(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 676 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (13) (1) T3 Int.Cl. C12Q 1/68 (06.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 13/02 EP 676 B1 (4) Tytuł wynalazku: Sposób i zestaw do molekularnego ilościowego oznaczania chromosomów () Pierwszeństwo: US 799 P (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 09/02 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 13/08 (73) Uprawniony z patentu: Vytal Diagnostics AB, Hägersten, SE (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP 676 T3 DAN HAUZENBERGER, Saltsjö-Boo, SE ULF KLANGBY, Sollentuna, SE ANDERS HEDRUM, Älta, SE (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Zofia Sulima SULIMA GRABOWSKA SIERZPUTOWSKA BIURO PATENTÓW I ZNAKÓW TOWAROWYCH SP.J. Skr. poczt Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 SGS-318/VAL Opis Dziedzina wynalazku EP B1 [0001] Niniejszy wynalazek dotyczy nowego sposobu do stosowania w wykrywaniu lub diagnozie aberracji chromosomowych. Wynalazek dotyczy szczególnie sposobu względnego molekularnego ilościowego oznaczania chromosomów umożliwiającego wykrywanie zarówno aneuploidii chromosomów, jak również ilościowych i jakościowych aberracji genów. Wynalazek dotyczy ponadto zestawu diagnostycznego. Tło [0002] Dobrze wiadomo, że ryzyko wystąpienia anomalii chromosomowych płodu (np. zespołu Downa) wzrasta wraz z wiekiem matki. Diagnostyka prenatalna odpowiada na potrzebę wykrywania na wczesnym etapie ciąży wielu anomalii chromosomowych. Prenatalna diagnoza anomalii chromosomowych stała się szeroko dostępna dla ciąż wysokiego ryzyka w ostatnich trzech dziesięcioleciach. Ryzyko wzrasta z wiekiem, a istotnie podwyższone ryzyko obserwuje się u matek w wieku 3 lat i starszych. Anomalie chromosomowe często obejmują trisomię 21 (zespół Downa), ale trisomie 13 i 18 oraz defekty chromosomów płciowych są również często obserwowane u dzieci urodzonych przez matki z tej grupy wiekowej. W wieku lat ryzyko trisomii 21 wynosi w przybliżeniu 1/00, 1/ w wieku lat, 1/900 w wieku lat, 1/400 w wieku 3 lat, 1/0 w wieku 40 lat i 1/40 w wieku 4 lat. [0003] Kariotypowanie jest najczęściej stosowaną metodą badawczą z użyciem materiału uzyskanego technikami inwazyjnymi, takich jak pobieranie próbek kosmków kosmówki (CVS) i punkcja owodni. Kariotypowanie pozwala wykryć pewien zestaw liczbowych i strukturalnych aberracji chromosomowych, poza powszechnymi autosomalnymi trisomiami 13 (zespół Pataua), 18 (zespół Edwardsa) i 21 (zespół Downa), jak również aberracje chromosomów płciowych, np. X0 (zespół Turnera) i XXY (zespół Klinefeltera). Jednak ze względu na to, że płyn owodniowy i komórki kosmków kosmówki są hodowane przed analizą, uzyskanie wyników może być opóźnione aż do 14 dni lub dłużej. Opracowano zatem metody molekularne oparte na łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) i hybrydyzacji sond DNA (cytowany dokument niepatentowy 0001: HULTEN, M A. Rapid and simple prenatal diagnosis of common chromosome disorders: advantages and disadvantages of the molecular methods FISH and QF-PCR. Reproduction, 03 tom 126, nr 3, str oraz cytowany dokument niepatentowy 0002: NICOLINI, U. The introduction of QF-PCR in prenatal diagnosis of fetal aneuploidies: time for reconsideration. Human Reproduction Update, 04 tom, nr 6, str ). Te techniki są szybsze od kariotypowania i mogą być stosowane w przypadku wymienionych powyżej powszechnych aneuploidii chromosomów autosomalnych i płciowych. Do obecnie stosowanych technik należą FISH (fluorescencyjna hybrydyzacja in-situ) komórek niepochodzących z hodowli oraz QF-PCR (ilościowa fluorescencyjna PCR). Te techniki dają wyniki w ciągu 48 godzin, ale mogą mieć ograniczenia w wykrywaniu aneuploidii chromosomowych w przypadku mozaicyzmu (cytowany dokument niepatentowy 0003: CAINE, A. Prenatal detection of Down s syndrome by rapid aneuploidy testing for chromosomes 13, 18, and 21 by FISH or PCR without a full karyotype: a cytogenetic risk assessment. Lancet, 0 tom 366, nr 9480, str ) i/lub w próbkach zanieczyszczonych komórkami matki (MCC). Jednakże fakt, iż te testy dają wyniki w ciągu godzin, co umożliwia wczesne decyzje dotyczące postępowania w przypadku ciąży z zaburzeniami płodu, doprowadził w wielu laboratoriach do zmiany techniki przesiewowych badań prenatalnych. [0004] QF-PCR opiera się na technologii, w której specyficzne dla chromosomu powtórzone sekwencje DNA (znane jako krótkie powtórzenia tandemowe (STR)) amplifikuje się metodą

