Screening, klonowanie, ekspresja i oczyszczanie białek

Transkrypt

1 Screening, klonowanie, ekspresja i oczyszczanie białek

2 Kiedy gen jest znany Dostępna sekwencja DNA sekwencjonowanie genomu, biblioteki Dostępna sekwencja białka sekwencjonowanie białka

3 Techniki pozyskania genu PCR amplifikacja z użyciem specyficznych Starterów Zalety: szybkość, ułatwiona procedura klonowania, duża specyficzność Wady: błędy polimerazy DNA w trakcie amplifikacji wymagane sekwencjonowanie, wymagana dostępność materiału DNA lub cdna

4 Techniki pozyskania genu Tworzenie bibliotek i screening aktywności Zalety: uzyskanie pełnej struktury operonu, bezpośrednia ekspresja poszukiwanego białka Wady: długotrwała procedura, wymagana łatwa kontrola aktywności białka, wymagana zdolność ekspresji białka w komórkach gospodarza Screening aktywności beta-galaktozydazy

5 Techniki pozyskania genu Synteza chemiczna genu Zalety: możliwość uzyskania struktury genu na podstawie sekwencji białka, dobór optymalnych kodonów codon usage dla ekspresji w danym gospodarzu, możliwość modyfikacji struktury Synteza z użyciem techniki PCR Wady: stosunkowo długotrwała i kosztowna procedura, możliwe zaburzenia struktury drugorzędowej DNA, która może być ważna dla aktywności genu, wymagane sekwencjonwanie utworzonego konstruktu Synteza z użyciem ligacji oligonukleotydów

6 Technika PCR Reduktaza ksylozowa Candida tropicalis Docelowy gospodarz S. cerevisiae BclI (155) BseBI (509) MvaI (509) DV XR full BglII (600) PvuII (621) PspPI (720) SseBI (756) Ec o147i (756) BsuRI (756) BshFI (756) SspI (863) 0a (100.0%) HpaI (920) H incii (920) NcoI (993) Ec ori (1018) M S I K L N S G Y ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ CTTTATAAAT TAATAGAGTT ACAATGTCAA TCAAGTTAAA TTCAGGTTAT GAAATATTTA ATTATCTCAA TGTTACAGTT AGTTCAATTT AAGTCCAATA DV X R Full 1093 bp EcoRI ~~~~~~~ W D T K N R I P I F Y ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 1001 GGGATACTA AGAACAGAAT TCCAATTTTC TACTGAGTAG CTGGTGTAAT TGGGTTGTT CCCTATGAT TCTTGTCTTA AGGTTAAAAG ATGACTCATC GACCACATTA ACCCAACAA

7 Technika PCR Starter - koniec 5 M S I K L N S G Y ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ CTTTATAAAT TAATAGAGTT ACAATGTCAA TCAAGTTAAA TTCAGGTTAT GAAATATTTA ATTATCTCAA TGTTACAGTT AGTTCAATTT AAGTCCAATA BcuI ~~~~~~~ M A I K L N S G ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 1 GCGGCGACTA GTCCATGGCA ATCAAGTTAA ATTCAGG CGCCGCTGAT CAGGTACCGT TAGTTCAATT TAAGTCC Natywny gen Starter 5 Silne wiązanie z matrycą kooca 3 startera Unikalne miejsce rozpoznania dla enzymu restrykcyjnego Modyfikacja inicjacji translacji dla drożdży sekwencja Kozaka Dodatkowe nukleotydy ułatwienie trawienia enzymem restrykcyjnym na koocach fragmentu DNA

8 Technika PCR Starter 3 EcoRI ~~~~~~~ W D T K N R I P I F Y ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 1001 GGGATACTA AGAACAGAAT TCCAATTTTC TACTGAGTAG CTGGTGTAAT TGGGTTGTT CCCTATGAT TCTTGTCTTA AGGTTAAAAG ATGACTCATC GACCACATTA ACCCAACAA Natywny gen SalI ~~~~~~ EcoRI AluI HincII ~~~~~~ ~~~~ ~~~~~~ W D T K N R I P I F Y * TGGG ATACTAAGAA CAGAATTCCA ATTTTCTACT AAGTAGCTGG TGTAATTGGG GTCGACGGCG GC ACCC TATGATTCTT GTCTTAAGGT TAAAAGATGA TTCATCGACC ACATTAACCC CAGCTGCCGC CG Starter 3 Dodatkowe nukleotydy Unikalne miejsce rozpoznania dla enzymu restrykcyjnego Modyfikacja kodonu STOP na optymalny dla S. cerevisiae Palindrom - niebezpieczeostwo tworzenia struktury II-rzędowej przez starter

