(54) Kompozycja stabilizująca osocze krwi podczas pasteryzacji i sposób pasteryzacji osocza krwi

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (51) IntCl6. A61K 35/16 (54) Kompozycja stabilizująca osocze krwi podczas pasteryzacji i sposób pasteryzacji osocza krwi (30) Pierwszeństwo: ,FR, (73) Uprawniony z patentu: ASSOCIATION POUR L ESSOR DE LA TRANSFUSION SANGUINE DANS LA RE- GION DU NORD, Lille, FR (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 01/94 (72) Twórca wynalazku: Miryana Burnouf, Wavrin, FR (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 06/98 (74) Pełnomocnik: Ostrowska Elżbieta, POLSERVICE PL B1 (57) 1. Kompozycja stabilizująca osocze krwi podczas pasteryzacji, znamienna tym, że stanowi mieszaninę sorbitu w stężeniu g/l wyjściowego osocza, sacharozę w stężeniu g/l wyjściowego osocza, glukonian wapniowy w stężeniu 3-5 mm, cytrynian trójsodowy w stężeniu 8-25 mm oraz lizynę i argininę w stężeniach 1-10 g/l. 7. Sposób pasteryzacji osocza krwi polegający na ogrzewaniu plazmy, dodawaniu do niej kompozycji stabilizującej i usuwaniu cukru przed etapem ogrzewania, a następnie dializowaniu wobec określonego buforu, znamienny tym, że przed etapem ogrzewania do osocza dodaje się kompozycję stanowiącą mieszaninę sorbitu w stężeniu g/l wyjściowego osocza, sacharozę w stężeniu g/l wyjściowego osocza, glukonian wapniowy w stężeniu 3-5 mm, cytrynian trójsodowy w stężeniu 8-25 mm oraz lizynę i argininę w stężeniach 1-10 g/l, a po etapie ogrzewania cukry zawarte w kompozycji usuwa się drogą dializy w obecności buforu zawierającego cytrynian trójsodowy, glukonian wapniowy, chlorek sodowy, lizynę i argininę.

2 Kompozycja stabilizująca osocze krwi podczas pasteryzacji i sposób pasteryzacji osocza krwi Zastrzeżenia patentowe 1. Kompozycja stabilizująca osocze krwi podczas pasteryzacji, znamienna tym, że stanowi mieszaninę sorbitu w stężeniu g/l wyjściowego osocza, sacharozę w stężeniu g/l wyjściowego osocza, glukonian wapniowy w stężeniu 3-5 mm, cytrynian trójsodowy w stężeniu 8-25 mm oraz lizynę i argininę w stężeniach 1-10 g/l. 2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera sorbit w stężeniu 1300 g/l. 3. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że zawiera sacharozę w stężeniu 514 g/l. 4. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że zawiera glukonian wapniowy w stężeniu 4 mm. 5. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że zawiera cytrynian trójsodowy w stężeniu 15 mm. 6. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera lizynę i argininę w stężeniach 5 g/l. 7. Sposób pasteryzacji osocza krwi polegający na ogrzewaniu plazmy, dodawaniu do niej kompozycji stabilizującej i usuwaniu cukru przed etapem ogrzewania, a następnie dializowaniu wobec określonego buforu, znamienny tym, że przed etapem ogrzewania do osocza dodaje się kompozycję stanowiącą mieszaninę sorbitu w stężeniu g/l wyjściowego osocza, sacharozę w stężeniu g/l wyjściowego osocza, glukonian wapniowy w stężeniu 3-5 mm, cytrynian trójsodowy w stężeniu 8-25 mm oraz lizynę i argininę w stężeniach 1-10 g/l, a po etapie ogrzewania cukry zawarte w kompozycji usuwa się drogą dializy w obecności buforu zawierającego cytrynian trójsodowy, glukonian wapniowy, chlorek sodowy, lizynę i argininę. 8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że stosuje się bufor zawierający 10 mm cytrynianu trój sodowego, 4 mm glukonianu wapniowego, 0,1 M chlorku sodowego, 10 g/l lizyny i 3 g/l argininy. * * * Przedmiotem wynalazku jest kompozycja stabilizująca osocze krwi podczas pasteryzacji oraz sposób pasteryzacji osocza krwi. Kompozycja według wynalazku przeznaczona jest do użytku terapeutycznego, zwłaszcza w zabiegach wypełniania osoczem Iub zabiegach zastępowania czynnika krzepliwości krwi. Pełne Iub wolne od białka strącalnego ochłodzeniem osocze krwi stosuje się w zabiegach wypełniania w przypadku osób, które doznały poważnych poparzeń Iub ran, względnie które poddano poważnym operacjom, to jest we wszystkich przypadkach znacznej utraty płynów przez pacjenta. W zabiegach tego typu stosuje się zwykle osocze krwi od indywidualnych zdrowych dawców poddanych uprzedniej kontroli, dla uniknięcia ryzyka przekazania infekcji wirusowej. Procedura ta nie umożliwia jednak wyeliminowania wszelkiego ryzyka zanieczyszczenia wirusami, a zwłaszcza różnymi wirusami zapalenia wątroby i AIDS, w stadium przedserologicznym. Dlatego też nadal przywiązuje się wagę do rozwoju różnych sposobów inaktywacji wirusów i opracowywania kompozycji stabilizujących, umożliwiających zachowanie podstawowych biologicznych funkcji osocza. Wykazano, że wirus zapalenia wątroby B ulega pełnej inaktywacji po ogrzewaniu w 60 C przez 10 godzin w obecności 0,5 m cytrynianu sodowego (Tabor i in., Thrombosis Res. 22,1981, ). Zabieg ten prowadzi jednak do utraty aktywności biologicznej pewnych białek zawartych w osoczu (Tabor i in., Barrowcliffe i in., FR. J. Haematology, 1983, 37-46).