3 PCR. Zastosowanie fluorescencyjnie znakowanych starterów umożliwia uwidocznienie i ilościowe oznaczenie fluorescencyjnie znakowanych produktów PCR. Oznaczanie ilościowe można przeprowadzić obliczając stosunek powierzchni pików specyficznych dla odpowiednich długości powtórzeń z użyciem automatycznego sekwenatora DNA. STR różnią się długością pomiędzy osobnikami, w zależności od tego ile razy powtórzone są tri-, tetra- lub pentanukleotydy. Zamplifikowany DNA od zdrowych osobników heterozygotycznych (mających allele różnej długości) powinien wykazywać dwa piki o takich samych powierzchniach. Zamplifikowany DNA od pacjentów z trisomią będzie wykazywać albo dodatkowy pik (gdy jest trójalleliczny) o takiej samej powierzchni, albo tylko dwa piki (gdy jest dwualleliczny), z których jeden jest dwa razy większy od drugiego (cytowany dokument niepatentowy 0004: NI- COLINI, U. The introduction of QF-PCR in prenatal diagnosis of fetal aneuploidies: time for reconsideration. Human Reproduction Update, 04 tom, nr 6, str ). Osobnicy homozygotyczni (mający allele tej samej długości) lub monosomiczni będą wykazywali tylko jeden pik. [000] Niezdolność techniki QF-PCR do rozróżniania osobników homozygotycznych od monosomicznych jest główną wadą w przypadku badania aberracji chromosomów płciowych. Gdy stosuje się STR specyficzne dla chromosomu X, niektóre próbki od zdrowych kobiet (46,XX) mogą wykazywać homozygotyczne wzorce QF-PCR, nierozróżnialne od tych wytworzonych przez próbki z pojedynczym chromosomem X, jak w zespole Turnera (4,X). Wprowadzenie do analizy dodatkowych markerów STR chromosomu X zmniejszy, ale nie wyeliminuje prawdopodobieństwa homozygotyczności (cytowany dokument niepatentowy 000: DONAGHUE, C. Development and targeted application of a rapid QF-PCR test for sex chromosome imbalance. Prenat Diagn, 03 tom 23, nr 3, str. 1-). [0006] Prenatalną diagnozę zespołu Turnera na podstawie stwierdzenia braku metylowanej kopii genu FMR-1 na chromosomie X opisano jako potencjalnie przydatny sposób wykrywania zespołu Turnera (cytowany dokument niepatentowy 0006: PENA, S D J. Fetal diagnosis of monosomy X (Turner s syndrome) with methylation-specific PCR. Prenatal Diagnosis, 03 tom 23, str ). [0007] Genotypowanie homologicznych segmentów genu amelogeniny z X i Y (AMELX i AMELY) w celu identyfikacji płci jest szeroko stosowane podczas określania profilu DNA w diagnozach prenatalnych. Regiony w tym genie są wystarczająco konserwatywne i mogą być amplifikowane z użyciem identycznych starterów, do równoczesnego wykrywania alleli AMELX i AMELY w procedurach identyfikacji płci. Gdy amplifikację AMELX i AMELY prowadzi się z zastosowaniem procedury QF-PCR, może ona być również przydatna przy dostarczaniu ilościowego związku między chromosomami X i Y. Jednak nie uzyska się informacji ilościowej dla chromosomu X u kobiet, ponieważ gen AMELY nie jest obecny. [0008] Jako alternatywną strategię QF-PCR do diagnozy monosomii X zaproponowano względne oznaczenie ilościowe chromosomu X drogą amplifikacji markera STR chromosomu X (HPRT) względem markera STR chromosomu 21 (D21S1411) z użyciem oddzielnych par starterów. Ten sposób nie wymaga uzyskania heterozygotycznego wzorca pod względem markerów STR, ale zakłada identyczną wydajność amplifikacji dla dwóch różnych par starterów amplifikujacych dwa różne markery STR (cytowany dokument niepatentowy 0007: CIRI- GLIANO, V. X chromosome dosage by quantitative fluorescent PCR and rapid prenatal diagnosis of sex chromosome aneuploidies. Molecular Human reproduction, 02 tom 8, nr 11, str ). [0009] Cirigliano i in. zastosowali w podobny sposób markery STR i QF-PCR do prenatalnej diagnozy aberracji chromosomowych (Molecular Human Reproduction, Rapid prenatal diagnosis of chromosome aneuploidies by QF-PCR. Assessment on consecutive clinical samples., tom, 04, str oraz Annals of the New York Academy of Sciences,

4 Rapid prenatal diagnosis by QF-PCR: Evaluation of,000 concecutive clinical samples and future applications, tom 7, wrzesień 06, str ) [00] Zestaw do testu diagnostycznego in vitro ChromoQuant do analizy zaburzeń chromosomowych jest dostarczony przez Cybergene AB i oceniony przez National Genetics Reference Laboratory (Wessex), XP-00988, wrzesień 0. ChromoQuant opiera się na wykrywaniu heterozygotycznych markerów STR i niezmiennych markerów determinujących płeć. Główną wadą tej techniki jest potrzeba wykrywania heterozygotycznych markerów w celu wykrycia ploidii chromosomów. [0011] W rezultacie nadal pozostaje zapotrzebowanie na ulepszony sposób umożliwiający wyeliminowanie wad i niedogodności związanych ze znanymi sposobami. Streszczenie [0012] Przy opracowywaniu sposobu ilościowego oznaczania chromosomów i genów w próbce pobranej od człowieka, twórcy niniejszego wynalazku nieoczekiwanie stwierdzili, że powyższe wady i niedogodności można wyeliminować wybierając co najmniej dwie sekwencje markerowe inne niż STR, przy czym jedna sekwencja markerowa jest sekwencją, o której wiadomo, że jest obecna na chromosomie X, a druga sekwencja markerowa jest sekwencją, o której wiadomo, że jest obecna na chromosomie autosomalnym, i sekwencje markerowe są częściowo homologiczne. Zgodnie z tym sposobem próbkę amplifikuje się z