SIR MYCOPLASMA TESTÓW

Transkrypt

1 SIR MYCOPLASMA TESTÓW OZNACZANIE WRAŻLIWOŚCI NA ANTYBIOTYKI MYKOPLAZM UROGENITALNYCH 1- ZASTOSOWANIE KLINICZNE Zestaw SIR MYCOPLASMA jest przeznaczony do oznaczania wrażliwości na antybiotyki mykoplazm urogenitalnych: Ureaplasma spp (Ureaplasma urealyticum, Ureaplasma parvum) oraz Mycoplasma hominis (Mh). Obecnie, zróżnicowanie Ureaplasma urealyticum i U. parvum jest trudne. Mikropłytka SIR MYCOPLASMA zawiera 8 antybiotyków aktywnych wobec tych drobnoustrojów i używanych powszechnie w leczeniu zakażeń urogenitalnych. Pojawienie się szczepów opornych, zwłaszcza na tetracykliny i makrolidy (antybiotyki z wyboru w leczeniu tych zakażeń), stwarza konieczność oznaczania wrażliwości, aby uniknąć niepowodzenia terapeutycznego (10, 11, 18). Dzięki zastosowaniu wystandaryzowanego inokulum uzyskuje się wysoką zgodność z metodami referencyjnymi (9). 2- ZASADA TESTU SIR MYCOPLASMA jest testem wrażliwości wykonywanym w płynnym podłożu, gdzie każdy antybiotyk występuje w dwóch różnych stężeniach (doksycyklina, tetracyklina, azytromycyna, josamycyna, erytromycyna, ofloksacyna) lub w pojedynczym stężeniu (klindamycyna, pristinamycyna). Test wykorzystuje zjawisko zahamowania metabolicznego. Wzrost mykoplazm jest obiektywnie twierdzany w oparciu o ich aktywność metaboliczną, hydrolizę mocznika w podłożu U9 przez Uu i hydrolizę argininy w podłożu z argininą przez Mh, z uwolnieniem amoniaku, który alkalizuje podłoże powodując zmianę barwy wskaźnika ph, (czerwieni fenolowej), z żółtej na czerwoną. Gdy drobnoustrój jest wrażliwy na badany antybiotyk, jego metabolizm jest zahamowany i podłoże pozostaje żółte. Jeśli badany szczep jest oporny, w wyniku jego wzrostu obesrwujemy zmianę barwy podłoża na czerwoną. 3- ZAWARTOŚĆ Test SIR MYCOPLASMA obejmuje: 10 mikropłytek SIR (schemat 16 dołków jest narysowany na etykiecie, co pozwala na identyfikację próbek). 10 folii samoprzylepnych. 1 instrukcję obsługi. Każda mikropłytka jest osobno zapakowana w folię aluminiową z pochłaniaczem wilgoci. 4- PRZECHOWYWANIE Zestaw SIR MYCOPLASMA przechowywany w temp C, może być używany do daty ważności podanej na opakowaniu. 5- SPRZĘT WYMAGANY (NIE DOSTARCZONY) bulion U9: kod (opakowanie zawierające 10 ampułek liofilizatu U9 Q.S.P. 2 ml) bulion argininowy: kod (opakowanie zawierające 10 ampułek liofilizatu Q.S.P. 2 ml) MYCOPLASMA DUO (opakowanie zawierające 20 testów kod 62740) Jałowa woda destylowana Pipety 2 ml, 200 µl, 100 µl, 20 µl Inkubator o temp. 37 C Pojemnik na odpady skażone 6- ZASADA DZIAŁANIA TESTU A) MIKROPŁYTKA SIR Mikropłytka zawiera 2 rzędy po 8 studzienek, zawierających różne antybiotyki. Zostają one uwodnione w czasie nanoszenia inokulum. Stężenia antybiotyków są zbliżone do stężeń granicznych, co pozwala na zakwalifikowanie szczepu jako wrażliwy (Sensitive), średnio-wrażliwy (Intermediate) lub oporny (Resistant).

