PL B1. Nowe pochodne chlorofilu, sposób otrzymywania nowych pochodnych chlorofilu oraz preparaty zawierające nowe pochodne chlorofilu

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (51) Int.Cl. C07D 487/22 ( ) A61K 31/409 ( ) A61P 35/00 ( ) (54) Nowe pochodne chlorofilu, sposób otrzymywania nowych pochodnych chlorofilu oraz preparaty zawierające nowe pochodne chlorofilu (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 20/05 (73) Uprawniony z patentu: FIEDOR LESZEK, Cieszyn, PL URBAŃSKA KRYSTYNA, Krasieniec Zakupny, PL STOCHEL GRAŻYNA, Kraków, PL UNIWERSYTET JAGIELLOŃSKI, Kraków, PL (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 12/12 (72) Twórca(y) wynalazku: LESZEK FIEDOR, Cieszyn, PL KRYSTYNA URBAŃSKA, Krasieniec Zakupny, PL GRAŻYNA STOCHEL, Kraków, PL PL B1

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku są nowe pochodne chlorofilu, w których atom centralny Mg jest podstawiony atomem Pt(II), sposób wytwarzania tych pochodnych, oraz zawierające je preparaty. Charakterystyczną cechą chlorofili jest ich intensywna zielona lub niebiesko-zielona barwa, związana z silnym pochłanianiem światła w zakresie niebieskich i czerwonych fal. Pochłonięta energia świetlna powoduje wzbudzenie cząsteczek barwnika, które wypromieniowują nadmiar energii w postaci fluorescencji lub przekazują energię wzbudzenia na inne cząsteczki w procesie fotosensybilizacji. Chlorofile są najważniejszymi barwnikami fotosyntetycznymi roślin, sinic i bakterii fotosyntetycznych. W procesie fotosyntezy chlorofile odpowiedzialne są zarówno za absorpcję światła, jak i za przenoszenie energii wzbudzenia i jej konwersję w energię chemiczną, przebiegającą z udziałem ich wzbudzonych stanów singletowych. Jak przedstawiono na rysunku, we wzorze 1, strukturalnie wszystkie chlorofile stanowią pochodne porfiryny, w których do czteropirolowego układu makrocyklicznego dołączony jest dodatkowy piąty pierścień izocykliczny V. W zależności od rodzaju chlorofilu, pierścienie pirolowe posiadają różny stopień utlenienia, w pozycjach bocznych układu makrocyklicznego występują różne podstawniki a grupa karboksylowa przy węglu C-17 3 zesteryfikowana jest alkoholem o długim łańcuchu węglowym, który nadaje chlorofilom lipidowy (hydrofobowy) charakter i czyni je nierozpuszczalnymi w wodzie. Hydroliza wiązania estrowego przy węglu C-17 3 prowadzi do powstania chlorofilidów, posiadających wolną grupę karboksylową a rozpuszczalnych zarówno w rozpuszczalnikach organicznych jak i w wodzie. W chlorofilach występujących naturalnie, cztery centralne atomy azotu wiążą atom magnezu, lub w rzadkich przypadkach atom cynku. Istotna jest jednak zdolność atomu centralnego do wiązania dodatkowych ligandów. W środowisku kwaśnym chlorofile łatwo ulegają reakcji feofitynizacji tworząc pochodne, tzw. feofityny, w których centralny jon magnezu podstawiony jest dwoma protonami. W rozpuszczalnikach organicznych w obecności soli cynku(ii) lub miedzi(ii), feofityna łatwo tworzy kompleksy z jonami tych metali i przechodzi w metalopodstawiony chlorofil. W podobnych warunkach, centralny atomu magnezu w chlorofilach również samorzutnie ulega wymianie na odpowiednio atom cynku lub miedzi(ll), reakcję tą obserwuje się także w warunkach naturalnych, na przykład w roślinach poddanych stresowi solami tych metali. Reakcje insercji