użyciem zasadniczo homologicznych par starterów do PCR hybrydyzujących z sekwencjami markerowymi, o których wiadomo, że są obecne na chromosomach, oraz wykrywa się zamplifikowane fragmenty DNA. [0013] Stosunek produktów amplifikacji sekwencji markerowych obecnych na chromosomie autosomalnym i chromosomie X wynoszący 2:1 wskazuje na zespół Turnera. [0014] Wynalazek jest zdefiniowany w załączonych zastrzeżeniach, wprowadzonych tu przez odniesienie. Krótki opis rysunków [00] Wynalazek zostanie dalej opisany bardziej szczegółowo w następującym opisie, nie stanowiących ograniczenia przykładach i zastrzeżeniach, w odniesieniu do załączonych rysunków, na których [0016] Figura 1 ilustruje analizę zgodnie z technologią ze stanu techniki z zastosowaniem QF-PCR i STR specyficznych dla chromosomu, w której nie jest możliwe dokonanie rozróżnienia między osobnikami homozygotycznymi i monosomicznymi. W tym teście zdrowi osobnicy homozygotyczni będą wykazywać dwa piki o takiej samej powierzchni piku. Zamplifikowany DNA od osobników z trisomią będzie wykazywać dodatkowy pik (gdy jest trójalleliczny), lub tylko dwa piki (gdy jest dwualleliczny), podczas gdy osobnicy homozygotyczni lub monosomiczni będą wykazywać tylko jeden pik. [0017] Figura 2 ilustruje postać wynalazku, w której stosuje się jedną parę starterów specyficzną dla sekwencji markerowej na chromosomie płciowym, jak również dla sekwencji markerowej na chromosomie autosomalnym, przy czym te dwie sekwencje markerowe są co najmniej częściowo homologiczne i różnią się długością. [0018] Figura 3a przedstawia normalny chromatogram mężczyzny (46,XY) przejawiający się obecnością AMELX i AMELY w stosunku 1:1. Pojedynczy allel markera specyficznego dla X DXS1187 i stosunek powierzchni chromosomu 7 (BRAF7) do chromosomu X (BRAFX) wynoszacy 2:1. [0019] Figura 3b przedstawia normalny chromatogram kobiety (46,XX) przejawiający się obecnością AMELX i brakiem AMELY. Wzorzec dwualleliczny markera specyficznego dla X DXS1187 w stosunku 1:1 i stosunek powierzchni chromosomu 7 (BRAF7) do chromosomu X

5 (BRAFX) wynoszący1:1. [00] Figura 3c przedstawia chromatogram kobiety z zespołem Turnera, X0 (4,X), przejawiający się obecnością AMELX i brakiem AMELY. Wzorzec monoalleliczny markera specyficznego dla X DXS1187 i stosunek powierzchni chromosomu 7 (BRAF7) do chromosomu X (BRAFX) wynoszący 2:1. Opis szczegółowy [0021] Należy podkreślić, że formy w liczbie pojedynczej, które stosuje się w tym opisie i w załączonych zastrzeżeniach obejmują też ich odpowiedniki w liczbie mnogiej jeżeli kontekst wyraźnie nie wskazuje inaczej. [0022] Określenie około stosowane w kontekście wartości liczbowych oznacza przedział dokładności, znany i dopuszczany przez specjalistę w danej dziedzinie. Ten przedział może wynosić ± % lub korzystnie ± %. [0023] Przy opisywaniu i zastrzeganiu niniejszego wynalazku będzie stosowana następująca terminologia zgodnie z przedstawionymi tu definicjami. [0024] Określenie próbka oznacza tu pewną objętość cieczy, roztworu, bioptatu lub zawiesiny komórek pobraną od człowieka. Próbka może być poddana oznaczaniu ilościowemu lub jakościowemu zgodnie z wynalazkiem jako taka, lub po odpowiedniej obróbce wstępnej, takiej jak homogenizacja, sonikacja, sączenie, sedymentacja, wirowanie itd. [00] Typowe próbki w kontekście niniejszego wynalazku stanowią płyny ustrojowe, takie jak krew, osocze, surowica, płyn owodniowy, limfa, mocz, ślina, nasienie, płyn żołądkowy, plwocina, łzy, jak również próbki tkanek, takie jak próbki kosmków kosmówki (CVS) itd. [0026] Ponadto w kontekście tego wynalazku określenia hybrydyzacja i zdolny do hybrydyzacji odnoszą się do wiązań wodorowych, które mogą być wiązaniami wodorowymi Watsona-Cricka, Hoogsteena lub odwróconymi wiązaniami Hoogsteena pomiędzy komplementarnymi nukleozydami lub zasadami kwasu nukleinowego. Przykładowo, adenina i tymina są komplementarnymi zasadami kwasu nukleinowego, które tworzą pary z utworzeniem wiązań wodorowych. [0027] Stosowane tu określenie komplementarny odnosi się do zdolności do dokładnego parowania między dwoma nukleotydami. Przykładowo, jeżeli nukleotyd z określonej pozycji w oligonukleotydzie jest zdolny do utworzenia wiązania wodorowego z nukleotydem z tej samej pozycji w cząsteczce DNA lub RNA, to wtedy oligonukleotyd i DNA lub RNA są uznane za wzajemnie komplementarne w tej pozycji. Oligonukleotyd i DNA lub RNA są ze sobą komplementarne, gdy wystarczająca liczba odpowiadających sobie pozycji w każdej cząsteczce jest zajęta przez nukleotydy, które mogą tworzyć ze sobą wiązania wodorowe. Zatem określenia zdolny do hybrydyzacji i komplementarny są stosowane do wskazania komplementarności lub dokładnego parowania w wystarczającym stopniu, by między oligonukleotydem i docelowym DNA lub RNA powstało stabilne i specyficzne wiązanie. [0028] Wyrażenia częściowo homologiczne lub częściowo identyczne odnoszą się do pokrewieństwa lub stopnia identyczności pomiędzy dwiema sekwencjami, tutaj korzystnie dwiema sekwencjami markerowymi, z których każda zawiera część sekwencji homologiczną do części drugiej sekwencji. Homologia pomiędzy tymi częściami jest zdefiniowana jako dopasowanie co najmniej około 90 lub korzystniej około 9% nukleotydów z tych części. Częściowa homologia pozwala zatem na niską homologię na całej długości sekwencji, pod warunkiem, że ich dwie zdefiniowane części wykazują wysoką homologię, na poziomie co najmniej około 90 % lub wyższą. [0029] Wyrażenia zasadniczo homologiczne lub zasadniczo identyczne odnoszą się do pokrewieństwa lub stopnia identyczności pomiędzy dwiema sekwencjami, tutaj korzystnie starterem i sekwencją markerową, i wymagają, aby co najmniej około 8%, korzystnie co

6 najmniej około 90%, a najkorzystniej co najmniej około 9 lub jeszcze korzystniej około 0% nukleotydów było dopasowanych na zdefiniowanej długości sekwencji DNA. Sekwencje, które są zasadniczo homologiczne można zidentyfikować porównując sekwencje z zastosowaniem standardowych programów dostępnych w bankach danych sekwencji lub w doświadczeniach hybrydyzacji typu Southern prowadzonych na przykład w ostrych warunkach określonych dla tego konkretnego układu. Określenie odpowiednich warunków hybrydyzacji mieści się w zakresie umiejętności w dziedzinie, a wskazówki można znaleźć w literaturze, np. w cytowanym dokumencie niepatentowym 0008: SAMBROOK, J. Molecular Cloning:A Laboratory Manual. 3, : Cold Spring Harbor Laboratory Press, 01. ISBN [00] Homologię lub stopień identyczności można też określić z zastosowaniem odpowiedniego programu, znanego i dostępnego specjalistom w dziedzinie. Przykłady takich programów obejmują, ale nie wyłącznie, ClustalW (dostępny do pobrania na stronie internetowej i NCBI BlastAlign (dostępny na stronie internetowej [0031] Twórcy wynalazku przedstawiają tu technikę wykorzystującą sekwencje DNA specyficzne dla chromosomów płciowych lub sekwencje markerowe, które są częściowo homologiczne do sekwencji specyficznych dla drugiego chromosomu autosomalnego. Te sekwencje DNA można wykorzystać do względnego i bezwzględnego ilościowego oznaczenia genu i/lub chromosomu z zastosowaniem sposobów i zestawów diagnostycznych zdefiniowanych w załączonych zastrzeżeniach, wprowadzonych tutaj w całości. Wykorzystanie opisanej tu techniki pozwala na ilościowe oznaczenie genów i/lub chromosomów niezależnie od tego, czy osobnicy są homozygotami, czy mają prawdziwe aneuploidie chromosomów. Jest to istotna korzyść w porównaniu z wcześniejszymi technikami, z którymi wiąże się ryzyko błędnej diagnozy osobników homozygotycznych. Najważniejsza jest możliwość ilościowego oznaczania zarówno genów, jak i chromosomów z zastosowaniem technik biologii molekularnej. Udostępnia to zupełnie nowe możliwości wykrywania homozygotycznych i heterozygotycznych zaburzeń jednogenowych i wielogenowych, jak również aneuploidii chromosomów z zastosowaniem względnych ilościowych i prawdziwych ilościowych technik biologii molekularnej. [0032] Wynalazek obejmuje projekt lub selekcję co najmniej dwóch sekwencji oligonukleotydowych, które są zasadniczo homologiczne do sekwencji genomowych znajdujących się na co najmniej dwóch interesujących chromosomach. Sekwencje oligonukleotydowe są ponadto projektowane lub wybierane w taki sposób, aby sekwencje genomowe między sekwencjami oligonukleotydowymi na interesującym chromosomie były częściowo homologiczne, co skutkuje amplifikacją fragmentów o odrębnych wielkościach i/lub odrębnych sekwencjach nukleotydowych. Te zamplifikowane fragmenty mogą być bezpośrednio oznaczane ilościowo z zastosowaniem prawdziwych ilościowych technik molekularnych, takich jak PCR w czasie rzeczywistym, gdzie te dwie sekwencje genomowe rozróżnia się na podstawie ich częściowo niehomologicznych sekwencji nukleotydowych. Te zamplifikowane fragmenty można też oznaczyć ilościowo z zastosowaniem względnych ilościowych technik molekularnych, jak na przykład QF-PCR, gdzie zamplifikowane fragmenty nukleotydowe rozróżnia się na podstawie odrębnych wielkości i/lub sekwencji nukleotydowych zamplifikowanych fragmentów wyznaczonych na etapie wykrywania po amplifikacji. [0033] Obie techniki ilościowe, QF-PCR i PCR w czasie rzeczywistym, opierają się na porównywalnej wydajności amplifikacji metodą PCR wszystkich oligonukleotydów biorących udział w reakcji. PCR to skrót oznaczający łańcuchową reakcję polimerazy, która jest techniką wykładniczej amplifikacji małej ilości specyficznej sekwencji nukleotydowej w obecności sekwencji matrycy, dwóch starterów oligonukleotydowych, które hybrydyzują z przeciwległymi niciami i flankują interesujący region w docelowym DNA, oraz termostabilnej polimerazy DNA. Mieszaninę reakcyjną wystawia się na różne temperatury w cyklach obejmujących de-

7 naturację matrycy, przyłączanie starterów i wydłużanie przyłączonych starterów przez polimerazę DNA aż do wytworzenia wystarczającej liczby kopii do dalszej analizy. Prowadzenie analiz metodą PCR jako takie uznaje się za dobrze znane specjaliście mającemu dostęp do odczynników, aparatury i protokołów od wielu różnych dostawców. [0034] Zgodnie z wynalazkiem sekwencje markerowe są częściowo homologiczne i mają różną długość, a ta różnica długości jest wystarczająca do rozróżnienia produktów amplifikacji podczas wykrywania. [003] Zgodnie z wynalazkiem sekwencje markerowe są częściowo homologiczne, ale wystarczająco różnią się sekwencją, aby umożliwić rozróżnienie produktów amplifikacji na podstawie sekwencji pomiędzy starterami do PCR. [0036] Sposób według wynalazku stosuje się do wykrywania i/lub diagnozy monosomii chromosomu w zespole Turnera (X0). [0037] W przykładzie zastosowanym do wykazania użyteczności wynalazku, parą sekwencji markerowych był gen BRAF na chromosomie 7 (BRAF7) i gen BRAF2 na chromosomie X (BRAFX). W tym przykładzie sekwencje markerowe zamplifikowano z użyciem starterów przedstawionych w przykładach jako SEQ ID NO. 1 i SEQ ID NO. 2 (Patrz niżej). [0038] Dodatkowe sekwencje starterów do PCR i ich sugerowane kombinacje do jednoczesnej amplifikacji BRAF7 i BRAFX obejmują, ale nie wyłącznie, następujące: [0039] Starter w przód: GGGGAACGGAACTGATTTTT (SEQ ID NO 1) Starter w tył: TGTTGGGCAGGAAGACTCTAA (SEQ ID NO 2) Starter w tył: TTGTTGGGCAGGAAGACTCTA (SEQ ID NO 3) Starter w tył: TGTTGGGCAGGAAGACTCTA (SEQ ID NO 4) Starter w tył: GTGGTGACTTGGGGTTGCT (SEQ ID NO ) Starter w przód: CTGGGGAACGGAACTGATT (SEQ ID NO 6) Starter w tył: TGTTGGGCAGGAAGACTCTAA (SEQ ID NO 7) Starter w tył: TTGTTGGGCAGGAAGACTCTA (SEQ ID NO 8) Starter w tył: TGGTGACTTGGGGTTGCT (SEQ ID NO 9) Starter w przód: CTGGGGAACGGAACTGATTT (SEQ ID NO ) Starter w tył: TTGTTGGGCAGGAAGACTC (SEQ ID NO 11) Starter w przód: TGGGGAACGGAACTGATTT (SEQ ID NO 12) Starter w przód: AACCCCAAGTCACCACAAAA (SEQ ID NO 13) Starter w tył: TTGTGGTGACTTGGGGTTG (SEQ ID NO 14) Starter w tył: TTTGTGGTGACTTGGGGTTG (SEQ ID NO ) Starter w przód: CAACCCCAAGTCACCACAA (SEQ ID NO 16) Starter w tył: GTGGTGACTTGGGGTTGC (SEQ ID NO 17) [0040] Powyższe sekwencje można stosować w różnych kombinacjach, na przykład jak przedstawiono poniżej: 1. SEQ ID NO 1 i SEQ ID NO 2. Oczekiwana wielkość produktu (chromosom X): 3 pz 2. SEQ ID NO 1 i SEQ ID NO 3. Oczekiwana wielkość produktu (chromosom X): 4 pz 3. SEQ ID NO 13 i SEQ ID NO 3. Oczekiwana wielkość produktu (chromosom X): 0 pz 4. SEQ ID NO 1 i SEQ ID NO 4. Oczekiwana wielkość produktu (chromosom X): 3 pz. SEQ ID NO 1 i SEQ ID NO 14. Oczekiwana wielkość produktu (chromosom X): 172 pz 6. SEQ ID NO 1 i SEQ ID NO. Oczekiwana wielkość produktu (chromosom X): 173 pz 7. SEQ ID NO 1 i SEQ ID NO. Oczekiwana wielkość produktu (chromosom X): 170 pz 8. SEQ ID NO 6 i SEQ ID NO 7. Oczekiwana wielkość produktu (chromosom X): pz 9. SEQ ID NO 6 i SEQ ID NO 8. Oczekiwana wielkość produktu (chromosom X): 6 pz

8 SEQ ID NO 1 i SEQ ID NO 17. Oczekiwana wielkość produktu (chromosom X): 170 pz 11. SEQ ID NO 1 i SEQ ID NO 9. Oczekiwana wielkość produktu (chromosom X): 169 pz 12. SEQ ID NO i SEQ ID NO 7. Oczekiwana wielkość produktu (chromosom X): pz 13. SEQ ID NO i SEQ ID NO 8. Oczekiwana wielkość produktu (chromosom X): 6 pz 14. SEQ ID NO 1 i SEQ ID NO 11. Oczekiwana wielkość produktu (chromosom X): 4 pz. SEQ ID NO 12 i SEQ ID NO 7. Oczekiwana wielkość produktu (chromosom X): 4 pz 16. SEQ ID NO 12 i SEQ ID NO 8. Oczekiwana wielkość produktu (chromosom X): pz 17. SEQ ID NO 13 i SEQ ID NO 11. Oczekiwana wielkość produktu (chromosom X): 0 pz 18. SEQ ID NO 6 i SEQ ID NO 14. Oczekiwana wielkość produktu (chromosom X): 174 pz 19. SEQ ID NO 16 i SEQ ID NO 7. Oczekiwana wielkość produktu (chromosom X): 0 pz. SEQ ID NO 16 i SEQ ID NO 3. Oczekiwana wielkość produktu (chromosom X): 1 pz [0041] Startery można rozróżnić nie tylko na podstawie różnicy długości, ale mogą one zawierać też odpowiednie markerowe grupy funkcyjne, takie jak markery fluorescencyjne lub tym podobne, dobrze znane specjaliście w dziedzinie. [0042] Postać niniejszego wynalazku dostarcza ponadto zestaw diagnostyczny obejmujący odczynniki do przeprowadzania wyżej zdefiniowanego sposobu. [0043] Przykłady 1. Projektowanie i amplifikacja sekwencji nukleotydowych stosowanych do rozróżnienia aneuploidii chromosomów płciowych z zastosowaniem QF-PCR [0044] W celu sprawdzenia zdolności wynalazku do ilościowego oznaczania liczby chromosomów w nieznanej próbce, zastosowano następujące warunki eksperymentalne. Zaprojektowano startery do PCR o sekwencjach homologicznych do sekwencji obecnych w genie BRAF na chromosomie 7 (nr dostępu NCBI NC_000007), jak również w genie BRAF2 na chromosomie X (nr dostępu NCBI NC_000023). Sekwencje starterów do PCR stosowanych do amplifikacji były następujące: Starter w przód: -GGGGAACGGAACTGATTTTT-3 (SEQ ID NO 1) Starter w tył: -HEX-TGTTGGGCAGGAAGACTCTAA-3 (SEQ ID NO 2). [004] Te sekwencje starterów do PCR zastosowano odpowiednio do amplifikacji fragmentu o długości około 182 pz z chromosomu 7 i fragmentu o długości około 3 pz z chromosomu X. W multipleksowej reakcji PCR zawsze uwzględniano startery do PCR dla następujących markerów genetycznych: AMEL, DXS1187, SRY, DXS981 i XHPRT (szczegóły, patrz tabela 1). Specjalista w dziedzinie potrafi zidentyfikować dodatkowe markery na podstawie rutynowych doświadczeń in silico. [0046] Oczyszczanie DNA i reakcje PCR przygotowano i przeprowadzono w następujący sposób: Komórki uzyskano drogą punkcji owodni lub hodowli komórek. Komórki wzbogacono i przemyto z zastosowaniem standardowego odwirowywania i PBS. Po wzbogaceniu i przemyciu DNA wyekstrahowano i oczyszczono z użyciem zestawu QIAamp DNA Blood Kit (Qiagen, Niemcy) i InstaGene Matrix (Bio-Rad Laboratories, UK). Oczyszczone kwasy nukleinowe poddano następnie amplifikacji metodą PCR jak opisano poniżej. W skrócie, µl DNA (1- ng/µl) dodano do mieszaniny reakcyjnej do PCR zawierającej polimerazę Taq (2 U/reakcję), startery PCR (odpowiednio 0,02 µm startera w przód i w tył) i bufor zawierający 0 mm KCl, mm Tris-HCl ph 8,0. Próbkę poddano amplifikacji metodą PCR z użyciem termocyklera GeneAmp PCR System 9700 w następujących warunkach; 9 C min; 94 C s; 8 C 90 s; 72 C 90 s przez 26 cykli, 72 C min i 4 C do końca. Następnie 3 µl zdenaturowanej i zamplifikowanej próbki analizowano w analizatorze genetycznym ABI PRISM jak opisano w dodatku; ABI PRISM Genetic Analyzers User Manual. Jako wewnętrzny wzo-

9 8 rzec wielkości zastosowano Gene-Scan-00 ROX. Wyniki dotyczące takich zamplifikowanych i rozdzielonych fragmentów PCR przedstawiono na Figurach 3a-c. [Tabela 0001] [Tabela] Tabela 1: Przykłady markerów genetycznych ID Markera Lokalizacja Typ Nr dostępu NCBI BRAF Chr X; Chr 7 niezmienny X:NC_ Y:NC_ AMEL Chr X; Chr Y niezmienny X:NC_ Y:NC_ DXS1187 Chr X STR NC_ DXS981 Chr X STR NC_ SRY Chr Y niezmienny NC_ XHPRT Chr X STR NC_ [0047] W sumie przeanalizowano 3 próbki kliniczne, w tym 94 próbek krwi, 4 próbki płynu owodniowego i linii komórkowych. Próbki analizowano z zastosowaniem warunków doświadczalnych i zestawu diagnostycznego opisanego poniżej. Dodatkowo próbki płynu owodniowego analizowano też równolegle metodą kariotypowania. [0048] 8 próbek krwi oznaczono jako męskie ze wszystkimi homozygotycznymi markerami STR chromosomu X i markerem BRAF (7:X) wykazującymi oczekiwany stosunek 2:1. 36 próbek krwi oznaczono jako żeńskie z co najmniej jednym heterozygotycznym markerem STR chromosomu X i oczekiwanym stosunkiem 1:1 BRAF (7:X). Jedna żeńska próbka była homozygotyczna pod względem wszystkich badanych markerów STR chromosomu X, ale wykazywała normalny żeński stosunek 1:1 BRAF (7:X). Wyniki ze wszystkich testowanych próbek krwi podsumowano w Tabelach 2a (żeńskie próbki krwi) i 2b (męskie próbki krwi). [0049] W sumie 2 próbki płynu owodniowego i linii komórkowych oznaczono niezależnie jako żeńskie metodą QF-PCR i kariotypowania (tabela 3a i figura 3b). Ponadto dwie żeńskie próbki oznaczono niezależenie jako 4,X (tabela 3a i figura 3c) metodą QF-PCR i kariotypowania. Wszystkie markery STR chromosomu X były homozygotyczne, a marker BRAF (7: X) wykazywał nieprawidłowy żeński stosunek 2:1 w QF-PCR dla obu próbek 4,X. W sumie 7 próbek płynu owodniowego i linii komórkowych oznaczono niezależnie jako męskie metodą QF-PCR i kariotypowania (Tabela 3b i Figura 3a). Ponadto dwie męskie próbki oznaczono jako 47,XXY metodą QF-PCR i kariotypowania. Co najmniej jeden marker STR chromosomu X był heterozygotyczny, a marker BRAF (7:X) wykazywał nieprawidłowy męski stosunek 1:1 w QF-PCR dla obu próbek 47,XXY. [000] Wyniki QF-PCR dla 94 próbek krwi [Tabela 0002]

10 9 [Tabela] Tabela 2a. Żeńskie próbki krwi Stosunek 7 : X 2:1 1:1 Suma 0 36 Wszystkie markery X homozygotyczne 0 1 Co najmniej jeden marker X heterozygotyczny 0 3 Wykryte chromosomy Y 0 0 Tabela 2b. Męskie próbki krwi Stosunek 7 : X 2:1 1:1 Suma 8 0 Wszystkie badane markery X homozygotyczne 8 0 Co najmniej jeden marker X heterozygotyczny 0 0 Wykryte chromosomy Y 8 0 [001] Wyniki QF-PCR z 9 próbek płynu owodniowego i linii komórkowych [002] [Tabela 0003] [Tabela] Tabela 3a. Żeńskie próbki płynu owodniowego i linii komórkowych Stosunek 7 : X 2:1 1:1 Suma 2* 0** Wszystkie badane markery X homozygotyczne 2* 0 Co najmniej jeden marker X heterozygotyczny 0 0** Wykryte chromosomy Y 0 0 * Wyniki kariotypowania: 4,X ** Wyniki kariotypowania: 46,XX

11 [003] [Tabela 0004] [Tabela] Tabela 3b. Męskie próbki płynu owodniowego i linii komórkowych Stosunek 7 : X 2:1 1:1 Suma * 2** Wszystkie badane markery X homozygotyczne * 0 Co najmniej jeden marker X heterozygotyczny 0 2** Wykryte chromosomy Y * 2** * Wyniki kariotypowania: 46,XY ** Wyniki kariotypowania: 47,XXY 2. Zestaw diagnostyczny [004] Do diagnozy zespołu Turnera u płodu w płynie owodniowym uzyskanym od ciężarnych kobiet zastosowano zestaw diagnostyczny (Devyser Complete, Devyser AB, Sztokholm, Szwecja). [00] Zestaw diagnostyczny zawierał następujące odczynniki: mieszaninę odczynników do PCR (Mix2), zawierającą zestawy starterów do wykrywania BRAF, AMEL, DXS1187, SRY i XHPRT w buforowanym roztworze Mg 2+, i mieszaninę aktywatora PCR (aktywator PCR), zawierającą polimerazę DNA w buforowanym roztworze. Dodatkowo zestaw zawierał drugą mieszaninę odczynników do PCR (Mix1) do analizy markerów STR znajdujących się na chromosomach 13, 18 i 21. [006] Zestaw diagnostyczny stosowano zgodnie z wynalazczym sposobem. W skrócie, oczyszczanie DNA przygotowano i przeprowadzono w następujący sposób: Płyn owodniowy uzyskano drogą punkcji owodni. Wzbogacono amniocyty z płynu owodniowego i płukano z zastosowaniem standardowego odwirowywania i PBS. Po wzbogaceniu i płukaniu DNA wyekstrahowano i oczyszczono z użyciem zestawu QIAamp DNA Blood Kit (Qiagen, Niemcy) lub InstaGene Matrix (Bio-Rad Laboratories, UK). [007] Reakcje PCR przygotowano i przeprowadzono w następujący sposób. Mieszaniny reakcyjne do PCR przygotowano przez dodanie µl aktywatora PCR odpowiednio do każdej mieszaniny Mix1 i Mix2. Po µl każdej z podstawowych mieszanin reakcyjnych rozdzielono kolejno do probówek PCR i do każdej mieszaniny Mix1 i Mix2 dodano po µl oczyszczonego kwasu nukleinowego. W każdej serii uwzględniono kontrolę pozytywną (normalne męskie genomowe DNA) i bez matrycy. [008] Próbki poddano amplifikacji metodą PCR z użyciem termocyklera w następujących warunkach; 9 C min; 94 C s; 8 C 90 s; 72 C 90 s przez 26 cykli, 72 C min i 4 C aż do końca serii. 1, µl zamplifikowanej próbki wymieszano z µl dejonizowanego formamidu zawierającego odpowiedni wzorzec wielkości, a następnie analizowano w analizatorze genetycznym ABI PRISM 31 jak opisano w instrukcjach użycia dostarczonych w zestawie diagnostycznym.

12 Ilościowa i jakościowa analiza molekularna statusu genetycznego w DNA [009] Chociaż wyżej wspomniany sposób rozróżniania aneuploidii chromosomów przedstawiono w tym zgłoszeniu z zastosowaniem QF-PCR, wykrywanie takiej aberracji genetycznej i/lub chromosomalnej z użyciem kwasów nukleinowych można również przeprowadzić z zastosowaniem innej odpowiedniej techniki molekularnej, takiej jak: wykrywanie w punkcie końcowym PCR (w tym na przykład QF-PCR, PCR połączony z wykrywaniem z zastosowaniem analizy żelowej, macierzy DNA lub MALDI-TOF itd.), wykrywanie metodą PCR w czasie rzeczywistym (w tym na przykład podwójnie znakowane sondy, amplikony będące własnymi sondami, barwniki interkalujące itd.). Te techniki są dobrze znane specjalistom w dziedzinie, a aparatura, odczynniki i zestawy są dostępne w handlu u wielu dostawców. Biorąc pod uwagę wskazówki obecne w tym opisie, przykłady i zastrzeżenia, specjalista może dostosować istniejące protokoły i zrealizować wynalazek. Odniesienia [0060] HULTEN, M A, i in. Rapid and simple prenatal diagnosis of common chromosome disorders: advantages and disadvantages of the molecular methods FISH and QF-PCR. Reproduction. 03, tom 126, nr 3, str NICOLINI, U, i in. The introduction of QF-PCR in prenatal diagnosis of fetal aneuploidies: time for reconsideration. Human Reproduction Update. 04, tom, nr 6, str CAINE, A, i in. Prenatal detection of Down s syndrome by rapid aneuploidy testing for chromosomes 13, 18, and 21 by FISH or PCR without a ful karyotype: a cytogenetic risk assessment. Lancet. 0, tom 366, nr 9480, str NICOLINI, U, i in. The introduction of QF-PCR in prenatal diagnosis of fetal aneuploidies: time for reconsideration. Human Reproduction Update. 04, tom, nr 6, str DONAGHUE, C, i in. Development and targeted application of a rapid QF-PCR test for sex chromosome imbalance. Prenat Diagn. 03, tom 23, nr 3, str. 1-. PENA, S D J. Fetal diagnosis of monosomy X (Turner s syndrome) with methylationspecific PCR. Prenatal Diagnosis. 03, tom 23, str CIRIGLIANO, V. X chromosome dosage by quantitative fluorescent PCR and rapid prenatal diagnosis of sex chromosome aneuploidies. Molecular Human reproduction. 02, tom 8, nr 11, str SAMBROOK, J, i in. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3 wydanie. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 01. ISBN Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób ilościowego oznaczania chromosomów i genów w próbce pobranej od człowieka, w diagnozie zespołu Turnera, znamienny tym, że a) wybiera się co najmniej dwie sekwencje markerowe inne niż STR, przy czym - jedna sekwencja markerowa jest sekwencją, o której wiadomo, że jest obecna na chromosomie X, a - druga sekwencja markerowa jest sekwencją, o której wiadomo, że jest obecna na chromosomie autosomalnym, b) próbkę amplifikuje się z użyciem co najmniej dwóch starterów, przy czym te co najmniej dwa startery są komplementarne do sekwencji markerowych, o których wiadomo, że są obecne na tym chromosomie X i tym chromosomie autosomalnym,

13 12 c) każda z tych sekwencji markerowych, o których wiadomo, że są obecne na tym chromosomie X i tym chromosomie autosomalnym, ma część swojej sekwencji homologiczną do części drugiej sekwencji, a homologia pomiędzy tymi częściami wynosi co najmniej 90% i przy czym co najmniej dwa startery są specyficzne dla tych części sekwencji markerowych, a sekwencje markerowe różnią się długością, przy czym różnica długości wystarcza do odróżnienia produktów amplifikacji podczas wykrywania, d) wykrywa się zamplifikowane fragmenty, a stosunek produktów amplifikacji sekwencji markerowych obecnych na chromosomie autosomalnym i chromosomie X wynoszący 2:1 w próbce oznaczonej jako uzyskana od kobiety wskazuje na zespół Turnera. 2. Sposób według zastrzeżenia 1, w którym co najmniej dwie sekwencje markerowe, o których wiadomo, że są obecne na chromosomie X i chromosomie autosomalnym, stanowi gen BRAF na chromosomie 7 i gen BRAF2 na chromosomie X. 3. Sposób według zastrzeżenia 2, w którym sekwencje markerowe amplifikuje się z użyciem starterów wybranych spośród SEQ ID NO Sposób według zastrzeżenia 3, w którym sekwencje markerowe amplifikuje się z użyciem pary starterów wybranej spośród; SEQ ID NO 1 i 2; SEQ ID NO 1 i 3; SEQ ID NO 1 i 4; SEQ ID NO 1 i ; SEQ ID NO 1 i 9; SEQ ID NO 1 i 11; SEQ ID NO 1 i 14; SEQ ID NO 1 i ; SEQ ID NO 1 i 17; SEQ ID NO 6 i 7; SEQ ID NO 6 i 8; SEQ ID NO 6 i 14; SEQ ID NO i 7; SEQ ID NO 12 i 7; SEQ ID NO 13 i 3; SEQ ID NO 13 i 11; SEQ ID NO 16 i 3; oraz SEQ ID NO 16 i 7.. Sposób według zastrzeżenia 3, w którym sekwencje markerowe amplifikuje się z użyciem pary starterów SEQ ID NO. 1 i SEQ ID NO Sposób według zastrzeżenia 2, w którym stosuje się ponadto następujące sekwencje markerowe: AMELX i AMELY, SRY, DXS1187, DXS981 i XHPRT. 7. Zestaw diagnostyczny zawierający co najmniej dwa startery wybrane spośród SEQ ID NO 1-17 do przeprowadzania sposobu według któregokolwiek z zastrzeżeń 1-6. Uprawniony: Pełnomocnik: Vytal Diagnostics AB mgr inż. Zofia Sulima Rzecznik patentowy

14 13

15 14

16 DOKUMENTY CYTOWANE W OPISIE Ta lista dokumentów cytowanych przez Zgłaszającego została przyjęta jedynie dla informacji czytającego i nie jest częścią składową europejskiego opisu patentowego. Została ona utworzona z dużą starannością; Europejski Urząd Patentowy nie ponosi jednak żadnej odpowiedzialności za ewentualne błędy i braki. Dokumenty niepatentowe cytowane w opisie HULTEN, M A. Rapid and simple prenatal diagnosis of common chromosome disorders: advantages and disadvantages of the molecular methods FISH and QF-PCR. Reproduction, 03, tom 126 (3), [0003] NICOLINI, U. The introduction of QF-PCR in prenatal diagnosis of fetal aneuploidies: time for reconsideration. Human Reproduction Update, 04, tom (6), [0003] [0004] CAINE, A. Prenatal detection of Down s syndrome by rapid aneuploidy testing for chromosomes 13, 18, and 21 by FISH or PCR without a full karyotype: a cytogenetic risk assessment. Lancet, 0, tom 366 (9480), [0003] DONAGHUE, C. Development and targeted application of a rapid QF-PCR test for sex chromosome imbalance. Prenat Diagn, 03, tom 23 (3), 1- [000] PENA, S D J. Fetal diagnosis of monosomy X (Turner s syndrome) with methylation-specific PCR. Prenatal Diagnosis, 03, tom 23, [0006] [0060] CIRIGLIANO, V. X chromosome dosage by quantitative fluorescent PCR and rapid prenatal diagnosis of sex chromosome aneuploidies. Molecular Human reproduction, 02, tom 8 (11), 42-4 [0008] [0060] Rapid prenatal diagnosis of chromosome aneuploidies by QF-PCR. Assessment on consecutive clinical samples. Molecular Human Reproduction, 04, tom, [0009] Rapid prenatal diagnosis by QF-PCR: Evaluation of,000 concecutive clinical samples and future applications. Annals of the New York Academy of Sciences. wrzesień 06, tom 7, [0009] SAMBROOK, J. Molecular Cloning:A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 01, tom 3 [0029] HULTEN, M A i in. Rapid and simple prenatal diagnosis of common chromosome disorders: advantages and disadvantages of the molecular methods FISH and QF-PCR. Reproduction, 03, tom 126 (3), [0060] NICOLINI, U i in. The introduction of QF-PCR in prenatal diagnosis of fetal aneuploidies: time for reconsideration. Human Reproduction Update, 04, tom (6), [0060] CAINE, A i in. Prenatal detection of Down s syndrome by rapid aneuploidy testing for chromosomes 13, 18, and 21 by FISH or PCR without a full karyotype: a cytogenetic risk assessment. Lancet, 0, tom 366 (9480), [0060] DONAGHUE, C i in. Development and targeted application of a rapid QF-PCR test for sex chromosome imbalance. Prenat Diagn., 03, tom 23 (3), 1- [0060] SAMBROOK, J i in. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 01 [0060]