RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 209469 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 374767 (22) Data zgłoszenia: 29.04.2005 (51) Int.Cl. C07H 21/04 (2006.01) C12N 9/38 (2006.01) C12R 1/84 (2006.01) C12N 15/04 (2006.01) (54) Startery oligonukleotydowe, sekwencja DNA, wektor plazmidowy, wektor ekspresyjny, rekombinantowy szczep Pichia pastoris i jego sposób otrzymywania oraz sposób wytwarzania termostabilnej β-d-galaktozydazy Pyrococcus woesei (73) Uprawniony z patentu: POLITECHNIKA GDAŃSKA, Gdańsk, PL (43) Zgłoszenie ogłoszono: 30.10.2006 BUP 22/06 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 30.09.2011 WUP 09/11 (72) Twórca(y) wynalazku: JÓZEF KUR, Wejherowo, PL MARTA WANARSKA, Lębork, PL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Popławski Czesław POLITECHNIKA GDAŃSKA PL 209469 B1
2 PL 209 469 B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku są startery oligonukleotydowe, a także sekwencja DNA, wektor plazmidowy, wektor ekspresyjny, rekombinantowy szczep Pichia pastoris i jego sposób otrzymywania oraz sposób wytwarzania termostabilnej β-d-galaktozydazy Pyrococcus woesei. Znane są β-d-galaktozydazy, które są enzymami syntetyzowanymi przez komórki ssaków, roślin, drożdży, grzybów strzępkowych i bakterii. W zależności od źródła, z którego pochodzą enzymy te różnią się masą cząsteczkową, ilością podjednostek wchodzących w skład natywnej cząsteczki, wartościami optymalnej temperatury i ph działania, a także zapotrzebowaniem na jony metali niezbędne dla aktywności enzymu lub/i stabilizowania jego struktury. Aktywność β-d-galaktozydaz zazwyczaj wzrasta, gdy w buforze reakcyjnym znajdują się jony potasu, sodu i magnezu. Jony metali ciężkich działają zaś, jako inhibitory. Enzymy te posiadają zdolność katalizowania reakcji hydrolizy laktozy, dlatego wykorzystuje się je głównie w procesach produkcji mleka o niskiej zawartości laktozy, przeznaczonego dla osób cierpiących z powodu nietolerancji tego disacharydu. β-d-galaktozydazy pochodzące z mikroorganizmów mezofilnych, grzybów strzępkowych z rodzaju Aspergillus i drożdży z rodzaju Kluyveromyces, od dawna stosowane są w przemysłowej produkcji mleka o obniżonej zawartości laktozy i przetwórstwie serwatki. Enzymy te znalazły też zastosowanie w produkcji oligosacharydów - należących do grupy prebiotyków - składników żywności funkcjonalnej. Nie spełniają one jednak do końca wymogów nowoczesnych biotechnologii pod względem aktywności i stabilności w warunkach prowadzenia procesu technologicznego. Stąd, poszukuje się nowych, wydajnych producentów β-d-galaktozydaz, w tym termostabilnych. Od około 30 lat trwają prace nad izolacją i charakterystyką enzymów pochodzących z organizmów termofilnych. W 1972 roku została opisana termostabilna β-d-galaktozydaza wyizolowana z komórek termofilnej bakterii Thermus sp. T2. Enzym miał masę cząsteczkową 570 kda. β-galaktozydaza Thermus sp. T2 jest kodowana przez gen bgaa. Polipeptyd będący produktem tego genu składa się z 645 reszt aminokwasowych, a jego obliczona na podstawie sekwencji aminokwasowej masa cząsteczkowa wynosi 73,595 kda, co sugeruje, że enzym w formie natywnej jest oktamerem. Optymalne warunki działania enzymu to 80 C i ph = 5,0. Termostabilna β-d-galaktozydazę wyizolowano również z komórek bakterii Thermus sp. 4-1 