9 Technika PCR Amplifikacja z użyciem starterów z wiszącymi końcami 5 Ta=50 C 5-7 cykli Annealing 50 C Ta=65 C cykli Annealing 65 C

10 Technika PCR Oczyszczanie produktu PCR - Clean-Up lub Gel-Out Trawienie produktu PCR - zwiększona liczba jednostek restryktazy - Dobór uniwersalnego buforu dla podwójnego trawienia lub trawienie kolejno w 2 buforach - Oczyszczanie produktu PCR z użyciem Clean-Up po każdym użyciu enzymów BcuI SalI

11 Clean Up

12 Gel-Out

13 Przygotowanie wektora GDP prom BcuI (662) ColE1 SalI (713) CYC ter Amp Sach p bp 1. Trawienie enzymami BcuI i SalI procedura tak jak wypadku produktu PCR 2. Oczyszczanie przez Clean Up Trp 2µ

14 Klonowanie do wektora drożdżowego BcuI (8) DV XR full SalI (997) GDP prom DV X R Full P CR 1007 bp GDP prom BcuI (1) BcuI (662) DV XR ColE1 SalI (713) SalI (990) CYC ter ColE1 Amp Sach p bp Ligacja DV XR in p bp Trp Amp Trp 2µ 2µ

15 Transformacja do E. coli selekcja i amplifikacja klonu GDP prom BcuI (1) DV XR SalI (990) Szczep TOP10F Wysoka zdolnośd do transformacji ColE1 DV XR in p bp Amp Trp 2µ Selekcja kolonii na stałym podłozu LB w obecności ampicyliny

16 Hodowla rekombinantów i izolacja plazmidowego DNA LB + ampicylina 24 h Procedura izolacji DNA z użyciem lizy alkalicznej i kolumn wiążących DNA

17 ColE1 Ekspresja w S. cerevisiae GDP prom BcuI (1) DV XR SalI (990) Transformacja - chemiczna - eletroporacja - sferoplasty S. cerevisiae Trp- DV XR in p bp Amp Trp 2µ Podłoże syntetyczne YNB bez tryptofanu Wyrastają kolonie zawierające niezmutowany gen Trp+

18 Technika PCR Indukcja ekspresji białka w obecności galaktozy na podłożu YNB wydajny promotor galaktozowy od 2 do 5 dni GDP prom BcuI (1) DV XR SalI (990) ColE1 DV XR in p bp GDP prom BcuI (1) DV XR SalI (990) Amp Trp ColE1 2µ GDP prom BcuI (1) DV XR SalI (990) DV XR in p bp ColE1 Amp Trp DV XR in p bp 2µ Amp Trp 2µ

19 Liza komórek drożdżowych w celu uwolnienia białka - Chitynaza liza enzymatyczna - Prasa francuska metoda mechaniczna - Rozcieranie z Al2O3 w ciekłym azocie metoda mechaniczna

20 Technika PCR Oczyszczanie białka 1. Separacja białek rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych 2. Badanie aktywności szukanego białka 3. Białka rozpuszczalne - kolejno - Chromatografia jonowymienna, hydrofobowa, sączenie molekularne 4. Białka nierozpuszczalne rozpuszczanie w moczniku, chromatografia jonowymienna, hydrofobowa i sączenie molekularne w obecności z mocznika

21 Biblioteki DNA/cDNA Wymagania : - znana aktywność enzymu - łatwe badanie aktywności prosty test Przykłady białek: - Beta- galaktozydaza - Chitynaza - Amylaza - Proteaza - Ksylanaza - Celulaza

