RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12)OPIS PATENTOWY (19) PL (21) Numer zgłoszenia: 319969 (22) Data zgłoszenia: 17.10.1994 (86 ) Data 1 numer zgłoszenia międzynarodowego: 17.10.1994, PCT/IE94/00050 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: 25.04.1996, W096/12191, PCT Gazette nr 18/96 (11) 176625 (13) B1 (51) In tc l6: G01N 33/573 C07K 16/40 C12N9/10 (54) Środek stabilizujący αgst w moczu i sposób ilościowego oznaczania αgst w moczu (43) Zgłoszenie ogłoszono: 01.09.1997 BUP 18/97 (73) Uprawniony z patentu: BIOTRIN INTELLECTUAL PROPERTIES LIMITED, Mount Merrion, IE (72) Twórcy wynalazku: John M. Doyle, Deansgrange, IE Cormac G. Kilty, Sandycove, IE (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 30.07.1999 WUP 07/99 (74) Pełnomocnik: Sierzputowska Iwona, SULIMA-GRABO- WSKA-SIERZPUTOWSKA, Biuro Patentów i Znaków Towarowych s.c. PL 176625 B1 ( 5 7 ) 1. Środek stabilizujący αgst w moczu, znamienny tym, że zawiera białko enzymatyczne wybrane spośród albuminy, hydrolizowanej albuminy, korzystnie hydrolizowanej żelatyny, i ich mieszanin w ilości stabilizującej agst, korzystnie 5-15% wagowo-objętościowych, czynnik chelatujący i bufor zapewniający temu środkowi ph 7,0-7,5. 14. Sposób ilościowego oznaczania αgst w moczu, polegający na kontaktowaniu próbki moczu z IgG anty-αgst w postaci nierozpuszczonej oraz oznaczaniu ilości αgst związanej z IgG anty-α GST drogą kontaktowania tej związanej αgst z IgG anty-agst znaczoną enzymem, korzystnie peroksydazą, a zwłaszcza peroksydazą chrzanową, i pomiaru aktywności znacznika enzymatycznego, znamienny tym, że przed skontaktowaniem próbki moczu z IgG anty-αgst w postaci nierozpuszczonej do tej próbki moczu dodaje się środek stabilizujący αgst w moczu zawierający białko enzymatyczne wybrane spośród albuminy, hydrolizowanej albuminy, korzystnie hydrolizowanej żelatyny, i ich mieszanin w ilości stabilizującej agst, korzystnie 5-15% wagowo-objętościowych, czynnik chelatujący i bufor zapewniający temu środkowi ph 7,0-7,5.
r Środek stabilizujący α GST w moczu i sposób ilościowego oznaczania α GST w moczu Zastrzeżenia patentowe 1. Środek stabilizujący αgst w moczu, znamienny tym, że zawiera białko enzymatyczne wybrane spośród albuminy, hydrolizowanej albuminy, korzystnie hydrolizowanej żelatyny, i ich mieszanin w ilości stabilizującej αgst, korzystnie 5-15% wagowo-objętościowych, czynnik chelatujący i bufor zapewniający temu środkowi ph 7,0-7,5. 2. Środek stabilizujący według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera mieszaninę albuminy i hydrolizowanej albuminy. 3. Środek stabilizujący według zastrz. 2, znamienny tym, że zawiera mieszaninę albuminy surowicy i hydrolizowanej albuminy. 4. Środek stabilizujący według zastrz. 3, znamienny tym, że zawiera mieszaninę albuminy surowicy bydlęcej i hydrolizowanej żelatyny w równych ilościach wyrażonych jako udziały wagowo-objętościowe. 5. Środek stabilizujący według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienny tym, że zawiera albuminę w stężeniu około 10% wagowo-objętościowych. 6. Środek stabilizujący według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienny tym, że jako czynnik chelatujący zawiera wersenian metalu alkalicznego. 7. Środek stabilizujący według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienny tym, że zawiera sól w stężeniu wynoszącym 4-5% wagowo-objętościowych. 8. Środek stabilizujący według zastrz. 7, znamienny tym, że jako sól zawiera sól metalu alkalicznego. 9. Środek stabilizujący według zastrz. 8, znamienny tym, że zawiera chlorek sodowy. 10. Środek stabilizujący według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienny tym, że zawiera inhibitor proteazy. 11. Środek stabilizujący według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienny tym, że jako bufor zawiera bufor amfoteryczny. 