A. Masa cząsteczkowa enzymu wynosiła 440 kda. β-d-galaktozydaza ze szczepu Thermus 4-1A jest wysoce termostabilnym enzymem. Po 20 godzinach inkubacji w 80 C zachowuje 83% początkowej aktywności. Scharakteryzowano również enzym wyizolowany z komórek termofilnych bakterii Thermus sp. A4. Stwierdzono, że natywna cząsteczka enzymu jest trimerem. Optymalne ph działania tej β-d- -galaktozydazy wynosi 6,5. Za optymalną temperaturę uznano 70 C, gdyż w tej temperaturze enzym jest całkowicie stabilny i nawet po 20 godzinach inkubacji zachowuje pełną aktywność. Termostabilna β-d-galaktozydazę wykazującą aktywność transglikozylacyjną wyizolowano z komórek Thermus aquaticus YT-I. Enzym ten ma niezwykle dużą masę cząsteczkową przekraczającą 700 kda. Natomiast masa cząsteczkowa jednej podjednostki wynosi 59 kda. Optymalne warunki działania tej P-D-galaktozydazy to ph = 5,5 i 80 C. Źródłem termostabilnej β-d-galaktozydazy mogą być też termofilne grzyby Rhizomucor sp., bakterie Bacillus coagulans RCS3 lub mezofilne drożdże Sterigmatomyces elviae CBS8119. Termostabilne grzyby strzępkowe Rhizomucor sp. produkują zewnątrzkomórkową β-d-galaktozydazę o masie cząsteczkowej 250 kda. Enzym jest glikoproteiną i występuje w postaci dimeru. Optymalne warunki jego działania to ph = 4,5 i temperatura 60 C. Zewnątrzkomórkową termostabilna β-d-galaktozydaza produkowana jest również przez termofilny szczep Bacillus coagulans RCS3. Maksymalną aktywność enzym wykazuje w temperaturze 65 C i ph = 6,8. Pozostaje ona na wysokim poziomie w ph = 6,0-7,0 i temperaturze 63-67 C. Termostabilna β-d-galaktozydaza syntetyzowana w komórkach Sterigmatomyces elviae CBS8119 związana jest ze ścianą komórkową mikroorganizmu. Masa cząsteczkowa enzymu wynosi 170 kda. W formie natywnej jest on dimerem złożonym z podjednostek o masie cząsteczkowej 86 kda. Optymalne ph działania β-d-galaktozydazy obejmuje zakres 4,5-5,0. Najwyższą aktywność enzym uzyskuje w 85 C w ph = 5,0. Enzym o aktywności β-d-galaktozydazy wyizolowano również z komórek hypertermostabilnego archaeona Sulfolobus solfataricus. Masa cząsteczkowa tej β-d-galaktozydazy wynosi 240 kda.
PL 209 469 B1 3 W formie natywnej enzym jest tetrametrem złożonym z podjednostek o masie 60 kda. Najwyższą aktywność w reakcji z ONPG wykazuje w temperaturze 95 C i ph = 6,5. Enzym charakteryzuje się szerokim spektrum substratowym. Katalizuje hydrolizę wiązań glikozydowych w syntetycznych β-d- -galaktozydach, β-d-glukozydach i β-d-fukozydach. Wykazuje również aktywność hydrolityczną w stosunku do laktozy, celobiozy i oligomerów glukozy o stopniu polimeryzacji 3 i 4 (aktywność egzoglukozydazy). Szerokim spektrum substratowym charakteryzuje się również termostabilny enzym z archaeona Pyrococcus furiosus. Wykazuje on jednak wyższą aktywność hydrolityczną w stosunku do β-d-glukozydów syntetycznych i naturalnych (p-nitrofenylo-β-d-glukopiranozyd, celobioza), niż β-d- -galaktozydów (p-nitrofenylo-β-d-galaktopiranozyd, laktoza). Z tego względu został zakwalifikowany do β-d-glukozydaz. Mimo to prowadzono badania nad wykorzystaniem obu hydrolaz glikozydowych (β-d-galaktozydazy z S. solfataricus i β-d-glukozydazy z P. furiosus) zarówno do hydrolizy laktozy, jak i syntezy oligosacharydów z laktozy w wysokiej temperaturze. Geny kodujące termostabilne enzymy z Thermus sp. T2, S. solfataricus, czy