22 Biblioteki DNA/cDNA Izolacja RNA wolnego od DNA w celu syntezy cdna - Wymagane zastosowanie DNAzy wolnej od RNaz

23 Biblioteki DNA/cDNA Synteza cdna technika SMART

24 Biblioteki DNA Technika SMART mrna z komórek eukariotycznych zawiera oligo A na koncu 3 miejsce przyłączenia startera 5 AAAAAAAAAAAAAAAA 3 XbaI

25 Biblioteki DNA Technika SMART Synteza cdna z użyciem odwrotnej transkryptazy 5 AAAAAAAAAAAAAAAA 3 XbaI

26 Biblioteki DNA Technika SMART Przyłączenie linkera do końca 5 RNA AAAAAAAAAAAAAAAA 3 XbaI

27 Biblioteki DNA Technika SMART Dalsze wydłużenie cdna na matrycy linkera AAAAAAAAAAAAAAAA 3 XbaI

28 Biblioteki DNA Technika SMART Amplifikacja PCR puli cdna z udziałem starterów AAAAAAAAAAAAAAAA cykli XbaI EcoRI XbaI EcoRI XbaI EcoRI XbaI

29 Biblioteki DNA/cDNA Technika SMART Separacja puli fragmentów cdna na żelu i ekstrakcja Gel Out Spodziewany zakres długości poszukiwanego genu Białko : 990 AA 3pz / kodonx990 = 2970 pz

30 Biblioteki DNA/cDNA Technika SMART Klonowanie wyizolowanej puli cdna EcoRI XbaI EcoRI XbaI EcoRI XbaI

31 Biblioteki DNA/cDNA Technika SMART Transformacja do E. coli ekspresja z promotora T7 w obecności polimerazy RNA faga T7 i induktora IPTG

32 Gen syntetyczny Technika jest stosowana gdy: 1. Znana jest jedynie sekwencja białka 2. Oryginalne źródło genu jest nieosiągalne lub unikalne 3. Potrzebne są modyfikacje genu i badanie różnych jego wariantów 4. Potrzebna jest optymalizacja kodonów

33 Gen syntetyczny Technika składania genu ze starterów i amplifikacji - gen jest tworzony z komplementarnych oligonukleotydów PCR od 50 do 100 cykli Polimeraza DNA Pfu

34 Gen syntetyczny PCR 2 z użyciem starterów flankujących

35 Gen syntetyczny Przykład składania genu metodą amplifikacji Gen: proteinaza K Długość: 1200 pz Ilość oligonukleotydów: 1200 pz x 2 nici / 40 pz długość oligonukleotydu = 60 oligonukleotydów Wektor: puc19 Promotor plac indukowany IPTG Wyniki klonowania : na 145 analizowanych klonów tylko 2 wykazywały aktywność proteinazy K Wniosek : Wysoki poziom błędów w trakcie amplifikacji

36 Gen syntetyczny Technika składania genu z ufosforylowanych oligonukleotydów i termofilnej ligazy z P. furiosus zależnej od ATP Ligacja Technika ta eliminuje powstawanie błędów

37 Gen syntetyczny Codon usage DataBase

38 Gen syntetyczny Gen ze Streptomyces do gospodarza Bacillus Genom bogaty w pary GC Genom bogaty w pary AT Np. Kodon UUU występuje 4 razy na kodonów w genomie Streptomyces W Bacillus kodon UUU występuje 307 razy na kodonów Wniosek: wymagana zmiana kodonów synteza genu

39 Gen syntetyczny Zastosowania w klonowaniu: - Szczepionki białkowe np. wirus grypy możliwość szybkich zmian (wymiana pojedynczych oligonukleotydów) - Modyfikacja białek o znaczeniu farmaceutycznym np. lepsze wiązanie z receptorem

40 Kiedy gen nie jest znany Poszukiwany: enzym endo-1,4-beta ksylanaza Organizm producenta: pleśń

41 Kiedy gen jest nieznany 1. Izolacja homogennej hodowli organizmu producenta

42 Nasza pleśń wykazuje nawiększe podobieńtwo do Aspergillus Kiedy gen jest nieznany Molekularna charakterystyka pleśni - Co to jest? Badanie sekwencji 18s rdna, 26 rdna, ITS1, ITS2, 5S.