3 Udowodniono, że możliwe jest poddawanie różnych białek o wartości terapeutycznej, wyodrębnionych z osocza krwi, zwykłemu procesowi pasteryzacji w 60 C w ciągu 10 godzin w obecności różnych środków stabilizujących. Stwierdzono jednak, że kompozycje stabilizujące pozwalające zachować jeden z rodzajów aktywności biologicznej mogą nie mieć absolutnie żadnego wpływu na inny rodzaj aktywności. Te różne ustalenia oparte na wynikach doświadczalnych stworzyły wrażenie, iż inaktywacji wirusów w pełnym osoczu (świeżym lub zamrożonym świeżym osoczu) nie można uzyskać drogą pasteryzacji. Ze względu na medyczne zapotrzebowanie na pełne osocze, poszukuje się kompozycji zapewniających zachowanie aktywności biologicznej wszystkich ważnych ze względów terapeutycznych czynników w obecnych w osoczu poprzez ich zabezpieczenie przed denaturacją w trakcie pasteryzacji. We francuskim zgłoszeniu patentowym nr przedstawiono mieszaninę sorbitu, heparyny, lizyny i CaCl2, skutecznie stabilizującą biologiczną aktywność czynników osocza podczas pasteryzacji. Takiego osocza nie można jednak podawać pacjentom przechodzącym kurację heparyną ze względu na obecność heparyny w tej mieszaninie stabilizującej, a zatem i w gotowym preparacie. Wiedząc, że sorbit daje pewien stopień zabezpieczenia przed denaturacją cieplną, jakkolwiek niejednakowy w przypadku różnych próbek osocza, także pod względem skuteczności, poszukuje się innych dodatków, które zmieszane z sorbitem podniosłyby jego moc stabilizowania. Z drugiej strony zaobserwowano, że CaCl2 jest nietrwały w warunkach długotrwałego ogrzewania, toteż istnieje konieczność wyeliminowania jego zastosowania. Istnieje zatem zapotrzebowanie na inne kompozycje o takim samym działaniu stabilizującym. Obecnie nieoczekiwanie stwierdzono, że wad znanych kompozycji stabilizujących nie wykazuje kompozycja stabilizująca według wynalazku, która stanowi mieszaninę sorbitu w stężeniu g/l wyjściowego osocza, sacharozę w stężeniu g/l wyjściowego osocza, glukonian wapniowy w stężeniu 3-5 mm, cytrynian trójsodowy w stężeniu 8-25 mm oraz lizynę i argininę w stężeniach 1-10 g/l. Kompozycja korzystnie zawiera sorbit w stężeniu 1300 g/l, sacharozę w stężeniu 514 g/l, glukonian wapniowy w stężeniu 4 mm oraz cytrynian trójsodowy w stężeniu 15 mm. Kompozycja według wynalazku korzystnie zawiera lizynę i argininę w stężeniach 5 g/l. Sposób pasteryzacji osocza krwi według wynalazku polega na ogrzewaniu plazmy, dodawaniu do niej kompozycji stabilizującej i usuwaniu cukru przed etapem ogrzewania, a następnie dializowaniu wobec określonego buforu, a charakteryzuje się tym, że przed etapem ogrzewania do osocza dodaje się kompozycję stanowiącą mieszaninę sorbitu w stężeniu g/l wyjściowego osocza, sacharozę w stężeniu g/l wyjściowego osocza, glukonian wapniowy w stężeniu 3-5 mm, cytrynian trójsodowy w stężeniu 8-25 mm oraz lizynę i argininę w stężeniach 1-10 g/l, a po etapie ogrzewania cukry zawarte w kompozycji usuwa się drogą dializy w obecności buforu zawierającego cytrynian trójsodowy, glukonian wapniowy, chlorek sodowy, lizynę i argininę. Korzystnie stosuje się bufor zawierający 10 mm cytrynianu trójsodowego, 4 mm glukonianu wapniowego, 0,1 M chlorku sodowego, 10 g/l lizyny i 3 g/l argininy. Dzięki zawartości sacharozy, odpowiadającej około 50% ilości sorbitu, uzyskano zwiększenie mocy stabilizującej sorbitu. Glukonian wapniowy, wykazujący dobrą odporność na warunki pasteryzacji, jest bardzo dobrym zamiennikiem nietrwałego w tych warunkach CaCl2. Dodatek cytrynianu trójsodowego zwiększa działanie zabezpieczające mieszaniny, pod warunkiem odpowiedniego dobrania ilości tego związku. Zbyt mała ilość prowadzi do samorzutnej koagulacji osocza, zbyt duża zaś spowalnia działanie czynników krzepliwości przy terapeutycznym stosowaniu osocza. Na 1 litr przeznaczonego do pasteryzacji osocza stosuje się następujące ilości składników kompozycji według wynalazku: - sorbit: g, korzystnie 1300 g, - sacharoza: g, korzystnie 514 g, - glukonian wapniowy: 3-5 mm, korzystnie 4 mm,