P. furiosus klonowano w komórkach E. coli. Prowadzono również wydajną biosyntezę termostabilnych enzymów w komórkach mezofilnego gospodarza i wykazano, że rekombinowane białka mają zbliżone właściwości do enzymów wyizolowanych z naturalnego źródła. Skonstruowano układ ekspresyjny pozwalający na wydajną biosyntezę termostabilnej β-d- -galaktozydazy z hypertermofilnego archaeona Pyrococcus woesei (DSM 3773) w komórkach E. coli. Gen kodujący termostabilne białko został zidentyfikowany i zsekwencjonowany. Na podstawie sekwencji nukleotydowej genu ustalono sekwencję aminokwasową kodowanego polipeptydu. Obliczona masa cząsteczkowa jednej podjednostki enzymu wynosi 59,056 kda. β-d-galaktozydaza została częściowo oczyszczona i scharakteryzowana. Najwyższą aktywność enzymu uzyskano w ph = 5,4 i 93 C. Białko produkowane w komórkach E. coli jest też wysoce termostabilne. Po 4-godzinnej inkubacji w 85, 93, 100 i 105 C traci odpowiednio 11, 15, 65 i 94% początkowej aktywności. Skonstruowano również drugi układ ekspresyjny pozwalający na biosyntezę β-d-galaktozydazy z P. woesei w E. coli w postaci białka fuzyjnego zawierającego domenę oligohistydynową na N-końcu łańcucha polipeptydowego. Wysoce oczyszczony, metodą chromatografii metalopowinowactwa, preparat fuzyjnego białka charakteryzuje się podobną termostabilnością jak enzym w formie dzikiej. Optymalna temperatura jego działania wynosi 90 C. Porównanie aktywności obu preparatów białkowych w reakcji z ON-PG w temperaturze 85 C wykazało jednak, że enzym w postaci fuzyjnej ma znacznie niższą aktywność właściwą. Wynalazek stanowią startery oligonukleotydowe do reakcji amplifikacji DNA o wzorze 1 i o symbolach Sygalfal i SygB2. Wynalazek stanowi także sekwencja DNA otrzymana w wyniku amplifikacji DNA z zastosowaniem starterów o wzorze 1, zawierająca fragment DNA kodujący termostabilna β-d-galaktozydazę Pyrococcus woesei, zawierająca fragment DNA rozpoznawany przez enzym restrykcyjny XhoI, zawierająca fragment DNA rozpoznawany przez enzym restrykcyjny Hindlll, zawierająca fragment DNA rozpoznawany przez enzym restrykcyjny Xbal, o wzorze 2. Wynalazek stanowi również wektor plazmidowy zawierający wklonowane DNA z fragmentem kodującym termostabilna β-d-galaktozydazę Pyrococcus woesei, z fragmentami DNA rozpoznawanymi przez enzymy restrykcyjne XhoI, Hindlll i Xbal, z promotorem arabad, z miejscami regulatorowymi O 1, O 2, I 1 i I 2 dla białka regulatorowego AraC, z miejscem wiązania białka CAP, z miejscem wiązania rybosomów rbs, z genem oporności na ampicylinę, z origin plazmidu pbr322, z genem arac kodującym białko regulatorowe AraC, o wzorze 3 i o symbolu pbad-topo-αβ-gal. Wynalazkiem jest też wektor ekspresyjny zawierający fragment DNA kodujący peptyd sygnalny a-faktor z Saccharomyces cerevisiae połączony z genem termostabilnej β-d-galaktozydazy Pyrococcus woesei pod regulacyjną kontrolą silnego promotora AOX1, z fragmentem DNA kodującym sekwencję aminokwasową rozpoznawaną przez proteazę Kex2, z terminatorem transkrypcji AOX1 z genem oporności na zeocynę (Sh ble), z syntetycznym prokariotycznym promotorem EM7, z promotorem TEF1 z Saccharomyces cerevisiae, z terminatorem transkrypcji CYC1, z origin ColEl, o wzorze 4 i o symbolu ppiczαβ-gal. Wynalazek stanowi rekombinantowy szczep Pichia pastoris o symbolu Pichia pastoris GS115 ppiczαβ-gal, który stanowią komórki drożdży Pichia pastoris GS115 zawierające gen kodujący β-d- -galaktozydazę Pyrococcus woesei zintegrowany z genomem drożdżowym. Wynalazkiem jest również sposób otrzymywania rekombinantowego szczepu Pichia pastoris o symbolu Pichia pastoris GS115 ppiczap-gal charakteryzujący się tym, że uzyskuje się fragment