43 Kiedy gen jest nieznany Poszukujemy genów kodujących ksylanazy u bliskich krewnych naszej pleśni i porównujemy sekwencje aminokwasowe (101) A. awamori (71) SASGSSSYLAVYGWVNYPQAEYYIVEDYGDYNPCSS--ATSLGTVYSDGSTYQVCTDTRTNEPSITGTSTFTQYFSVRESTRTSGTVTVANHFNFWAQHGFG A. usammi (86) SASSSSSYLAVYGWVNSPQAEYYIVEDYGDYNPCSS--ATSLGTVYSDGSTYQVCTDTRTNAPSITGTSTFTQYFSVRESTRTSGTVTIANHFNFWAQHGFG A. niger (86) SASSSSSYLAVYGWVNSPQAEYYIVEDYGNYNPCSS--ATSLGTVYSDGSTYQVCTDTRTNAPSITGTSTFTQYFSVRESTRTSGTVTVANHFNFWAQHGFG A. oryzae (98) ESN-SNSYVSLYGWTQNPLVEYYIVDKYGDYDPSTG--ATELGTVESDGGTYKIYKTTRENAPSIEGTSTFNQYWSVRQSGRVGGTITAQNHFDAWANVGLQ A. tubingensis (86) SASGSASYLAVYGWVNYPQAEYYIVEDYGDYNPCSS--ATSLGTVYSDGSTYQVCTDTRTNEPSITGTSTFTQYFSVRESTRTSGTVTVANHFNFWAHHGFG A. sulfureus (86) SASGSSSYLAVYGWVNYPQAEYYIVEDYGDYNPCSS--ATSLGTVYSDGSTYQVCTDTRTNEPSITGTSTFTQYFSVRESTRTSGTVTVANHFNFWAQHGFG P. purpurogenum (82) SAS-GGSYLAVYGWVNSPQAEYHVVEAYGNYNPCSSGSATNLGTVSSDGGTYQVCTDTRVNQPSITGTSTFTQFFSVRQGSRTSGTVTIANHFNFWAKHGFG Consensus(101) SAS SSSYLAVYGWVN PQAEYYIVEDYGDYNPCSS ATSLGTVYSDGSTYQVCTDTRTN PSITGTSTFTQYFSVRESTRTSGTVTVANHFNFWAQHGFG

44 Kiedy gen jest nieznany Porównanie sekwencji aminokwasowych A. awamori (0.0127) A. usammi (0.0094) A. niger (0.0143) P. purpurogenum (0.1193) A. tubingensis (0.0178) A. sulfureus (0.0154) A. oryzae (0.4748)

45 Kiedy gen jest nieznany Motywy zakonserwowane (84) A. awamori (54) A. usammi (69) A. niger (69) A. oryzae (81) A. tubingensis (69) A. sulfureus (69). purpurogenum (65) Consensus (84) LGWTTGSSNAITYSAEYSASGSSSYLAVYGWVNYPQAEYYIVEDYGDYNPCSS--ATSLGTVYSDGSTYQVCTDTRTNEPSITGTSTFTQYFSVRESTRTSGTV LGWTTGSSKSITYSAQYSASSSSSYLAVYGWVNSPQAEYYIVEDYGDYNPCSS--ATSLGTVYSDGSTYQVCTDTRTNAPSITGTSTFTQYFSVRESTRTSGTV LGWTTGSSKSITYSAQYSASSSSSYLAVYGWVNSPQAEYYIVEDYGNYNPCSS--ATSLGTVYSDGSTYQVCTDTRTNAPSITGTSTFTQYFSVRESTRTSGTV KGWNPGSAKTVTYSGEWESN-SNSYVSLYGWTQNPLVEYYIVDKYGDYDPSTG--ATELGTVESDGGTYKIYKTTRENAPSIEGTSTFNQYWSVRQSGRVGGTI LGWTTGSSNAITYSAEYSASGSASYLAVYGWVNYPQAEYYIVEDYGDYNPCSS--ATSLGTVYSDGSTYQVCTDTRTNEPSITGTSTFTQYFSVRESTRTSGTV LGWTTGSSNPITYSADYSASGSSSYLAVYGWVNYPQAEYYIVEDYGDYNPCSS--ATSLGTVYSDGSTYQVCTDTRTNEPSITGTSTFTQYFSVRESTRTSGTV LGRSTGSSNPITYSASYSAS-GGSYLAVYGWVNSPQAEYHVVEAYGNYNPCSSGSATNLGTVSSDGGTYQVCTDTRVNQPSITGTSTFTQFFSVRQGSRTSGTV LGWTTGSSNAITYSAEYSAS SSSYLAVYGWVN PQAEYYIVEDYGDYNPCSS ATSLGTVYSDGSTYQVCTDTRTN PSITGTSTFTQYFSVRESTRTSGTV A B Motyw A: LGTVYSDG Motyw B: PSITGTSTF

