm SERS Peptydy i białka adsorbują się lub oddziałują z powierzchnią koloidalnego srebra poprzez aminokwasy, które tworzą z powierzchnią metalicznego srebra π-elektronowe około1042-1044 cm -1 i 1354-1361 cm -1 przypisano odpowiednio drganiu rozciągającemu asymetrycznemu C-C α -N (ν as (C-C α -N)) i drganiu złożonemu ν(c α -NH 2 )+δ(ch), co wskazuje, iż grupa końcowa C-NH 2 jest zaangażowana w procesie adsorpcji na koloidalnym srebrze. Wniosek ten jest potwierdzony przez obecność pasma w zakresie 1065 1078 cm -1, które zostało przypisane drganiu kołyszącemu τ(nh 2 ). Należy podkreślić, iż w tych warunkach pomiaru (ph 8.3) nie jest możliwe tworzenie się grupy NH + 3, która również może oddziaływać z powierzchnią koloidu. Natomiast pasma obserwowane przy 1429-1446 cm -1 i 1293-1303 cm -1 związane z drganiami, odpowiednio, deformacyjnymi grup -CH 2 - (δ(ch 2 ) i kompleksy (fenyloalanina (Phe), histydyna (His), tryptofan (Trp) i tyrozyna (Tyr)) lub δ- kompleksy (aminokwasy zawierające niesparowaną parę elektronów, np. His i Trp). Zasadowe aminokwasy, lizyna (Lys) i arginina (Arg) również oddziałują z powierzchnią srebra, lecz wyłącznie w wysokich ph. Natomiast, kwas asparaginowy (Asp) i glutaminowy (Glu), czy C-końcowa grupa łańcucha polipeptydowego oddziałują z metalicznym srebrem jedynie po deprotonacji grupy karboksylowej. W warunkach zasadowego ph, a zatem w warunkach przeprowadzonego eksperymentu należy spodziewać się udziału grupy molekularnej COO - w oddziaływaniu z powierzchnią metalicznego srebra. Prezentowane widma SERS OFQ/N i jej OFQ/N(1-13), OFQ/N(1-11) i OFQ/N(1-6) 1625 1625 1624 1584 1582 1571 1564 1541 1536 1429 1601 1580 1585 1565 1534 1538 1443 1446 1408 1403 1403 1362 1361 1384 1354 1358 1293 1286 1303 1288 1302 1277 1214 1218 1208 1218 1170 1170 1164 1065 1172 1077 1044 1079 1044 1042 997 998 1031 1002 998 932 927 934 934 A B C D fragmentów (Rys. 2) podobnie, jak ich widma FT-RS, zawierają pasma charakterystycznych drgań pierścienia fenylowego: ν 12, ν 9a, ν 7a i ν 8b, które obserwowane są, odpowiednio, przy około 998, 1172, 1218 i 1585 cm -1. Niska intensywność tych pasm, szczególnie pasma drgania ν 12 wskazuje, iż pierścień fenylowy albo znajduje się w pewnej odległości od 1700 1600 1500 1400 1300 1200 1100 1000 900 Przesuniecie ramanowskie [cm-1] Rys. 2. Widma SERS OFQ/N(1-6) (A), OFQ/N(1-11) (B), OFQ/N(1-13) (C) i FQ/N (D) zaadsorbowanych na powierzchni koloidalnego srebra w zakresie częstości od 1750 do 900 cm -1. 179 180
wahadłowymi grup -CH 2 - i CH 3 (ω(ch 2 /CH 3 )), wskazują, iż łańcuchy badanych peptydów układają się równolegle do powierzchni srebra. W widmach SERS wszystkich czterech omawianych peptydów (Rys. 2), w zakresie częstości 1384-1408 cm -1, obserwowane są niskiej intensywności pasma drgań symetrycznych grupy karbonylowej (ν s (CCO - )). Pojawienie się tych pasm w widmach SERS świadczy o oddziaływaniu zdeprotonowanej C-końcowej grupy z powierzchnią koloidalnego srebra. Potwierdzeniem faktu, iż zdeprotonowana grupa karboksylowa wiąże się do powierzchni koloidu jest obecność pasm przy 1565 i 932 cm -1. Pasma te przypisane są odpowiednio drganiom rozciągającym asymetrycznym grupy karbonylowej (ν as (CCO - )) i rozciągającym wiązań C-COO - (ν(c-cco - )). Pasma drgań amidu I w widmach SERS obserwowane są przy około 1625 cm -1, a drgań amidu III w zakresie częstości 1277-1286 cm -1. Pochodzą one przede wszystkim od drgań struktury α-helikalnej. Potwierdza to nasze wcześniejsze badania, iż peptydy i białka najchętniej adsorbują się na powierzchni srebrnego koloidu poprzez fragmenty o strukturze α- helisy [14]. Dodatkowo, w widmach SERS obserwowane są pasma amidu II, który jest charakterystyczny dla widm absorpcyjnych w podczerwieni (widm IR). Pasma te występują przy około 1564-1571 cm -1 i są także charakterystyczne dla struktury α. Podsumowanie Badania przy wykorzystaniu spektroskopii FT-RS czterech peptydów wykazały, iż tylko OFQ/N