Porównanie metod przydatnych w ocenie wpływu flukonazolu na żywotność komórek Candida albicans

Transkrypt

1 diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics 2011 Volume 47 Number Praca oryginalna Original Article Porównanie metod przydatnych w ocenie wpływu flukonazolu na żywotność komórek Candida albicans Comparison of methods, useful in assessing the impact of fluconazole on Candida albicans viability Dominika Trzaska, Monika Kocot, Zenon P. Czuba Katedra i Zakład Mikrobiologii i Immunologii Wydziału Lekarskiego z Oddziałem Lekarsko-Dentystycznym w Zabrzu, Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach Streszczenie Celem pracy było porównanie metod pozwalających na ocenę wpływu różnych stężeń flukonazolu na komórki Candida albicans tj. posiewu ilościowego, spektrofotometrii, testu MTT, chemiluminescencji i mikroskopii fluorescencyjnej z udziałem oranżu akrydyny. W badaniach wykorzystano szczep referencyjny Candida albicans ATCC W pierwszym etapie porównano liczby wyrosłych kolonii komórek grzyba na stałych podłożach Sabourauda, które posiewano z hodowli kontrolnych, prowadzonych na stałym i płynnym podłożu Sabourauda. Gęstości optyczne zawiesin wyjściowych, mierzonych przy długości fali λ=550 nm, wynosiły 0,5 oraz 1,0 według skali McFarlanda. Ponadto określono zmiany w liczebności komórek C. albicans poddanych działaniu flukonazolu w stężeniach 0,1; 1,0 oraz 10 µg/ml w stosunku do kontroli. Metoda posiewu ilościowego umożliwiła określenie przydatności skali McFarlanda do oceny gęstości komórek badanego szczepu w zawiesinie, przeprowadzenie analizy porównawczej liczby wyrosłych kolonii na stałych podłożach, jak również określenie wpływu flukonazolu na żywotność C. albicans. Do oceny żywotności komórek C. albicans w hodowlach badanych wykorzystano również test MTT, metodę spektrofotometryczną, a także mikroskopię fluorescencyjną z użyciem barwienia oranżem akrydyny. W niniejszej pracy określono procent komórek żywych w próbach poddanych działaniu flukonazolu. Summary The aim of this study was to compare methods used to estimate of Candida albicans cells viability, like quantitative culture, absorption spectrophotometry, MTT assay, chemiluminescence method and fluorescence microscopy with acridine orange dye. The references strain of Candida albicans ATCC was used in this study as a control. At first stage of research, we compared numbers of yeast colonies after growth on solid Sabourauda medium, which we inoculated from control culture, maintained on solid and in liquid Sabourauda medium. Optical density of starting measured suspension at 550 nm wavelength conformed 0,5 and 1,0 in McFarland s scale. Moreover we specyfied changes in number of C. albicans cells, treated of fluconazole in concentrations 0,1; 1,0 and 10 µg/ml, according to the control. The solid medium culture allowed us to assess usefulness of McFarland s scale for estimating cell density in suspension, comperative analysis of cells number on medium and defining fluconazole influence on C. albicans cell viability. To assess the C. albicans cell viability we used MTT assay, spectrophotometry and fluorescence microscopy with acridine orange. In this study we estimated percent of lives cells after fluconazole treatment. Słowa kluczowe: Candida albicans, żywotność komórek, spektrofotometria, chemiluminescencja, analiza MTT Key words: Candida albicans, cell viability, spectrophotometry, chemiluminescence, MTT assay Wstęp W ciągu ostatnich lat znacznie wzrosła częstość występowania grzybic, zarówno powierzchniowych jak i układowych, w których dominujący czynnik etiologiczny stanowią drożdżaki z rodzaju Candida, zwłaszcza Candida albicans [1]. Zakażenia grzybicze dotyczą obecnie około 40% ludności świata, a najczęstszą ich lokalizacją jest skóra i jej przydatki. Zakażenia te stanowią 7,9% przyczyn zakażeń szpitalnych. Zajmują czwarte miejsce wśród tych zakażeń na oddziałach intensywnej opieki medycznej i obarczone są w 67-83% śmiertelnością [11, 16]. Pomimo ciągłego postępu w rozpoznawaniu i leczeniu zakażeń grzybiczych pozostają więc one nadal poważnym problemem medycznym. Warunkiem skutecznej i bezpiecznej terapii grzybic jest przede 169