46 Kiedy gen jest nieznany Sekwencja DNA na podstawie motywów Motyw A Motyw B Wybór konkretnej sekwencji DNA na podstawie najmniejsze liczby degeneracji i braku degeneracji na koocach

47 Kiedy gen jest nieznany Stopień degeneracji DNA motywów powinien być zbliżony Motyw A: GGNACNGTNTAYWSNGAYGG Degeneracja: 4 x 4 x 4 x 2 x2x4x2 = 2048 Motyw B: ACNGGNACNWSNACNTT Degeneracja 4 x 4 x 4 x2x2x4x4 = 4096

48 Kiedy gen jest nieznany Zamiana motywów na startery do PCR: Motyw A: GGNACNGTNTAYWSNGAYGG - Bez zmian koniec 5 fragmentu genu Starter A Motyw B: ACNGGNACNWSNACNTT - Sekwencja komplementarna Starter B-koniec 3 fragmentu genu AANGTNSWNGTNCCNGT

49 Kiedy gen jest nieznany Badanie temperatury annealingu dla starterów: Starter A : 49 C długość 20 nt Starter B: 42 C długość 17 nt Stosunkowo duża różnica temperatur- eliminacja fragmentu 5 sekwencji startera A 5 GGNACNGTNTAYWSNGAYGG 3 Zatem starter A po modyfikacji: 40 C długość 17 nt

50 Kiedy gen jest nieznany Spodziewana wielkość produktu PCR (84) A. awamori (54) A. usammi (69) A. niger (69) A. oryzae (81) A. tubingensis (69) A. sulfureus (69). purpurogenum (65) Consensus (84) LGWTTGSSNAITYSAEYSASGSSSYLAVYGWVNYPQAEYYIVEDYGDYNPCSS--ATSLGTVYSDGSTYQVCTDTRTNEPSITGTSTFTQYFSVRESTRTSGTV LGWTTGSSKSITYSAQYSASSSSSYLAVYGWVNSPQAEYYIVEDYGDYNPCSS--ATSLGTVYSDGSTYQVCTDTRTNAPSITGTSTFTQYFSVRESTRTSGTV LGWTTGSSKSITYSAQYSASSSSSYLAVYGWVNSPQAEYYIVEDYGNYNPCSS--ATSLGTVYSDGSTYQVCTDTRTNAPSITGTSTFTQYFSVRESTRTSGTV KGWNPGSAKTVTYSGEWESN-SNSYVSLYGWTQNPLVEYYIVDKYGDYDPSTG--ATELGTVESDGGTYKIYKTTRENAPSIEGTSTFNQYWSVRQSGRVGGTI LGWTTGSSNAITYSAEYSASGSASYLAVYGWVNYPQAEYYIVEDYGDYNPCSS--ATSLGTVYSDGSTYQVCTDTRTNEPSITGTSTFTQYFSVRESTRTSGTV LGWTTGSSNPITYSADYSASGSSSYLAVYGWVNYPQAEYYIVEDYGDYNPCSS--ATSLGTVYSDGSTYQVCTDTRTNEPSITGTSTFTQYFSVRESTRTSGTV LGRSTGSSNPITYSASYSAS-GGSYLAVYGWVNSPQAEYHVVEAYGNYNPCSSGSATNLGTVSSDGGTYQVCTDTRVNQPSITGTSTFTQFFSVRQGSRTSGTV LGWTTGSSNAITYSAEYSAS SSSYLAVYGWVN PQAEYYIVEDYGDYNPCSS ATSLGTVYSDGSTYQVCTDTRTN PSITGTSTFTQYFSVRESTRTSGTV 31 AA = 3 pz/aa x 31=93 pz Ale uwaga!!! Mamy organizm eukariotyczny więc może występowad intron