12. Środek stabilizujący według zastrz. 11, znamienny tym, że jako bufor zawiera kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1 -piperazynoetanosulfonowy. 13. Środek stabilizujący według zastrz. 12, znamienny tym, że zawiera bufor o ph 7,3. 14. Sposób ilościowego oznaczania agst w moczu, polegający na kontaktowaniu próbki moczu z IgG anty-αgst w postaci nierozpuszczonej oraz oznaczaniu ilości agst związanej z IgG anty-αgst drogą kontaktowania tej związanej agst z IgG anty-αgst znaczoną enzymem, korzystnie peroksydazą, a zwłaszcza peroksydazą chrzanową, i pomiaru aktywności znacznika enzymatycznego, znamienny tym, że przed skontaktowaniem próbki moczu z IgG anty-αgst w postaci nierozpuszczonej do tej próbki moczu dodaje się środek stabilizujący αgst w moczu zawierający białko enzymatyczne wybrane spośród albuminy, hydrolizowanej albuminy, korzystnie hydrolizowanej żelatyny, i ich mieszanin w ilości stabilizującej αgst, korzystnie 5-15% wagowo-objętościowych, czynnik chelatujący i bufor zapewniający temu środkowi ph 7,0-7,5. 15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że dodaje się środek stabilizujący zawierający mieszaninę albuminy i hydrolizowanej albuminy. 16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że dodaje się środek stabilizujący zawierający mieszaninę albuminy surowicy i hydrolizowanej albuminy. 17. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że dodaje się środek stabilizujący zawierający mieszaninę albuminy surowicy bydlęcej i hydrolizatu żelatyny w równych ilościach wyrażonych jako udziały wagowo-objętościowe. 18. Sposób według zastrz. 14albo 15,albo 16,znamienny tym, że dodaje się środek stabilizujący zawierający albuminę w stężeniu około 10% wagowo-objętościowych.
176 625 3 19. Sposób według zastrz. 14 albo 15, albo 16, znamienny tym, że dodaje się środek stabilizujący zawierający jako czynnik chelatujący wersenian metalu alkalicznego. 20. Sposób według zastrz. 14 albo 15, albo 16, znamienny tym, że dodaje się środek stabilizujący zawierający sól w stężeniu wynoszącym 4-5% wagowo-objętościowych. 21. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że dodaje się środek stabilizujący zawierający sól metalu alkalicznego. 22. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że dodaje się środek stabilizujący zawierający chlorek sodowy. 23. Sposób według zastrz. 14 albo 15, albo 16, znamienny tym, że dodaje się środek stabilizujący zawierający inhibitor proteazy. 24. Sposób według zastrz. 14 albo 15, albo 16, znamienny tym, że dodaje się środek stabilizujący zawierający bufor amfoteryczny. 25. Sposób według zastrz. 24, znamienny tym, że dodaje się środek stabilizujący zawierąjący jako bufor kwas 4-(2-hydroksyetylo)-l-piperazynoetanosulfonowy. 26. Sposób według zastrz. 25, znamienny tym, że dodaje się środek stabilizujący zawierający bufor o ph 7,3. 27. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że stosuje się kor u gat IgG anty-αgst-hrp w postaci ciekłej w środku stabilizującym zawierającym stabilizującą ilość cy tochromu c i stabilizującą ilość albuminy surowicy, substancję powierzchniowo czynną, poliol i bufor zapewniający temu środkowi ph około 6,5, przy czym końcowe stężenie poliolu wynosi 5-15% objętościowych. * * * Przedmiotem wynalazku są środek stabilizujący GST w moczu i sposób ilościowego oznaczania αgst w moczu, czyli środek stabilizujący transferazę S alfa glutationową (αgst) w moczu i sposób jej ilościowego oznaczania w teście enzymóimmunologicznym na αgst. Transferazy glutationowe (GST) są enzymami znajdującymi się w znacznie różniących się ilościach w tkankach ludzkich. Enzymy te tworzą trzy główne klasy, oznaczone jako α, π i (i. Te trzy klasy enzymów różnią się pomiędzy sobą właściwościami. αgst znajduje się w okolicy kanalików