2 Porównanie metod przydatnych w ocenie wpływu flukonazolu na żywotność komórek Candida albicans wszystkim właściwe rozpoznawanie infekcji, połączone z identyfikacją patogennych grzybów, a także właściwy wybór skutecznej i akceptowanej przez chorego metody leczenia. Równie ważna jest odpowiednia profilaktyka, polegająca głównie na usuwaniu czynników predysponujących do zakażenia. Podstawowa diagnostyka mykologiczna obejmuje badanie mikroskopowe materiału biologicznego pobranego od pacjenta, hodowlę na podłożu agarowym oraz identyfikację biochemiczną z użyciem testów opartych na auksanografii węglowodanowej i związków azotowych (testy przyswajania węgla i azotu z określonych związków organicznych) oraz ocenie zdolności wytwarzania określonych enzymów. Uzupełnieniem diagnostyki może być także badanie histologiczne wycinka pobranego z miejsca zajętego przez kolonie grzyba, ocena przeciwciał przeciwgrzybiczych we krwi pacjenta (test immunoenzymatyczny - ELISA) [7, 15] oraz wykrycie materiału genetycznego grzyba z wykorzystaniem technik biologii molekularnej (w tym PCR, real-time PCR) [5, 7, 15, 17, 18]. Metody te dają jednak jedynie wynik jakościowy. Dlatego też celem niniejszej pracy była ocena przydatności posiewu ilościowego na podłożu agarowym w ocenie żywotności komórek C. albicans poddanych działaniu flukonazolu oraz porównanie tej metody z innymi, nie wykorzystywanymi rutynowo w diagnostyce mykologicznej tj. z testem MTT, barwieniem oranżem akrydyny i oznaczaniem ATP metodą chemiluminescencji [6, 8, 10, 19]. Materiały i metody Badany szczep i warunki hodowli Do badań wykorzystano szczep referencyjny Candida albicans ATCC 10231, pochodzący z American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA. Przed użyciem badany szczep został poddany procedurze sprawdzenia czystości, obejmującej obserwację mikroskopową w celu potwierdzenia typowego kształtu komórek badanych, identyfikację biochemiczną przy użyciu testu API 20C AUX firmy Biomerieux Industry, Warszawa, Polska, (przeprowadzoną zgodnie z zaleceniami producenta), a także wzrost na selektywnym podłożu chromogennym. Test API 20C AUX jest wystandaryzowanym zestawem do identyfikacji drożdżaków w czasie godzin i umożliwia przeprowadzenie 12 testów tj. reakcji enzymatycznych lub zakwaszania cukrów, które uwidaczniają się podczas inkubacji dzięki spontanicznym zmianom barwy. Komórki C. albicans hodowano na stałym podłożu Sabourauda, zawierającym pepton (10,0 g/l), glukozę (40,0 g/l) oraz agar (8,0 g/l). Hodowlę prowadzono w temperaturze 37 C i regularnie przesiewano co godziny. Metoda posiewu ilościowego W celu przygotowania komórek badanego szczepu do analizy zastosowano metodę rozcieńczeń. W pierwszym etapie przygotowano jałowy roztwór związku przeciwgrzybicznego - flukonazolu o stężeniu 1 mg/ml, w jałowym buforowanym fizjologicznym roztworze soli (PBS), pozbawionym jonów wapnia i magnezu. Następnie ze sporządzonego roztworu wyjściowego, techniką dziesięciokrotnych rozcieńczeń, przygotowano roztwory flukonazolu w jałowej soli fizjologicznej (0,85%) o stężeniach: 20; 10 i 1,0 µg/ml. W drugim etapie, z 48-godzinnej hodowli szczepu referencyjnego C. albicans na stałym podłożu Sabourauda, sporządzono zawiesiny w roztworze soli fizjologicznej (0,85%). Gęstości optyczne zawiesin (OD, optical density) zmierzone przy użyciu densytometru DensiLaMetr (typ Densi-2, EMO), przy długości fali λ=550 nm, wynosiły odpowiednio 0,250 oraz 0,500 (standard 1,0 oraz 2,0 według skali McFarlanda). Następnie przygotowane szeregi roztworu flukonazolu