lub podstawienia atomami innych metali zachodzą w bardziej drastycznych warunkach i wymagają użycia odpowiednich metod syntetycznych. Stosowania specjalnych metod wymaga też podstawienie metalu centralnego w chlorofilach bakteryjnych. W zależności od charakteru centralnego atomu metalu zmieniają się właściwości fizykochemiczne metalopodstawionych chlorofili. Podstawowymi cechami, które determinowane są rodzajem metalu centralnego są: (i) widma absorpcji; (ii) widma emisji; (iii) czasy życia stanów wzbudzonych; (iv) wydajność kwantowa tworzenia stanu trypletowego; (v) liczba skoordynowanych ligandów; (vi) stabilność chemiczna i potencjał redoks. Wiadomo, że szczególnie drastyczne zmiany właściwości fizykochemicznych metaloporfiryn i metalopodstawionych chlorofili związane są z obecnością w pierścieniu makrocyklicznym atomu metalu przejściowego, na przykład Cu(II) lub Ni(II). Powodują one bardzo silne skrócenie czasów życia stanów wzbudzonych metalopodstawionych pochodnych i wygaszenie fluorescencji, podwyższają ich potencjał redoks, jak też wywołują zmiany w parametrach przejść międzysystemowych, związane z efektem ciężkiego atomu. Jeśli metal centralny, oprócz czterech atomów azotu układu porfirynowego wiąże dodatkowe ligandy, jak w przypadku Ni(II), po wzbudzeniu cząsteczek barwnika światłem obserwuje się ultraszybką dysocjację tych dodatkowych ligandów (tzw. fotodysocjacja ligandów) oraz ewentualne ponowne ich wiązanie (Rodriguez J. and Holten D. J., J. Phys. Chem. 92, 5944, 1990; Musewald et al., J. Am. Chem. Soc. 103, 7055, 1999). Od wymienionych parametrów w dużej mierze zależą oddziaływania chlorofili ze światłem i drogi deaktywacji ich stanów wzbudzonych (wzbudzenie elektronowe i emisja), reakcje przekazu energii wzbudzenia (fotosensybilizacja), jak i oddziaływania metalochlorofili z otoczeniem (Porphyrins and Metalloporphyrins (1975) Smith Ed., Elsevier, Amsterdam). Po ekstrakcji chlorofilu z naturalnego otoczenia biologicznego i umieszczeniu barwnika na przykład w rozpuszczalnikach organicznych lub w środowisku wodnym, szczególnie istotne stają się trypletowe stany wzbudzone barwnika oraz reakcje fotosensybilizacji. Prowadzą one do powstawania aktywnych form tlenu, między innymi tlenu singletowego, pod wpływem światła w obecności fotosen-

3 PL B1 3 sybilizatora, a w konsekwencji do tak zwanego efektu fotodynamicznego, opisanego szeroko w literaturze dla wielu barwników, głównie z grupy porfiryn, w tym również dla chlorofili (Spikes and Bommer, Chlorophylls (1991) Scheer H. Ed., str , CRC Press, Boca Raton; Rosenbach-Belkin V., Chen L., Fiedor L., Salomon Y. and Scherz A. Photodynamic Tumor Therapy. 2nd and 3rd generation photosensitizers (1998) Moser J. G. Ed., str , Harwood Academic Publishers, Amsterdam). Efekt fotodynamiczny przejawia się w zdolności fotosensybilizatora, takiego jak chlorofil, do uśmiercania żywych organizmów pod wpływem światła, na przykład bakterii lub komórek zwierzęcych i ludzkich. Ponieważ skupioną wiązką światła można selektywnie i precyzyjnie naświetlać chore tkanki ludzkie, efekt ten wykorzystuje się od pewnego czasu do zwalczania nowotworów w metodzie zwanej terapią fotodynamiczną (PDT - photodynamic therapy). Jednym z przykładów substancji dopuszczonych do użytku medycznego jako fotosensybilizator w terapii fotodynamicznej