proksymalnych nerki i jest wydzielana do moczu u zdrowych osobników, co potwierdzają test enzymoimmunologiczny i analiza western biot (Campbell, J. A. H. i inni (1991) Cancer (Philadelphia), 67,1608-1613). Każda sytuacja prowadząca do uszkodzenia kanalików proksymalnych może powodować uwalnianie agst do moczu, prowadząc do wzrostu jej normalnego poziomu. Tak więc wzrost poziomu agst w moczu może być wskaźnikiem uszkodzenia kanalików proksymalnych (Sherman, R. A. i inni (1985) Uremia Investigation, 8, 111-115). Ostatnia praca wykazała, że indukowane cisplatyną uszkodzenie kanalików proksymalnych u szczurów Wistar jest powiązane ze zwiększonym poziomem aktywności agst w moczu i zmniejszonym klirensem kreatyniny z surowicy krwi (Stojanov, M. i inni (1994) Clin. Chem., 14,1125), oraz że ostra martwica kanalików nerkowych i zawał przeszczepionej nerki u ludzi powodują gwałtowny wzrost poziomu zarówno a, jak i tt GST (Sundberg, A. G. M. i inni (1994) Nephron 67, 308-316). Możliwość wykorzystywania moczu jako próbki płynu ustrojowego do wykrywania i oznaczania enzymu będącego wskaźnikiem uszkodzenia nerek, a w szczególności określonego obszaru nerki jest korzystna, zwłaszcza dlatego, że nie wymaga stosowania inwazyjnych metod pobierania próbek ciała. Zawsze, gdy potrzebne jest określenie poziomu ααgst u ciężko chorych pacjentów, minimalizacja wszelkich zbędnych dodatkowych urazów jest bardzo pożądana. Tradycyjnie stosowany test radioimmunologiczny do oznaczania αgst w moczu ma wady związane z użyciem substancji znaczonej radioaktywnie. Często niemożliwe jest przeprowadzenie niezbędnego oznaczenia αgst w moczu przez jakiś dłuższy czas, np. kilka dni, po pobraniu próbki. Dlatego często niezbędne jest przechowy-
4 176 625 wanie próbki moczu w bardzo niskiej temperaturze, zazwyczaj około -20 C. Wiadomo jednak, że przechowywanie moczu zawierającego agst w tak niskiej temperaturze prowadzi do spadku immunoreaktywności, a zatem również do obniżenia czułości testu immunologicznego. Wspomniany spadek immunoreaktywności jest spowodowany najprawdopodobniej denaturacją wskutek zamrażania/rozmrażania. Zatem istnieje zapotrzebowanie na środek umożliwiający przechowywanie αgst w moczu w temperaturze około -20 C bez znaczącego spadku immunoreaktywności αgst w teście immunologicznym stosowanym do wykrywania αgst. Nieoczekiwanie stwierdzono, że skuteczny w zapobieganiu spadkowi aktywności immunologicznej αgst jest środek stabilizujący αgst w moczu, charakteryzujący się tym, że zawiera białko enzymatyczne wybrane spośród albuminy, hydrolizowanej albuminy, korzystnie hydro lizowanej żelatyny, i ich mieszanin w ilości stabilizującej agst, korzystnie 5-15% wagowo- -objętości owych, czynnik chelatujący i bufor zapewniający temu środkowi ph 7,0-7,5. Środek stabilizujący według wynalazku można stosować do przechowywania próbek moczu w temperaturze około -20 C bez spadku immunoreaktywności. Ponadto środek stabilizujący według wynalazku poprawia immunoreaktywność w przypadku dodania go do świeżej próbki moczu, którą przechowuje się tymczasowo w temperaturze 2-8 C, do dwóch godzin przed wykonaniem testu. Korzystnie środek stabilizujący jako białko nieenzymatyczne zawiera mieszaninę albuminy i hydrolizowanej albuminy. Korzystną hydrolizowaną albuminą jest hydrolizowana żelatyna, często zwana hydrolizatem żelatyny. Takie hydrolizaty żelatyny są dostępne w handlu, np. z Sigma Chemicals (Kod G-0262, generowana enzymatycznie). Szczególnie korzystną albuminą nie hydrolizowaną jest albumina surowicy, a zwłaszcza albumina surowicy bydlęcej (BSA). Korzystnie środek stabilizujący zawiera mieszaninę albuminy surowicy i hydrolizowanej albuminy, a zwłaszcza albuminy surowicy bydlęcej i hydrolizowanej żelatyny w równych ilościach wyrażonych jako udziały wagowo-objętościowe. Określenie