Charakterystyka wzorów lekowrażliwości szpitalnych szczepów Clostridium difficile w Polsce oraz badanie mechanizmów oporności na wybrane leki

Transkrypt

1 STRESZCZENIE W JĘZYKU POLSKIM Charakterystyka wzorów lekowrażliwości szpitalnych szczepów Clostridium difficile w Polsce oraz badanie mechanizmów oporności na wybrane leki Clostridium difficile to Gram-dodatnia, bezwzględnie beztlenowa, przetrwalnikująca laseczka, która jest najważniejszym czynnikiem etiologicznym biegunek szpitalnych. Zakażenie C.difficile (Clostridium difficile infection-cdi) może mieć stosunkowo łagodny przebieg, w postaci samoograniczającej się lub średniej biegunki, ale może też przybierać postać rzekomobłoniastego zapalenia jelita grubego lub megacolon toxicum (ostre rozdęcie okrężnicy). Głównymi czynnikami wirulencji szczepów C. difficile są toksyny: toksyna A (TcdA) (enterotoksyna), toksyna B (TcdB) (cytotoksyna) oraz wytwarzana przez część szczepów tzw. toksyna binarna (CDT). Szczepy C. difficile cechuje zmienność genetyczna. Obecnie znanych jest wiele typów genetycznych określanych, w zależności od stosowanej metody typowania molekularnego, jako: pulsotypy (NAP) - typy uzyskane na drodze elektroforezy pulsacyjnej, typy wg analizy restrykcyjnej (REA), PCR-rybotypy (PCR-RT) i toksynotypy (PCR-RFLP). W szczególności szczepy hiperepidemiczne należące do typu genetycznego o pełnej nazwie NAP1/BI/RT027/toksynotyp III, które pojawiły się w Ameryce Północnej i Europie na początku nowego tysiąclecia, stały się przyczyną wzrostu zapadalności na CDI. Szczepy, które występowały w krajach zachodnich charakteryzowała wysoka oporność na liczne antybiotyki, co z pewnością ułatwiało im przeżycie i ekspansję w środowisku szpitalnym. Szczepy należące do wyżej opisanego typu genetycznego stanowiły w latach w Polsce poważny problem epidemiologiczny. Głównym celem niniejszej rozprawy doktorskiej, będącej częścią prospektywnego badania epidemiologicznego zorganizowanego w Polsce w latach , dotyczącego zakażeń C. difficile, była charakterystyka wzorów lekowrażliwości klinicznych szczepów C. difficile występujących w polskich szpitalach. Jednocześnie celem pracy było monitorowanie oporności na wybrane antybiotyki/chemioterapeutyki stosowane w lecznictwie, w wybranych szpitalach w Polsce w latach