jest syntetyczna pochodna hematoporfiryny (Hp) o nazwie komercyjnej Photofrin II, która pod względem chemicznym jest mieszaniną co najmniej kilku związków o zbliżonej strukturze. O dopuszczeniu Photofrinu II zadecydowała nieznaczna lecz korzystna akumulacja Photofrinu II w komórkach nowotworowych oraz widmo absorpcji tego związku, typowe dla porfiryn, z silnym pasmem absorpcji w części niebieskiej (ok nm) i o wiele słabszym pasmem w zakresie powyżej 600 nm. Dla terapii istotne jest to słabsze, długofalowe pasmo tego leku, ponieważ znajduje się ono w zakresie relatywnie głębszej przenikalności fal światła przez tkanki (tak zwane okno terapeutyczne), przypadającym pomiędzy zakres pochłaniania światła przez wodę a zakres absorpcji endogennych porfiryn, czyli pomiędzy 600 a 900 nm. Ujemną cechą Photofrinu II jest niska intensywność tego pasma, co powoduje konieczność podawania bardzo wysokich dawek leku oraz używania intensywnych i kosztownych źródeł światła, na przykład laserów. Inną ujemną cechą Photofrinu II jest jego długi, co najmniej kilkutygodniowy czas retencji w organizmie leczonych pacjentów, w trakcie którego fotosensybilizator nadal działa silnie fotouczulająco i może prowadzić do niebezpiecznych dla pacjenta skutków ubocznych. Z powyższych względów trwają intensywne prace nad ulepszaniem i opracowywaniem nowych rodzajów fotosensybilizatorów, o korzystniejszych parametrach fizykochemicznych i wyższej biokompatybilności. W tym kontekście pochodne chlorofili mogą stanowić alternatywę w zastosowaniach terapeutycznych. Ze względu na bardzo intensywne pasma absorpcji światła przesunięte do zakresu ponad 600 nm i powyżej, chlorofile należą do II generacji fotosensybilizatorów. Położenie pasm absorpcji światła jest przede wszystkim determinowane strukturą chlorofili i ich oddziaływaniami ze środowiskiem. Dla przykładu, chlorofil a (Chla), barwnik roślin zielonych, w roztworze acetonowym posiada intensywne pasmo absorpcji Q Y przy 660 nm, które w układach naturalnych ulega przesunięciu do 700 nm. Ponadto, jak wykazały niedawne badania nad chlorofilidami (Rosenbach-Belkin V., Chen L., Fiedor L., Tregub I., Pavlotsky F., Brumfeld V., Salomon Y. and Scherz A., Photochem. Photobiol. 64, 174, 1996), stosunkowo szybko ulegają one rozkładowi w organizmach żywych i mają krótkie czasy retencji w tkankach. Z wymienionych powyżej przyczyn, z punktu widzenia terapii fotodynamicznej, chlorofile stanowią bardzo atrakcyjną i terapeutycznie obiecującą grupę fotosensybilizatorów. Z wielu względów (między innymi: nierozpuszczalność w wodzie, stabilność chemiczna, efektywność fotosensybilizacji), bezpośrednie zastosowanie naturalnych chlorofili w terapii i diagnostyce jest niemożliwe i stąd wynika konieczność poddania tych barwników odpowiednim chemicznym modyfikacjom. Z opisów polskich patentów nr i znane są nowe pochodne chlorofilu i bakteriochlorofilu oraz sposób ich wytwarzania na drodze enzymatycznej transestryfikacji i odpowiednio - na drodze katalitycznej kondensacji. W opisie patentowym nr podano ponadto, że znane są z literatury fachowej sposoby uzyskiwania pochodnych chlorofilu i bakteriochlorofilu podstawionych takimi metalami jak Cu, Ni, Zn, V, Co (Hambright, 1975; Hynninen 1991; Fiedor i wsp. 1993). Jednak z literatury patentowej ani fachowej nie są znane pochodne chlorofilu, w