51 Kiedy gen jest nieznany Ustalanie warunków reakcji PCR touch-down - Stopniowe obniżanie temperatury annealingu z cyklu na cykl zaczynamy od 52 C a kończymy na 42 C - Stosunek ilościowy starterów ze względu na degenerację Starter A: Starter B 1:2 - Stężenie starterów w reakcji PCR 10 µm - Czas wydłużania produktu 30 sec - Czas annealingu 1 min (dopasowanie startera do matrycy)

52 Kiedy gen jest nieznany Obecność intronu DNA cdna M 250 pz Produkt właściwy100 pz

53 Kiedy gen jest nieznany Izolacja mrna w celu przygotowania cdna zawierającego poszukiwany gen musi być wykonana z hodowli organizmu uzyskanej w określonych warunkach Np. Ekspresja genu kodującego ksylanazę (mrna) zachodzi w obecności ksylanu w hodowli organizmu

54 Kiedy gen jest nieznany Określenie sekwencji DNA fragmentu genu pozwala na określenie sekwnecji białka

55 Kiedy gen jest nieznany Porównanie sekwencji aminokwasowej znalezionego fragmentu (114) A. awamori (84) WVNYPQAEYYIVEDYGDYNPCSS--ATSLGTVYSDGSTYQVCTDTRTNEPSITGTSTFTQYFSVRESTRTSGTVTVANH A. usammi (99) WVNSPQAEYYIVEDYGDYNPCSS--ATSLGTVYSDGSTYQVCTDTRTNAPSITGTSTFTQYFSVRESTRTSGTVTIANH A. niger (99) WVNSPQAEYYIVEDYGNYNPCSS--ATSLGTVYSDGSTYQVCTDTRTNAPSITGTSTFTQYFSVRESTRTSGTVTVANH A. oryzae(110) WTQNPLVEYYIVDKYGDYDPSTG--ATELGTVESDGGTYKIYKTTRENAPSIEGTSTFNQYWSVRQSGRVGGTITAQNH A. tubingensis (99) WVNYPQAEYYIVEDYGDYNPCSS--ATSLGTVYSDGSTYQVCTDTRTNEPSITGTSTFTQYFSVRESTRTSGTVTVANH A. sulfureus (99) WVNYPQAEYYIVEDYGDYNPCSS--ATSLGTVYSDGSTYQVCTDTRTNEPSITGTSTFTQYFSVRESTRTSGTVTVANH P. purpurogenum (94) WVNSPQAEYHVVEAYGNYNPCSSGSATNLGTVSSDGGTYQVCTDTRVNQPSITGTSTFTQFFSVRQGSRTSGTVTIANH Fragment AB (1) TVYSDGSTYQVCTDTRTNEPSITGTST Consensus(114) WVN PQAEYYIVEDYGDYNPCSS ATSLGTVYSDGSTYQVCTDTRTNEPSITGTSTFTQYFSVRESTRTSGTVTVANH

56 Kiedy gen jest nieznany Konstrukcja wewnętrznych specyficznych starterów

57 Kiedy gen jest nieznany Izolacja mrna Konstrukcja cdna z użyciem techniki SMART Wyodrębnienie genu z użyciem starterów specyficznych For i Rev oraz starterów SMART

58 Kiedy gen jest nieznany cdna uzyskane techniką SMART AAAAAAAAAAAAAAAA cykli SMARTrev

59 Kiedy gen jest nieznany 2 niezależne amplifikacje na mieszaninie cdna (1) SMARTfor / StarterRev (2) SMARTrev/ StarterFor

60 Kiedy gen jest nieznany PCR 1 PCR 2

61 Kiedy gen jest nieznany Izolacja obu produktów PCR z żelu, wymieszanie i ponowna amplifikacja z udziałem starterów SMARTfor i SMARTrev

62 Kiedy gen jest nieznany Annealing i wydłużenie produktów PCR 1 i 2 Amplifikacja z udziałem starterów SMART

63 Kiedy gen jest nieznany Analiza na żelu agarozowym 1 fragment PCR 1 3 fragment PCR fragment po amplifikacji całego genu