4 PL 209 469 B1 DNA kodujący termostabilna β-d-galaktozydazę Pyrococcus woesei o wzorze 2 poprzez amplifikację DNA z zastosowaniem starterów oligonukleotydowych o wzorze 1 i o symbolach Sygalfal i SygB2. Uzyskany fragment DNA klonuje się do wektora plazmidowego pbad-topo firmy Invitrogen, w wyniku czego uzyskuje się wektor plazmidowy o wzorze 3 i o symbolu pbad-topo-αβ-gal. Następnie fragment DNA kodujący termostabilna β-d-galaktozydazę Pyrococcus woesei przeklonowuje się z wektora plazmidowego pbad-topo-αβ-gal o wzorze 3 do wektora plazmidowego ppiczα B firmy Invitrogen, w wyniku czego uzyskuje się wektor ekspresyjny o wzorze 4 i o symbolu ppiczαβ-gal. Otrzymanym DNA wektora ekspresyjnego ppiczαβ-gal o wzorze 4 transformuje się komórki Pichia pastoris GS115, w wyniku czego uzyskuje się rekombinantowy szczep Pichia pastoris o symbolu Pichia pastoris GS115 ppiczαβ-gal. W wariancie realizacji tego wynalazku, DNA wektora ekspresyjnego ppiczαβ-gal o wzorze 4 transformuje się komórki Pichia pastoris SMD1168, w wyniku czego uzyskuje się rekombinantowy szczep Pichia pastoris o symbolu Pichia pastoris SMD1168 ppiczαβ-gal. W innym wariancie realizacji tego wynalazku, DNA wektora ekspresyjnego ppiczαβ-gal o wzorze 4 transformuje się komórki Pichia pastoris KM71, w wyniku czego uzyskuje się rekombinantowy szczep Pichia pastoris o symbolu Pichia pastoris KM71 ppiczαβ-gal. Wynalazkiem jest również sposób wytwarzania termostabilnej β-d-galaktozydazy Pyrococcus woesei polegający na zewnątrzkomórkowej produkcji enzymu przez komórki rekombinantowego szczepu drożdży w pożywkach płynnych charakteryzujący się tym, że prowadzi się hodowlę komórek szczepu drożdży o symbolu Pichia pastoris GS115 αβ-gal w temperaturze 28-30 C, a następnie izoluje się białka z płynu pohodowlanego na drodze wysalania siarczanem amonu, przy czym proces prowadzi się do uzyskania 60-70% nasycenia płynu pohodowlanego siarczanem amonu, po czym oddziela się osady białkowe i rozpuszcza się je w 0,05-0,1 M buforze fosforanowym o ph 6,0-7,0, odsala się na drodze dializy, a następnie uzyskaną termostabilna β-d-galaktozydazę Pyrococcus woesei oczyszcza się na drodze strącania termicznego innych obecnych w preparacie białek w temperaturze 70-80 C przez 30-60 minut. Dzięki wykorzystaniu wynalazku uzyskuje się układ ekspresyjny umożliwiający wydajną produkcję termostabilnej β-d-galaktozydazy Pyrococcus woesei w komórkach drożdży Pichia pastoris, przy czym produkcja ta jest znacznie bardziej wydajna od biosyntezy enzymu w komórkach bakterii. Sposób według wynalazku pozwala na uzyskanie preparatów białkowych o stopniu czystości przekraczającym 90%. Uzyskana według wynalazku rekombinowana β-d-galaktozydaza Pyrococcus woesei zachowuje 60% maksymalnej aktywności w buforze o ph = 6,6 (ph mleka), co umożliwia zastosowanie w przemysłowej produkcji mleka o obniżonej zawartości laktozy. Dodatkowo korzystną cechą rekombinowanej β-d-galaktozydazy Pyrococcus woesei jest to, iż