dodawano do wyjściowych zawiesin szczepu C. albicans, uzyskując w równej objętości końcowe stężenia flukonazolu 10; 1,0 i 0,1 µg/ml. W ostatnim etapie hodowle inkubowano 24 godziny w temperaturze 37 C. Po okresie inkubacji z przygotowanych hodowli komórek C. albicans ze związkiem przeciwgrzybicznym, sporządzono szeregi dziesięciokrotnych rozcieńczeń w zakresie od 10-1 do Z trzech ostatnich stężeń z każdego szeregu pobierano po 2 µl zawiesiny, które przy użyciu ezy kalibrowanej posiewano ilościowo metodą murawkową na powierzchni stałego podłoża Sabourauda. Posiane płytki inkubowano 48 godzin w temperaturze 37 C. Równocześnie przygotowano hodowle kontrolne z 24- i 48-godzinnej hodowli szczepu wzorcowego. Ocenę ilościową komórek badanych C. albicans, wyrażoną przez jednostki tworzące kolonie (CFU - colony forming unit), przeprowadzono w porównaniu do hodowli kontrolnych, pozbawionych związku badanego. Zliczano wyrosłe pojedyncze kolonie na płytce, a uzyskane dane wykorzystano do określenia przydatności skali McFarlanda do oceny gęstości komórek badanego szczepu w zawiesinie, do przeprowadzenia ilościowej analizy porównawczej wyrosłych kolonii komórek grzyba pochodzących z hodowli prowadzonej na stałym podłożu Sabourauda, celem określenia wpływu flukonazolu na żywotność C. albicans w hodowlach badanych w porównaniu do kontroli. Wszystkie oznaczenia prowadzono w dwóch powtórzeniach. Ocena żywotności Candida albicans metodą spektrofotometryczną W pierwszym etapie przygotowano w dwóch szeregach rozcieńczenia roztworu flukonazolu w jałowej soli fizjologicznej (0,85%), o stężeniach: 20; 10 i 1,0 µg/ml, które następnie dodano do zawiesin szczepu badanego C. albicans. Gęstości optyczne zawiesin wyjściowych, przygotowanych z 48-godzinnej hodowli grzyba na stałym podłożu Sabourauda, wynosiły odpowiednio 0,250 dla pierwszego szeregu oraz 0,500 dla drugiego (standard 1,0 oraz 2,0 według skali McFarlanda). Ostatecznie w hodowlach badanych uzyskano stężenie flukonazolu równe 10; 1,0 i 0,1 µg/ml. Przygotowano również hodowle kontrolne, pozbawione związku przeciwgrzybiczego, o gęstościach optycznych 0,125 oraz 0,250 (standard 0,5 oraz 1,0 według skali McFarlanda). Dodatkowo dla flukonazolu sporządzono widmo absorbcyjne, 170

3 D. Trzaska, M. Kocot i Z.P. Czuba w zakresie od 800 do 200 nm, przy użyciu spektrofotometru JASCO V-630 (Japonia). Tak przygotowane próby poddano 24-godzinnej inkubacji w temperaturze 37 C. Po upływie czasu inkubacji zmierzono gęstość optyczną prób badanych i kontrolnych a następnie pobierano po 200 μl i tę ilość zawiesiny nanoszono na mikropłytkę. Odczyt prowadzono w trzech powtórzeniach w automatycznym czytniku do mikropłytek Elx 800 firmy BioTek Instr., (USA), przy długości fali λ=550 nm. Z otrzymanych danych wyliczono procent żywotności C. albicans w obecności badanego związku w porównaniu do kontroli. Ocena żywotności komórek Candida albicans testem MTT Ocenę żywotności komórek badanych C. albicans przeprowadzono z użyciem testu MTT. Polega on na oznaczeniu barwnego produktu formazanu, powstającego po dodaniu bromku [3-(4,5-dimetylo-2-ilo)-2,5-difenylotetrazolu] (MTT) do zawiesiny hodowlanej zawierającej badany związek. Stężenie powstającego produktu jest proporcjonalne do ilości żywych komórek. Nierozpuszczalne w wodzie kryształki formazanu gromadzą się w komórkach i do ich rozpuszczenia konieczne jest użycie roztworu rozpuszczającego barwnik. W tym celu użyto 100% dimetylosulfotlenek (DMSO). Stężenie uwolnionego barwnika mierzono ilościowo w automatycznym czytniku do płytek 96-dołkowych metodą spektrofotometryczną, przy długości fali λ=550 nm, porównując wartości w próbach badanych do kontrolnych [8]. Przygotowanie komórek C. albicans do analizy przebiegało według opisanej procedury, obejmującej przygotowanie zawiesin wyjściowych i szeregu rozcieńczeń flukonazolu w odpowiednich stężeniach