udział wagowo-objętościowy oznacza tu ilość danej substancji w gramach na 100 ml środka stabilizującego. Środek stabilizujący, korzystnie zawiera białko nieenzymatyczne w stężeniu 5-15%, a zwłaszcza około 10% wagowo-objętościowych. Korzystnym czynnikiem chelatującym jest wersenian metalu alkalicznego. Ponadto środek stabilizujący korzystnie zawiera sól w stężeniu 4-5% wagowo-objętościowych. Korzystnymi solami są sole metali alkalicznych, a zwłaszcza chlorek sodowy. Zastosowanie soli, takiej jak chlorek sodowy, jest pomocne w procesie rozpuszczania albuminy i/lub hydrolizatu albuminy oraz zapewnia wymagane właściwości stabilizujące. Uważa się, że sól może wywierać działanie poprzez zmniejszanie tła testu, to jest wiązania niespecyficznego. Środek stabilizujący korzystnie zawiera również inhibitor proteazy. Odpowiednim inhibitorem proteazy jest inhibitor trypsyny, taki jak aprotynina. Odpowiednim buforem jest bufor amfoteryczny typu buforu opisanego przez N. E. Gooda i S. łzawa (1972) Methods in Enzymol., 24, PartB, 53). Szczególnie odpowiednim buforem jest kwas 4-(2-hydroksyetylo)-l-piperazynoetanosulfonowy (HEPES) o ph 7,3. Środek stabilizujący może także zawierać inne dodatki, np. różne środki przeciw drobnoustrojom lub konserwanty. Do odpowiednich konserwantów należą azydek sodowy oraz konserwanty zawierające etylortęciosalicylan sodowy, znany także jako thiomersal lub thiomerosal. Środek stabilizujący według wynalazku miesza się przed przechowywaniem z próbką moczu, która ma być poddana testowi na αgst po przechowywaniu w temperaturze -20 C przez dany okres czasu. Zgodny z wynalazkiem sposób ilościowego oznaczania αgst w moczu polega na kontaktowaniu próbki moczu z IgG anty-αgst w postaci nierozpuszczonej oraz oznaczaniu ilości
176 625 5 agst związanej z IgG anty-αgst drogą kontaktowania tej związanej αgst z IgG anty-αgst znaczoną enzymem, korzystnie peroksydazą, a zwłaszcza peroksydazą chrzanową, i pomiaru aktywności znacznika enzymatycznego, a cechą tego sposobu jest to, że przed skontaktowaniem próbki moczu z IgG anty-αgst w postaci nierozpuszczonej do tej próbki moczu dodaje się środek stabilizujący αgst w moczu zawierający białko enzymatyczne wybrane spośród albuminy, hydrolizowanej albuminy, korzystnie hydrolizowanej żelatyny, i ich mieszanin w ilości stabilizującej αgst, korzystnie 5-15% wagowo-objętościowych, czynnik chelatujący i bufor zapewniający temu środkowi ph 7,0-7,5. Środek stabilizujący według wynalazku pozwala na uzyskanie czułości testu immunologicznego na αgst w moczu, ściśle skorelowanej z czułością uzyskiwaną wtedy, gdy test immunologiczny prowadzi się na próbkach określanych w literaturze jako świeże próbki moczu. W przeciwieństwie do sytuacji, gdy próbki moczu przechowuje się w temperaturze -20 C bez środka stabilizującego, nie obserwuje się spadku immunoreaktywności po przechowywaniu takich próbek w obecności środka stabilizującego według wynalazku, jak wykazano w poniższych przykładach. Korzystnym znacznikiem enzymatycznym jest peroksydaza, a zwłaszcza peroksydaza chrzanowa. Innym korzystnym koniugatem peroksydazy jest biotynylowany kompleks awidyny (w tym streptawidyny) i peroksydazy, który można stosować w koniugacie przeciwciało-biotyna w celu wzmocnienia testu enzymatycznego w znany sposób. W takim teście enzymatycznym nierozpuszczony antygen na fazie stałej przeciwciała wiąże się z koniugatem przeciwciało-biotyna, który z kolei wiąże się z biotynylowanym kompleksem awidyna/streptawidyna-peroksydaza, po czym mierzy się aktywność peroksydazy. Korzystnie w teście enzymoimmunologicznym stosuje się koniugat IgG anty-αgst-hrp w trwałej postaci ciekłej w środku stabilizującym zawierającym stabilizującą ilość cytochromu c i stabilizującą ilość albuminy surowicy, substancję powierzchniowo czynną, poliol