4 cytrynian trójsodowy: 8-25 mm, korzystnie 15 mm, - lizyna: 1-10 g, korzystnie 5 g, - arginina: 1-10 g, korzystnie 5 g. Kompozycję według wynalazku dodaje się do świeżego osocza albo do uprzednio zamrożonego, odmrożonego świeżego osocza, względnie do osocza wolnego od białek strąconych w krioprecypitacie, po czym osocze w stanie ciekłym poddaje się pasteryzacji drogą ogrzewania w 60 C ± 1 C w ciągu 10 godzin. Po pasteryzacji temperaturę obniża się stopniowo do 20 C i roztwór dializuje się w celu usunięcia sorbitu i sacharozy. Jako bufor o ph 7,5 stosuje się w dializie bufor zawierający 10 mm cytrynianu trójsodowego, 4 mm glukonianu wapniowego, 0,1 M chlorku sodowego, lizynę w stężeniu 10 g/litr i argininę w stężeniu 3 g/litr. Można także stosować inne bufory dializy, w zależności od potrzeb. Następnie roztwór zatęża się dla przywrócenia fizjologicznej zawartości białek osocza. Powstały roztwór klaruje się przez przesączenie, a potem poddaje filtracji sterylizującej, dozuje do pojemników i poddaje głębokiemu mrożeniu lub liofilizacji. Cechą sposobu pasteryzacji według wynalazku jest to, że do osocza przed etapem ogrzewania dodaje się kompozycję stabilizującą według wynalazku, a po etapie ogrzewania prowadzi się dializę wobec wyżej zdefiniowanego buforu. Ten sposób jest szczególnie korzystny, gdyż można go stosować w przypadku dużej ilości osocza z różnych pobrań, wynoszącej od 1 litra do kilkuset litrów. Przeprowadzono szereg operacji pasteryzacji sześćdziesięciolitrowych i większych porcji osocza i przy odpowiedniej kontroli uzyskano produkty o jednakowej, powtarzalnej jakości biochemicznej. Zakresem wynalazku objęte są także pasteryzowane roztwory osocza otrzymane sposobem według wynalazku, zawierające pełne osocze lub osocze wolne od pewnych białek (takich jak białka strącone w krioprecypitacie) i przeznaczone do użytku terapeutycznego, albo w celu zastąpienia pełnego osocza, albo w celu uzupełnienia niedoboru określonego czynnika krwi. Kompozycję i sposób według wynalazku można zastosować w przypadku osocza pochodzenia zwierzęcego. Korzystnie stosuje się je w przypadku surowicy płodu bydlęcego stosowanej jako dodatek w hodowli komórek, szczególnie przeznaczonych do wytwarzania środków farmaceutycznych. Wynalazek ilustruje poniższy przykład, nie stanowiący ograniczenia jego zakresu. P r z y k ł a d. Do 60 litrów rozmrożonego osocza dodano w trakcie łagodnego mieszania mieszaninę o następującym składzie podanym w przeliczeniu na 1 litr wyjściowego osocza: sorbit 1300 g sacharoza 514 g glukonian wapniowy 4 mm cytrynian trójsodowy 15 mm lizyna 5 g arginina 5 g Pasteryzację prowadzono w termostatowanym zbiorniku drogą ogrzewania w 60 C przez 10 godzin. Po pasteryzacji temperaturę stopniowo obniżono do 20 C, po czym roztwór poddano dializie dla usunięcia sorbitu i sacharozy. Dializę można prowadzić np. w kasetowym zestawie do ultrafiltracji Pellicon. Skład buforu stosowanego w dializie był następujący: cytrynian trójsodowy 10 mm lizyna 10 g/litr arginina 3 g/litr glukonian wapniowy 4 mm chlorek sodowy 0,1 M Skuteczność usunięcia sorbitu i sacharozy bada się poddając gotowy produkt analizie odpowiednio kolorymetrycznej i enzymatycznej. Po dializie można przeprowadzić, w razie takiej potrzeby, zatężanie z użyciem tego samego urządzenia, dla przywrócenia zawartości czynnika krzepliwości około 1 jednostki/ml, co odpowiada jego zawartości w terapeutycznym osoczu dobrej jakości. Produkt dializuje się przy ciśnieniu osmotycznym 370 mosmoli/litr i ph 7-7,5.

5 Następnie produkt sterylizuje się drogą filtracji, np. z użyciem filtra Millipack 40 (Millipore) o porach 0,22 μm. Następnie produkt m dozuje się do plastykowych worków lub butli i poddaje się go głębokiemu zamrażaniu lub liofilizacji. Skuteczność pasteryzacji pod względem inaktywacji wirusów oceniono z użyciem zestawu wirusów zalecanego przez grupę ekspertów z dziedziny biotechnologii/farmakologii, należących do europejskich autorytetów zajmujących się badaniem procesów eliminowania wirusów i inaktywacji wirusów w produktach biologicznych. Wyniki próby przedstawiono w tabeli 1. Tabela 1 Wirus Genom Budowa Zmniejszenie zdolności zakażania (log 10) Czas trwania Wirus HI V RNA E >5 <10 minut Wirus Polio Sabin 1 RNA NE >6,23 <5 godzin Wirus krowianki DNA E >4,30 <1 godziny Wirus Herpes-Aujeszky DNA E >4,15 <5 godzin Wirus parainfluency typ 3 RNA E >6,30 <2 godzin Reowirus typ 3 RNA NE >3,28 <10 godzin Wirus Sindbis RNA E >5,74 <5 godzin E - z otoczką NE - bez otoczki Wyniki kontroli jakości, której poddano sześć kolejnych partii pilotowych podano w poniższych tabelach 2-3. Tabela 2 Odzyskiwanie czynników krwi Czynnik Stężenie (jednostka/ml) Wydajność(%) Białka (g/litr) 60,0 ± ± 2 Czynnik VIII: C (jednostek międzynarodowych/ml) 1,10±0,26 94 ± 7 Czynnik VIII: C (chromogeniczny) 0,70 ±0,09 83 ± 13 Czynnik V: C 1,12 ±0,25 83 ± 4 Czynnik XI: C 0,64 ±0,10 88 ± 7 Czynnik VII: C 0,65 ±0,05 59 ± 7 Fibrynogen Ag (g/litr) 3,10 ±0,28 67 ± 6 Fibrynogen zdolny do krzepnięcia (g/litr) 2,50 ±0,17 92 ± 3 Aktywność antytrombiny III (g/litr) 0,99 ±0,04 92 ± 3 Aktywność α-l-antytrypsyny (g/litr) 0,96 ±0,10 92 ± 3 APTT sekund -

6 Tabela 3 Kontrola jakości: brak proteaz i produktów rozkładu Czynnik Stężenie (jedn./litr) Trombina <0,01 PKA (%) <2 Kalikreina (%) 3 Czynnik IXa (jednostki/ml) <0,1 Czynnik Xa (jednostki/ml) <0,1 Czynnik VIIb/F VIIa 0,97 Aktywność proteolityczna (S.2288-OD/mn) 0,03 Produkty rozkładu fibrynogenu (ng/ml) <250 Kontrolę jakości in vivo przeprowadzono w testach na zwierzętach. W teście na szczurach ciśnienie krwi spadło po podaniu osocza o mniej niż 2%, tętno pozostało niezmienione, a po dożylnym podaniu w dawce 25 ml/kg nie stwierdzono toksyczności. W teście na królikach nie stwierdzono obecności ciał gorączkotwórczych. Osocze pasteryzowane w obecności kompozycji według wynalazku spełnia wszystkie normy dla produktu do użytku terapeutycznego. Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 2,00 zł