oraz 24-godzinną inkubację w temperaturze 37 C. Jednocześnie przygotowano próby kontrolne pozbawione związku przeciwgrzybiczego, o gęstości 0,5 i 1,0 w skali McFarlanda. Po inkubacji próbki odwirowano, ściągnięto nadsącz a do osadu komórek dodano po 450 µl HBSS i 50 µl roztworu MTT i ponownie inkubowano przez 4 godziny w temperaturze 37 C. Następnie próbki ponownie odwirowano, ściągnięto nadsącz a do osadu komórek dodano 300 µl DMSO (100%), po czym zawiesiny komórek poddano wytrząsaniu. Na mikropłytkę naniesiono po 150 µl zawiesiny badanej i kontrolnej a następnie przeprowadzono analizę kolorymetryczną wytworzonego formazanu przy długości fali λ=550 nm, z użyciem automatycznego czytnika do mikropłytek [6, 8, 9]. Odczyt prowadzono w trzech powtórzeniach. Z otrzymanych danych wyliczono procent żywotności komórek C. albicans w obecności badanego związku, w porównaniu do kontroli. Oznaczanie ATP metodą chemiluminescencji Zasada luminometrycznego oznaczania ATP z użyciem układu lucyferyna/lucyferaza opiera się na następującej reakcji, katalizowanej przez lucyferazę: ATP + lucyferyna + O 2 oksylucyferyna + AMP + PPi + CO 2 (emisja światła) Po upływie 24-godzinnej inkubacji zawiesin kontrolnych i badanych, przeprowadzono ekstrakcję ATP z komórek C. albicans przy użyciu 5% kwasu trójchlorooctowego (TCA). Do probówki typu eppendorf dodano 60 μl zawiesiny badanej z flukonazolem oraz 20 μl kwasu trójchlorooctowego i inkubowano w temperaturze 4 o C. Jednocześnie przygotowano próbę kontrolną, którą stanowiła zawiesina komórek C. albicans pozbawionych wpływu związku przeciwgrzybiczego (60 μl) oraz kwas trójchlorooctowy (20 μl), sprzężony ze wskaźnikiem ph ksylenolem oraz próbę ślepą (woda destylowana + TCA). Po inkubacji pobrano po 40 μl zawiesiny i dodano 160 μl buforu do oznaczeń (0,1 M TRIS-kwas octowy o ph 7,75 z 2 mm EDTA). Następnie z uprzednio przygotowanych próbek pobrano po 20 μl i do tej ilości dodano po 140 μl buforu do oznaczeń, 40 μl odczynnika zawierającego lucyferynę i lucyferazę. Inkubowano 10 minut w temperaturze pokojowej. Zmierzono luminescencję z użyciem luminometru LB Centro XS3 (Berthold Technologies, Niemcy). Następnie dodano 10μl standardu ATP, ponownie zmierzono luminescencję w celu zbadania wpływu czynników obecnych w próbce. Ilość uwolnionego ATP jest proporcjonalna do ilości żywych komórek C. albicans. Odczynniki stosowane w oznaczeniu pochodziły z firmy Bio-Orbit (LKB Wallac, Turku, Finlandia) [13, 19]. Ocena żywotności komórek Candida albicans metodą mikroskopową z użyciem oranżu akrydyny Przygotowanie komórek C. albicans do analizy przebiegało według wyżej opisanej procedury, obejmującej przygotowanie zawiesin wyjściowych i szeregu rozcieńczeń flukonazolu o odpowiednich stężeniach oraz 24-godzinną inkubację w temperaturze 37 C. Po upływie czasu inkubacji pobrano po 1 ml zawiesin badanych, które następnie odwirowano a nadsącz odrzucono. Do osadu komórek dodano 50 µl roztworu oranżu akrydyny (1:100000) i poddano 15-minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej. Następnie po dodaniu 100 µl buforu HBSS, próbki poddano wytrząsaniu i analizie mikroskopowej z użyciem mikroskopu fluorescencyjnego IX- 51 (Olympus, Japonia) przyjmując komórki fluoryzujące na zielono za żywe, a fluoryzujące na czerwono za martwe. Dla prób badanych, traktowanych flukonazolem zliczano liczbę komórek żywych na 100 komórek w polu widzenia, celem obliczenia żywotności komórek C. albicans, wyrażonej w procencie kontroli [10, 12]. Analiza statystyczna W opracowaniu statystycznym wyników korzystano z programu Statictica 9.0. W analizie zależności pomiędzy danymi zastosowano test t-studenta dla prób zależnych. Wyniki wyrażono w procencie wartości średnich ± odchylenie standardowe. Liczebność prób dla zastosowanych w badaniach testów zawierała się w przedziale od 2 do 4. Za różnice statystycznie istotne pomiędzy poszczególnymi próbami badanymi a kontrolą uznawano wartości p<0,

