Assessment of susceptibility of strictly anaerobic bacteria originated from different sources to fluoroquinolones and other antimicrobial drugs

Transkrypt

1 MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2012, 64: Ocena wrażliwości szczepów bezwzględnych beztlenowców pochodzących z różnych źródeł na fluorochinolony oraz inne leki stosowane w lecznictwie szpitalnym Assessment of susceptibility of strictly anaerobic bacteria originated from different sources to fluoroquinolones and other antimicrobial drugs Dominika Lachowicz 1, Ewa Skopińska 1, Jolanta Pawłowska 2, Marek Kostkiewicz 2, Piotr Obuch-Woszczatyński 1, Dorota Wultańska 1, Hanna Pituch 1 1 Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego 2 Wojewódzki Szpital Zespolony im. M. Kacprzaka w Płocku Na świecie obserwuje się wzrost oporności bakterii bezwzględnie beztlenowych na leki stosowane w lecznictwie szpitalnym, w tym na nowe fluorochinolony. W pracy potwierdzono wzrastającą oporność bezwględnych beztlenowców z grupy Bacteroides fragilis (BFG) oraz gatunku Clostridium difficile na fluorochinolony oraz inne leki stosowane w leczeniu zakażeń mieszanych, w których uczestniczą beztlenowce. Odnotowano obniżoną wrażliwość na wankomycynę u 13% szczepów C. difficile. ABSTRACT Introduction. During the past 20 years, several studies at a national level in different countries followed resistance trends for Bacteroides sp. and Clostridium difficile. This study analysed antimicrobial susceptibility 73 anaerobic bacteria strains of Bacteroides fragilis group (BFG) and C. difficile to fluoroquinolones and other antimicrobial drugs. Methods. The strictly anaerobes strains isolated in different hospitals were sent to the Department of Medical Microbiology, Medical Uniwersity of Warsaw, where species determination was carried out with the API20 ANA (biomerieux SA, Marcy-l Etoile, France) system. Susceptibility to antimicrobials was determined using E-test. Results. The rates of high resistance to ciprofloxacin and moxifloxacin of BFG was respectively 84% and 31% and among of C. difficile strains respectively 92% and 36%). The percentage of BFG strains resistant to erythromycin and clindamycin were respectively 84% and 46%. The percentage of C. difficile strains resistant to erythromycin and clindamycin was 52%. Reduced level of susceptibility of BFG strains to amoxicillin/clavulanic acid

2 116 D. Lachowicz i inni Nr 2 (8%) was confirmed. Resistance to cefoxitin was 16% of BFG strains. All tested strains as well as BFG and C. difficile were susceptible to metronidazole. Was observed reduced level (EUCAST) of susceptibility of C. difficile strains to vancomycin (13%). Conclusions. Increasing resistance to various antimicrobial agents is a significant problem in Poland. This demonstrate the need to continue with antibiotic resistance testing and surveys in anaerobic bacteria. WSTĘP Bakterie beztlenowe, w tym pałeczki Gram-ujemne z grupy Bacteroides fragilis (BFG), stanowią dominujący składnik flory fizjologicznej dolnego odcinka przewodu pokarmowego człowieka (9). Drobnoustroje należące do grupy BFG odgrywają znaczącą rolę w wielu zakażeniach mieszanych pochodzenia endogennego. W przypadku biegunek poantybiotykowych u pacjentów hospitalizowanych, najważniejszym czynnikiem etiologicznym, najczęściej pochodzenia egzogennego, jest beztlenowa Gram-dodatnia laseczka Clostridium difficile. Oporność na antybiotyki i chemioterapeutyki wśród bezwzględnych beztlenowców w ostatnich latach znacząco wzrosła (12, 14,15). Dotyczy to również nowych fluorochinolonów stosowanych w terapii, zarówno w przypadku zakażeń bakteriami Gram-ujemnymi jak i Gram-dodatnimi (4). W przypadku nowych fluorochinolonów, na które szczepy C. difficile mogą być oporne, sądzi się, że leki te prawdopodobnie miały wpływ na rozprzestrzenianie się szczepów należących do PCR-rybotypu 027 (18). Celem niniejszej pracy była ocena lekowrażliwości szczepów bezwzględnych beztlenowców: pałeczek Gram-ujemnych z grupy BFG oraz laseczek Gram- dodatnich z gatunku C. diffiicile pochodzących z różnych źródeł, na fluorochinolony oraz inne leki stosowane w lecznictwie. MATERIAŁ I METODY Badane szczepy bakteryjne. Do badań użyto 73 klinicznych szczepów bezwzględnych beztlenowców, które pochodziły z różnych źródeł, w tym: 13 szczepów nieprzetrwalnikujących pałeczek Gram-ujemnych oraz 60 szczepów z gatunku C. difficile, które zgromadzono w Katedrze i Zakładzie Mikrobiologii Lekarskiej, Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego. Szczepy wyhodowano z materiałów klinicznych pobranych od chorych hospitalizowanych w 4 szpitalach województwa warszawskiego w latach Wśród pałeczek Gram-ujemnych uwzględnionych w badaniach 7 należało do gatunku B. fragilis, po dwa do gatunku B. ovatus, B. vulgatus i nowego gatunku Parabacteroides distasonis (dawniej B. distasonis). Hodowla i identyfikacja szczepów. Uzyskane izolaty bezwzględnych beztlenowców posiano na podłoże Columbia agar z krwią baranią (biomerieux, Francja) i inkubowano w warunkach beztlenowych w temp. 37 C przez 48 godzin. Wstępnej identyfikacji szczepów dokonano na podstawie wykonania preparatu barwionego metodą Grama, a w przypadku szczepów C. difficile również na podstawie charakterystycznego wyglądu kolonii na podłożu stałym oraz ich żółto-zielonej fluorescencji w świetle UV o długości fali 365 nm