2 Celami szczegółowymi było: 1. Zbadanie mechanizmów genetycznej oporności/poszukiwanie determinant oporności na wybrane antybiotyki w polskich szczepach C. difficile o fenotypowej oporności na te leki. 2. Ustalenie czy istnieją powiązania między PCR-rybotypem a nabywaniem oporności na leki stosowane w lecznictwie. Materiałem do badań były 253 toksynotwórcze szczepy C. difficile wyhodowane w latach od chorych z niepowtarzalnych przypadków zakażenia C. difficile. Szczepy pochodziły głównie z dwóch okresów badawczych tj. z lutego i marca 2012 oraz z lutego i marca 2013 (wchodzących w zakres projektu badawczego numer 2011/01/B/NZ7/02720, finansowanego przez Narodowe Centrum Nauki w Krakowie) oraz z 2014 roku. Szczepy C. difficile wyhodowano od chorych hospitalizowanych w 16 szpitalach położonych w różnych regionach Polski. Toksynotwórczość szczepów C. difficile zbadano z użyciem testu immunochromatograficznego do wykrywania toksyn A/B (C.DIFF QUICK CHEK COMPLETE TECHLAB, US), metody klasycznej PCR do wykrywania fragmentów genów toksyn A, B i CDT oraz metody qpcr do wykrywania fragmentów genów toksyn C. difficile (Gene Xpert; Xpert C. difficile, Cepheid). Dwieście pięćdziesiąt trzy toksynotwórcze szczepy, o określonym metodą PCR-rybotypowania PCR-rybotypie, zbadano pod względem lekowrażliwości na 10 antybiotyków/chemioterapeutyków takich jak: metronidazol, wankomycyna, erytromycyna, klindamycyna, cyprofloksacyna, moksyfloksacyna, ryfampicyna, imipenem, tetracyklina i tygecyklina, z użyciem metody gradientowo-dyfuzyjnej E-test, dla celów badania epidemiologicznego. Dodatkowo określono wrażliwość losowo wybranych szczepów C. difficile na dwa inne karbapenemy tj. meropenem i ertapenem (n=77) oraz zbadano wrażliwość losowo wybranych szczepów C. difficile na penicylinę G (n=56) i linezolid (n=28). Metodę PCR zastosowano do wykrycia fragmentu genu ermb, najczęściej odpowiedzialnego w szczepach C. difficile za wysoką oporność jednocześnie na erytromycynę i klindamycynę. W celu zbadania mechanizmu oporności na fluorochinolony i ryfampicynę wybrano szczepy o wysokim poziomie oporności fenotypowej na te leki. Namnożone metodą PCR fragmenty genów gyra i gyrb oraz genu rpob zsekwencjonowano, w poszukiwaniu mutacji warunkujących oporność na fluorochinolony (geny gyr A i gyr B) i ryfamycyny (gen rpob). Badane pod względem lekowrażliwości 253 szczepy C. difficile należały do 25 różnych PCRrybotypów. Wśród tych szczepów największy odsetek stanowiły szczepy należące do PCRrybotypów: RT027 (65,2%), RT176 (13,0%), RT014 i bardzo do niego podobny genetycznie

3 RT020 czyli RT014/RT020 (łącznie stanowiły 5,9%) oraz RT023 (2,4%). Pozostałe PCRrybotypy (RT001, RT002, RT003, RT005, RT012, RT017, RT018, RT045, RT046, RT053, RT056, RT081, RT087, RT112, RT152, RT231 oraz cztery nieznane wcześniej PCR-rybotypy) stanowiły 13,5%. Wrażliwość na leki klinicznych szczepów C. difficile była zróżnicowana. Wszystkie 253 szczepy C. difficile, zgromadzone w latach , badane z użyciem wybranej metody do oznaczania lekowrażliwości tj. metody E-test, były wrażliwe na metronidazol (MIC90=0,5 mg/l) i wankomycynę (MIC90=0,75 mg/l). Wartości MIC dla metronidazolu były wyższe wobec szczepów należących do PCR-rybotypów hiperepidemicznych (RT027 i RT176) w porównaniu do PCR-rybotypów nieepidemicznych. Różnice te były istotne statystycznie (p<0,05), co wykazano przy użyciu testu Manna- Whitney a. Natomiast w przypadku wankomycyny różnice MIC wankomycyny wobec szczepów hiperepidemicznych, w porównaniu do szczepów nieepidemicznych, nie były istotne statystycznie (p=0,065). W przypadku erytromycyny odsetek szczepów C. difficile (wśród wszystkich badanych) opornych na ten lek wyniósł 81,0% (n=205); MIC90=256 mg/l. Odsetek szczepów opornych na klindamycynę wyniósł 17,4% (n=44); MIC90=256 mg/l. Wśród szczepów opornych na erytromycynę ustalono odsetek opornych jednocześnie na klindamycynę na 20,5%, (n=42 z 205) (MIC 256 mg/l). Wśród ogólnej liczby szczepów zgromadzonych w latach , szczepy oporne jednocześnie na erytromycynę i klindamycynę stanowiły 16,6% (42 z 253). Tylko dwa szczepy, izolowane w roku 2014, spośród 253 badanych, były oporne na klindamycynę (MIC=12 mg/l) a wrażliwe na erytromycynę. Wśród 253 szczepów 100% było opornych na cyprofloksacynę (MIC90=32 mg/l), a 80,6% (n=204) było jednocześnie opornych na moksyfloksacynę (MIC90=32 mg/l). Wrażliwość na karbapenemy była zróżnicowana. Z 253 szczepów 93,3% (n=236) było opornych na imipenem (MIC90=32 mg/l), natomiast z 77 losowo wybranych szczepów z grupy szczepów toksynotwórczych 59,7% (n=46) było opornych na ertapenem. Szczepy w 100% (n=77) były wrażliwe na meropenem (MIC90=2 mg/l). Tylko 1,6% (n=4) z 253 szczepów wykazało oporność na tetracyklinę. Nie wykryto szczepów opornych na tygecyklinę (MIC90=0,125 mg/l). Wszystkie szczepy (100%) należące do RT027 prezentowały oporność wysokiego stopnia na moksyfloksacynę (MIC 32 mg/l). Szczepy RT027, oporne na erytromycynę, stanowiły 99,4% całej puli RT027 (MIC 256 mg/l). Natomiast tylko jeden szczep C. difficile RT027 był wrażliwy na erytromycynę (MIC=1 mg/l), Wszystkie szczepy należące do RT176 były oporne na moksyfloksacynę i erytromycynę. W grupie szczepów hiperepidemicznych (RT027 i RT176) 5,4% (n=9) szczepów należących do RT027 i 84,8% (n=28) szczepów należących do RT176 było jednocześnie opornych na klindamycynę