4 Porównanie metod przydatnych w ocenie wpływu flukonazolu na żywotność komórek Candida albicans Wyniki Czystość badanego szczepu Na podstawie przeprowadzonej procedury stwierdzono czystość użytego w badaniu szczepu grzyba i przynależność do C. albicans. Barwienie metodą Grama i obserwacja mikroskopowa wykazały typowy dla tych drożdżaków wygląd komórek. Hodowla na odpowiednim podłożu chromogennym wykazała typowy wzrost kolonii, charakterystyczny dla badanego szczepu. Ponadto identyfikacja biochemiczna grzyba, przeprowadzona przy użyciu testu API 20C AUX, jednoznacznie potwierdziła przynależność badanego szczepu do C. albicans. Metoda posiewu ilościowego Analiza wyników posiewu ilościowego wykazała wpływ flukonazolu w zastosowanych stężeniach na żywotność komórek badanych, wyrażoną w procencie kontroli. Dla hodowli badanych C. albicans o gęstości 0,5 w skali McFarlanda, poddanych działaniu wybranych stężeń flukonazolu, zaobserwowano spadek żywotności komórek badanych w porównaniu do hodowli kontrolnej (100±15,7%) (p<0,05), za wyjątkiem najniższego stężenia (ryc. 1). Po wprowadzeniu flukonazolu w stężeniach 1,0 i 10 μg/ml żywotność C. albicans wynosiła odpowiednio 44,4±2,2% (p=0,0385) oraz 11,1±15,7% (p=0,0299). Dla najniższego stężenia flukonazolu nie odnotowano różnic statystycznie istotnych (NS). W przypadku hodowli badanych C. albicans o gęstości 1,0 w skali McFarlanda poddanych działaniu flukonazolu, zaobserwowano spadek żywotności komórek drożdżaka w porównaniu do hodowli kontrolnej (100±7,4%) na poziomie istotności p<0,05 dla 0,1 i 10 μg/ml, oraz p<0,01 dla stężenia 1,0 μg/ml. Po wprowadzeniu flukonazolu w stężeniu 0,1 μg/ml żywotność komórek drożdżaka wynosiła 52,6±1,1% (p=0,0124), natomiast dla stężeń wyższych wynosiła 42,1±1,1 (p=0,0083) oraz 36,8±7,4% (p=0,0136) odpowiednio dla 1,0 i 10 μg/ml. Metoda spektrofotometryczna Przeprowadzona analiza wartości zmętnienia prób badanych i kontrolnych mierzona przez pomiar absorbancji metodą spektrofotometryczną (λ=550 nm) wykazała istotny wpływ flukonazolu na żywotność komórek C. albicans, wyrażoną w procencie kontroli. W przypadku zawiesiny o gęstości 0,5 w skali McFarlanda zaobserwowano istotny spadek żywotności prób badanych poddanych działaniu flukonazolu w stężeniu 1,0 i 10 μg/ml (p<0,01). Po wprowadzeniu flukonazolu w tych stężeniach żywotność komórek spadła odpowiednio do poziomu 75±1,25% (p=0,0028) oraz 62,5±10,2% (p=0,002) w porównaniu do wartości kontrolnej (100±10,2%). Dla najniższego stężenia flukonazolu nie zaobserwowano różnic statystycznie istotnych (NS) (ryc. 2) Rycina 2. komórek Candida albicans, oceniony pomiarem zmętnienia przez odczyt absorbancji światła przechodzącego metodą spektrofotometryczną, przy długości fali λ=550 nm. Wyniki uzyskane z prób badanych porównano do hodowli kontrolnej, nie zawierającej badanego związku. Na wykresie przedstawiono wartości średnie ± odchylenie standardowe dla n=4, wyrażone w procencie kontroli. Różnice statystycznie istotne zaznaczono gwiazdkami: * p<0,05; ** p<0,01. Po wprowadzeniu do hodowli grzyba o gęstości 1,0 w skali McFarlanda flukonazolu w stężeniach 1 i 10 μg/ml odnotowano spadek żywotności komórek C. albicans w porównaniu do kontroli (100±22,5%) odpowiednio do poziomu 57,5±13% (p<0,05) oraz 45±6,9% (p<0,01). Dla najniższego stężenia flukonazolu nie zaobserwowano różnic statystycznie istotnych (NS) (ryc. 2). Rycina 1. komórek Candida albicans, oceniony metodą posiewu ilościowego na stałym podłożu Sabourauda. Ocenę ilościową komórek badanych (rozcieńczenia 10-3 ), wyrażoną przez jednostki tworzące kolonie (CFU), przeprowadzono w porównaniu do hodowli kontrolnej nie zawierającej badanego związku. Na wykresie przedstawiono wartości średnie ± odchylenie standardowe dla n=2, wyrażone w procencie kontroli. Różnice statystycznie istotne próby badanej względem kontroli zaznaczono gwiazdkami: * p<0,05; ** p<0,01. Test MTT Przeprowadzona analiza wartości stężenia formazanu uwolnionego z komórek poddanych działaniu flukonazolu wykazała wpływ badanych stężeń związku na ten parametr w porównaniu do kontroli. Otrzymane dane posłużyły do oceny żywotności komórek C. albicans wyrażonej w procencie kontroli. Po wprowadzeniu do hodowli badanej (gęstość 0,5 w skali McFarlanda) flukonazolu w stężeniu 0,1 i 1,0 μg/ml zaobserwowano istotny spadek żywotności komórek drożdżaka w porównaniu do kontroli (100±2,9%) odpowiednio do poziomu 93,9±2% (p=0,014) oraz 80,8±5,1% (p=0,0006). Dla najwyższego stężenia także wykazano istotny spadek 172

5 D. Trzaska, M. Kocot i Z.P. Czuba żywotności do wartości 68±2,1% (p<0,001) (ryc. 3). Dla hodowli badanej o gęstości 1,0 według skali McFarlanda poddanych działaniu flukonazolu w dwóch najwyższych stężeniach również zaobserwowano istotny spadek żywotności komórek badanych w porównaniu do wartości kontrolnej (100±1,7). Po wprowadzeniu flukonazolu w stężeniu 1,0 i 10 μg/ml żywotność komórek wynosiła kolejno 81,2±0,8% (p<0,001) oraz 76±2,4% (p<0,001). Po wprowadzeniu flukonazolu w stężeniu 0,1 μg/ml do hodowli badanej nie zaobserwowano różnic statystycznie istotnych w żywotności komórek C. albicans w porównaniu do kontroli (NS) (ryc. 3). Rycina 4. komórek Candida albicans, oceniony metodą mikroskopową z użyciem barwnika fluorescencyjnego. Zliczano liczbę żywych komórek (fluoryzujących na zielono) z prób badanych, na 100 komórek w polu widzenia. Na wykresie przedstawiono wartości średnie ± odchylenie standardowe dla n=3, wyrażone w procencie kontroli. Różnice istotne statystycznie zaznaczono gwiazdkami: ** p<0,01; *** p<0,001. Rycina 3. komórek Candida albicans, oceniony ilościowym pomiarem stężenia formazanu uwolnionego z komórek żywych metodą spektrofotometryczną przy długości fali λ=550 nm. Wyniki uzyskane z prób badanych porównano do hodowli kontrolnej, nie zawierającej badanego związku. Na wykresie przedstawiono wartości średnie ± odchylenie standardowe dla n=4, wyrażone w procencie kontroli. Różnice statystycznie istotne zaznaczono gwiazdkami: * p<0,05; *** p<0,001. Metoda mikroskopowa z barwieniem oranżem akrydyny Analiza danych z ilości komórek żywych C. albicans (fluoryzujących na zielono) zliczanych na 100 komórek w polu widzenia metodą mikroskopową, posłużyły do obliczenia żywotności komórek drożdżaka poddanych działaniu flukonazolu. Wykazano wpływ flukonazolu na żywotność komórek badanych na poziomie istotności (p<0,01 oraz p<0,001), wyrażoną w procencie kontroli. Dla hodowli grzyba o gęstości 0,5 w skali McFarlanda zaobserwowano spadek żywotności komórek poddanych działaniu flukonazolu we wszystkich stężeniach tj. 0,1; 1,0 i 10 μg/ml (p<0,001), w porównaniu do kontroli (100±0,1%). Dane widoczne na wykresie (ryc. 4). W przypadku hodowli badanej C. albicans o gęstości 1,0 w skali McFarlanda żywotność komórek grzyba istotnie spadła w porównaniu z hodowlą kontrolną (100±0,1%). Po wprowadzeniu flukonazolu we wzrastających stężeniach żywotność komórek zmniejszyła się istotnie się odpowiednio do wartości 97,3±0,6% (p=0,0014); 92,3±0,6% (p<0,001) oraz 88,7±0,6% (p<0,001) (ryc. 4). Oznaczanie ATP metodą chemiluminescencji Przeprowadzona analiza wyników pozwoliła na obliczenie ilości ATP uwolnionego z komórek C. albicans poddanych działaniu flukonazolu i porównanie ich z wartościami uzyskanymi dla próby kontrolnej. Otrzymane dane posłużyły do obliczenia żywotności komórek wyrażonej w procencie kontroli. Zarówno dla hodowli o gęstości 0,5 jak i dla 1,0 w skali McFarlanda odnotowano istotny spadek żywotności komórek badanych (p<0,05 oraz p<0,01). Po wprowadzeniu do hodowli grzyba o gęstości 0,5 w skali McFarlanda flukonazolu w stężeniu 1, i 10 μg/ml żywotność komórek C. albicans spadła z poziomu 