których atom centralny byłby podstawiony platyną (II). Zainteresowanie terapeutyczne związkami platyny wynika z faktu ich szerokiego zastosowania w klasycznej chemioterapii nowotworowej, gdzie jednym z najczęściej stosowanych leków jest pochodna platyny(ii), tak zwana cis-platyna o wzorze Pt(NH 3 ) 2 Cl 2. Obok tego związku w chemioterapii stosowane są jeszcze inne pochodne platyny, na przykład karboplatyna i oksyplatyna. Według ogólnie przyjętego mechanizmu działania cis-platyny, formą aktywną tego związku są jej akwapochodne, które powstają w wyniku wymiany ligandów chlorkowych na cząsteczki wody w środowisku wnętrza żywych komórek. Z uwagi na labilność ligandów akwa, cis-platyna staje się

4 4 PL B1 bardziej reaktywna i cytotoksyczna, ulegając silnej selektywnej addycji do atomów azotu dwóch sąsiadujących zasad guaninowych łańcucha DNA i powodując zahamowanie replikacji całego łańcucha. Zgodnie z wynalazkiem, nowe pochodne chlorofilu posiadają strukturę przedstawioną wzorem 1, przy czym atom centralny M jest atomem Pt(II), a R jest fitylem lub atomem wodoru. Sposób otrzymywania nowych pochodnych chlorofilu polega na tym, że chlorofil, feofitynę lub ich pochodne poddaje się reakcji ze związkiem kompleksowym platyny(ii), korzystnie z K 2 [PtCl 4 ], w środowisku kwasu karboksylowego o 1 do 4 atomach węgla, korzystnie kwasu octowego, w zakresie temperatur 30 do 110 C, korzystnie 40 do 100 C. Preparat terapeutyczny lub diagnostyczny, zawiera jako substancję aktywną nowe pochodne chlorofilu, posiadające strukturę przedstawioną wzorem 1, przy czym atom centralny M jest atomem Pt(II), a R jest fitylem lub atomem wodoru. Jak wykazały badania laboratoryjne, pochodne chlorofilu, będące przedmiotem wynalazku, są bardzo wydajnymi fotouczulaczami i wykazują wysoką aktywność fotocytotoksyczną. Dlatego można je skutecznie wykorzystać w celach terapeutycznych lub diagnostycznych, na przykład do generowania aktywnych form tlenu, w tym tlenu w stanie singletowym, lub indukowanego światłem uwalniania aktywnych form jonów platyny, jak również do detekcji tlenu. Poniższa tabela przedstawia nomenklaturę chlorofilu, jego naturalnej pochodnej - chlorofilidu, oraz pochodnych chlorofilu, będących przedmiotem wynalazku, przedstawionych we wzorze 1. Podstawnik Barwnik M R chlorofil a (Chla) Mg fityl Pt-Chla Pt fityl chlorofilid (Chlide) Mg H Pt-Chlide Pt H Wzór 1 przedstawia strukturę chemiczną oraz numerację atomów węgla w cząsteczce chlorofilu a i jego pochodnych. Właściwości pochodnych chlorofilu, objętych wynalazkiem, zilustrowano na rysunku, na którym fig. 2 przedstawia widma absorpcji elektronowej Pt-Chla i Pt-Chlide w metanolu; fig. 3 - przeżywalność komórek linii S91 inkubowanych w ciemności w obecności Pt-Chlide; fig. 4 - porównanie efektu fotodynamicznego Pt-Chlide na komórki S91 z efektami fotodynamicznymi Chlide oraz komercyjnego fotosensybilizatora Photofrin II. Zastosowano logarytmiczną skalę osi rzędnych; fig. 5 - wpływ stężenia fotosensybilizatora użytego do inkubacji komórek na wielkość efektu fotodynamicznego Pt-Chlide na komórki S91. Zastosowano logarytmiczną skalę osi rzędnych. Wynalazek ilustrują poniższe przykłady, które nie ograniczają jego zakresu. P r z y k ł a d I (Synteza i oczyszczanie Pt-Chla) Porcję czystego chlorofilu a (1,8 mg) rozpuszcza się w 1,1 ml lodowatego kwasu octowego i w temperaturze 80 C miesza z 10 mg soli K 2 [PtCl 4 ] (10-krotny nadmiar stechiometryczny) rozpuszczonej w 0,1 ml wody destylowanej. Następnie do roztworu reagentów dodaje się 55 mg octanu sodu. Reakcję insercji Pt do pierścienia chlorofilu prowadzi się w ciągu 20 minut ogrzewania mieszaniny reakcyjnej w łaźni olejowej o temperaturze C. Przebieg reakcji kontroluje się poprzez rejestrację widm absorpcyjnych próbek mieszaniny reakcyjnej w metanolu. Po reakcji, rozpuszczalnik odparowuje się w strumieniu azotu i ewentualnie dodaje się niewielką ilość acetonu i kontynuuje odparowywanie. Po wysuszeniu, produkt rozpuszcza się w małej objętości chloroformu i przesącza przez bibułę chromatograficzną w celu oddzielenia stałych zanieczyszczeń. Przesącz odparowuje się pod azotem i osusza pod próżnią a końcowy produkt, Pt-Chla, oczyszcza się chromatograficznie na DEAE-Sepharose CL6B (Pharmacia, Szwecja). W tym celu kolumnę o średnicy 14 mm wypełnia się do wysokości około 5-6 cm żelem DEAE- -Sepharose zawieszonym w acetonie. Na kolumnę nakłada się próbkę rozpuszczoną w mieszaninie 5% metanolu/95% acetonu (v/v) i wypłukuje rozpuszczalnikiem o tym samym składzie. Zbiera się ciemno-

5 PL B1 5 zieloną frakcję, zawierającą oczyszczony Pt-Chla, rozpuszczalnik odparowuje się a produkt osusza dokładnie pod próżnią. Czysty produkt przechowuje się w atmosferze argonu w temperaturze -30 C. Czystość produktu określono za pomocą analitycznej chromatografii cienkowarstwowej (TLC) na żelu krzemionkowym (Merck, RFN). Chromatogram rozwinięto w eluencie o składzie: 68% dichlorometan, 25% n-heksan, 5% 2-propanol, 2% metanol (v/v). Masa cząsteczkowa produktu, oznaczona za pomocą spektroskopii masowej, wynosi 1065 jm (m/z), a obliczona na podstawie wzoru sumarycznego 1064,3 jm. P r z y k ł a d II (Synteza i oczyszczanie Pt-Chlide) Porcję czystego chlorofilidu a (Chlide) (0,25 mg) rozpuszcza się w 0,2 ml lodowatego kwasu octowego i w temperaturze 90 C dodaje się 1,6 mg K 2 [PtCl 4 ] rozpuszczonego w 0,2 ml wody oraz porcję octanu sodu (13 mg). Mieszaninę reakcyjną utrzymuje się w temperaturze C pod chłodnicą zwrotną przez około 1,5 godziny. Przebieg reakcji insercji Pt kontroluje się przez rejestrację widm absorpcyjnych próbek pobranych z mieszaniny reakcyjnej. Po zakończeniu reakcji, rozpuszczalnik z mieszaniny reakcyjnej odparowuje się pod azotem, ewentualnie z dodatkiem małej ilości metanolu. Suchą pozostałość rozpuszcza się w niewielkiej ilości metanolu i odwirowuje (5 min, 7000 obr/min, 15 C), zbiera nadsącz i ponownie odparowuje pod azotem. Końcowy produkt, Pt-Chlide, otrzymuje się po dwukrotnym oczyszczeniu metodą chromatografii kolumnowej na CM-Sepharose (Pharmacia, Szwecja). W tym celu, próbkę surowego produktu rozpuszczonego w mieszaninie 40% metanolu w acetonie nakłada się na kolumnę o średnicy 10 mm wypełnioną do wysokości około 3 cm żelem CM-Sepharose, uprzednio stabilizowanym w acetonie. Frakcję zawierającą czysty produkt wymywa się z kolumny wpierw mieszaniną 40% metanolu w acetonie a potem roztworem 10% kwasu octowego w acetonie. Po odparowaniu rozpuszczalnika, procedurę oczyszczania powtarza się. Na koniec produkt suszy się pod próżnią i przechowuje w temperaturze -30 C w atmosferze argonu. Stopień czystości Pt-Chlide określono za pomocą wysokosprawnej