2 Kontrola wzrostu przy braku antybiotyku Doksycyklina (4 mg/l i 8 mg/l) Tetracyklina (4 mg/l i 8 mg/l) Azytromycyna (2 mg/l i 4 mg/l) Jozamycyna (2 mg/l i 8 mg/l) Erytromycyna (1 mg/l i 4 mg/l) Klindamycyna (2 mg/l) Pristynamycyna (2 mg/l) Ofloksacyna (1 mg/l i 4 mg/l) B) WYBÓR ANTYBIOTYKÓW Wyboru antybiotyków, które mają być testowane, dokonano na podstawie zaleceń terapeutycznych w leczeniu zakażeń mykplazmami u noworodków oraz zakażeń układu płciowego (17). Do chwili obecnej brak jest danych na temat stężenia krytycznego swoistego dla mykoplazm; wynikiem tego, stężenia krytyczne wybrane dla palenu SIR MYCOPLASMA bazują na danych z prac badawczych i/lub zalecanych przez stowarzyszenia medyczne takie jak CA SFM (Antibiogram Committee French Microbiological Society). Dobór stężeń azytromycyny jest wynikiem ewaluacji prowadzonej z użyciem szczepów klinicznych (19). Tetracykliny: tetracyklina i doksycyklina (w stężeniach 4 i 8 mg/l). Szczepy Mh i Ureaplasma spp. opisywane jako oporne na tetracykliny są w jednoznaczny sposób wykrywane od opublikowania, iż Minimalne Stężenie Hamujące [Minimum Inhibitory Concentration] (MIC) wynosi 8 mg/l w porównaniu do MIC 2 mg/l dla szczepów wrażliwych (15, 18). W przypadku tej grupy antybiotyków opisana jest oporność niskiego stopnia, której stwierdzenie wymaga czasu inkubacji wynoszącego 48 godzin (19). Częstość występowania oporności na tetracykliny wśród szczepów mykoplazm urogenitalnych różni się w zależności od kraju i poziomu ekspozycji na antybiotyki (18). Makrolidy: erytromycyna (w stężeniach 1 i 4 mg/l), azytromycyna (w stężeniach 2 i 4 mg/l), josamycyna (w stężeniach 2 i 8 mg/l). Szczepy Mh są naturalnie oporne na erytromycynę i azytromycynę. Josamycyna pozostaje aktywna. Konsekwentnie, wyniki otrzymane dla tych antybiotyków powinny potwierdzić uzyskaną uprzednio identyfikację szczepów. Częstość nabytej oporności na makrolidy wśród szczepów Mh i Ureaplasma spp izolowanych od szczepów klinicznych nie jest znana, ale prawdopodobnie jest bardzo niska (18). Linkozamidy: klindamycyna (w stężeniu 2 mg/l). Szczepy Ureaplasma spp są naturalnie oporne na ten antybiotyk (18). Streptograminy: pristynamycyna (w stężeniu 2 mg/l). Szczepy bakterii Mycoplasma są wysoce wrażliwe na ten antybiotyk. Fluorochinolony: ofloksacyna (w stężeniach 1 i 4 mg/l). Antybiotyk ten jest aktywny w stosunku do Mh i Ureaplasma spp. Częstość występowania oporności nie jest dobrze poznana, szacunkowo wynosi poniżej 1% w przypadku Ureaplasma spp. (6, 18). C) WYKONANIE ANTYBIOGRAMU Test wrażliwości można wykonać z zawartości dołka X testu MYCOPLASMA DUO (kod 62740). Należy zapoznać się z rekomendacjami dotyczącymi warunków przechowywania (czas i temperatura) materiałów biologicznych (13). 1) Standaryzacja inokulum W celu wykonania antybiogramu z inokulum 10 3 do 10 5 CCU/ml (CCU = Colour Changing Units), konieczne jest przeprowadzenie hodowli wstępnej w podłożu zaszczepionym materiałem klinicznym. Wstępna hodowla (prowadzona według protokołu opisanego poniżej) prowadzi do wzrostu mykoplazm i uzyskania maksymalnego miana 10 6 do 10 7 CCU/ml. Rozcieńczenie wstępnej hodowli w stosunku 1/100 w bulionie U9 lub bulionie argininowym, w zależności od wyizolowanych gatunków, pozwala na uzyskanie wystandaryzowanego inokulum.