i bufor zapewniający środkowi ph około 6,5, przy czym końcowe stężenie poliolu wynosi około 5-15% objętościowych. Ilość cytochromu c korzystnie wynosi 0,02-2% wagowo-objętościowych. Podczas, gdy stężenie cytochromu c można zwiększyć do powyżej 2% wagowo-objętościowych bez znaczącego wpływu na proces stabilizacji, to zmniejszenie jego stężenia do poniżej około 0,02% wagowo-objętościowych powoduje pogorszenie właściwości stabilizujących buforu. Cytochrom c to cytochrom mający wiązania kowalencyjne pomiędzy łańcuchami bocznymi ugrupowania hemu a białkiem. Korzystnym białkiem stabilizującym jest albumina surowicy, obecna w ilości 0,5-2% wagowo-objętościowych. Szczególnie odpowiednią albuminą surowicy jest albumina surowicy bydlęcej (BSA). Podczas, gdy ilość BSA można zwiększyć do powyżej 2% wagowo-objętościowych bez znaczącego wpływu na proces stabilizacji, tak jak w przypadku cytochromu c, o tyle zmniejszenie stężenia poniżej około 0,5% wagowo-objętościowych powoduje pogorszenie właściwości stabilizujących buforu. Do albuminy surowicy można dodać innego białka stabilizującego, np. płodowej surowicy cielęcej, bogatej w BSA. Substancją powierzchniowo czynną jest korzystnie niejonowa substancja powierzchniowo czynna wybrana spośród estrów polioksyetylenowych kwasów tłuszczowych, estrów polioksyetylenosorbitanu, alkoholi polioksyetylenowych, izoalkoholi polioksyetylenowych, eterów polioksyetylenowych, estrów polioksyetylenowych, polioksyetyleno-p-t-oktylofenoli lub kondensatów oktylofenylu z tlenkiem etylenu, kondensatów tlenku etylenu z alkoholami tłuszczowymi, polioksyetylenononylofenoli oraz mieszanin glikoli polialkilenowych lub mieszanin tych związków. Do szczególnie korzystnych niejonowych substancji powierzchniowo czynnych należą estry polietylenosorbitanu sprzedawane pod nazwą handlową Tween, zwłaszcza monolaurynian
6 176 625 polioksyetylenosorbitanu lub Tween 20, lecz również Tween 60 i Tween 80; etery polioksyetylenowe sprzedawane pod nazwą handlową Triton, takie jak Triton X100, Triton X I14, Triton X110E i Triton N I01 oraz Brij; kondensat oktylofenylu z tlenkiem etylenu, sprzedawany pod nazwą handlową Nonidet P40; kondensaty alkoholi tłuszczowych z tlenkiem etylenu, sprzedawane pod nazwą handlową Lubrol, zwłaszcza Lubrol PX oraz mieszanina jednej części wagowej glikolu polietylenowego z czterema częściami wagowymi glikolu polipropylenowego, sprzedawana pod nazwą handlową Synperonic F I08. Szczególnie odpowiednią substancją powierzchniowo czynną jest Synperonic FI 08. Poliol stabilizuje interakcje białko-białko. Do odpowiednich polioli należą glukoza, gliceryna, mannit, sorbit i sacharoza bądź ich mieszaniny. Szczególnie korzystnym poliolem jest gliceryna w stężeniu końcowym około 10% objętościowych. Szczególnie odpowiednim buforem jest solanka buforowana fosforanem. Środek stabilizujący koniugat IgG anty-αgst-hrp może także zawierać inne dodatki w zależności od właściwości koniugatu enzymu, takie jak różne środki przeciw drobnoustrojom, konserwanty i inhibitory proteaz, czynniki stabilizujące interakcje białko-białko, przeciwutleniacze oraz środki barwiące pomocne w identyfikacji. Odpowiednim środkiem przeciw drobnoustrojom jest gentamycyna. Do odpowiednich konserwantów należą konserwanty zawierające etylortęciosalicylan sodowy, znany także jako thiomersal lub thiomerosal. Odpowiednim inhibitorem proteazy jest np. inhibitor trypsyny, taki jak aprotynina. Odpowiednim środkiem barwiącym jest barwnik karminowy. Poniższy przykład 1 ilustruje środek stabilizujący według wynalazku, przykład 2 ilustruje skład i wytwarzanie środka stabilizującego koniugat IgG anty-αgst-hrp, ewentualnie stosowanego w sposobie według wynalazku, przykład 3 ilustruje działanie tego środka, a przykłady 4-6 ilustrują sposób według wynalazku. Przykład 