chromatografii cienkowarstwowej z odwróconą fazą (HPTLC RP-18, Merck). Po nałożeniu próbki barwnika na płytkę, chromatogram rozwinięto w eluencie o składzie: 50% metanol/50% acetonitryl (v/v). Masa cząsteczkowa produktu, oznaczona za pomocą spektroskopii masowej, wynosi 786 jm (m/z), a obliczona na podstawie wzoru sumarycznego 785,5 jm. P r z y k ł a d III (Widma absorpcyjne Pt-Chla i Pt-Chlide) Widma absorpcyjne Pt-Chla i Pt-Chlide, wyznaczone znaną metodą, przedstawiono na fig. 2. Są typowe dla chloryn, ale kształtem nieco odbiegają od widm naturalnych barwników, Chla i Chlide, które są substancjami wyjściowymi do ich syntezy. Zasadniczą różnicą jest przesunięcie położenia maksimum pasma Q Y z 660 nm do 635 nm, co dodatkowo potwierdza obecność Pt(II) jako atomu centralnego w tych związkach. P r z y k ł a d IV (Wyznaczenie poziomu cytotoksyczności Pt-Chlide w ciemności) Komórki nowotworowe czerniaka (linia S91) w ilości 1 x 10 5 umieszczono na dnie naczynek hodowlanych (szalki Petriego) w pożywce RMPI 5 zawierającej antybiotyki (penicylina oraz streptomycyna) i pozostawiono w cieplarce (37 C, 5% CO 2 ) w celu ich rozpłaszczenia. Po usunięciu medium i przemyciu komórek zbuforowanym roztworem soli fizjologicznej (PBS, bez jonów Ca 2+ i Mg 2+ ), do szalek z komórkami podano świeżo przygotowane i wyjałowione roztwory Pt-Chlide w PBS, zawierające od 0 do 0,5 μμ fotouczulacza i poddano inkubacji w cieplarce (15 min, 37 C, 5% CO 2 ). Następnie usunięto roztwór fotouczulacza, przemyto komórki zbuforowanym roztworem PBS, podano nową porcję pożywki hodowlanej i pozostawiono komórki w cieplarce. Wszystkie czynności przeprowadzano chroniąc kultury komórkowe od światła. Po 48 godz. inkubacji, w celu uzyskania jednorodnej zawiesiny, komórki traktowano roztworem 0,05% trypsyny, zawierającym EDTA. Frakcję przeżywającą określono przez zliczanie w komorze Burkera, względem kontrolnych nieoświetlanych komórek, nie inkubowanych z fotosensybilizatorem. Wykres - fig. 3 przedstawia zależność wielkości frakcji przeżywających komórek S91 od użytego stężenia Pt-Chlide. Wykres obrazuje fakt, że w zakresie stężeń do 0,5 μμ Pt-Chlide w ciemności nie jest cytotoksyczny dla komórek linii S91, a w zakresie najniższych stężeń posiada nieznaczne właściwości stymulujące.

6 6 PL B1 P r z y k ł a d V (Efekt fotodynamiczny Pt-Chlide) Poniższy przykład ilustruje efekt fotodynamiczny wywierany przez Pt-Chlide na modelowe kultury in vitro komórek czerniaka linii S91 i przedstawia porównanie z efektami fotodynamicznymi wykazywanymi przez dwa inne fotouczulacze, tj. z komercyjnie dostępnym Photofrinem II, fotosensybilizatorem dopuszczonym do użycia w terapii fotodynamicznej oraz chlorofilidem (Chlide), hydrofilową pochodną Chla. A) Porównanie efektów fotodynamicznych Pt-Chlide, Chlide i Photofrinu II Komórki czerniaka linii S91 w ilości 1 x 10 5 umieszczono na dnie naczynek hodowlanych (szalki Petriego) w pożywce RMPI 5 zawierającej antybiotyki (penicylina oraz streptomycyna) i pozostawiono w cieplarce (37 C, 5% CO 2 ) w celu ich rozpłaszczenia. Po usunięciu medium i przemyciu komórek zbuforowanym roztworem soli fizjologicznej (PBS, bez jonów Ca 2+ i Mg 2+ ) do szalek z komórkami podano świeżo przygotowane i wyjałowione roztwory fotouczulacza i poddano je inkubacji w cieplarce (15 min, 37 C, 5% CO 2 ). Następnie