64 Kiedy gen jest nieznany Klonowanie całego genu do wektora

65 Kiedy gen nie jest znany Kompletna sekwencja cdna poszukiwanego genu

66 Kiedy gen nie jest znany Translacja uzyskanej sekwencji cdna pozwala na weryfikację uzyskanego genu tj. Czy koduje on ksylanazę? NASZA KSYLANAZA (0.0000) Fragment AB (0.0000) P. purpurogenum (0.0908) A. usammi (0.0000) A. niger (0.0000) A. sulfureus (0.0000) A. awamori (0.0000) A. tubingensis (0.0000) N. crassa (0.2743) A. oryzae (0.1651)

67 Kiedy gen nie jest znany Ekspresja ksylanazy w E. coli - Badanie obecności hydrofobowej sekwencji sygnalnej (sekwencje sygnalne obniżają znacząco ekspresję w E. coli)

68 Kiedy gen nie jest znany Sekwencja Sygnalna Aminokwasy 3-24 Wykres analizy hydrofobowości sekwencji aminokwasowej badanego białka

69 Kiedy gen nie jest znany Zaprojektowanie starterów do klonowania z użyciem systemu LIC w celu ekspresji ksylanazy w postaci białka fuzyjnego w E. coli Ekspresja i oczyszczanie z użyciem chromatografii metalopowinowactwa

70 Kiedy gen nie jest znany

71 Kiedy gen nie jest znany Startery LIC dla ksylanazy koniec 5 Starter For Na niebiesko oznaczono sekwencję sygnalną 5 GAC GAC GAC AAG Sekwencja LIC 5 GTGTCGCGAAGTGCTGG 3 Sekwencja komplementarna do matrycy

72 Kiedy gen nie jest znany Starter LIC dla ksylanazy koniec 3 5 GA GGA GAA GCC CGG Sekwencja LIC 3 TCACCGTTCCAGATGTGCGCGT 3 Sekwencja komplementarna do matrycy

73 Kiedy gen nie jest znany Dwustopniowy PCR - Matryca : cdna lub wcześniej uzyskany klon całego genu cykli w temperaturze optymalnej dla przyłączenia starterów w części komplementarnej do matrycy - Pozostałe 23 do 25 cykli w temperaturze o 6 do 10 C wyższej

74 Kiedy gen nie jest znany Produkt PCR oczyszczany z żelu lub Clean-UP i traktowany polimetazą DNA faga T4 w obecności datp Tak przygotowany produkt jest mieszany z wektorem i użyty do transformacji komórek E. coli TOP10F

75 Kiedy gen nie jest znany Miejsce insercji genu ksylanazy

76 Kiedy gen nie jest znany Kodowane białko fuzyjne będzie zawierało następujące domeny: - 6xHis domena wiązania do złoża Ni2+ IDA - S*Taq domena w celu specyficznej detekcji białka na żelu - Miejsce cięcia dla specyficznej proteazy trombiny oraz enterokinazy

77 Kiedy gen nie jest znany Transformacja plazmidu ekspresyjnego do E. coli BL21(DE3)pLysS

78 Kiedy gen nie jest znany Ekspresja białka następuje po dodaniu do hodowli w logarytmicznej fazie wzrostu induktora IPTG Liza komórek z użyciem lizozymu jaja kurzego w obecności detergentów niejonowych oraz EDTA Rozbicie chromosomalnego DNA z użyciem sonifikatora

79 Kiedy gen nie jest znany Rozdzielenie białek na frakcje rozpuszczalną i nierozpuszczalną oraz zbadanie aktywności ksylanazy w obu frakcjach

80 Kiedy gen nie jest znany Oczyszczanie białka z użyciem chromatografii metalopowinowactwa

81 Kiedy gen nie jest znany Chromatografia IMAC

82 Kiedy gen nie jest znany Badanie czystości białka z użyciem SDS-PAGE 1 lizat przed indukcją 2- lizat pod indukcji białka po 4 h 3 oczyszczony preparat białka z użyciem Ni2+IDA

83 Kiedy gen nie jest znany Badanie aktywności i charakterystyka białka rekombinantowego - Optymalne ph - Optymalna temperatura - Termostabilność - Badania kinetyki reakcji - Badania strukturalne