1. Środek stabilizujący αgst w moczu, o ph 7,3 sporządzono z poniższych składników: Składniki HEPES Na2EDTA NaCl BSA Hydrolizat żelatyny Aprotynina Thiomersal Azydek sodowy 0,5 M 10 mm 4,5% (udział wagowo-objętościowy) 5% (udział wagowo-objętościowy) 5% (udział wagowo-objętościowy) 10 µg/ml 0,01% (udział wagowo-objętościowy) 0,05% (udział wagowo-objętościowy) Wszystkie podane wyżej składniki dodano do wody dejonizowanęj w ilości stanowiącej 80% objętości końcowej i ph doprowadzono do wartości 7,3 zapomocą NaOH. Roztwór następnie uzupełniono do objętości końcowej wodą dejonizowaną. W przypadku dodawania BSA i hydrolizatu żelatyny istotne jest oddzielne dodawanie tych składników i upewnienie się, że składnik dodany jako pierwszy został całkowicie rozpuszczony przed dodaniem drugiego składnika. Tak sporządzony środek stabilizujący stosuje się do stabilizowania αgst w moczu, przy czym dodaje się jedną część tego środka do czterech części moczu (rozcieńczenie 1/5), całość łagodnie miesza się i próbkę zamraża się w temperaturze -20 C lub przechowuje tymczasowo w temperaturze 2-8 C przez okres do dwóch godzin przed wykonaniem testu.
176 625 7 Przykład2. Środek stabilizujący koniugat IgG anty-αgst-hrp, o ph 6,5 sporządzono z następujących składników: Składnik NaCl NaH2PO4 2H2O Na2H2PO4-2H2O Cytochrom c Synperonic F I08 BSA Płodowa surowica cielęca Thiomersal Gentamycyna Barwnik karminowy Stężony HC1 (do nastawiania ph) Woda dejonizowana Ilość 8,000 g 0,260 g 1,425 g 0,250 g 10,000 g 10,000 g 25,000 ml 0,100 g 0,100 g 0,930 g zmienna zmienna Całość uzupełniono do 1000 ml wodą dejonizowaną. Do pojemnika szklanego wprowadzono 700 ml wody dejonizowanej. Do wody dodano NaCl, NaH2P 0 4-2H20, Na2H2P 0 4-2H20 i thiomersal, mieszając aż do całkowitego rozpuszczenia dodanych składników. Następnie dodano Synperonic F I08 i roztwór ponownie mieszano aż do rozpuszczenia substancji powierzchniowo czynnej. Następnie sprawdzono ph roztworu i doprowadzono je do wartości 6,5 za pomocą 5 M HC1. Potem dodano BSA i pozwolono by rozpuściła się. Do tego dodano następnie płodowej surowicy cielęcej i mieszano aż do jej rozpuszczenia. Z kolei dodano gentamycyny, cytochromu c i barwnika karminowego i roztwór mieszano aż do ich rozpuszczenia. ph ponownie sprawdzono i doprowadzono,do wymaganej wartości 6,5. Objętość końcową uzupełniono do 1000 ml, i bufor po przesączeniu przez filtr 0,2 pm był gotowy do przechowywania. Przy stosowaniu dodaje się dziewięć części buforu na jedną część gliceryny. Przykład 3. Zbadano trwałość koniugatu IgG anty-αgst-hrp, obecnie dostarczanego w postaci zliofilizowanej w zestawie do testu enzymoimmunologicznego, sprzedawanym przez Biotrin International Limited pod nazwą handlową Nephkit, w środku stabilizującym sporządzonym w przykładzie 2. Test Nephkit zapewnia sposób ilościowego oznaczania αgst w moczu i może być wskaźnikiem uszkodzenia kanalików proksymalnych w nerce. 100% trwałość dziesięciokrotnego koncentratu uzyskano po przechowywaniu koniugatu przez dwadzieścia godzin w temperaturze pokojowej w środku stabilizującym sporządzonym w przykładzie 2. Przykład 4. Użyteczność środka stabilizującego z przykładu 1 do stabilizowania αgst w moczu podczas przechowywania w temperaturze -20 C. Pobrano dziewięć próbek moczu (od mężczyzn i kobiet) i natychmiast oznaczono αgst z użyciem zestawu do testu enzymoimmunologicznego, sprzedawanego przez Biotrin International Limited, Mount Merrion, County Dublin, Irlandia, pod nazwąhandlowąnephkit. Wyniki podano w kolumnie 2 w tabeli 1. Próbki następnie podzielono i środek stabilizujący sporządzony w przykładzie 1 dodano do jednej serii (-20 C (SM)), a nie dodano go do drugiej serii (-20 C). Próbki przechowywano w temperaturze -20 C przez trzy dni, po czym poddano je analizie z użyciem zestawu Nephkit.