komórki napromieniowano światłem czerwonym o długościach fal powyżej 600 nm o natężeniu 108 mw/cm 2, regulując wielkość dawek światła przez odpowiednio dobrane czasy naświetlania. Jako źródło światła zastosowano mikroprocesorowy oświetlacz halogenowy HOP (Optel, Opole) wyposażony w światłowód (średnica 8 mm) z wewnętrznym filtrem górnoprzepustowym, przepuszczającym promieniowanie w zakresach powyżej 600 nm). Po naświetlaniu, usunięto roztwór fotouczulacza, przemyto komórki buforowanym roztworem soli fizjologicznej (PBS, bez jonów Ca 2+ i Mg 2+ ) i inkubowano 48 godz. w świeżym podłożu hodowlanym w cieplarce. Po potraktowaniu komórek trypsyną zliczono je jak w Przykładzie IV. Frakcję przeżywającą określono względem kontrolnej hodowli tych samych komórek, nie traktowanych ani fotouczulaczem ani światłem. Zastosowano następujące stężenia fotouczulaczy: Pt-Chlide: 0,5 μμ (0,38 μg/ml) Chlide: 1 μμ (0,59 μg/ml), Photofrin II: 10 μg/ml. Powyżej opisaną procedurę przeprowadzono w czterech powtórzeniach, zaś na wykresie fig. 4 przedstawiono uśrednione wyniki. We wszystkich przypadkach wykres obrazuje typową zależność wywieranego efektu fotodynamicznego od dostarczonej dawki światła. Jednakże modyfikacja naturalnego barwnika roślinnego Chlide, polegająca na podstawieniu centralnego jonu Mg przez jon Pt drastycznie zwiększa jego właściwości fotocytotoksyczne. Porównanie z komercyjnym fotouczulaczem Photofrin II pokazuje, że podobny efekt fotodynamiczny na komórki linii S91 in vitro osiągany jest już przy stężeniach Pt-Chlide 25-krotnie niższych od stężeń wymaganych dla Photofrinu II. Efekt fotocytotoksyczny Pt-Chlide jest silniejszy niż można by oczekiwać. Jest to, jak się wydaje, skutkiem synergistycznego mechanizmu działania polegającego na amplifikowaniu efektu fotodynamicznego chlorofilu (lub pochodnej) przez uwolnione w reakcji fotodysocjacji aktywne formy jonów platyny(ii). B) Zależność efektu fotodynamicznego od stężenia Pt-Chlide. Do oświetlania komórek użyto światła czerwonego o długościach fali powyżej 600 nm o mocy 108 mw/cm 2, dostarczona dawka światła: 97 J/cm 2. Pozostałe warunki wyznaczania efektu fotodynamicznego zachowano jak w punkcie A niniejszego przykładu, używając komórek linii S91. Parametrem zmiennym było stężenie Pt-Chlide, użytego do inkubacji komórek. Uzyskane wyniki zilustrowano wykresem - fig. 5. Wykres ten ilustruje silną zależność efektu fotodynamicznego od stężenia fotosensybilizatora. Zastrzeżenia patentowe 1. Nowe pochodne chlorofilu o strukturze przedstawionej wzorem 1, w którym M oznacza atom Pt(II), a R oznacza fityl lub atom wodoru. 2. Sposób otrzymywania nowych pochodnych chlorofilu o strukturze przedstawionej wzorem 1, znamienny tym, że chlorofil, feofityne lub ich pochodne poddaje się reakcji ze związkiem kompleksowym platyny(ii), korzystnie z K 2 [PtCl 4 ], w środowisku kwasu karboksylowego o 1 do 4 atomach węgla, korzystnie kwasu octowego, w zakresie temperatur 30 do 110 C, korzystnie 40 do 100 C. 3. Preparat terapeutyczny lub diagnostyczny, znamienny tym, że jako substancję aktywną zawiera nowe pochodne chlorofilu o strukturze przedstawionej wzorem 1, w którym M oznacza atom Pt(II), a R oznacza fityl lub atom wodoru.

7 PL B1 7 Rysunki

8 8 PL B1

9 PL B1 9

10 10 PL B1 Departament Wydawnictw UP RP Cena 2,46 zł (w tym 23% VAT)