przyjmuje konformację α-helisy. Natomiast jej OFQ/N(1-13), OFQ/N(1-11) i OFQ/N(1-6) fragmenty przyjmują głównie strukturę nieuporządkowaną. Dodatkowo, badania techniką SERS pokazały, iż grupy C-końcowe łańcucha polipeptydowego, NH 2 (Nkońcowa, Arg, Lys, Asn lub/i Gln) i CH 3 (Thr, Ala lub/i Leu) oraz pierścień aromatyczny powierzchnia. Co więcej, z analizy intensywności pasma drgania ν 12 wynika, iż pierścień Phe przyjmuje prawie prostopadłe ułożenie względem powierzchni srebra. Dodatkowo, wszystkie badane związki wiążą się do powierzchni srebra przez zdeprotonowaną grupę karboksylową. Literatura [1.] Reinscheid R.K., Nothecher H.P., Bourson A., Henningen R.A., Bunzow J.R., Grandy D.K., Langen H., Mousma F., Civelli O. (1995) Orphanin FQ: A Neuropeptide That Activates an Opioidlike G Protein-Coupled Receptor, Science, 270, 792-794. [2.] Meunier J.-C., Mollereau J.C., Toll L., Snaudeau C., Moisand Ch., Alvinerie P., Butour J- C., Guillenat J.C., Ferrara P., Monsarrat B., Mazarguil H., Vassart G., Parmetier M., Constentin J. (1995) Isolation and structure of the endogenous agonist of opioid receptorlike ORL1 receptor, Nature, 377, 532-535. [3.] Salvadori S., Guerrini R., Calo G., Regoli D. (1999) Structure activity studies on nociceptin/orphanin FQ: from full agonist, to partial agonist, to pure antagonist, Il Farmaco, 54, 810-825. [4.] Barlocco D., Cignarella G., Giardina G.A.M., Toma L. (2000) The opioid-receptor-like 1 (ORL-1) as a potential target for new analgesics, Eur. J. Med. Chem, 35, 275-282. [5.] Kotlińska J., Suder P., Ściubisz A., Łęgowska A., Eilmes J., Rolka K., Silberring J. (2001) C-Terminal Glycine is Crucial for Hyperalgesic Activity of Nociceptin/Orphanin FQ-(1-6), Eur. J. Pharmacol., 419, 33-37. [6.] Kotlińska J., Suder P., Łegowska A., Rolka K., Silberring J. (2000) Orphanin FQ/Nociceptin Inhibits Morphine Withdrowal, Life Sci, 66, 119-123. [7.] Meunier J.-C. (1997) Nociceptin/orphanin FQ and the opioid receptor-like ORL1 receptor, Eur. J. Pharmacol., 340, 1-15. fenloalaniny są w bliskim sąsiedztwie powierzchni koloidalnego srebra lub oddziałują z jego 181 182
[8.] Butour J.-L., Moisand Ch., Mazarguil H., Mollereau C., Meunier J.-C. (1997) Recognition and activation of the opioid receptor-like ORL1 receptor by nociceptin analogs and opioids, Eur. J. Pharmacol., 321, 97-103. [9.] Suder P., Kotlińska J., Smoluch M.T., Sallberg M., Silberring J. (1999) Metabolic fate of nociceptin/orphanin FQ in the rat spinal cord and biological activity of its released fragment, Peptides, 20, 239-247. [10.] Colaianni S.E.M., Aubard J., Hansen S.H., Nielsen O.F. (1995) Raman spectroscopic studies of some biochemically relevant molecules, Vib. Spectrosc., 9, 111-120. [11.] Podstawka E., Ozaki Y., Proniewicz L.M. (2004) Part I: Surface enhanced Raman spectroscopy investigation of amino acids and their homodipeptides adsorbed on colloidal silver, Appl. Spectrosc., 58, 570-580. [12.] Sällberg M., Ruden U., Magnius L.O., Norrby E., Wahren B. (1991) Rapid "tea-bag" peptide synthesis using 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) protected amino acids applied for antigenic mapping of viral proteins, Immunol. Lett., 30, 59-68. [13.] Podstawka E., Ozaki Y., Proniewicz L.M. (2004) Part II: Surface enhanced Raman spectroscopy investigation of heterodipeptides containing methionine adsorbed on colloidal silver, Appl. Spectrosc., 58, 581-590. [14.] Podstawka E., Ozaki Y., Proniewicz L.M. (2004) Adsorption of S-S containing proteins on a colloidal silver surface studied by surface enhanced Raman spectroscopy, Appl. Spectrosc., 58, w druku. [15.] Schweitzer-Stenner R. (2002) Dihedral Angles of Tripeptides in Solution Directly Determined by Polarized Raman and FTIR Spectroscopy, Biophys. J., 83, 523-532. [16.] Haris P.I., Severcan F. (1999) FTIR spectroscopic characterization of protein structure in aqueous and non-aqueous media, J. Mol. Catal. B, 7, 207-221. 183