100±1,19% w kontroli do wartości, odpowiednio 93,9±0,5% (p=0,0226) oraz 92,2±1,2% (p=0,0235). Dla najniższego stężenia związku nie zaobserwowano różnic statystycznie istotnych w porównaniu do kontroli (NS) (ryc. 5). Dla hodowli grzyba o gęstości 1,0 w skali McFarlanda odnotowano zmniejszenie żywotności komórek w próbach badanych poddanych działaniu wzrastających stężeń flukonazolu, w porównaniu do kontroli (100±0,4%) i uzyskano następujące wartości: 91,4±0,5% (p<0,01) dla Rycina 5. komórek Candida albicans, oceniony przez pomiar uwolnionego z komórek żywych ATP (μmol/l) metodą chemiluminescencji. Wyniki uzyskane z prób badanych porównano do hodowli kontrolnej, nie zawierającej badanego związku. Na wykresie przedstawiono wartości średnie ± odchylenie standardowe dla n=3, wyrażone w procencie kontroli. Różnice statystycznie istotne zaznaczono gwiazdkami: * p<0,05; ** p<0,

6 Porównanie metod przydatnych w ocenie wpływu flukonazolu na żywotność komórek Candida albicans stężenia 1 μg/ml oraz 89,8±0,6% (p<0,01) dla stężenia 10 μg/ml. Dla najniższego stężenia związku nie zaobserwowano różnic statystycznie istotnych w porównaniu do kontroli (NS) (ryc. 4). Dyskusja W ostatnich latach nastąpił znaczny wzrost zakażeń grzybiczych wywołanych przez C. albicans. Podstawowa diagnostyka mykologiczna, obejmująca obserwację mikroskopową, hodowlę na podłożu agarowym oraz testy biochemiczne, pozwala głownie na analizę jakościową i wykrycie czynnika etiologicznego zakażeń [1, 5]. Ocena żywotności komórek C. albicans nie jest badaniem rutynowo wykorzystywanym w mykologii. Dlatego też celem niniejszej pracy było określenie przydatności metod pozwalających na ocenę wpływu związku przeciwgrzybicznego - flukonazolu w różnych stężeniach na żywotność komórek Candida albicans. Flukonazol jest przedstawicielem azoli-syntetycznych leków przeciwgrzybicznych (związek grzybostatyczny), którego mechanizm działania związany jest z hamowaniem zależnej od cytochromu P α-demetylazy lanosterolu w biosyntezie hormonów steroidowych grzybów. Prowadzi to do zmniejszenia ilości ergosterolu najważniejszego sterolu w błonie komórkowej grzybów oraz do kumulacji lanosterolu w błonie komórkowej grzyba, zaburzeń w jej strukturze i funkcjonowaniu, a w efekcie zniszczenia komórki [2, 3, 4, 14]. W badaniach wykorzystano metodę posiewu ilościowego na podłożu agarowym, metodę spektrofotometryczną, kolorymetryczny test MTT, chemiluminescencyjny pomiar stężenia ATP oraz metodę mikroskopową z udziałem barwnika fluorescencyjnego. Analiza statystyczna otrzymanych wyników wykazała przydatność zastosowanych w pracy metod do oceny żywotności komórek C. albicans poddanych działaniu wybranych stężeń flukonazolu (0,1; 1,0 i 10 μg/ml). Metoda posiewu ilościowego, spektrofotometrii, chemiluminescencji wykazała negatywny wpływ flukonazolu w stężeniach 1,0 i 10 μg/ ml na żywotność komórek badanych o gęstości 0,5 w skali McFarlanda. Metody te natomiast nie okazały się przydatne do oceny żywotności komórek drożdżaka poddanych działaniu flukonazolu w najniższym zastosowanym stężeniu (0,1 μg/ml). W przeciwieństwie do powyższych metod, analiza mikroskopowa z użyciem barwnika oranżu akrydyny, umożliwiła określenie wpływu flukonazolu na żywotność komórek C. albicans w najniższym zastosowanym stężeniu, zarówno w odniesieniu do gęstości komórek badanych 0,5 jak i 1,0 w skali McFarlanda. W teście mikroskopowym wykorzystuje się możliwość przechodzenia oranżu akrydyny przez błonę komórkową, dzięki czemu barwnik ten zabarwia całą komórkę, umożliwiając identyfikację komórek żywych. Po przeprowadzonych badaniach najbardziej czułą i dokładną metodą okazał się test MTT. Analiza ilości uwolnionego formazanu pozwoliła na ocenę wpływu flukonazolu we wszystkich zastosowanych stężeniach na żywotność komórek C. albicans. Test MTT jest ilościowym testem toksyczności, którego podstawą jest przekształcenie soli tetrazoliowych (MTT) o zabarwieniu żółtym do fioletowo zabarwionego, nierozpuszczalnego w wodzie formazanu. Proces ten zachodzi w mitochondriach żywych komórek a redukcja MTT do formazanu następuje w sposób proporcjonalny do ich ilości. Jeżeli więc komórki zostały wcześniej uszkodzone lub zniszczone przez związek przeciwgrzybiczny to reakcja ta jest mniej intensywna lub nie zachodzi w ogóle [6, 8, 9]. Analiza statystyczna wyników uzyskanych wybranymi metodami dla hodowli badanych C. albicans o gęstości 1,0 w skali McFarlanda pozwoliła na podobne obserwacje jak w przypadku zawiesiny komórek badanych o niższej gęstości w sali McFarlanda. Piśmiennictwo 1. Biliński P, Seweryńska I, Warzocha K. Diagnostyka i leczenie układowych zakażeń grzybiczych w onhohematologii. Onkol Prak Klin 2008; 4: Bille J. Mechanisms and clinical significance of antifungal resistance. Int J Antimicrob Agents 2000; 16: Carrillo-Munoz AJ, Giusiano G, Ezkurra PA i wsp. Antifungal agents: Mode of action in yeast cells. Rev Esp Quimioterap 2006; 19: Charlier C, Hart E, Lefort A i wsp. Fluconazole for the management of invasive candidiasis: where do we stand after 15 years?. J Antomicrob Chemother 2006; 57: Chybicka A. Kandydoza jako problem w onkologii i hematologii dziecięcej. Zakażenia 2004; 4: Derengowski LS, De-Souza-Silva C, Braz SV i wsp. Antimicrobial effect of farnesol, a Candida albicans quorum sensing molecule, on Paracoccidioides brasiliensis growth and morphogenesis. Ann Clin Microbiol Antimicrob 2009; 8: Drożdż I, Makarewicz M. Zakażenia mikrobiologiczne. Nowoczesne metody ich wykrywania w przemyśle spożywczym. Laboratorium Przegląd Ogólnopolski : Freimoser FM, Jakob CA, Aebi M i wsp. The MTT [3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide] Assay Is a Fast and Reliable Methods for Colorimetric Determination of Fungal Cell Densities. Appl Environ Microbiol 1999; 65: Gregoraszczuk EŁ. Hodowla in vitro w toksykologii Hodowla tkanek w badaniach toksykologicznych. Hodowla komórek i tkanek, pod red. S. Stokłosowej, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2004; Gregoraszczuk EŁ. Hodowla in vitro w toksykologii Hodowla tkanek w badaniach toksykologicznych. Hodowla komórek i tkanek, pod red. S. Stokłosowej, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2004; Hasse-Cieślińska M. Flukonazol w leczeniu powierzchownych zakażeń grzybiczych. Zakażenia 2008; 6: Hjertstedt J, Hahn BL, Kos WL i wsp. Comparison of fungal viability assays using Candida albicans yeast cells undergoing prolonged incubation in the absence of nutrients. Mycoses 1998; 41: Koshlukova SE, Araujo MWB, Baev D i wsp. Released ATP is an Extracellular Cytotoxic Mediator in Salivary Histatin 5-Induced Killing of Candida albicans. Infect Immun 2000; 68: Lupetti A, Danesi R, Campa M i wsp. Molecular basis of resistance to azole antifungals. Trends Mol Med 2002; 8: McCullough MJ, Ross BC, Reade PC. Candida albicans: a review of its history, taxonomy, epidemiology, virulence attributes, and methods of strain differentation. Int J Oral Maxillofac Surg 1996; 25: Reboli AC, Rotstein C, Pappas PG i wsp. Anidulafungina w po- 174

7 D. Trzaska, M. Kocot i Z.P. Czuba równaniu z flukonazolem w leczeniu inwazyjnej kandydozy. N Engl J Med 2007; 356: Tomczak H. Zakażenia grzybicze w laryngologii problemy związane z diagnostyką i leczeniem. Post chir głowy i szyi 2008; 2: Wacińska-Drabińska M, Gajdzik-Plutecka D, Olczak-Kowalczyk D. Grzybica jamy ustnej, diagnostyka i leczenie. Nowa stom 2009; 3: Yamashoji S, Asakawa A, Kawasaki S i wsp. Chemiluminescent assay for detection of viable microorganisms. Anal Biochem 2004; 15: Adres do korespondencji: Katedra i Zakład Mikrobiologii i Immunologii Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach Zabrze, ul. Henryka Jordana 19 dominika.trzaska-saramak@wp.pl tel: Zaakceptowano do publikacji: