(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (13) (1) T3 Int.Cl. C07K 16/28 (06.01) A61P 3/00 (06.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 13/29 EP B1 (4) Tytuł wynalazku: Cząsteczki wiążące się z ludzkim receptorem OX () Pierwszeństwo: US P (43) Zgłoszenie ogłoszono: 27.. w Europejskim Biuletynie Patentowym nr /43 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 13/12 (73) Uprawniony z patentu: Bristol-Myers Squibb Company, Princeton, US Pfizer Inc., New York, US (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 JING MIN, Chesterfield, US YANLI WU, Ballwin, US RORY FRANCIS FINN, Manchester, US BARRETT RICHARD THIELE, Saint Louis, US WEI LIAO, Chesterfield, US RONALD PAUL GLADUE, Stonington, US ARVIND RAJPAL, San Francisco, US TIMOTHY JOSEPH PARADIS, Richmond, US PETER BRAMS, Sacramento, US BRIGITTE DEVAUX, Palo Alto, US YI WU, Milpitas, US KRISTOPHER TOY, San Jose, US HEIDI N. LEBLANC, Mountain View, US HAICHUN HUANG, Fremont, US (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Katarzyna Rudnicka SULIMA-GRABOWSKA-SIERZPUTOWSKA BIURO PATENTÓW I ZNAKÓW TOWAROWYCH SP.J. skr. poczt Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 SGS-1/VAL EP B1 Opis TŁO [0001] Niniejsze ujawnienie dotyczy przeciwciał, a w szczególności przeciwciał, które wiążą się z receptorem OX. [0002] Wzmacnianie przeciwnowotworowego działania komórek T stanowi silne i nowe podejście do leczenia nowotworu. Istotnymi składnikami zaangażowanymi w wytwarzanie skutecznej przeciwnowotworowej odpowiedzi komórek T są wzmacnianie aktywności komórek T pomocniczych CD4+ do pobudzania wytwarzania przeciwnowotworowych komórek T cytolitycznych i dostarczanie sygnałów przetrwania dla komórek T pamięci i efektorowych. Kluczowym receptorem, dla którego wykazano, że pośredniczy w tych odpowiedziach jest receptor OX, Sugamura, K., Ishii, N., Weinberg, A. Therapeutic targeting of the effector T-cell co-stimulatory molecule OX. Nature Rev. Imm. 4: (04); Hori, T. Roles of OX in the pathogenesis and control of diseases. Intn. J. Hematology. 83: (06). [0003] Receptor OX (OXR) (znany również jako CD134, TNFRSF4, ACT-4, ACT3 i TXGP1L) należy do nadrodziny receptorów TNF. Stwierdzono, że OXR ulega ekspresji na aktywowanych komórkach T CD4+. Duże liczby komórek T OXR+ stwierdzono w guzach (limfocyty naciekające guz) i w drenujących węzłach chłonnych pacjentów z chorobą nowotworową (Vetto, J.T. i in Presence of the T-cell activation marker OX- on tumor infiltrating lymphocytes and draining lymph nodes cells from patients with melanoma and head and neck cancers. Am. J. Surg. 174: 28-26; Weinberg, A. D. i in. Engagement of the OX- receptor in vivo enhances antitumor immunity. J. Immunol. 164: (00); Petty, J.K., i in. Survival in human colorectal cancer correlates with expression of the T-cell costimulatory molecule OX- (CD 134). Am. J. Surg. 183: (02)). W modelach nowotworów u myszy wykazano, że zajęcie OXR in vivo podczas stymulowania guza istotnie opóźniało i zapobiegało pojawianiu się guzów w porównaniu z myszami traktowanymi kontrolą (Weinberg i in., 00). Rozważano zatem wzmacnianie odpowiedzi immunologicznej ssaka na antygen przez zajęcie receptora OXR poprzez zastosowanie środka wiążącego się z OXR (WO 99/428; Weinberg i in., 00). STRESZCZENIE [0004] Niniejsze ujawnienie dostarcza izolowane cząsteczki wiążące, jak je zdefiniowano w zastrzeżeniach, które wiążą się z ludzkim OXR, w tym przeciwciała przeciw OXR, fragmenty wiążące antygen przeciwciał przeciw OXR i pochodne przeciwciał przeciw OXR. W niektórych postaciach cząsteczka wiążąca wiąże się z ludzkim OXR z K D równą 1 x "7 M lub niższej i wykazuje działanie agonistyczne wobec ludzkiego OXR. W niektórych dalszych postaciach cząsteczką wiążącą jest ludzkie przeciwciało monoklonalne, które specyficznie wiąże się z ludzkim OXR przy K 0 równej 0 nm lub niższej. [000] Niniejsze ujawnienie dostarcza również kompozycję, która zawiera jedną lub większą liczbę cząsteczek wiążących, jak je zdefiniowano w zastrzeżeniach, i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik. W niektórych postaciach cząsteczką wiążącą jest przeciwciało przeciw OXR lub jego fragment wiążący antygen. Kompozycja może ponadto zawierać dodatkowe środki farmaceutyczne, takie jak środki chemioterapeutyczne, środki immunoterapeutyczne i terapeutyczne środki hormonalne. [0006] Niniejsze ujawnienie dostarcza ponadto cząsteczki wiążące, jak zdefiniowano powyżej, do stosowania w sposobach terapeutycznych i diagnostycznych. W niektórych postaciach sposób terapeutyczny jest sposobem leczenia lub profilaktyki nowotworu u ssaka. W niektórych innych postaciach sposób terapeutyczny jest sposobem wzmacniania odpo-

3 wiedzi immunologicznej u ssaka. W niektórych określonych postaciach cząsteczką wiążącą stosowaną w tych sposobach jest ludzkie przeciwciało monoklonalne przeciw OXR lub jego fragment wiążący antygen. [0007] Niniejsze ujawnienie dostarcza ponadto cząsteczki kwasu nukleinowego, które kodują sekwencję aminokwasową cząsteczki wiążącej, wektory obejmujące takie kwasy nukleinowe, komórki gospodarze zawierające te wektory i sposoby wytwarzania cząsteczek wiążących. [0008] Ujawnienie dostarcza również inne aspekty, które będą jasno wynikać z całego ujawnienia, włączając zastrzeżenia. KRÓTKI OPIS RYSUNKÓW [0009] Figury 1a i 1b są wykresami pokazującymi, że przeciwciało 11D4 specyficznie wiąże się z OXR; [00] Figura 2 jest wykresem pokazującym wpływ usieciowanego przeciwciała 11D4 na aktywność lucyferazy stymulowaną przez OXR; [0011] Figura 3 jest wykresem pokazującym wpływ przeciwciała 11D4 na wytwarzanie IL-2 przez komórki T stymulowane alloantygenem; [0012] Figura 4 jest wykresem pokazującym wpływ przeciwciała 11D4 na wywołane przez anty-cd3 wytwarzanie IL-2 przez pierwotne komórki T; [0013] Figura jest wykresem pokazującym wpływ przeciwciała 11D4 na wywołane przez anty-cd3 wytwarzanie IL-2 przez pierwotne komórki T makaka jawajskiego; [0014] Figura 6 pokazuje krzywe wysycenia wiązania przeciwciałem 11D4 z użyciem PBMC makaka jawajskiego od 14 dawców stymulowanych anty-cd3 i anty-cd28; [001] Figura 7 pokazuje krzywe wysycenia wiązania przeciwciałem 11D4 z użyciem ludzkich PBMC od 17 dawców stymulowanych anty-cd3 i anty-cd28; [0016] Figura 8 jest wykresem pokazującym wpływ przeciwciała 11D4 na wzrost chłoniaka B-komórkowego Raji u myszy SCID; [0017] Figura 9 jest wykresem pokazującym wpływ przeciwciała 11D4 na wzrost chłoniaka B-komórkowego Raji 21 dni po wstrzyknięciu guza; [0018] Figura jest wykresem pokazującym wpływ pojedynczego wstrzyknięcia przeciwciała 11D4 na wzrost raka gruczołu krokowego PC-3 u myszy SCID; [0019] Figura 11 jest wykresem pokazującym wpływ przeciwciała 11D4 na wzrost nowotworu gruczołu krokowego PC-3 u myszy SCID 27 dni po wstrzyknięciu guza; [00] Figura 12 jest wykresem pokazującym wpływ przeciwciała 11D4 na wzrost raka okrężnicy LOVO u myszy SCID; [0021] Figura 13 jest wykresem pokazującym wpływ przeciwciała 11D4 na wzrost raka okrężnicy LOVO u myszy SCID 2 dni po wstrzyknięciu guza; [0022] Figura 14 jest wykresem pokazującym wpływ przeciwciała 11D4 na wzrost raka sutka BT474 u myszy SCID; i [0023] Figura 1 jest wykresem pokazującym wpływ przeciwciała 11D4 na wzrost raka sutka BT474 u myszy SCID. OPIS SZCZEGÓŁOWY DEFINICJE [0024] Określenie agonista odnosi się do cząsteczki wiążącej, jak tu zdefiniowano, która po związaniu się z OXR, (1) stymuluje lub aktywuje OXR, (2) wzmacnia, zwiększa, pobudza, wywołuje lub przedłuża działanie, funkcję lub obecność OXR albo (3) wzmacnia, zwiększa, pobudza lub wywołuje ekspresję OXR. [002] Określenie przeciwciało odnosi się do cząsteczki immunoglobuliny, która składa się zwykle z dwóch identycznych par łańcuchów polipeptydowych, z których każda obejmuje jeden łańcuch lekki (L) i jeden łańcuch ciężki (H). Ludzkie łańcuchy lekkie są sklasyfikowane jako łańcuchy lekkie kappa i lambda. Łańcuchy ciężkie są sklasyfikowane

4 jako mi, delta, gamma, alfa lub epsilon i określają one izotyp przeciwciała odpowiednio jako IgM, IgD, IgG, IgA i IgE. W łańcuchach lekkich i ciężkich region zmienny i stały są połączone poprzez region J złożony z około 12 lub większej liczby aminokwasów, przy czym łańcuch ciężki zawiera również region D złożony z około 3 lub większej liczby aminokwasów. Każdy łańcuch ciężki składa się z regionu zmiennego łańcucha ciężkiego (tu w skrócie HCVR lub V H ) i regionu stałego łańcucha ciężkiego. Region stały łańcucha ciężkiego składa się z trzech domen C H 1, C H 2 i C H 3. Każdy łańcuch lekki składa się z regionu zmiennego łańcucha lekkiego (tu w skrócie LCVR lub V L ) i regionu stałego łańcucha lekkiego. Region stały łańcucha lekkiego składa się z jednej domeny, CL. Regiony stałe przeciwciał mogą pośredniczyć w wiązaniu się immunoglobulin z tkankami lub czynnikami gospodarza, w tym z różnymi komórkami układu odpornościowego (np. komórkami efektorowymi) i pierwszym składnikiem (C1q) klasycznej drogi aktywacji układu dopełniacza. Regiony V H i V L można podzielić dalej na regiony hiperzmienności, nazywane regionami determinującymi komplementarność (CDR), rozdzielone regionami, które są bardziej konserwatywne, nazywanymi regionami zrębowymi (FR). Każdy V H i V L składa się z trzech CDR i czterech FR, ułożonych od końca aminowego do końca karboksylowego w następującej kolejności: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Regiony zmienne odpowiednio każdej pary łańcuch ciężki/lekki (V H i V L ) tworzą miejsce wiążące przeciwciała. Przypisanie aminokwasów do każdego regionu lub domeny jest zgodne z definicjami SEQuences of Proteins of Immunological Interest Kabata (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 i 1991)) lub Chothia i Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: ; Chothia i in. (1989) Nature 342: Określenie przeciwciało obejmuje przeciwciało, które jest częścią multimeru przeciwciał (multimerycznej postaci przeciwciał), takiego jak dimery, trimery lub multimery wyższych rzędów z przeciwciał monomerycznych. Obejmuje ono również przeciwciało, które jest połączone z lub przyłączone do, lub w inny sposób związane fizycznie lub funkcjonalnie z cząsteczką niebędącą przeciwciałem. Określenie przeciwciało nie jest ograniczone do żadnego określonego sposobu wytwarzania przeciwciała. Przykładowo obejmuje ono między innymi przeciwciała rekombinowane, przeciwciała monoklonalne i przeciwciała poliklonalne. [0026] Określenie pochodna przeciwciała lub pochodna odnosi się do cząsteczki, która jest zdolna do wiązania się z tym samym antygenem (np. OXR), z którym wiąże się to przeciwciało i obejmuje sekwencję aminokwasową przeciwciała połączoną z dodatkową jednostką molekularną. Sekwencja aminokwasowa przeciwciała zawarta w pochodnej przeciwciała może być przeciwciałem pełnej długości lub może być jakąkolwiek częścią lub częściami przeciwciała pełnej długości. Dodatkową jednostką molekularną może być cząsteczka chemiczna lub biologiczna. Przykłady dodatkowych jednostek molekularnych obejmują grupy chemiczne, aminokwasy, peptydy, białka (takie jak enzymy, przeciwciała) i związki chemiczne. Dodatkowa cząsteczka może mieć dowolną użyteczność, taką jak zastosowanie jako środek do detekcji, znacznik, marker, środek farmaceutyczny lub terapeutyczny. Sekwencja aminokwasowa przeciwciała może być przyłączona do lub połączona z dodatkową cząsteczką drogą sprzęgania chemicznego, fuzji genetycznej, wiązania niekowalencyjnego lub w inny sposób. Określenie pochodna przeciwciała obejmuje również przeciwciała chimeryczne, przeciwciała humanizowane i cząsteczki, które są uzyskane drogą modyfikacji sekwencji aminokwasowych przeciwciała przeciw OXR, takich jak konserwatywne podstawienia aminokwasów, addycje i insercje. [0027] Określenie fragment wiążący antygen przeciwciała odnosi się do jednej lub większej liczby części pełnej długości przeciwciała, które zachowują zdolność wiązania się z tym samym antygenem (np. OXR), z którym wiąże się to przeciwciało. Określenie fragment wiążący antygen obejmuje również część przeciwciała, która jest fragmentem większej cząsteczki utworzonej przez kowalencyjne lub niekowalencyjne związanie części przeciwciała z jedną lub większą liczbą dodatkowych jednostek molekularnych. Przykłady dodatkowych jednostek molekularnych obejmują aminokwasy, peptydy lub białka, takie

5 jak rdzeniowy region streptawidyny, który można wykorzystać do wytworzenia tetramerycznej cząsteczki scfv (Kipriyanov i in., (199) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-1), reszta cysteiny, peptyd markerowy lub C-końcowy znacznik polihistydynowy, który można wykorzystać do wytworzenia dwuwartościowych i biotynylowanych cząsteczek scfv (Kipriyanov i in., (1994) Mol. Immunol. 31:47-8). [0028] Określenie cząsteczka wiążąca obejmuje (1) przeciwciało, (2) fragment wiążący antygen przeciwciała i (3) pochodną przeciwciała, jak tu każde z nich zdefiniowano. [0029] Określenie wiąże się z OXR lub wiązanie się z OXR odnosi się do wiązania się cząsteczki wiążącej, jak tu zdefiniowano, z OXR w teście in vitro, takim jak test BIAcore. Wiązanie oznacza powinowactwo wiązania (K D ) równe 1 x -6 M lub mniej. [00] Określenie przeciwciało chimeryczne odnosi się do przeciwciała, które zawiera sekwencje aminokwasowe pochodzące z dwóch lub większej liczby przeciwciał. Te dwa lub większa liczba przeciwciał mogą pochodzić z tego samego gatunku lub z dwóch lub większej liczby różnych gatunków. [0031] Określenie konserwatywne podstawienie aminokwasu odnosi się do podstawienia reszty aminokwasowej przez inną resztę aminokwasową, w którym grupy R łańcuchów bocznych tych dwóch reszt aminokwasowych mają podobne właściwości chemiczne (np. ładunek lub hydrofobowość). Przykłady grup aminokwasów, które mają łańcuchy boczne o podobnych właściwościach chemicznych obejmują 1) alifatyczne łańcuchy boczne: glicyna, alanina, walina, leucyna i izoleucyna; 2) alifatyczno-hydroksylowe łańcuchy boczne: seryna i treonina; 3) łańcuchy boczne zawierające grupę amidową: asparagina i glutamina; 4) aromatyczne łańcuchy boczne: fenyloalanina, tyrozyna i tryptofan; ) zasadowe łańcuchy boczne: lizyna, arginina i histydyna; 6) kwasowe łańcuchy boczne: kwas asparaginowy i kwas glutaminowy; oraz 7) łańcuchy boczne zawierające atom siarki: cysteina i metionina. Grupami aminokwasów do konserwatywnych podstawień mogą być na przykład walina-leucyna-izoleucyna, fenyloalanina-tyrozyna, lizyna-arginina, alanina-walina, glutaminian-asparaginian i asparagina-glutamina. [0032] Określenie epitop odnosi się do tej części antygenu, która jest zdolna do specyficznego wiązania się z przeciwciałem lub receptorem komórki T lub do oddziaływania z cząsteczką w inny sposób. Epitop jest również znany w dziedzinie pod nazwą determinanta antygenowa. Epitop składa się zazwyczaj z chemicznie aktywnych powierzchniowych ugrupowań cząsteczek, takich jak aminokwasy lub węglowodany lub cukrowe łańcuchy boczne i ma zazwyczaj specyficzne cechy struktury trójwymiarowej, jak również specyficzne cechy ładunku. Epitop może być liniowy lub konformacyjny. Po wyznaczeniu pożądanego epitopu w antygenie, można wytworzyć przeciwciała przeciwko temu epitopowi, np. z użyciem opisanych tu technik. Wytwarzanie i charakteryzowanie przeciwciał może również dawać informacje o pożądanych epitopach. Na podstawie tej informacji możliwe jest następnie przeszukiwanie przeciwciał pod kątem współzawodnictwa o wiązanie się z tym samym epitopem. Podejściem do osiągnięcia tego jest przeprowadzenie badań współzawodnictwa krzyżowego, w celu znalezienia przeciwciał, które wiążą się ze sobą w sposób współzawodniczący, tj. przeciwciała współzawodniczą o wiązanie się z antygenem. Wysokowydajny proces grupowania przeciwciał na podstawie ich współzawodnictwa jest opisany w publikacji PCT nr WO 03/ [0033] Określenie linia zarodkowa odnosi się do sekwencji nukleotydowych genów i segmentów genów przeciwciał, które są przekazywane od rodziców do potomstwa przez gamety. Sekwencja linii zarodkowej jest odróżniana od sekwencji kodujących przeciwciała w dojrzałych komórkach B, które zostały zmienione drogą zdarzeń rekombinacji i hipermutacji w trakcie dojrzewania komórek B. [0034] Określenie komórka gospodarz odnosi się do komórki, do której wprowadzono wektor ekspresyjny. To określenie obejmuje nie tylko daną określoną komórkę, ale także potomstwo takiej komórki. Ponieważ w kolejnych pokoleniach mogą pojawić się pewne modyfikacje spowodowane mutacją lub wpływem środowiska, takie potomstwo może nie

6 być identyczne z komórką rodzicielską, ale nadal jest objęte zakresem określenia komórka gospodarz. Określenie ludzkie przeciwciało odnosi się do przeciwciała składającego się wyłącznie z sekwencji aminokwasowych ludzkich sekwencji immunoglobulin. Ludzkie przeciwciało może zawierać mysie łańcuchy węglowodanowe, gdy jest wytwarzane u myszy, w mysiej komórce lub w hybrydomie uzyskanej z mysiej komórki. Ludzkie przeciwciała można wytwarzać na wiele różnych sposobów znanych w dziedzinie. [003] Określenie przeciwciało humanizowane odnosi się do przeciwciała chimerycznego, które zawiera reszty aminokwasowe pochodzące z sekwencji ludzkich przeciwciał. Humanizowane przeciwciało może zawierać niektóre lub wszystkie CDR ze zwierzęcego przeciwciała innego niż ludzkie, podczas gdy regiony zrębowe i stałe przeciwciała zawierają reszty aminokwasowe pochodzące z sekwencji ludzkich przeciwciał. [0036] Określenie ssak odnosi się do jakiegokolwiek gatunku istot żywych z gromady ssaków. Przykłady ssaków obejmują: ludzi, zwierzęta laboratoryjne, takie jak szczury, myszy, małpy i świnki morskie; zwierzęta domowe, takie jak koty, psy, króliki, bydło, owce, kozy, konie i świnie; oraz dzikie zwierzęta żyjące w niewoli, takie jak lwy, tygrysy, słonie i tym podobne. [0037] Określenie izolowany kwas nukleinowy odnosi się do cząsteczki kwasu nukleinowego o pochodzeniu genomowym, z cdna lub syntetycznym, lub ich połączeń, która jest oddzielona od innych cząsteczek kwasu nukleinowego obecnych w naturalnym źródle kwasu nukleinowego. Przykładowo w odniesieniu do genomowego DNA, określenie izolowany obejmuje cząsteczki kwasu nukleinowego, które są oddzielone od chromosomu, z którym to genomowe DNA jest naturalnie związane. Korzystnie izolowany kwas nukleinowy jest wolny od sekwencji, które naturalnie otaczają ten kwas nukleinowy (tj. sekwencji zlokalizowanych na końcach ' i 3' interesującego kwasu nukleinowego) w genomowym DNA organizmu, z którego pochodzi ten kwas nukleinowy. [0038] Określenie izolowane przeciwciało lub izolowana cząsteczka wiążąca odnosi się do przeciwciała lub cząsteczki wiążącej, które: (1) nie są związane z naturalnie związanymi składnikami, które towarzyszą im w ich stanie natywnym; (2) są wolne od innych białek z tego samego gatunku; (3) ulegają ekspresji w komórce z innego gatunku; lub (4) nie występują w przyrodzie. Przykłady izolowanych przeciwciał obejmują przeciwciało przeciw OXR, które zostało wyizolowane na podstawie powinowactwa z użyciem OXR, przeciwciało przeciw OXR wytworzone przez hybrydomy lub inne linie komórkowe in vitro i ludzkie przeciwciało przeciw OXR pochodzące z transgenicznego zwierzęcia. [0039] Określenie K D odnosi się do stałej równowagi dysocjacji dla określonego oddziaływania przeciwciało-antygen i jest stosowane do opisania powinowactwa wiązania między ligandem (takim jak przeciwciało) i białkiem (takim jak OXR). Im mniejsza stała równowagi dysocjacji, tym silniej związany jest ligand, lub tym wyższe jest powinowactwo między ligandem i białkiem. K D można zmierzyć metodą powierzchniowego rezonansu plazmonowego, na przykład z użyciem układu BIACORE. Procedura testowa z użyciem układu BIACORE (test BIAcore) jest opisana w sekcji przykładów tego ujawnienia. [00] Określenie szybkość dysocjacji lub kd odnosi się do stałej szybkości dysocjacji dla określonego oddziaływania przeciwciało-antygen. Stałą szybkości dysocjacji można zmierzyć metodą powierzchniowego rezonansu plazmonowego, na przykład z użyciem układu BIACORE. [0041] Określenie przeciwciało przeciw OXR odnosi się do przeciwciała, jak tu zdefiniowano, zdolnego do wiązania się z ludzkim OXR. [0042] Określenia receptor OX i OXR są stosowane zamiennie w niniejszym zgłoszeniu i obejmują ludzki OXR, jak również jego warianty, izoformy i homologi ga- tunkowe. Zgodnie z tym ujawnione tu ludzkie cząsteczki wiążące mogą w niektórych przypadkach również wiązać się z OXR z gatunków innych niż człowiek. W innych

7 przypadkach cząsteczki wiążące mogą być całkowicie specyficzne względem ludzkiego OXR i mogą nie wykazywać reaktywności międzygatunkowej ani innego rodzaju reaktywności krzyżowej. [0043] Określenie specyficznie wiąże się z ludzkim OXR w odniesieniu do oddziaływania cząsteczki wiążącej, np. przeciwciała, z jej partnerem wiązania, np. antygenem, oznacza, że K D dla wiązania się cząsteczki wiążącej z CD, CD137 lub CD271 jest ponad 0 razy wyższa od K D dla jej wiązania się z ludzkim OXR, przy wyznaczaniu w teście in vitro. [0044] Określenie wektor odnosi się do cząsteczki kwasu nukleinowego zdolnej do przenoszenia innej cząsteczki kwasu nukleinowego w komórce gospodarzu. Przykłady wektorów obejmują plazmidy, wektory wirusowe, wektory ekspresyjne z nagiego DNA lub RNA, kosmidy lub wektory fagowe. Niektóre wektory są zdolne do autonomicznej replikacji w komórce gospodarzu, do którego są wprowadzone (np. bakteryjne wektory z bakteryjnym miejscem inicjacji replikacji i episomalne wektory ssacze). Niektóre wektory mogą ulegać integracji z genomem komórki gospodarza po wprowadzeniu do komórki gospodarza, a tym samym ulegają replikacji razem z genomem gospodarza (np. nieepisomalne wektory ssacze). Niektóre wektory są zdolne do kierowania ekspresją genów, z którymi są funkcjonalnie połączone, a zatem mogą być nazywane wektorami ekspresyjnymi. [004] W niniejszym opisie, dwadzieścia tradycyjnych aminokwasów i ich skróty są zgodne z tradycyjnym użyciem. Patrz Immunology - A Synthesis (Wydanie 2, E.S. Golub i D.R. Gren, Red., Sinauer Associates, Sunderland, MA (1991)). [0046] CZĄSTECZKI WIĄŻĄCE, KTÓRE WIĄŻĄ SIĘ Z LUDZKIM OXR [0047] Niniejsze ujawnienie dostarcza izolowane cząsteczki wiążące, które wiążą się z ludzkim OXR, w tym przeciwciała przeciw OXR, fragmenty wiążące antygen przeciwciał przeciw OXR i pochodne przeciwciał przeciw OXR. Cząsteczki wiążące charakteryzują się co najmniej jedną z następujących właściwości funkcjonalnych: (a) wiążą się z ludzkim OXR z K D równą 1 x -6 M lub mniej; (b) wykazują działanie agonistyczne wobec ludzkiego OXR; (c) nie wiążą się z receptorem CD przy stężeniu do 00 nm; (d) nie wiążą się z receptorem CD137 przy stężeniach do 00 nm; (e) nie wiążą się z receptorem CD271 przy stężeniach do 00 nm; (f) są zdolne do wzmacniania wytwarzania IL-2 przez izolowane ludzkie komórki T; (g) są zdolne do wzmacniania odpowiedzi immunologicznej; (h) są zdolne do hamowania wzrostu komórek nowotworowych; oraz (i) wykazują terapeutyczny wpływ na nowotwór. W niektórych postaciach cząsteczka wiążąca wiąże się z ludzkim OXR z K D równą 1 x -7 M lub mniej, lub 1 x -8 M lub mniej lub x 1 x -9 M lub mniej. [0048] Ludzkie przeciwciała przeciw OXR [0049] W niektórych pierwszych aspektach niniejsze ujawnienie dostarcza ludzkie przeciwciało, które wiąże się z ludzkim OXR. W niektórych postaciach ludzkie przeciwciało jest przeciwciałem monoklonalnym, które specyficznie wiąże się z ludzkim OXR z K D równą 0 nm lub mniej, korzystnie nm lub mniej i wykazuje działanie agonistyczne wobec ludzkiego OXR. Jednym z przykładów takich ludzkich przeciwciał jest ludzkie przeciwciało monoklonalne 11D4. Sekwencja aminokwasowa łańcucha ciężkiego i sekwencja aminokwasowa regionu zmiennego łańcucha ciężkiego (V H ) przeciwciała 11D4 są pokazane odpowiednio w SEQ ID NO: 9 i 7. Sekwencja aminokwasowa łańcucha lekkiego i sekwencja aminokwasowa regionu zmiennego łańcucha lekkiego (V L ) przeciwciała 11D4 są pokazane odpowiednio w SEQ ID NO: i 8. Izotypy przeciwciała 11D4 to IgG2 w przypadku łańcucha ciężkiego i kappa w przypadku łańcucha lekkiego. Allotypy przeciwciała 11D4 to G2(n-) w przypadku łańcucha ciężkiego i Km3 w przypadku łańcucha lekkiego. Dojrzałe sekwencje aminokwasowe łańcucha ciężkiego i lekkiego są uzyskane drogą koncepcyjnej translacji sekwencji DNA z konstruktów ekspresyjnych. Przeciwciało 11D4 nie zawiera mutacji w regionach zrębowych łańcucha ciężkiego, ani łańcucha lekkiego, ale zawiera mutację w CDR2 łańcucha ciężkiego.

8 [000] Innym przykładowym przeciwciałem według ujawnienia jest ludzkie przeciwciało monoklonalne 18D8. Sekwencja aminokwasowa regionu V H i regionu V L przeciwciała 18D8 jest pokazana odpowiednio w SEQ ID NO: 19 i. Sekwencja aminokwasowa łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego jest pokazana odpowiednio w SEQ ID NO: 21 i 22. [001] Zgodnie z tym, w niektórych postaciach, ujawnienie dostarcza izolowane przeciwciało przeciw OXR, które obejmuje: (1) region zmienny łańcucha ciężkiego przeciwciała 11D4 lub 18D8, (2) region zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 7 lub 19, lub (3) region zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 11 lub 23; oraz (1) region zmienny łańcucha lekkiego przeciwciała 11D4 lub 18D8, (2) region zmienny łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 8 lub, lub (3) region zmienny łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 12 lub 24. [002] W innym aspekcie ujawnienie dostarcza przeciwciała, które zawierają CDR1, CDR2 i CDR3 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego (V H ) oraz CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha lekkiego 11D4 lub 11D8. Sekwencja aminokwasowa CDR1 V H, CDR2 V H i CDR3 V H 11D4 jest pokazana odpowiednio w SEQ ID NO: 1, 2 i 3. Sekwencja aminokwasowa CDR1 V L, CDR2 V L i CDR3 V L przeciwciała 11D4 jest pokazana odpowiednio w SEQ ID NO: 4, i 6. Sekwencja aminokwasowa CDR1 V H, CDR2 V H i CDR3 V H przeciwciała 18D8 jest pokazana odpowiednio w SEQ ID NO: 13, 14 i 1. Sekwencja aminokwasowa CDR1 V L, CDR2 V L i CDR3 V L przeciwciała 18D8 jest pokazana odpowiednio w SEQ ID NO: 16, 17 i 18. Regiony CDR są przedstawione z użyciem systemu Kabata (Kabat, E. A., i in. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Wydanie piąte, U.S. Department of Health and Human Services, Publikacja NIH Nr ). [003] Zgodnie z tym, w niektórych postaciach ujawnienie dostarcza (1) izolowane przeciwciało monoklonalne, które zawiera CDRI V H, CDR2 V H i CDR3 V H przeciwciała 11D4 lub 18D8; oraz CDRI V L, CDR2 V L i CDR3 V L przeciwciała 11D4 lub 18D8. W niektórych kolejnych postaciach ujawnienie dostarcza izolowane przeciwciało monoklonalne, które zawiera CDRI V H obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 1 lub 13, lub sekwencję, która różni się od SEQ ID NO: 1 lub 3 o 1, 2, 3 lub 4 konserwatywne podstawienia aminokwasów; CDR2 V H obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 2 lub 14, lub sekwencję, która różni się od SEQ ID NO: 2 lub 14 o 1, 2, 3, lub 4 konserwatywne podstawienia aminokwasów; oraz CDR3 V H obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 3 lub 1, lub sekwencję, która różni się od SEQ ID NO: 3 lub 1 o 1, 2, 3 lub 4 konserwatywne podstawienia aminokwasów; i izolowane przeciwciało monoklonalne zawiera także CDRI V L obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 4 lub 16, lub sekwencję, która różni się od SEQ ID NO: 4 lub 16 o 1, 2, 3 lub 4 konserwatywne podstawienia aminokwasów; V L CDR2 obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: lub 17, lub sekwencję, która różni się od SEQ ID NO: lub 17 o 1, 2, 3 lub 4 konserwatywne podstawienia aminokwasów; oraz V L CDR3 obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 6 lub 18, lub sekwencję, która różni się od SEQ ID NO: 6 lub 18 o 1, 2, 3 lub 4 konserwatywne podstawienia aminokwasów. [004] W niektórych przypadkach C-końcowa lizyna z łańcucha ciężkiego przeciwciała przeciw OXR jest odszczepiona (Harris R. J., J. of Chromatography, 70: (199)). Łańcuch(-y) ciężki(-e) i/lub lekki(-e) przeciwciał przeciw OXR może/mogą ewentualnie zawierać sekwencję sygnałową. [00] Klasę (np. IgG, IgM, IgE, IgA lub IgD) i podklasę (np. IgG1, IgG2, IgG3 lub IgG4) przeciwciał przeciw OXR można określić dowolną odpowiednią metodą. Ogólnie klasę i podklasę przeciwciała można określić z użyciem przeciwciał, które są specyficzne dla określonej klasy i podklasy przeciwciał. Takie przeciwciała są dostępne w handlu. Klasę i podklasę można określić w teście ELISA lub metodą Western Blot, jak również innymi technikami. Alternatywnie, klasę i podklasę można określić drogą sekwencjonowania cało-

9 ści lub części domen stałych łańcuchów ciężkich i/lub lekkich przeciwciał, porównania ich sekwencji aminokwasowych ze znanymi sekwencjami aminokwasowymi różnych klas i podklas immunoglobulin oraz określenia klasy i podklasy przeciwciał. Przeciwciała przeciw OXR mogą być cząsteczką IgG, IgM, IgE, IgA lub IgD. Przykładowo, przeciwciała przeciw OXR mogą być IgG należącą do podklasy IgG1, IgG2, IgG3 lub IgG4. Zatem kolejny aspekt ujawnienia dostarcza sposób przekształcania klasy lub podklasy przeciwciała przeciw OXR w inną klasę lub podklasę. W niektórych przypadkach cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca V L lub V H, która nie zawiera sekwencji kodujących C L lub C H jest izolowana z użyciem metod dobrze znanych w dziedzinie. Cząsteczka kwasu nukleinowego zostaje następnie funkcjonalnie połączona z sekwencją kwasu nukleinowego kodującą C L lub C H z pożądanej klasy lub podklasy immunoglobulin. Można to osiągnąć z użyciem wektora lub cząsteczki kwasu nukleinowego, która zawiera łańcuch C L lub C H, jak opisano powyżej. Przykładowo, przeciwciało przeciw OXR, które było wyjściowo IgM można przełączyć na klasę IgG. Ponadto, przełączanie klas można zastosować do przekształcenia jednej podklasy IgG w inną, np. IgG1 w IgG2. Kolejny sposób wytwarzania przeciwciała o pożądanym izotypie obejmuje etapy izolowania kwasu nukleinowego kodującego łańcuch ciężki przeciwciała przeciw OXR i kwasu nukleinowego kodującego łańcuch lekki przeciwciała przeciw OXR, izolowania sekwencji kodującej region V H, ligacji sekwencji V H z sekwencją kodującą domenę stałą łańcucha ciężkiego o pożądanym izotypie, ekspresji genu łańcucha lekkiego i konstruktu łańcucha ciężkiego w komórce i zbierania przeciwciała przeciw OXR o pożądanym izotypie. [006] Fragmenty wiążące antygen [007] W kolejnym aspekcie niniejsze ujawnienie dostarcza fragmenty wiążące antygen któregokolwiek z ludzkich przeciwciał przeciw OXR, jak tu opisano powyżej. W niektórych postaciach fragment wiążący antygen jest wybrany spośród: (1) łańcucha lekkiego przeciwciała przeciw OXR i (2) łańcucha ciężkiego przeciwciała przeciw OXR; (3) regionu zmiennego łańcucha lekkiego przeciwciała przeciw OXR i (4) regionu zmiennego łańcucha ciężkiego przeciwciała przeciw OXR; () sześciu CDR przeciwciała przeciw OXR, które obejmują trzy CDR łańcucha lekkiego i trzy CDR łańcucha ciężkiego przeciwciała przeciw OXR. W niektórych szczególnych postaciach ujawnienie dostarcza fragment wiążący antygen przeciwciała 11D4 lub 18D8. W niektórych innych szczególnych postaciach fragmenty wiążące antygen przeciwciała przeciw OXR obejmują: (i) fragment Fab, jednowartościowy fragment składający się z domen V L, V H, CL i C H I; (ii) fragment F(ab') 2, dwuwartościowy fragment obejmujący dwa fragmenty Fab połączone mostkiem dwusiarczkowym w regionie zawiasowym; (iii) fragment Fd składający się z domen V H i CHI; (iv) fragment Fv składający się z domen V L i V H pojedynczego ramienia przeciwciała; (v) fragment dab (Ward i in., (1989) Nature 341 :44-46), który składa się z domeny V H ; (vi) izolowany CDR i (vii) jednołańcuchowe przeciwciało (scfv), które jest polipeptydem zawierającym region VL przeciwciała połączony z regionem VH przeciwciała. Bird i in., (1988) Science 242: i Huston i in., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8: Fragment wiążący antygen może również obejmować dwa lub większą liczbę krótszych fragmentów, z tego samego łańcucha ciężkiego lub tego samego łańcucha lekkiego, albo z różnych łańcuchów. Fragmenty wiążące antygen, takie jak fragmenty Fab i F(ab') 2 można wytworzyć z całych przeciwciał z użyciem tradycyjnych technik, takich jak trawienie całych przeciwciał odpowiednio papainą lub pepsyną. Można je również uzyskać z użyciem technik rekombinacji DNA, jak tu opisano. [008] Pochodne przeciwciał [009] W niektórych kolejnych aspektach niniejsze ujawnienie dostarcza pochodne któregokolwiek z przeciwciał przeciw OXR, jak tu opisano powyżej. [0060] W jednym szczególnym aspekcie pochodną przeciwciała uzyskuje się drogą mody- fikacji sekwencji aminokwasowych 11D4 lub 18D8. Można modyfikować sekwencje aminokwasowe któregokolwiek z regionów łańcuchów przeciwciała, takich jak regiony zrę-

10 bowe, regiony CDR lub regiony stałe. Modyfikacje można wprowadzać z użyciem standardowych technik znanych w dziedzinie, takich jak ukierunkowana mutageneza i losowa mutageneza za pośrednictwem PCR, i mogą one obejmować naturalne, jak również nienaturalne aminokwasy. [0061] Rodzaje modyfikacji obejmują podstawienia, insercje, delecje lub ich połączenia, jednego lub większej liczby aminokwasów przeciwciała przeciw OXR. W niektórych postaciach pochodna przeciwciała zawiera 1, 2, 3 lub 4 podstawienia aminokwasów w CDR łańcucha ciężkiego i/lub jedno podstawienie aminokwasu w CDR łańcucha lekkiego. W niektórych postaciach pochodna przeciwciała przeciw OXR zawiera jedno lub większą liczbę podstawień aminokwasów w stosunku do sekwencji aminokwasowej linii zarodkowej ludzkiego genu. W szczególnej postaci jedno lub większa liczba tych podstawień z linii zarodkowej jest w regionie CDR2 łańcucha ciężkiego. W innej szczególnej postaci podstawienia aminokwasów w stosunku do linii zarodkowej są w jednej lub większej liczbie tych samych pozycji, co podstawienia w stosunku do linii zarodkowej w przeciwciałach 11D4 lub 18D8. W innej postaci podstawieniem aminokwasu jest zmiana jednej lub większej liczby cystein w przeciwciele na inną resztę, taką jak, bez ograniczenia, alanina lub seryna. Cysteina może być cysteiną kanoniczną lub niekanoniczną. Podstawienie można przeprowadzić w CDR lub w regionie zrębowym domeny zmiennej lub w domenie stałej przeciwciała. Innym rodzajem podstawienia aminokwasu jest wyeliminowanie par asparagina-glicyna, które tworzą potencjalnie miejsca deamidacji, zmieniając jedną lub obie z tych reszt. W jeszcze innych postaciach podstawienie aminokwasu jest konserwatywnym podstawieniem aminokwasu. W jednej postaci pochodna przeciwciała ma 1, 2, 3 lub 4 konserwatywne podstawienia aminokwasów w regionach CDR łańcucha ciężkiego w stosunku do sekwencji aminokwasowych 11D4 lub 18D8. [0062] Innym rodzajem modyfikacji przeciwciała przeciw OXR jest zmiana oryginalnego wzorca glikozylacji przeciwciała. Określenie zmiana odnosi się do usunięcia jednej lub większej liczby ugrupowań węglowodanowych znajdujących się na przeciwciele i/lub dodania jednego lub większej liczby miejsc glikozylacji, które nie są obecne w przeciwciele. Glikozylacja przeciwciała jest zazwyczaj N-glikozylacją. N-glikozylacja odnosi się do przyłączenia ugrupowania węglowodanowego do łańcucha bocznego reszty asparaginy. Dodanie miejsc glikozylacji do przeciwciała osiąga się dogodnie przez zmianę sekwencji aminokwasowej w taki sposób, by zawierała ona jedną lub większą liczbę z wyżej opisanych sekwencji trójpeptydowych (dla miejsc N-glikozylacji). [0063] Jeszcze inny rodzaj modyfikacji obejmuje usunięcie któregokolwiek z ugrupowań węglowodanowych obecnych na przeciwciele, które można osiągnąć chemicznie lub enzymatycznie. Chemiczna deglikozylacja wymaga ekspozycji przeciwciała na związek, taki jak kwas trifluorometanosulfonowy lub związek mu równoważny. To działanie skutkuje odszczepieniem prawie wszystkich lub wszystkich cukrów za wyjątkiem cukru łączącego (N-acetyloglukozaminy lub N-acetylogalaktozaminy), pozostawiając przeciwciało nienaruszone. Chemiczna deglikozylacja została opisana przez Sojahr, H. T., i Bahl, O. P., Arch. Biochem. Biophys. 29 (1987) 2-7 oraz przez Edge, A. S., i in. Anal. Biochem. 118 (1981) Enzymatyczne odszczepianie ugrupowań węglowodanowych z przeciwciał można osiągnąć z użyciem różnych endo- i egzoglikozydaz, jak to opisano w Thotakura, N. R., i Bahl, O. P., Meth. Enzymol. 138 (1987) -39. [0064] Przykłady innych modyfikacji obejmują acetylowanie, acylowanie, amidowanie, sieciowanie, cyklizację, tworzenie wiązań dwusiarczkowych, demetylację, tworzenie kowalencyjnych wiązań poprzecznych, tworzenie cystyny, formylowanie, hydroksylację, jodowanie, metylowanie, mirystylację, utlenianie, pegilację, obróbkę proteolityczną, fosforylację, prenylację i siarczanowanie. [006] W kolejnym aspekcie dostarcza się pochodną przeciwciała, która obejmuje prze- ciwciało przeciw OXR lub jego fragment wiążący antygen, jak tu opisano, połączone z dodatkową jednostka molekularną. Przykłady dodatkowych jednostek molekularnych

11 obejmują środki farmaceutyczne, peptydy lub białka, i środki detekcyjne lub znaczniki. Specyficzne przykłady środków farmaceutycznych, które można połączyć z przeciwciałem przeciw OXR obejmują środki cytotoksyczne lub inne przeciwnowotworowe środki terapeutyczne i promieniotwórcze izotopy. Specyficzne przykłady peptydów lub białek, które można połączyć z przeciwciałem przeciw OXR, obejmują przeciwciała, którymi może być to samo przeciwciało przeciw OXR lub inne przeciwciało. Specyficzne przykłady środków detekcyjnych lub znaczników, które można połączyć z przeciwciałem przeciw OXR obejmują (1) związki fluorescencyjne, takie jak fluoresceina, izotiocyjanian fluoresceiny, rodamina, chlorek -dimetyloamino-1-naftalenosulfonylu, fikoerytryna i luminofory z lantanowcami; (2) enzymy, takie jak peroksydaza chrzanowa, β-galaktozydaza, lucyferaza, fosfataza alkaliczna i oksydaza glukozowa; (3) biotynę; (4) wcześniej wyznaczony epitop polipeptydowy rozpoznawany przez drugorzędową cząsteczkę reporterową, takie jak sekwencja z parą suwaka leucynowego, miejsca wiążące dla przeciwciał drugorzędowych, domeny wiążące metale i epitopy znacznikowe. W szczególnej postaci pochodna przeciwciała jest multimerem przeciwciała przeciw OXR, który jest multimeryczną postacią przeciwciała przeciw OXR, taką jak dimery przeciwciała, trimery lub multimery wyższego rzędu z przeciwciał monomerycznych. Poszczególne monomery w multimerze przeciwciała mogą być identyczne lub różne, tj. mogą być heteromerycznymi lub homomerycznymi multimerami przeciwciał. Poszczególne przeciwciała w multimerze mogą mieć takie same lub różne specyficzności wiązania. Multimeryzację przeciwciał można osiągnąć drogą naturalnej agregacji przeciwciał. Przykładowo, pewien procent oczyszczonych preparatów przeciwciał (np. oczyszczonych cząsteczek IgG1) spontanicznie tworzy agregaty białek zawierające homodimery przeciwciał i inne multimery wyższych rzędów. Alternatywnie homodimery przeciwciał można utworzyć z użyciem technik chemicznego sprzęgania znanych w dziedzinie, tak jak z użyciem heterobifunkcyjnych środków sieciujących. Odpowiednie środki sieciujące obejmują te, które są heterobifunkcyjne, posiadają dwie reagujące w różny sposób grupy rozdzielone odpowiednią grupą rozdzielającą (takie jak ester m-maleimidobenzoilo-n-hydroksysukcynoimidowy, 4-(maleimidometylo)cykloheksano-1-karboksylan sukcynoimidylu i S-acetylotiooctan N-sukcynoimidylu), lub homobifunkcyjne (takie jak suberynian disukcynoimidylu). Takie łączniki są dostępne w handlu z Pierce Chemical Company, Rockford, IL. Można również wywoływać multimeryzację przeciwciał z użyciem znanych w dziedzinie technik rekombinacji DNA. [0066] W jeszcze innym aspekcie pochodna przeciwciała jest przeciwciałem chimerycznym, które obejmuje sekwencję aminokwasową opisanego tu powyżej ludzkiego przeciwciała przeciw OXR. W jednym przykładzie jeden lub większa liczba CDR z ludzkiego przeciwciała przeciw OXR jest połączona z CDR z przeciwciała istoty żywej innej niż człowiek, takiej jak mysz lub szczur. W innym przykładzie wszystkie CDR przeciwciała chimerycznego pochodzą z ludzkich przeciwciał przeciw OXR. W innym przykładzie regiony CDR z więcej niż jednego ludzkiego przeciwciała przeciw OXR są połączone w przeciwciele chimerycznym. Ponadto, przeciwciało chimeryczne może zawierać regiony zrębowe pochodzące z jednego ludzkiego przeciwciała przeciw OXR i jeden lub większą liczbę CDR z jednego lub większej liczby innych ludzkich przeciwciał. Przeciwciała chimeryczne można wytworzyć z użyciem tradycyjnych metod znanych w dziedzinie. W niektórych szczególnych postaciach chimeryczne przeciwciało zawiera jeden, dwa lub trzy CDR z regionu zmiennego łańcucha ciężkiego lub regionu zmiennego łańcucha lekkiego przeciwciała wybranego spośród przeciwciała 11D4 lub 18D8. [0067] Przykłady innych pochodnych przeciwciał dostarczonych w niniejszym ujawnieniu obejmują przeciwciała jednołańcuchowe, diaciała, przeciwciała domenowe, nanociała i uniciała. Przeciwciało jednołańcuchowe (scfv) składa się z pojedynczego łańcucha polipeptydowego obejmującego domenę V L połączoną z domeną V H, przy czym domena V L i domena V H parują się tworząc cząsteczkę jednowartościową. Przeciwciało jednołańcuchowe można wytworzyć zgodnie z metodami znanymi w dziedzinie (patrz na przykład

12 Bird i in., (1988) Science 242: oraz Huston i in., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8: ). Diaciało (ang. diabody) składa się z dwóch łańcuchów, z których każdy zawiera region zmienny łańcucha ciężkiego połączony z regionem zmiennym łańcucha lekkiego na tym samym łańcuchu polipeptydowym, połączonych krótkim łącznikiem peptydowym, przy czym te dwa regiony na tym samym łańcuchu nie parują się ze sobą, ale z komplementarnymi domenami na innym łańcuchu z wytworzeniem cząsteczki bispecyficznej. Sposoby wytwarzania diaciał są znane w dziedzinie (Patrz np. Holliger P. i in., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: , oraz Poljak R. J. i in., (1994) Structure 2: ). Przeciwciała domenowe (dabs) są małymi funkcjonalnymi jednostkami wiążącymi przeciwciał, odpowiadającymi zmiennym regionom łańcuchów ciężkich lub lekkich przeciwciał. Przeciwciała domenowe są dobrze eksprymowane w układach komórek bakteryjnych, drożdżowych i ssaczych. Dalsze informacje na temat przeciwciał domenowych i sposobów ich wytwarzania są znane w dziedzinie (patrz na przykład opisy patentowe US nr ; 68291; 6981; ; ; europejskie opisy patentowe i 06166; WO0/0372, WO04/1790, WO04/0826, WO04/08821, WO04/0019 i WO03/ Nanociała (ang. nanobodies) są uzyskiwane z łańcuchów ciężkich przeciwciał. Nanociało obejmuje zazwyczaj pojedynczą domenę zmienną i dwie domeny stałe (CH2 i CH3) i zachowuje zdolność wiązania antygenu wyjściowego przeciwciała. Nanociała można wytworzyć metodami znanymi w dziedzinie (Patrz np. opis patentowy US nr , opis patentowy US nr , WO 06/079372). Uniciała (ang. unibodies) składają się z jednego łańcucha lekkiego i jednego łańcucha ciężkiego przeciwciała IgG4. Uniciała można wytworzyć przez usunięcie regionu zawiasowego z przeciwciał IgG4. Dalsze szczegóły na temat uniciał i sposobów ich wytwarzania można znaleźć w WO07/ [0068] SPOSOBY WYTWARZANIA CZĄSTECZEK WIĄŻĄCYCH [0069] Cząsteczki wiążące, jak tu ujawniono, można wytwarzać technikami znanymi w dziedzinie, w tym z użyciem tradycyjnej metodologii dla przeciwciał monoklonalnych, np. standardowej techniki hybrydyzacji komórek somatycznych z Kohler i Milstein (Nature 26: 49, (197)), jak również innych technik, takich jak transformacja limfocytów B wirusem lub onkogenem. [0070] Immunizcja istot żywych innych niż człowiek [0071] Ujawnienie dostarcza również sposób wytwarzania przeciwciał przeciw OXR lub ich fragmentów wiążących antygen, który obejmuje immunizację istoty żywej innej niż człowiek, która zawiera loci ludzkiej immunoglobuliny, antygenem OXR i izolację przeciwciała z immunizowanego zwierzęcia lub z komórek uzyskanych z immunizowanego zwierzęcia. [0072] Przykłady odpowiednich istot żywych innych niż człowiek obejmują zwierzęta transgeniczne lub transchromosomowe, takie jak HuMAb Mouse, KM Mouse, myszy TC i Xenomouse. HuMAb Mouse (Medarex, Inc.) zawiera miniloci genu ludzkiej immunoglobuliny, które kodują nieprzearanżowane sekwencje łańcuchów ciężkich (µ i γ) i lekkich κ ludzkich immunoglobulin, wraz z ukierunkowanymi mutacjami, które inaktywują endogenne loci łańcuchów µ i κ (patrz np. Lonberg, i in. (1994) Nature 368: 86-89). Odpowiednio, myszy wykazują obniżoną ekspresję mysiego IgM lub κ, a w odpowiedzi na immunizację, wprowadzone transgeny ludzkich łańcuchów ciężkich i lekkich ulegają przełączeniu klas i somatycznej mutacji z wytworzeniem ludzkich przeciwciał monoklonal- nych IgGκ o wysokim powinowactwie (Patrz np. Harding, F. i Lonberg, N. (199) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:36-46). Wytwarzanie i stosowanie HuMAb Mouse i genomowe modyfikacje zachodzące u takich myszy są dobrze znane w dziedzinie (Patrz np. Fishwild, D. i in. (1996) Nature Biotechnology 14: 84-81). KM mice zawierają transgen ludzkiego łańcucha ciężkiego i transchromosom z ludzkim łańcuchem lekkim i są opisane szczegółowo w WO 02/ Xenomouse (Abgenix, Inc.) zawiera duże fragmenty loci ludzkich immunoglobulin i jest defektywna pod względem wytwarzania mysich przeciw-

13 ciał. Ten model zwierzęcy jest dobrze znany w dziedzinie (Patrz np. opisy patentowe US nr.: 93998; ; ; 684; i ). Myszy TC również są myszami modyfikowanymi genetycznie zawierającymi zarówno transchromosom z ludzkim łańcuchem ciężkim, jak i transchromosom z ludzkim łańcuchem lekkim. Takie myszy są opisane w Tomizuka i in. (00) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: [0073] Antygen OXR do stosowania w immunizacji zwierzęcia może być izolowanym i/lub oczyszczonym OXR i jest korzystnie ludzkim OXR. W jednej postaci antygen OXR jest fragmentem ludzkiego OXR, korzystnie zewnątrzkomórkową domeną OXR. W innej postaci antygen OXR jest fragmentem, który zawiera co najmniej jeden epitop z ludzkiego OXR. W innej postaci antygen OXR jest komórką, która eksprymuje OXR na swojej powierzchni, a w szczególności komórką wykazującą nadekspresję OXR na swojej powierzchni. Immunizację zwierząt można przeprowadzić w dowolny odpowiedni sposób znany w dziedzinie (Patrz np. Harlow i Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1990). Konkretne metody immunizacji istot żywych innych niż człowiek, takich jak myszy, szczury, owce, kozy, świnie, bydło i konie, są dobrze znane w dziedzinie (Patrz np. Harlow i Lane (1990); opis patentowy US ). Przykład 1 dostarcza sposób immunizacji myszy HuMab. [0074] Po immunizacji zwierzęcia antygenem OXR, ze zwierzęcia można uzyskać przeciwciała i/lub komórki wytwarzające przeciwciała. W jednej postaci ze zwierzęcia uzyskuje się surowicę, a z surowicy można uzyskać frakcję immunoglobulin lub z surowicy można oczyścić przeciwciała przeciw OXR. [007] Przeciwciała przeciw OXR można również wytwarzać z użyciem unieśmiertelnionych komórek wytwarzających przeciwciała uzyskanych z komórek izolowanych z immunizowanego zwierzęcia. Po immunizacji komórki B z węzłów chłonnych i/lub śledziony pobiera się od zwierzęcia i unieśmiertelnia w odpowiedni sposób. Sposoby unieśmiertelniania komórek obejmują, lecz nie wyłącznie, transfekowanie ich onkogenami, zakażenie ich wirusami onkogennymi i hodowanie ich w warunkach selekcji unieśmiertelnionych komórek, eksponowanie ich na związki rakotwórcze lub mutagenne, poddanie ich fuzji z unieśmiertelnioną komórką, np. komórką szpiczaka i inaktywację genu supresorowego nowotworu (Patrz np. Harlow i Lane, powyżej). W szczególnej postaci komórki B ze śledziony pobrane od immunizowanego zwierzęcia są poddane fuzji z unieśmiertelnionymi komórkami szpiczaka z wytworzeniem unieśmiertelnionych hybrydom wytwarzających przeciwciało. Komórki szpiczaka korzystnie nie wydzielają polipeptydów immunoglobulin (niewydzielnicza linia komórkowa). Unieśmiertelnione hybrydomy przeszukuje się z użyciem antygenu OX (np. OXR, jego części lub komórki eksprymującej OXR). Wstępne przeszukiwanie można przeprowadzić na przykład z użyciem testu immunoenzymatycznego (ELISA) lub radioimmunologicznego. Przykład przeszukiwania w teście ELISA jest opisany w WO 00/3704. [0076] Komórki wytwarzające przeciwciało przeciw OXR, np. hybrydomy, selekcjonuje się, klonuje i dalej przeszukuje pod względem pożądanych właściwości, w tym intensywnego wzrostu, wysokiej produkcji przeciwciał i pożądanych cech przeciwciał, jak je dalej omówiono. Hybrydomy można dalej namnażać in vivo w zwierzętach syngenicznych, w zwierzętach, które są pozbawione układu immunologicznego, np. myszach nude lub w hodowli komórkowej in vitro. [0077] Dostarcza się zatem sposoby wytwarzania komórki, która wytwarza ludzkie prze- ciwciało monoklonalne przeciw OXR lub jego fragment wiążący antygen, obejmujące: (a) immunizację transgenicznej istoty żywej innej niż człowiek antygenem OXR; (b) umożliwienie wytworzenia u zwierzęcia odpowiedzi immunologicznej na antygen OXR; (c) izolację komórek wytwarzających przeciwciało z tego zwierzęcia; oraz (d) unieśmiertelnienie komórek wytwarzających przeciwciało. W jednej postaci sposób obejmuje ponad- to (e) tworzenie pojedynczych monoklonalnych populacji unieśmiertelnionych komórek wytwarzających przeciwciała; oraz (f) przeszukiwanie unieśmiertelnionych komórek wy-