obecność występujących w mleku jonów wapnia nie wpływa na jej aktywność. Wynalazek objaśniony jest bliżej w przykładach wykonania i na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia fragment DNA o wzorze 2 z zaznaczeniem sekwencji genu termostabilnej β-d-galaktozydazy Pyrococcus woesei i fragmentów DNA rozpoznawanych przez enzymy restrykcyjne XhoI, Hindlll i Xbal, fig. 2 przedstawia schemat uzyskania wektora plazmidowego o wzorze 3 i o symbolu pbad- -TOPO-αβ-gal, fig. 3 przedstawia sekwencję nukleotydową wektora plazmidowego pbad-topo-αβ- -gal w rejonie klonowania fragmentu DNA o wzorze 2, fig. 4 przedstawia schemat uzyskania wektora ekspresyjnego o wzorze 4 i o symbolu ppiczαβ-gal, fig. 5 przedstawia sekwencję nukleotydową wektora ekspresyjnego o wzorze 4 i o symbolu ppiczαβ-gal w rejonie insercji genu kodującego β-d- -galaktozydazę Pyrococcus woesei oraz sekwencję aminokwasową białka powstającego w komórkach Pichia pastoris GS 115 transformowanych DNA wektora ekspresyjnego ppiczαβ-gal, fig. 6 przedstawia wynik rozdziału elektroforetycznego w 10% żelu poliakrylamidowym frakcji pochodzących z kolejnych etapów izolacji i oczyszczania β-d-galaktozydazy Pyrococcus woesei produkowanej przez rekombinantowy szczep Pichia pastoris GS 115 ppiczαβ-gal, zaś tabela 1 przedstawia wyniki oznaczeń aktywności i stężenia β-d-galaktozydazy Pyrococcus woesei w preparatach uzyskanych w wyniku izolacji i oczyszczania enzymu produkowanego przez rekombinantowy szczep Pichia pastoris GS115 ppiczαβ-gal. P r z y k ł a d 1 Otrzymywanie sekwencji DNA kodującej termostabilna β-d-galaktozydazę Pyrococcus woesei. W celu amplifikacji DNA kodującego termostabilna β-d-galaktozydazę Pyrococcus woesei syntetyzuje się startery oligonukleotydowe o wzorze 1 i o symbolach Sygalfal i SygB2. Reakcję amplifikacji
PL 209 469 B1 5 DNA kodującego termostabilna β-d-galaktozydazę Pyrococcus woesei wykonuje się z użyciem starterów Sygalfal (0,2 µm) i SygB2 (0,2 µm) na matrycy DNA plazmidu pgal2 (0,2 µg) (S. Dąbrowski, J. Maciuńska, J. Synowiecki Cloning and nucleotide sequence of the thermostable β-galactosidase gene from Pyrococcus woesei in Escherichia coli and some properties of the isolated enzyme, (1998), Mol. Biotechnol., 10, 217-222) w buforze zawierającym: 20 mm Tris-HCl ph 8,8, 10 mm KCl, 10 mm (NH 4 ) 2 SO 4, 2 mm MgSO 4, 0,1% Triton X-100, 250 µm każdego z trifosforanów deoksyrybonukleozydów (dntp) i 1 U polimerazy DNA Pwo produkowanej przez DNA-Gdańsk II s.o, Gdańsk, Polska. Reakcję przeprowadza się w termocyklerze w następujących warunkach temperaturowo-czasowych: 93 C - 1 minuta, 66 C - 1 minuta, 72 C - 2 minuty; 30 cykli. W wyniku reakcji amplifikacji uzyskuje się fragment DNA o wzorze 2. Fragment DNA o wzorze 2 z dokładnym zaznaczeniem sekwencji genu termostabilnej β-d-galaktozydazy Pyrococcus woesei i fragmentów DNA rozpoznawanych przez enzymy restrykcyjne XhoI, Hindlll i Xbal ilustruje fig. 1. P r z y k ł a d 2. Otrzymywanie wektora plazmidowego o wzorze 3 i o symbolu pbad-topo-αβ-gal. Schemat uzyskania wektora plazmidowego o wzorze 3 i o symbolu pbad-topo-αβ-gal ilustruje fig. 2. W celu uzyskania wektora plazmidowego pbad-topo-αβ-gal przeprowadza się klonowanie fragmentu DNA o wzorze 2 do wektora plazmidowego pbad-topo firmy Invitrogen, Carlsbad, Kalifornia, USA, przy pomocy zestawu pbad TOPO TA Expression Kit firmy Invitrogen. Postępuje się zgodnie z procedurą klonowania, proponowaną przez producenta zestawu, dla fragmentów DNA zakończonych tępymi końcami. Następnie mieszaniną reakcyjną transformuje się komórki Escherichia coli TOP10 i wysiewa na podłoże LA zawierające 100 µg/ml ampicyliny. Uzyskane kolonie bakteryjne zawierające wektory plazmidowe przesiewa się na pożywkę LB z dodatkiem 100 µg/ml ampicyliny i hoduje się w celu izolacji DNA plazmidowego. W wyniku izolacji uzyskuje się DNA wektora plazmidowego o wzorze 3 i o symbolu pbad-topo-αβ-gal, który zawiera wklonowany gen kodujący termostabilna β-d-galaktozydazę Pyrococcus woesei, co potwierdza się poprzez analizę restrykcyjną i sekwencjonowanie DNA metodą Sangera. Dokładną sekwencję nukleotydową wektora plazmidowego pbad-topo-αβ-gal w rejonie klonowania fragmentu DNA o wzorze 2 ilustruje fig. 3. P r z y k ł a d 3. Otrzymywanie wektora ekspresyjnego o wzorze 4 i o symbolu ppiczαβ-gal. Schemat uzyskania wektora ekspresyjnego o wzorze 4 i o symbolu ppiczαβ-gal ilustruje fig. 4. W celu uzyskania wektora ekspresyjnego ppiczαβ-gal przeprowadza się reakcję ligacji fragmentu DNA o wielkości 3506 par zasad powstałego w wyniku trawienia plazmidu ppiczα B firmy Invitrogen enzymami restrykcyjnymi XhoI i Xbal z fragmentem DNA o wielkości 1549 par zasad powstałym po trawieniu wektora plazmidowego pbad-topo-αβ-gal o wzorze 3 enzymami restrykcyjnymi XhoI i Xbal, w temperaturze 17 C przez 3 godziny z użyciem 2U DNA ligazy faga T4, stosując bufor reakcyjny: 33 mm Tris-CH 3 COOH ph 7,8, 10 mm (CH 3 COO) 2 Mg, 66 mm CH 3 COOK, 0,5 mm DTT, 1 mm ATP. Następnie mieszaniną ligacyjną transformuje się komórki Escherichia coli TOP 10 i wysiewa na podłoże LA niskosolne zawierające 25 µg/ml zeocyny. Uzyskane kolonie bakteryjne zawierające wektory ekspresyjne przesiewa się na pożywkę LB niskosolną z dodatkiem 25 µg/ml zeocyny i hoduje się w celu izolacji DNA plazmidowego. W wyniku izolacji uzyskuje się DNA wektora ekspresyjnego o wzorze 4 i o symbolu ppiczαβ-gal, który zawiera fragment DNA kodujący peptyd sygnalny α-faktor z Saccharomyces cerevisiae połączony z genem β-d-galaktozydazy Pyrococcus woesei pod regulacyjną kontrolą silnego promotora AOX1 przedstawionego na fig. 5, co potwierdza się poprzez analizę restrykcyjną i sekwencjonowanie DNA metodą Sangera. P r z y k ł a d 4. Otrzymywanie rekombinantowego szczepu Pichia pastoris o symbolu Pichia pastoris GS115 ppiczαβ-gal. W celu uzyskania rekombinantowego szczepu Pichia pastoris GS115 ppiczαβ-gal wykonuje się transformację komórek Pichia pastoris GS115 liniową formą DNA plazmidu ekspresyjnego pp- ICZαβ-gal o wzorze 4 powstałą w wyniku trawienia DNA plazmidu ppiczαβ-gal enzymem restrykcyjnym Pmel. Komórki drożdży wysiewa się na podłoże YPDS zawierające 100 µg/ml zeocyny, a następnie uzyskane kolonie rekombinantowego szczepu Pichia pastoris GS 115 ppiczαβ-gal przesiewa się na podłoże YPD z dodatkiem 100 µg/ml zeocyny. W celu stwierdzenia obecności genu kodującego termostabilna β-d-galaktozydazę Pyrococcus woesei w obrębie genomu drożdży Pichia pastoris GS115 ppiczαβ-gal wykonuje się izolację genomowego DNA z komórek drożdży, a następnie reakcję amplifikacji DNA z zastosowaniem starterów o wzorze 1 i symbolach Sygalfal i SygB2 zgodnie z przykładem 1.