3 WYKORZYSTANIE MYCOPLASMA DUO W przypadku wykonywania antybiogramu, użycie zawartości dołka X z płytki MYCOPLASMA DUO, po 24 lub 48 godzinach dla Mh, i po 24 godzinach dla Ureaplasma spp, odpowiada hodowli wstępnej; zawartość dołka, należy rozcieńczyć za pomocą bulionu U9 lub bulionu argininowego, zgodnie z protokołem opisanym poniżej, w celu otrzymania wystandaryzowanego inokulum. 1. W przypadku Mycoplasma hominis Pobierając materiał z dołka X (po 24 lub 48 godzinach inkubacji), wykonać rozcieńczenie w stosunku 1/100 w bulionie argininowym (20 µl zawartości dołka X w 2 ml bulionu argininowego). 2. W przypadku Ureaplasma spp Po 24 godzinach inkubacji: wykonać rozcieńczenie zawartości dołka X w stosunku 1/100 w bulionie U9 (20 µl zawartości dołka X w 2ml bulionu U9). Po 48 godzinach inkubacji: w tym przypadku, nie jest możliwe wykorzystanie zawartości dołka X, ponieważ istnieje ryzyko, że bakterie Ureaplasma mogły ulec procesowi autolizy. Należy wykonać rozcieńczenie zawiesiny podłoża transportowego przechowywanego w temperaturze + 4 C w stosunku 1/10 (200 µl w 2 ml bulionu U9). KORZYSTANIE Z PODŁOŻA NAMNAŻAJĄCEGO DLA MYKOPLAZM Próbką zawierającą materiał z układu moczowo-płciowego można posiać na podłoże hodowlane swoiste dla mykoplazm (15). W przypadku oczekiwania na identyfikację i wyniki ilościowe, antybiogram można wykonać później, a podłoże może być przechowywane w temperaturze +4 C (porównaj z ulotką dołączona do opakowania używanego podłoża hodowlanego). Następnie, w celu namnożenia mykoplazm, zalecana jest 16-godzinna inkubacja zaszczepionego podłoża w temperaturze 37 C. Uzyskiwane zazwyczaj miano wynosi CCU/ml. Zgodnie z opublikowanymi zaleceniami (15) sugeruje się, aby do wykonania antybiogramu stosować wystandaryzowane inokulum. Zatem, 20 µl wzbogaconego podłoża hodowlanego rozcieńcza się w 2 ml bulionu U9 lub bulionu argininowego (rozcieńczenie stosunku 1/100), w zależności od zidentyfikowanego szczepu mykoplazm. 2) Nanoszenie wystandaryzowanego inokulum 100 µl wystandaryzowanego materiału inokulacyjnego (rozcieńczenie hodowli wstępnej w stosunku 1/100 za pomocą bulionu U9 lub bulionu argininowego) nanosi się do każdego dołka mikropłytki SIR Mycoplasma. Mikropłytkę należy przykryć folią adhezyjną i inkubować w temperaturze 37 C przez 48 godzin.