3 Nr 2 Wrażliwość beztlenowców na leki 117 i końskiego zapachu (zapach para-krezolu) (11). Dalszej identyfikacji dokonano na podstawie ustalenia profilu biochemicznego stosując testy API 20 A, które wykonano zgodnie z instrukcją producenta. Badanie lekowrażliwości szczepów. Najmniejsze stężenie hamujące wzrost szczepów (MIC) określono stosując metodę gradientowo-dyfuzyjną E-test (biomerieux, Francja). Dla szczepów bakterii Gram-ujemnych i Gram- dodatnich zastosowano paski E-test zawierające fluorochinolony: cyprofloksacynę (CI) ( 0, mg/l) i moksyfloksacynę (MX) (0, mg/l), a także paski zawierające inne leki tj. erytromycynę (EM) (zakres 0, mg/l), klindamycynę (CM) (0, mg/l), metronidazol (MZ) (0, mg/l). Dla pałeczek Gram- ujemnych dodatkowo zastosowano paski zawierające: amoksycylinę z kwasem klawulanowym (XL) (0, mg/l ), imipenem (IP) (0, mg/l), cefoksytynę (FX) (0, mg/l). Dla szczepów C. difficile zastosowano dodatkowo paski E-test zawierające wankomycynę (VA) (0, mg/l). Do oznaczeń użyto podłoża Brucella Agar z krwią baranią. Procedura wykonania testów oraz sposób odczytu wyników były zgodne z rekomendacją producenta. Do kontroli metody oznaczania wrażliwości zastosowano następujące szczepy: B. fragilis ATCC (szczep wrażliwy na metronidazol), B. fragilis NCTC (szczep oporny na metronidazol izolowany przez Inghama, otrzymany od prof. M. Sebald z Instytutu Pasteura w Paryżu), szczep B. thetaiotaomicron (ATCC 29741), szczepy E. coli i S. aureus ATCC Kryteria oporności przyjęto zgodnie z rekomendacjami CLSI a nie EUCAST ze względu na brak rekomendacji dla beztlenowców wg EUCAST dla wszystkich leków zastosowanych w niniejszej pracy. Szczepy określono jako wrażliwe lub oporne jak następuje: cyprofloksacyna 2 i 4 mg/l, moksyfloksacyna 2 i 4 mg/l, imipenem 4 i 16 mg/l, erytromycyna 2 i 8 mg/l, klindamycyna 2 i 8 mg/l, amoksycylina/kwas klawulanowy 4/2 i 16/8 mg/l, metronidazol 8 i 32 mg/l, wankomycyna 8 i 32 mg/l, cefoksytyna 16 i 64 mg/l zgodnie z zaleceniami CLSI (3). Ze względu na obniżenie wartości MIC wg EUCAST dla wankomycyny i metronidazolu wobec C. difficile jak następuje: minimalne stężenie hamujące (MIC) dla metronidazolu i wankomycyny zalecane w rekomendacjach EUCAST do określenia szczepów C. difficile jako wrażliwe (S) bądź oporne (R) wynoszą S 2mg/L i R>2 mg/l, zastosowano to kryterium dla celów porównawczych (3). WYNIKI W tabeli I przedstawiono wyniki oznaczania lekowrażliwości szczepów należących do grupy B. fragilis (BFG). Oporność na cyprofloksacynę i moksyfloksacynę stwierdzono odpowiednio u 11 (84%) i 4 (31%) izolatów. Oporność na erytromycynę i klindamycynę stwierdzono odpowiednio u 11 (84%) (zakres mg/l) i 7 (46%) (zakres mg/l). Oporność na pozostałe leki wyniosła: w przypadku imipenemu - 8% i cefoksytyny - 16%. Zaobserwowano natomiast obniżoną wrażliwość na amoksycylinę/kwas klawulanowy u 8% szczepów. Wszystkie badane izolaty były wrażliwe na metronidazol. Wyniki oznaczania lekowrażliwości 60 klinicznych szczepów C. difficile przedstawiono w tabeli II i III. Wśród badanych szczepów 57 (95%) było opornych na cyprofloksacynę a 22 (36%) na moksyfloksacynę. Oporność na dwa badane fluorochinolony zaobserwowano u 21 (35%) przebadanych szczepów. Wszystkie badane szczepy były wrażliwe wg danych CLSI

4 118 D. Lachowicz i inni Nr 2 Tabela I. Wartości graniczne minimalnego stężenia hamującego (MIC=mg/L) wg CLSI dla 8 leków oraz liczba i odsetek szczepów z grupy BFG wrażliwych, średniowrażliwych i opornych na poszczególne leki. AB 1 EM 2 CM 2 CI 2 MX 2 XL 2 IP 2 FX 2 MZ 2 Wartości graniczne Liczba szczepów BFG na metronidazol i wankomycynę. Natomiast zgodnie z rekomendacjami EUCAST osiem szczepów C. difficile miało obniżoną wrażliwość na wankomycynę (MIC dla wankomycyny dla sześciu szczepów wyniósł 1 mg/l a dla dwóch szczepów 1,5 mg/l). Natomiast 52% szczepów było opornych na erytromycynę i klindamycynę (MIC 256 mg/l). DYSKUSJA Udział procentowy W 2 1 8% Śr >2<8 1 8% O % W % Śr >2<8 1 8% O % W 2 1 8% Śr >2<4 1 8% O % W % Śr >2<4 3 23% O % W % Śr >4<16 1 8% O 16 W % Śr >4<16 1 8% O % W % Śr >16<64 O % W % Śr >8<32 O 32 1 AB-antybiotyki lub chemioterapeutyki; n-liczba szczepów; 2 EM, CM, CI, MX, XL, IP, FX, MZ odpowiednio: erytromycyna, klindamycyna, cyprofloksacyna, moksyfloksacyna, amoksycylina z kwasem klawulanowym, imipenem, cefoksytyna, metronidazol, - wartości ustalone według zaleceń CLSI. W ostatnich 30 latach odnotowano znaczący wzrost oporności bakterii bezwzględnie beztlenowych na leki stosowano w terapii empirycznej zakażeń spowodowanych przez drobnoustroje beztlenowe. Obserwuje się znaczący wzrost oporności na klindamycynę

5 Nr 2 Wrażliwość beztlenowców na leki 119 Tabela II. Liczba i odsetek wrażliwych, średniowrażliwych i opornych 60 klinicznych szczepów C. difficile na 6 leków. AB Wartości graniczne mg/l Liczba szczepów Udział procentowy W % EM Śr >2<8 O % W % CM Śr >2<8 4 7% O % W 2 2 3% CI Śr >2<4 1 2% O % W % MX Śr >2<4 1 2% O % W % MZ Śr >8<32 O 32 W % VA Śr >8<32 O 32 1 AB-antybiotyki lub chemioterapeutyki; 2 EM, CM, CI, MX, MZ, VA odpowiednio: erytromycyna, klindamycyna, cyprofloksacyna, moksyfloksacyna, metronidazol, wankomycyna, (-) brak szczepów, - wartości ustalone według zaleceń CLSI czy cefoksytynę (1). W przeprowadzonym badaniu wśród pałeczek Gram-ujemnych zaobserwowano wysoki odsetek szczepów opornych na erytromycynę (84%) i klindamycynę (46%). Podobną oporność na klindamycynę na poziomie prawie 48% opisano w Hiszpanii w 2006 roku (2). W innych krajach odsetek szczepów opornych oscyluje w granicy 30% (10,14,16). Zbadane izolaty wykazały wrażliwość na amoksycylinę z kwasem klawulanowym, jednak na świecie odnotowywano oporność również na ten lek i tak np. w Hiszpanii zaobserwowano ją na poziomie 18% (2). Poziom oporności na fluorochinolony wśród pałeczek z grupy BFG różni się w zależności od zastosowanego leku. Przebadane szczepy były oporne na cyprofloksacynę aż w 84% natomiast na moksyfloksacynę w 31%. Zarówno w Stanach Zjednoczonych jak i w Niemczech poziom oporności na moksyfloksacynę byłpodobny i wynosił odpowiednio 37% i 38% (1,14,15). Odsetek szczepów opornych na cefoksytynę wśród badanych izolatów pałeczek Gram-ujemnych wyniósł 16%. Podobne wyniki uzyskali Nagy i wsp. (10). Pomimo wzrastającej oporności na leki, wśród bakterii z omawianej grupy, stosowanie w terapii imipenemu ciągle przynosi dobre rezultaty. Na świecie odsetek szczepów opornych na imipenem jest niski i wynosi poniżej 1% (2,15,16). Mimo wzrastającej oporności na antybiotyki i chemioterapeutyki wydaje się, że szczepy C. difficile pozostają wrażliwe zarówno na lek pierwszego rzutu, którym jest metronidazol jak i na wankomycynę. Istotny jest fakt, że zgodnie z kryterium oporności wg CLSI wszystkie badane izolaty były wrażliwe zarówno na metronidazol i wankomycynę. Natomiast stosując

6 120 D. Lachowicz i inni Nr 2 Tabela III. Skumulowane wyniki badania minimalnego stężenia hamującego (MIC=mg/L) 6 leków wobec 60 badanych szczepów C. difficile. Minimalne stężenie hamujące (MIC) mg/l wobec szczepów C.difficile AB 1 0,012 0,016 0,023 0,032 0,047 0,064 0,094 0,125 0,19 0,25 0,38 0,5 0,75 1 1, EM CM CI MX MZ VA AB-antybiotyki lub chemioterapeutyki; n-liczba szczepów; 2 EM, CM, CI, MX, MZ, VA odpowiednio: erytromycyna, klindamycyna, cyprofloksacyna, moksyfloksacyna, metronidazol, wankomycyna.

7 Nr 2 Wrażliwość beztlenowców na leki 121 kryteria wrażliwości i oporności wg EUCAST dla wankomycyny 12% szczepów C. difficile wykazała obniżoną wrażliwośc in vitro. Zazwyczaj oporność laseczek C. difficile na erytromycynę i klindamycynę przekracza 40% badanych szczepów. Zbadane izolaty były oporne w 48% na erytromycynę i w 54% na klindamycynę. Podobny odsetek szczepów opornych na klindamycynę zaobserwowano w Kuwejcie w 2002 roku tj. 48% (8). W Polsce w latach ponad 47% szczepów było opornych na klindamycynę i erytromycynę (12). W bardzo dużym tempie narasta oporność C. difficile na nowe fluorochinolony. Dawniej uważano, że zastosowanie tych leków w terapii będzie stanowiło małe ryzyko dla rozwoju biegunki o etiologii C. difficile. Obecnie wiadomo już, że fluorochinolony zaliczane są do grupy leków o wysokim ryzyku wystąpienia biegunek o tej etiologii i sprzyjają też selekcji szczepów hiperwirulentnych (17). Obserwuje się też oporność krzyżową na te chemioterapeutyki. Badane szczepy w 95% było oporne na cyprofloksacynę a w 36% na moksyfloksacynę. Najwyższy odsetek szczepów opornych na cyprofloksacynę obserwowano w Szwecji i w Chinach, gdzie nawet 100% szczepów było wysoce opornych na ten lek (6,7). W badaniach przeprowadzonych w Kanadzie w 2005 roku również wszystkie szczepy były oporne na cyprofloksacynę, a oporność na moksyfloksacynę wyniosła 83% badanych szczepów (18). W przeglądzie europejskim z 2005 roku spośród 411 szczepów C. difficile, 134 izolaty uznano jako oporne lub średnio wrażliwe na moksyfloksacynę. Spośród tych szczepów przebadano 83, wśród których wykryto 20 szczepów o rybotypie 027. Wszystkie przebadane szczepy było oporne zarówno na cyprofloksacynę jak i na lewofloksacynę (17). W Polsce między 2004 a 2006 rokiem 98% szczepów było opornych na cyprofloksacynę, natomiast na moksyfloksacynę opornych było 38% badanych szczepów (11,12). Podsumowując należy stwierdzić, że narastanie oporności na leki stosowane lecznictwie szpitalnym wśród bakterii bezwględnie beztlenowych jest zjawiskiem niepokojącym, które należy stale monitorować. PIŚMIENNICTWO 1. Aldridge KE, O Brien M. In vitro susceptibilities of the Bacteroides fragilis group species: change in isolation rates significantly affects overall susceptibility data. J Clin Microbiol. 2002;40: Betriu C, Culebras E, Gómez M, i inni. Resistance trends of the Bacteroides fragilis group over a 10-year period, 1997 to 2006, in Madrid, Spain. Antimicrob Agents Chemother. 2008;52: Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for antimicrobial susceptibility testing of anaerobic bacteria, 7th edn. Approved Standard, Document M11-A7, Wayne, PA: CLSI, Goldstein E.J.C, Citron D.M. Resistance trends in antimicrobial susceptibility of anaerobic bacteria, Part I. Clin Microbiol Newslett 2011;33: CAST_breakpoints_v_2.0_ pdf, Huang H, Fang H, Weintraub A, Nord CE. Distinct ribotypes and rates of antimicrobial drug resistance in Clostridium difficile from Shanghai and Stockholm. Clin Microbiol Infect. 2009;15: Huang H, Weintraub A, Fang H, i inni. Antimicrobial susceptibility and heteroresistance in Chinese Clostridium difficile strains. Anaerobe. 2010;16:633-5.

8 122 D. Lachowicz i inni Nr 2 8. Jamal WY, Mokaddas EM, Verghese TL, Rotimi VO. In vitro activity of 15 antimicrobial agents against clinical isolates of Clostridium difficile in Kuwait. Int J Antimicrob Agents. 2002;20: Nagy E. Anaerobic infections: update on treatment considerations. Drugs ;70: Nagy E, Urbán E, Nord CE. Antimicrobial susceptibility of Bacteroides fragilis group isolates in Europe: 20 years of experience. Clin Microbiol Infect. 2011;17: Pituch H. Zakażenia Clostridium difficile w Polsce nowa epidemiologia. Rozprawa habilitacyjna, Warszawski Uniwersytet Medyczny, Warszawa Pituch H, Obuch-Woszczatyński P, Wultańska D i inni. Characterization and antimicrobial susceptibility of Clostridium difficile strains isolated from diarrhoeal adult patients hospitalized in two university hospitals in Poland, J Med Microbiol. 2011;60: Rupnik M, Wilcox MH, Gerding DN. Clostridium difficile infection: new developments in epidemiology and pathogenesis. Nat Rev Microbiol. 2009;7: Seifert H, Dalhoff A; PRISMA Study Group. German multicentre survey of the antibiotic susceptibility of Bacteroides fragilis group and Prevotella species isolated from intra-abdominal infections: results from the PRISMA study. J Antimicrob Chemother. 2010;65: Snydman DR, Jacobus NV, McDermott LA, i inni. National survey on the susceptibility of Bacteroides fragilis group: report and analysis of trends in the United States from 1997 to Antimicrob Agents Chemother. 2007; 51: Snydman DR, Jacobus NV, McDermott LA i inni. Lessons learned from the anaerobe survey: historical perspective and review of the most recent data ( ). Clin Infect Dis. 2010:1;50 Suppl 1:S Spigaglia P, Barbanti F, Mastrantonio P, i inni. Fluoroquinolone resistance in Clostridium difficile isolates from a prospective study of C. difficile infections in Europe. J Med Microbiol. 2008;57: Walkty A, Boyd DA, Gravel D, i inni. Molecular characterization of moxifloxacin resistance from Canadian Clostridium difficile clinical isolates. Diagn Microbiol Infect Dis. 2010;66: Otrzymano: 19 IV 2012 r. Adres Autora: Warszawa, ul. Chałubińskiego 5, Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Warszawski Uniwersytet Medyczny