8 176 625 Stwierdzono, że wartości otrzymane dla próbek przechowywanych w temperaturze -20 C w obecności środka stabilizującego były ściśle skorelowane z danymi otrzymanymi dla pierwotnych (świeżych) próbek (4 C). Jednakże we wszystkich próbkach zamrożonych bez środka stabilizującego zaobserwowano spadek immunoreaktywności αgst. Jak wskazano powyżej, ten spadek immunoreaktywności jest najprawdopodobniej spowodowany denaturacją wskutek zamrażania/rozmrażania. próbka 4 C Tabela 1 Temperatura przechowywania -20 C [µgst] ng/ml -20 C (SM) 1 2,62 0,58 3,01 2 2,63 0,81 2,93 3 0,44 0,00 0,71 4 8,54 3,64 8,43 5 1,40 0,43 2,15 6 3,30 0,95 4,43 7 4,12 0,93 4,29 8 1,80 0,43 2,13 9 4,31 0,50 4,88 Przykład 5. Stabilizacja próbek moczu z dodatkiem αgst. Do dwóch próbek moczu, A i B, dodano αgst tak, aby osiągnąć pięć różnych poziomów agst (10,25,50,100 i 500 ng/ml), a następnie próbki przechowywano w obecności środka stabilizującego z przykładu 1 przez dwa dni w temperaturze 4 C. Wyniki podano w tabelach 2 i 3. Z tabel 2 i 3 wynika, że obecność środka stabilizującego chroni αgst przed spadkiem aktywności immunologicznej, ułatwiając wykrycie w stosowanym teście enzymoimmunologicznym. próbka Tabela 2 Temperatura przechowywania 4 C [αgst] ng/ml -20 C (SM) A:500 191,10 507,80 A: 100 57,22 103,20 A:50 29,48 47,11 A:25 15,35 25,90 A: 10 7,71 11,82 próbka Tabela 3 4 C [αgst] ng/ml -20 C (SM) 1 2 3 B:500 49,30 467,8 B:100 37,30 88,95
176 625 9 Tabela 3 (ciąg dalszy) 1 2 3 B:50 17,52 45,23 B:25 8,63 21,12 B:10 3,40 8,26 Przykład 6. Sporządzono dwie próbki, oznaczone jako C 200 i D 200, zawierające 200 ng/ml αgst i do każdej z nich dodano środka stabilizującego z przykładu 1. Każdą próbkę podzielono następnie na dwie części, które przechowywano w temperaturze 4 C i -20 C. Po dwóch dniach przechowywania poddano analizie próbki w różnych rozcieńczeniach (1/40-1/320) w odpowiednim rozpuszczalniku, stosując procedurę testu Nephkit opisaną w przykładzie 4. Wyniki podano w tabelach 4 i 5. Z danych przedstawionych w tabelach 4 i 5 wynika, że rozcieńczenie próbki nie wpływa na oznaczenie αgst, oraz że przechowywanie w temperaturze -20 C jest nieoczekiwanie bardziej korzystne niż przechowywanie w temperaturze 4 C. próbka Tabela 4 Temperatura przechowywania 4 C [αgst] ng/ml -20 C (SM) C 200 (1/40) 106 175 (1/80) 109 185 (1/160) 104 188 (1/320) 111 180 próbka Tabela 5 Temperatura przechowywania 4 C [αgst] ng/ml -20 C (SM) D 200 (1/40) 141 183 (1/80) 141 183 (1/160) 134 180 (1/320) 128 187
176 625 Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 2,00 zł.