4 i erytromycynę. Oporność zarówno na erytromycynę, moksyfloksacynę i ryfampicynę wykryto u 30,8% (n=78) badanych szczepów, z czego 74 należała do RT027. Ustalono, że polskie, kliniczne, hiperepidemiczne szczepy C. difficile (RT027 i RT176) posiadały jeden z pięciu (RT027) lub czterech (RT176) wzorów lekowrażliwości, biorąc pod uwagę kombinację wrażliwości/oporności na leki istotne w aspekcie badań epidemiologicznych tj. erytromycynę (EM), klindamycynę (CM), moksyfloksacynę (MX) i ryfampicynę (RI) gdzie R oznacza oporność a S wrażliwość: RT027 {wzór I: EM-R, CM-R, MX-R, RI-R: 3,0% (n=5); wzór II: EM-R, CM-S, MX-R, RI-R: 40,6% (n=67); wzór III: EM-R,CM-R, MX-R, RI-S: 2,4% (n=4); wzór IV: EM-R,CM-S,MX-R,RI-S: 53,4% (n=88); wzór V: EM-R, CM- R, MX-S, RI-S: 0%; wzór VI: EM-S, CM-S, MX-R, RI-S: 0,6% (n=1); wzór VII: EM-S, CM- R, MX-S, RI-S: 0%: wzór VIII: EM-R, CM-S, MX-S, RI-S: 0%; wzór IX: EM-S, CM-S, MX-S, RI-S: 0%}; RT176 {wzór I: 6,1% (n=2); wzór II: 3,0% (n=1); wzór III: 78,8% (n=26); wzór IV: 12,1% (n=4); pozostałe wzory tj. V, VI, VII, VIII i IX: 0%}. Natomiast wśród szczepów należących do innych PCR-rybotypów najwyższy odsetek tj. 78,2% (n=43) szczepów stanowiły szczepy o wzorze lekowrażliwości IX tj. szczepy wrażliwe na wszystkie badane leki, chociaż opisane powyżej wzory wrażliwości/oporności występowały w tej grupie (21,8% szczepów). Szczepy C. difficile oporne na liczne antybiotyki występowały we wszystkich szpitalach w Polsce w kolejnych latach 2012, 2013 i Obecność genu ermb potwierdzono u 29 z 44 fenotypowo opornych na klindamycynę szczepów, natomiast u 15 szczepów nie wykryto genu ermb. W obrębie genu gyra u 11 z 14 badanych szczepów wykryto jedną mutacje punktową Thr82Ile. Trzy z badanych szczepów nie posiadało powyższej mutacji. Cztery różne typy pojedynczych mutacji punktowych w obrębie genu gyrb wykryto u 4 z 14 badanych szczepów (Arg447Lys, Ser416Ala, Asp426Val, Asp426Asn). Pozostałe 10 szczepów nie posiadało mutacji w obrębie badanego fragmentu genu gyrb. Wszystkie 14 badanych szczepów charakteryzowała wysoka oporność na cyprofloksacynę i moksyfloksacynę (MIC 32 mg/l), chociaż u jednego z nich nie wykryto żadnej mutacji w obrębie badanych fragmentów genów. Wykryto 4 różne mutacje punktowe w obrębie genów rpob w 21 badanych, wysokoopornych na ryfampicynę szczepach. Każdy badany szczep posiadał co najmniej jedną mutację punktową w obrębie badanego fragmentu genu rpob. Najczęściej wykrywaną mutacją była Arg505Lys. Wykryto jedną nową, nie opisaną wcześniej w literaturze, mutację punktową w obrębie genu rpob tj. Gln489Leu.

5 Sformułowano następujące wnioski: 1. W wybranych, polskich szpitalach w latach biegunki powodowały szczepy C. difficile o dużym zróżnicowaniu genetycznym (różne PCR-rybotypy), które charakteryzowała wysoka oporność na liczne antybiotyki, co wykazano analizując lekowrażliwość tych szczepów. 2. Analiza wrażliwości na leki takie jak: erytromycyna, klindamycyna, moksyfloksacyna i ryfampicyna, przeprowadzona dla celów epidemiologicznych, wykazała występowanie w populacji polskich szczepów klinicznych C. difficile dziewięciu wzorów, wyróżnionych na podstawie kombinacji wrażliwości/oporności na wyżej wymienione leki, co świadczy o dużym zróżnicowaniu wrażliwości na leki w obrębie populacji polskich, szpitalnych szczepów C. difficile. 3. W pracy stwierdzono, że szczepy C. difficile należące do hiperepidemicznych PCRrybotypów RT027 i blisko spokrewnionego z nim RT176, stanowiły grupę najbardziej opornych na leki, co może wskazywać na związek między typem genetycznym a nabywaniem oporności na antybiotyki/chemioterapeutyki. Ostateczne ustalenie tych związków wymaga jednak dalszych badań. 4. Analiza genetycznych determinant oporności na wybrane leki wykazała istnienie podobnych mechanizmów oporności do tych jakie obserwowano w międzynarodowych szczepach C. difficile. Wykazano również, że mogą pojawiać się nowe mutacje punktowe (nie obserwowane wcześniej w szczepach C.difficile pochodzących z innych krajów), co stwierdzono w przypadku oporności na ryfampicynę. 5. W pracy stwierdzono, że szczepy C. difficile oporne jednocześnie na wiele antybiotyków występowały stale w wybranych szpitalach w Polsce w kolejnych latach okresu badawczego, niezależnie od położenia geograficznego tychże szpitali jak i ich referencyjności. 6. Stwierdzenie w niniejszej pracy wyższych wartości MIC dla metronidazolu wobec szczepów RT027 i RT176, w porównaniu do innych RT i wykazanie istotności statystycznej różnic w wartościach mediany MIC metronidazolu wobec wyżej wymienionych szczepów należących do dwóch opisanych grup PCR-rybotypów, wskazuje na niższą wrażliwość szczepów hiperepidemicznych na metronidazol i może być jedną z prawdopodobnych przyczyn braku skuteczności działania metronidazolu w przypadku leczenia pacjentów zakażonych szczepem RT027 lub RT176.

6 7. Występowanie w wybranych, polskich szpitalach z dużą częstością, szczepów C. difficile opornych na liczne antybiotyki może wskazywać na nadużywanie poszczególnych grup leków. 8. Występowanie w wybranych, polskich szpitalach szczepów C. difficile o wysokim potencjale lekooporności, wymaga opracowania skutecznych metod zwalczania niekontrolowanego rozprzestrzeniania się tych szczepów, jak też monitorowania w dalszych latach nabywania oporności na leki, w tym w szczególności na leki stosowane do zwalczania C. difficile.