4

5 D) PRÓBKI ZAWIERAJĄCE Ureaplasma spp i Mh W tym przypadku, należy zaszczepić 2 mikropłytki SIR: jedną z użyciem wystandaryzowanego inokulum przygotowanego w bulionie U9 (w przypadku antybiogramu dla szczepu Ureaplasma spp), a drugą z użyciem wystandaryzowanego inokulum przygotowanego w bulionie argininowym (w przypadku antybiogramu dla szczepu Mh). 7- INTERPRETACJA WYNIKÓW Odczyt testu można wykonać gdy dołki z kontrolą wzrostu zmienią kolor z żółtych na czerwone. Odczytu dokonuje się po 24 godzinach, a następnie po 48 godzinach. Odczyt po 48 godzinach pozwala na wykrycie niskiego poziomu oporności na tetracykliny (19) i potwierdzenie wyników, kiedy wyjściowe inokulum miało niskie miano (10 3 CCU/ml) lub kiedy zmiana koloru jest wątpliwa po 24 godzinach. 2 żółte dołki: Brak wzrostu Szczep wrażliwy 2 czerwone dołki: Wzrost w obecności antybiotyku Szczep oporny Dołek z niskim stężeniem antybiotyku: czerwony Dołek z wysokim stężeniem antybiotyku : żółty Szczep średnio-wrażliwy W przypadku klindamycyny i pristinamycyny, występujących tylko w jednym stężeniu, można uzyskać jeden z dwóch wyników: wrażliwy lub oporny. Przykład: żółty / żółty: S Szczep wrażliwy [Sensitive strain] czerwony / żółty: I Szczep pośredni [Intermediate strain] czerwony / czerwony: R Szczep oporny [Resistant strain] Szczególny przypadek: gdy obserwuje się kolor pomarańczowy. Można go zaobserwować na początku fazy zmiany z koloru żółtego na czerwony, co powoduje powstanie pomarańczowego koloru w dołkach o niskim stężeniu antybiotyku. Wynik taki należy zinterpretować jako wynik dodatni, a wyraźną zmianę koloru można uzyskać po 48 godzinach. 8- KONTROLA JAKOŚCI PRODUCENTA Każdy produkt wytwarzany i sprzedawany przez Bio-Rad, został przygotowany zgodnie z naszym systemem jakości, poczynając od materiałów wyjściowych, aż do ostatecznego produktu komercyjnego. Każda seria ostatecznego produktu podlega oznaczeniu kontrolnemu i jest dopuszczona do użytku, jeśli spełnia wymagane kryteria. Bio-Rad posiada protokoły produkcji i kontroli jakości każdej serii. 9 WEWNĘTRZNA KONTROLA JAKOŚCI Kontrolę jakości można prowadzić wykorzystując szczepy liofiliowane z kolekcji (Ureaplasma parvum ATCC ). Liofilizat zawiesić należy w 1 ml świeżo odtworzonego podłoża U9 (nr katalogowy 62762). Wykonać rozcieńczenie w świeżo odtworzonym podłożu U9 w stosunku 1/10. Zaszczepione podłoże U9 inkubować w temperaturze 37 C przez 18 godzin w atmosferze tlenowej. Po etapie namnażania, ze wzbogaconego w ureaplazmy podłoża U9, należy wykonać rozcieńczenie w stosunku 1/100 (pobrać 20 µl podłoża i dodać do 2 ml odtworzonego bulionu U9). Inokulacja mikropłytki SIR MYCOPLASMA wykonywana jest zgodnie z rutynową procedurą, tj. 100 µl zawiesiny nanosi się do każdego dołka mikropłytki SIR Mycoplasma. Mikropłytkę należy przykryć folią adhezyjną i inkubować w temperaturze 37 C przez 48 godzin. Test można odczytać kiedy dołki kontrolne wzrostu zmienią kolor z żółtych na czerwone.