6 PL 209 469 B1 P r z y k ł a d 5. Otrzymywanie termostabilnej β-d-galaktozydazy Pyrococcus woesei. Uzyskuje się sekwencję DNA kodującą termostabilna β-d-galaktozydazę Pyrococcus woesei o wzorze 2 według przykładu 1. Następnie otrzymuje się wektor plazmidowy o wzorze 3 i o symbolu pbad-topo-αβ-gal zgodnie z przykładem 2. W kolejnym etapie uzyskuje się wektor ekspresyjny o wzorze 4 i o symbolu ppiczαβ-gal według przykładu 3. Następnie otrzymuje się rekombinantowy szczep Pichia pastoris o symbolu Pichia pastoris GS115 ppiczαβ-gal zgodnie z przykładem 4. Szczep hoduje się w pożywce BMGY przez 18 godzin w temperaturze 30 C, a następnie komórki drożdży oddziela się od pożywki poprzez wirowanie. Uzyskane osady komórkowe zawiesza się w pożywce BMMY i hoduje przez 4 doby w temperaturze 30 C, dodając raz na dobę 100% metanolu, do końcowego stężenia w pożywce 0,5%. Następnie komórki drożdży oddziela się od płynu pohodowlanego poprzez wirowanie. Termostabilna β-d-galaktozydazę Pyrococcus woesei izoluje się z pożywki pohodowlanej na drodze wysalania białek siarczanem amonu. Proces prowadzi się do uzyskania 60% stopnia nasycenia płynu pohodowlanego siarczanem amonu. Preparaty uzyskane po rozpuszczeniu osadów białkowych w 0,1 M buforze fosforanowym o ph 6,6 łączy się i odsala na drodze dializy. Termostabilna β-d-galaktozydazę Pyrococcus woesei oczyszcza się następnie na drodze strącania termicznego innych obecnych w preparacie białek w temperaturze 75 C przez 30 minut. Wyniki biosyntezy i oczyszczania β-d-galaktozydazy Pyrococcus woesei analizuje się metodą elektroforezy w 10% żelu poliakrylamidowym w warunkach denaturujących (fig. 6). Aktywność termostabilnej β-d-galaktozydazy Pyrococcus woesei oznacza się w reakcji z ONPG (o-nitrofenylo-β-d-galaktopiranozyd) w temperaturze 85 C. Stężenie białka oznacza się metodą Bradford. Wyniki oznaczeń przedstawia tabela 1, z której wynika, że z 1 litra pożywki otrzymanej po hodowli rekombinantowego szczepu Pichia pastoris GS115 ppiczαβ-gal uzyskuje się 74 mg termostabilnej β-d-galaktozydazy Pyrococcus woesei, co stanowi 37% wszystkich obecnych w płynie pohodowlanym białek. Zastrzeżenia patentowe 1. Startery oligonukleotydowe do reakcji amplifikacji DNA o wzorze 1 i o symbolach Sygalfal i SygB2. 2. Sekwencja DNA otrzymana w wyniku amplifikacji DNA z zastosowaniem starterów o wzorze 1, zawierająca fragment DNA kodujący termostabilna β-d-galaktozydazę Pyrococcus woesei, zawierająca fragment DNA rozpoznawany przez enzym restrykcyjny XhoI, zawierająca fragment DNA rozpoznawany przez enzym restrykcyjny Hindlll, zawierająca fragment DNA rozpoznawany przez enzym restrykcyjny Xbal, o wzorze 2. 3. Wektor plazmidowy zawierający wklonowane DNA z fragmentem kodującym termostabilna β-d-galaktozydazę Pyrococcus woesei, z fragmentami DNA rozpoznawanymi przez enzymy restrykcyjne XhoI, Hindlll i Xbal, z promotorem arabad, z miejscami regulatorowymi O 1, O 2, I 1 i I 2 dla białka regulatorowego AraC, z miejscem wiązania białka CAP, z miejscem wiązania rybosomów rbs, z genem oporności na ampicylinę, z origin plazmidu pbr322, z genem arac kodującym białko regulatorowe AraC, o wzorze 3 i o symbolu pbad-topo-αβ-gal. 4. Wektor ekspresyjny zawierający fragment DNA kodujący peptyd sygnalny α-faktor z Saccharomyces cerevisiae połączony z genem termostabilnej β-d-galaktozydazy Pyrococcus woesei pod regulacyjną kontrolą silnego promotora AOX1, z fragmentem DNA kodującym sekwencję aminokwasową rozpoznawaną przez proteazę Kex2, z terminatorem transkrypcji AOX1 z genem oporności na zeocynę (Sh ble), z syntetycznym prokariotycznym promotorem EM7, z promotorem TEF1 z Saccharomyces cerevisiae, z terminatorem transkrypcji CYC1, z origin ColE1, o wzorze 4 i o symbolu ppi- CZαβ-gal. 5. Rekombinantowy szczep Pichia pastoris o symbolu Pichia pastoris GS115 ppiczαβ-gal, który stanowią komórki drożdży Pichia pastoris GS115 zawierające gen kodujący β-d-galaktozydazę Pyrococcus woesei zintegrowany z genomem drożdżowym. 6. Sposób otrzymywania rekombinantowego szczepu Pichia pastoris o symbolu Pichia pastoris GS115 ppiczαβ-gal, znamienny tym, że uzyskuje się fragment DNA kodujący termostabilna β-d- -galaktozydazę Pyrococcus woesei o wzorze 2 poprzez amplifikację DNA z zastosowaniem starterów oligonukleotydowych o wzorze 1 i o symbolach Sygalfal i SygB2, po czym uzyskany fragment DNA klonuje się do wektora plazmidowego pbad-topo firmy Invitrogen, w wyniku czego uzyskuje się
PL 209 469 B1 7 wektor plazmidowy o wzorze 3 i o symbolu pbad-topo-αβ-gal, a następnie fragment DNA kodujący termostabilna β-d-galaktozydazę Pyrococcus woesei przeklonowuje się z wektora plazmidowego pbad-topo-αβ-gal o wzorze 3 do wektora plazmidowego ppiczα B firmy Invitrogen, w wyniku czego uzyskuje się wektor ekspresyjny o wzorze 4 i o symbolu ppiczαβ-gal, zaś otrzymanym DNA wektora ekspresyjnego ppiczαβ-gal o wzorze 4 transformuje się komórki Pichia pastoris GS 115, w wyniku czego uzyskuje się rekombinantowy szczep Pichia pastoris o symbolu Pichia pastoris GS115 ppic αβ-gal. 7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że DNA wektora ekspresyjnego ppiczαβ-gal o wzorze 4 transformuje się komórki Pichia pastoris SMD1168, w wyniku czego uzyskuje się rekombinantowy szczep Pichia pastoris o symbolu Pichia pastoris SMD1168 ppiczαβ-gal. 8. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że DNA wektora ekspresyjnego ppiczαβ-gal o wzorze 4 transformuje się komórki Pichia pastoris KM71, w wyniku czego uzyskuje się rekombinantowy szczep Pichia pastoris o symbolu Pichia pastoris KM71 ppiczαβ-gal. 9. Sposób wytwarzania termostabilnej β-d-galaktozydazy Pyrococcus woesei polegający na zewnątrzkomórkowej produkcji enzymu przez komórki rekombinantowego szczepu drożdży w pożywkach płynnych, znamienny tym, że prowadzi się hodowlę komórek szczepu drożdży o symbolu Pichia pastoris GS115 ppiczαβ-gal w temperaturze 28-30 C, a następnie izoluje się białka z płynu pohodowlanego na drodze wysalania siarczanem amonu, przy czym proces prowadzi się do uzyskania 60-70% nasycenia płynu pohodowlanego siarczanem amonu, po czym oddziela się osady białkowe i rozpuszcza się je w 0,05-0,1 M buforze fosforanowym o ph 6,0-7,0, odsala się na drodze dializy, a następnie uzyskaną termostabilna β-d-galaktozydazę Pyrococcus woesei oczyszcza się na drodze strącania termicznego innych obecnych w preparacie białek w temperaturze 70-80 C przez 30-60 minut.
8 PL 209 469 B1
PL 209 469 B1 9
10 PL 209 469 B1
PL 209 469 B1 11
12 PL 209 469 B1
PL 209 469 B1 13
14 PL 209 469 B1
PL 209 469 B1 15 Rysunki
16 PL 209 469 B1
PL 209 469 B1 17
18 PL 209 469 B1
PL 209 469 B1 19
20 PL 209 469 B1
PL 209 469 B1 21
22 PL 209 469 B1 Departament Wydawnictw UP RP Cena 4,92 zł (w tym 23% VAT)