6 Oczekiwany profil: Kontrola wzrostu Kontrola wzrostu DO 4 8 mg/l TE 4 8 mg/l JM 2 8 mg/l AZM 2 4 mg/l E 1 4 mg/l CM 2 mg/l PT 2 mg/l OFX 1 4 mg/l + + S S S S S/I R S S/I 10 CHARAKTERYSTYKA TESTU Dobór antybiotyków oznaczanych z użyciem testu SIR MYCOPLASMA wyewoluował stosownie do zaleceń terapeutycznych, antybiogram SIR MYCOPLASMA został ponownie oceniony pod kątem zmodyfikowanych metod leczenia. W przypadku dwóch badań opisanych poniżej, wykorzystaną metodą porównawczą było określanie Minimalnego Stężenia Hamującego [Minimum Inhibitory Concentration] w podłożu płynnym (MIC) (6, 15). Pierwsze badanie (bez dołków z azytromycyną) zostało przeprowadzone na 80 szczepach, w tym na 60 szczepach Ureaplasma spp i 20 szczepach Mycoplasma hominis (9). W przypadku szczepów Ureaplasma spp: Dla tetracyklin, odsetek zgodności wyniósł od 90 % [79,5 96,2 %] a do 95 % [86,1 99 %] a w zależności od antybiotyku. Dla makrolidów, odsetek zgodności wyniósł od 92 % [81,6 97,3 %] a do 100 % [95,1 100 %] a w zależności od antybiotyku. Dla klindamycyny, odsetek zgodności wyniósł 85 % [73,4 92,9 %] a Dla pristynamycyny, odsetek zgodności wyniósł 100 % [95,1 100 %] a. Dla fluorochinolonów, odsetek zgodności wyniósł 93 % [83,8 98,2 %] a. W przypadku szczepów Mycoplasma hominis: Odsetek zgodności wyniósł 85 % [62,1 96,8 %] a dla tetracykliny i 100 % [86,1 100 %] a dla wszystkich innych antybiotyków. Całkowita zgodność, dla wszystkich wcześniej wymienionych antybiotyków, wyniosła 94,6 % [92,4 96,4 %] a przy największej niezgodności wynoszącej 2,6 %. Żaden szczep nie został oznaczony jako wrażliwy w badaniu SIR MYCOPLASMA, gdy w metodzie porównawczej był oporny (brak bardzo dużych niezgodności). Druga ocena została przeprowadzona po zamianie minocykliny na azytromycynę w stężeniach 2 i 4 µg/ml. Badanie porównawcze przeprowadzono określając MIC w podłożu płynnym i dla dołków zawierających azytromycynę w mikroszeregu SIR MYCOPLASMA. Badane szczepy były szczepami referencyjnymi oraz dzikimi szczepami klinicznymi. Każdy materiał inokulacyjny poddano standaryzacji i potwierdzono, że mieści się w akceptowanych i zalecanych limitach, tj i 10 5 CCU/ml (15). Wyniki uzyskane za pomocą tych dwóch metod były interpretowane dla różnych stężeń zawartych w mikroszeregu jako Wrażliwy (S), Pośredni (I) lub Oporny (R). W przypadku 15 referencyjnych szczepów mycoplasma (13 szczepów ATCC Ureaplasma spp i 2 szczepy ATCC Mycoplasma hominis), odsetek zgodności w zakresie klasyfikacji klinicznej S lub R wyniósł 100 % [81,9 100 %] a. Wszystkie szczepy Ureaplasma spp wykazały profil wrażliwy, a dwa szczepy Mycoplasma hominis wykazały profil oporny, co odpowiada naturalnej oporności tego gatunku. W przypadku 15 izolatów klinicznych Ureaplasma spp, odsetek zgodności wyniósł 100 % [81,9 100 %] a pomiędzy kliniczną klasyfikacją uzyskaną w mikroszeregu SIR MYCOPLASMA oraz uzyskanych referencyjnych wartości MIC. a: [CI 95%] = 95% przedział ufności.

7 11 OGRANICZENIA TESTU W przypadku, gdy podłoże zmieni kolor na czerwony i stanie się mętne, oznacza to wzrost innych bakterii niż mycoplasma (wzrost ostatnich nie zmienia przejrzystości podłoża). Zjawisko to można zaobserwować w hodowlach z zastosowaniem bulionu argininowego i bulionu U9, jeżeli zostały one poddane inkubacji w temperaturze 37 C. Obecność innych bakterii można potwierdzić na agarze czekoladowym. Ostateczna interpretacja wyników, podobnie jak interpretacja wszystkich wyników biologicznych, nie może być przeprowadzana na podstawie jednego testu, lecz należy ją przeprowadzać na podstawie danych klinicznych oraz wyników biochemicznych, cytologicznych i immunologicznych. W przypadku, gdy materiał inokulacyjny wykorzystany do wykonania posiewu mikroszeregu SIR MYCOPLASMA posiada niskie miano (<10 3 CCU/ml), zmiana koloru w dołkach może być niemiarodajna. W przypadku, gdy wynik okaże się nieprawidłowy, zaleca sie powtórne przygotowanie wystandaryzowanego inokulum i wykonanie antybiogramu za pomocą mikroszeregu SIR MYCOPLASMA. Jeżeli, w przypadku danego antybiotyku, dołek z najwyższym stężeniem jest czerwony, a dołek z najniższym stężeniem pozostaje żółty, nie można wykorzystać wyników. Zaleca się wykonanie innego antybiogramu zaczynając od uzyskania wystandaryzowanego inokulum. Makrolidy, a w szczególności erytromycyna, są znane ze swojej wrażliwości na wartość ph (14). Można obserwować zmianę koloru w dołkach zawierających niskie stężenie antybiotyku, prowadzące do uzyskania wyniku pośredniego będącego raczej wynikiem wpływu ph niż a nie miarą aktywności antybiotyku. To zjawisko zmiany koloru można również zaobserwować w dołkach zawierających azytromycynę. 12- PIŚMIENNICTWO 1. BEBEAR C. Activité comparée de la minocycline et doxycycline sur les mycoplasmes pathogènes pour l'homme. Pathol. Bio., 1985,33, CANTET P et BEBEAR C. Activité comparée in vitro de sept quinolones sur Ureaplasma urealyticum. Pathol. Bio. 1983, 31, DAVIS J.W. Antimicrobial Susceptiblity of Ureaplasma urealyticum. J. Clin. Microb., 1981, 13, EVANS R.T and TAYLOR ROBINSON D. The Incidence of Tetracycline Resistant Strains of Ureaplasma urealyticum. J. Antimicrob. Chemother, 1978, 4, ROBERT M.C. Dissemination of the Tet M Tetracycline Resistance Determinant to Ureaplasma urealyticum. Antimicrob. Agents Chemother, 1986, 29, ROBERTSON J.A. Standardized Method for Determining Antimicrobial Susceptibility of Strains of Ureaplasma urealyticum and their Response to Tetracycline, Erythromycin and Rosaramincin. Antimicrob. Agents Chemother, 1981, 20, TAYLOR ROBINSON D. Clinical Antibiotic Resistances of Ureaplasma urealyticum. Pediatr. Infec. Dis., 1986, 5, SOBETZKO R., HARTMANN A.A., ELSNER P. Susceptibility of Ureaplasma urealyticum to Ten Chemotherapeutic Agents. Zbl.Bakt. Hyg. 1988, A269, RENAUDIN H., BEBEAR C. Evaluation des systèmes Mycoplasma Plus et SIR Mycoplasma pour la détection quantitative et l'étude de la sensibilité aux antibiotiques des mycoplasmes génitaux. Path.Biol., 1990, 38, n 5, CUMMINGS M.C., Mc CORMACK W.M. Increase in Resistance of Mycoplasma hominis to Tetracyclines. Antimicrob. Agents Chemother. 1990, 34, BAURIAUD R., SEROR C.,LARENG M.B., LEFEVRE J.C. Sensibilité in vitro aux antibiotiques des mycoplasmes génitaux isolés à Toulouse. Etude de nouvelles molécules (macrolides et quinolones).path. Biol. 1992, 40, n 5, WAITES K., DUFFY L., HAMRICK W., CROUSE D., CASSEL G. Microbiologic Efficacy of Intravenous erythromycin against Ureaplasma urealyticum in the Lower Respiratory Tract of Preterm Neonates. 10th International IOM congress Bordeaux July 19 26th 1994 Poster n 163.

8 13. BEBEAR C.M., RENAUDIN H., CHARRON A., CLERC M., PEREYRE S., BEBEAR C DNA Gyrase and Topoisomerase IV Mutations in Clinical Isolates of Ureaplasma spp. and Mycoplasma hominis Resistant to Fluoroquinolones. Antimicrob. Agents Chemother. 47: KENNY G. E, CARTWRIGHT F.D Effect of ph, Inoculum size, and Incubation time on the susceptibility of Ureaplasma urealyticum to Eryhtromycin in vitro. Clin. Infect. Dis.; 17 (Suppl 1). 15. WAITES K.B., BEBEAR C.M., ROBERTSON J.A., TALKINGTON D. F., KENNY G. E. Laboratory Diagnosis of Mycoplasmal Infections. Cumitech Basic laboratory procedures in clinical bacteriology. Geneva : World Health Organization (WHO), 1991, 1 st edition. 17. Sexually transmitted diseases treatment guidelines. MMWR May 10, 2002 / 51 / No-RR BEBEAR C.M L antibiogramme. Chap Paris : Eska Editor, 1 st edition. 19. BEBEAR C.M., RENAUDIN H Evaluation de la galerie SIR Mycoplasma incluant l azithromycine.

9 55

10 Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) /2007 Fax.: +33 (0) code: