ENZYMATYCZNY ROZDZIAŁ ENANCJOMERÓW α-izopropyloseryny

Transkrypt

1 BARTŁMIEJ KŹNIEWSKI, JANINA EWA KAMIŃSKA Instytut Podstaw Chemii Żywności, Wydział Biotechnologii i Nauk o Żywności, Politechnika Łódzka ENZYMATYCZNY RZDZIAŁ ENANCJMERÓW α-izprpylseryny Słowa kluczowe: α-izopropyloseryna; rozdział racematu; lipaza; acetylowanie; rozpuszczalniki organiczne Stosowane skróty: VA octan winylu IPA octan izopropenylu ee p /ee s nadmiar enancjomeryczny produktu/substratu E współczynnik enancjoselektywności C konwersja CCL lipaza z Candida cylindracea ACN acetonitryl MTBE eter tert-butylowometylowy Wstęp α-izopropyloseryna jest nietypowym aminokwasem zawierającym przy węglu α łańcuchy boczne dwóch różnych aminokwasów białkowych waliny i seryny. α-podstawione seryny występują w przyrodzie jako metabolity grzybów (na przykład sfingofungina E lub miriocyna) [1] lub jako element struktury bardziej złożonych metabolitów bakteryjnych, takich jak (-)-amicetyna czy (+)-konagenina, które zawierają α-metyloserynę [2,3]. Zainteresowanie tymi związkami wynika z aktywności biologicznej samych α-podstawionych seryn oraz ich pochodnych a także użyteczności jako substratów do syntezy modyfikowanych leków peptydowych [4]. Występowanie α-izopropyloseryny w organizmach żywych nie zostało dotychczas stwierdzone. Jedyną metodą otrzymywania tego związku w postaci racematu jest synteza organiczna. Dotychczas nie opisano w literaturze żadnej metody syntezy enancjomerów tego aminokwasu. Wyniki wcześniejszych badań dotyczących rozdziału racemicznych pochodnych α-metyloseryny [5] doprowadziły do próby rozszerzenia metodyki na inne α-podstawione seryny. W artykule przedstawiono rezultaty eksperymentów dotyczących opracowania metody enzymatycznego rozdziału enancjomerów estru etylowego N-benzoilo-α-izopropyloseryny w katalizowanej lipazami reakcji -acetylowania. Wyniki i dyskusja (±)-5-Benzoilamino-5-izopropylo-4-okso-1,3-dioksan (1) otrzymany z waliny według metody Kamińskiego i Leplawego [6] przeprowadzono w ester etylowy (±)-N-benzoilo-α-izopropyloseryny (2) oraz jego pochodną -acetylową (3) (Rysunek 1). Etanoliza oksodioksanu 1 w obecności etanolanu 1

2 sodu dostarczyła estru 2, który przekształcono w racemiczny octan 3 poprzez działanie bezwodnikiem octowym w pirydynie. EtH, EtNa Ac 2, Pirydyna H CH 3 CH 3 CH Rysunek 1: Synteza estru etylowego ( )-N-benzoilo- -izopropyloseryny 2 i ( )--acetylowej pochodnej 3 Dysponując racemicznymi pochodnymi 2 i 3 opracowano metodę analizy HPLC zapewniającą rozdział enancjomerów obu związków. Zastosowano kolumnę z chiralną fazą stacjonarną Chiralcel D i mieszaninę heksan/izopropanol (95:5) jako fazę ruchomą (0,5 ml/min). W tych warunkach uzyskano doskonały rozdział enancjomerów estru ( )-2 o czasach retencji 23,5 i 27,5 min. oraz pochodnej ( )-3 o czasach retencji 17,0 i 20,7 min. Pozwoliło to na kontrolę postępu reakcji enzymatycznej oraz oznaczenie nadmiarów enancjomerycznych substratu i produktu. Współczynnik enancjoselektywności E obliczono z wartości konwersji i nadmiarów enancjomerycznych produktu ze względu na większe rozsunięcie sygnałów enancjomerów pochodnej -acetylowej. bliczenia współczynnika enancjoselektywności wykonano zgodnie z [7]. Selekcja aktywnych enzymów Selekcję aktywnych enzymów przeprowadzono dla ośmiu preparatów lipaz: siedmiu dostępnych handlowo - Novozyme 435, Lipozyme RM IM, Lipozyme TL IM, Amano PS, Amano A, Amano AY, CCL oraz niekomercyjnego preparatu suszonej grzybni Mucor circinelloides. Enzymy te wykazywały aktywność we wcześniejszych eksperymentach acetylowania estru etylowego N- benzoilo-α-metyloseryny. Wstępne badanie aktywności enzymów wobec związku (±)-2 jako substratu przeprowadzono stosując octan winylu jako czynnik acetylujący, zaś jako rozpuszczalnik mieszaninę heksan:thf 7:3 (Rysunek 2). Skład rozpuszczalnika dobrano tak, by zapewnić całkowite rozpuszczenie substratu. Spośród zastosowanych lipaz aktywność wykazały jedynie preparaty immobilizowane, tzn. Lipozyme TL IM, Lipozyme RM IM oraz Novozyme 435 (Tabela 1), przy czym w obecności Lipozyme RM IM reakcja przebiegała najwolniej (poniżej 2% konwersji po 24 h). Dlatego do dalszych eksperymentów wybrano Lipozyme TL IM i Novozyme 435. Przyjęto, że konfiguracja absolutna preferowanego przez lipazy enancjomeru jest taka sama jak w przypadku α-metyloseryny, to znaczy (R), co jednak będzie wymagało potwierdzenia eksperymentalnego po przeprowadzeniu rozdziału w skali preparatywnej. 2

3 Rozpuszczalnik Donor acetylu Lipaza H CH 3 + CH 3 H CH 3 CH 3 2 (S)-2 (R)-3 Rysunek 2: Rozdział kinetyczny pochodnej ( )-2 -izopropyloseryny Tabela 1: Aktywność i enancjoselektywność lipaz w reakcji acetylowania ( )-2 za pomocą VA Enzym Czas [h] ee s [%] ee p [%] c [%] E 24 9,8 96,5 8,0 61 Lipozyme TL IM 48 15,3 91,9 13, ,1 90,2 16, ,2 89,2 25, ,1 99,0 1,9 203 Lipozyme RM IM 48 3,2 91,4 3, ,1 91,1 4, ,3 87,2 8, ,7 6,3 13,3 1 Novozyme ,6 3,3 24, ,6 1, 3 33, ,0 0,6 53,6 1 Warunki standardowe: 0,25 mmol ( )-2, 1 mmol VA, 100 mg lipazy, 3 ml heksan/thf 7:3, 30 C Stwierdzono, że lipaza o najwyższej aktywności - Novozyme nie wykazuje enancjoselektywności w procesie acetylowania pochodnej ( )-2. We wcześniejszych badaniach stwierdzono, że w przypadku niektórych enzymów zastąpienie octanu winylu octanem izopropenylu powoduje wzrost współczynnika enancjoselektywności procesu, zwykle przy jednoczesnym zmniejszeniu szybkości reakcji [5]. W przeprowadzonej próbie acetylowania substratu ( )-2 octanem izopropenylu w obecności Novozyme 435 stwierdzono jedynie obniżenie szybkości reakcji przy niezmiennym braku enancjoselektywności (Tabela 2). Tabela 2: Aktywność i enancjoselektywność Novozyme 435 w reakcji acetylowania ( )-2 za pomocą IPA Czas [h] ee s [%] ee p [%] c [%] E 24 1,1 7,0 8, ,1 2,6 17, ,6 4,5 37,3 1 3

4 Warunki standardowe: 0,25 mmol ( )-2, 1 mmol IPA, 100 mg Novozyme 435, 3 ml heksan/thf 7:3, 30 C W dalszych eksperymentach, zmierzających do opracowania metodyki rozdziału enancjomerów stosowano jedynie Lipozyme TL IM, który przy umiarkowanej aktywności (około 17% konwersji po 72 h) wykazał enancjoselektywność E>20. Wpływ proporcji donor acetylu: substrat Podczas selekcji aktywnych enzymów stosowano proporcje molowe donor acetylu : ( )- 2=4:1. W celu zbadania zmian szybkości reakcji i enancjoselektywności przeprowadzono eksperymenty przy mniejszym (2:1) i większym (8:1) nadmiarze octanu winylu (Tabela 3). Tabela 3: Wpływ nadmiaru octanu winylu na szybkość i enancjoselektywność reakcji. VA:( )-2 Czas [h] ee s [%] ee p [%] c [%] E 2:1 4:1 8:1 24 7,4 94,6 6, ,6 93,5 13, ,8 96,5 8, ,1 90,2 16, ,0 93,6 8, ,3 94,4 17,4 42 Warunki standardowe: 100 mg Lipozyme TL IM, 3 ml heksan/thf 7:3, 30 C Stwierdzono, ze zwiększenie nadmiaru octanu winylu powoduje niewielki wzrost konwersji, natomiast nie wpływa na enancjoselektywność. Dla porównania wyników zmian innych parametrów reakcji, w dalszych eksperymentach stosowano czterokrotny nadmiar octanu winylu. Wpływ ilości biokatalizatora Zakładając możliwość przyspieszenia procesu poprzez zwiększenie ilości biokatalizatora zastosowano podwojoną dawkę preparatu Lipozyme TL IM (Tabela 4). Tabela 4: Wpływ ilości enzymu na szybkość i enancjoselektywność reakcji. Ilość enzymu (mg) 100 mg 200 mg Czas [h] ee s [%] ee p [%] c [%] E 24 9,8 96,5 8, ,3 91,9 13, ,1 90,2 16, ,4 94,9 7, ,4 90,4 12, ,9 93,9 15,9 38 4

5 Warunki standardowe: 0,25 mmol ( )-2, 1 mmol VA, Lipozyme TL IM, 3 ml heksan/thf 7:3, 30 C Wbrew oczekiwaniom podwojenie ilości enzymu nie spowodowało przyspieszenia reakcji, co skłania do przypuszczenia, że jest to proces kontrolowany szybkością dyfuzji substratu do centrum katalitycznego i/lub produktu na zewnątrz. Wpływ stężeń reagentów Jednym z etapów badań było również określenie wpływu zmian stężeń reagentów (czyli ilości użytego rozpuszczalnika) na przebieg reakcji. W tym celu stałe proporcje substrat ( )-2 : octan winylu : enzym wynoszące 1 mmol : 4 mmole : 400 mg, zmieniając ilość użytej mieszaniny rozpuszczalników (Tabela 5). Tabela 5: Wpływ ilości rozpuszczalnika na szybkość i enancjoselektywność reakcji. Skład mieszaniny reakcyjnej Czas [h] ee s [%] ee p [%] c [%] E Podwojone ilości reagentów, 3 ml heksan/thf 7:3 0,25 mmol ( )-2, 1 mmol VA, 100 mg Lipozyme TL IM, 3 ml heksan/thf 7:3 Standardowe ilości reagentów, 6 ml heksan/thf 7:3 Warunki standardowe: 30 C 24 10,7 99,0 7, ,4 97,8 12, ,9 96,8 16, ,8 96,5 8, ,4 91,9 13, ,1 90,2 16, ,6 71,8 8, ,5 64,7 13, ,4 64,6 20,3 5 Podwojenie stężeń substratów i ilości enzymu na jednostkę objętości rozpuszczalnika nie spowodowały znaczących zmian szybkości reakcji, natomiast zaobserwowano wyraźny wzrost enancjoselektywności. Natomiast podwojenie ilości rozpuszczalnika (zmniejszenie stężeń reagentów) spowodowało przyspieszenie procesu i jednocześnie znaczne obniżenie enancjoselektywności. Wpływ rodzaju rozpuszczalnika Z racji na niewielką szybkość reakcji w standardowej mieszaninie rozpuszczalników (heksan/thf), oraz zahamowanie procesu przy konwersji poniżej 40%, podjęto próby zastosowania innych rozpuszczalników. Współczynnikiem określającym własności rozpuszczalnika w stosunku do enzymu jest logarytm współczynnika podziału miedzy 1-oktanol i wodę (log P). Z reguły rozpuszczalniki o niskiej wartości log P, zwykle dobrze mieszające się z wodą, są niekompatybilne z enzymami i powodują często ich deaktywację, zaś rozpuszczalniki hydrofobowe, o log P>2 powodują, że enzym zachowuje aktywność [8]. Wybrano trzy rozpuszczalniki hydrofobowe - eter tertbutylowometylowy (log P = 0,94), 1,2-dichloroetan (log P = 1,48) oraz toluen (log P = 2,5) oraz jeden hydrofilowy acetonitryl (log P = -0,33). Podstawowym kryterium doboru była dobra rozpuszczalność 5

6 substratu i wystarczająca lotność rozpuszczalnika, umożliwiająca szybkie odparowanie po zakończeniu procesu. W eksperymencie zastosowano ośmiokrotny nadmiar octanu winylu (Tabela 6). Tabela 6: Wpływ rodzaju rozpuszczalnika na szybkość i enancjoselektywność reakcji Rozpuszczalnik Czas [h] ee s [%] ee p [%] c [%] E MTBE ACN Toluen ClCH 2 CH 2 Cl 24 26,5 91,0 22, ,9 88,9 33, ,6 86,3 41, Brak reakcji 24 11,8 37,4 8, ,6 41,5 13, ,1 39,6 15, Brak reakcji Warunki standardowe: 0.25 mmol ( )-2, 2 mmol VA, 100 mg Lipozyme TL IM, 3 ml rozpuszczalnika, 30 C W reakcji prowadzonej w acetonitrylu Lipozyme TL IM okazał się nieaktywny, prawdopodobnie z racji, iż acetonitryl miesza się z wodą, co może prowadzić do pozbawienia enzymu wody strukturalnej i dezaktywacji. W hydrofobowym 1,2-dichloroetanie enzym również nie wykazał aktywności. W toluenie szybkość reakcji była porównywalna do szybkości w mieszaninie heksan: THF, jednak przy znacznie obniżonej enancjoselektywności. Natomiast w eterze tert-butylowometylowym acetylowanie przebiegało około 2,5 razy szybciej, prowadząc po 72 h do konwersji powyżej 40%. Współczynnik enancjoselektywności był porównywalny do reakcji prowadzonej w mieszaninie heksan:thf. Warunki te umożliwiają przeprowadzenie rozdziału w skali preparatywnej. 6

7 Kinetyka rozdziału enzymatycznego W celu ustalenia parametrów rozdziału w skali preparatywnej zbadano kinetykę reakcji w eterze tert-butylowometylowym (Rysunek 3). Rysunek 3: Zawartość produktu (linia czarna) i substratu (linia czerwona) w funkcji czasu reakcji Warunki standardowe: 0,25 mmol ( )-2, 2 mmol VA, 100 mg Lipozyme TL IM, 3 ml MTBE, 30 C znaczony czas połowy konwersji (t ½ ) wynosił 118 h. Po przekroczeniu 50% konwersji nie obserwowano zahamowania reakcji. Ponadto wyznaczono zależności nadmiarów enancjomerycznych substratu i produktu w funkcji konwersji. (Rysunek 4). Rysunek 4: Nadmiary enancjomeryczne substratu i produktu w funkcji konwersji Warunki standardowe: 0,25 mmol ( )-2, 2 mmol VA, 100 mg Lipozyme TL IM, 3 ml MTBE, 30 C Przy konwersji powyżej 52% uzyskane nadmiary enancjomeryczne zarówno substratu jak i produktu przekraczają 80%. Przy tej czystości enancjomerycznej realne jest dalsze wzbogacenie każdego z enancjomerów poprzez krystalizację. 7

8 Podsumowanie W wyniku badań opracowano sposób kinetycznego rozdziału enancjomerów estru etylowego N-benzoilo-α-izopropyloseryny. Acetylowanie substratu octanem winylu przy użyciu Lipozyme TL IM w eterze tert-butylowometylowym dostarcza przy konwersji około 52% obu enancjomerów o nadmiarze enancjomerycznym powyżej 80%. Po przeprowadzeniu reakcji w skali preparatywnej podjęte zostaną próby podwyższenia czystości enancjomerycznej metoda krystalizacji oraz określenia konfiguracji absolutnej preferowanego przez enzym substratu. Materiały i metody dczynniki i rozpuszczalniki czyste z firm Fluka, Sigma-Aldrich lub Chempur stosowano bez dodatkowego oczyszczania. Preparat grzybni Mucor circinelloides otrzymano od prof. Tadeusza Antczaka z Instytutu Biochemii Technicznej (Politechnika Łódzka). Lipazy immobilizowane: Novozyme 435 (Candida antarctica B), Lipozyme RM IM (Rhizomucor miehei), Lipozyme TL IM (Thermomyces lanuginosus) firmy Novozymes, lipazy natywne: PS (Burkholderia cepacia), A (Aspergillus niger), AY (Candida rugosa) firmy Amano, lipazę CCL (Candida cylindracea) firmy Sigma zakupiono od polskich przedstawicieli firm. ( )-5-Benzoilamino-5-izopropylo-4-okso-1,3-dioksan (1) otrzymano w trzech etapach z waliny zgodnie z metodyką opisaną w [6] z wydajnością 87%; temp. topnienia C, lit. [6] C Ester etylowy ( )-N-benzoilo-α-izopropyloseryny (2) otrzymano z 1 zgodnie z metodyką opisaną w [5]. Wydajność 44% po chromatografii. Biały, krystaliczny proszek, temp. topnienia C. Czystość 97% (HPLC). 1 H-NMR; δ [ppm]: 0,88 (d, J=7 Hz, 3H); 0,98 (d, J=7 Hz, 3H); 1,24 (t, J=7 Hz, 3H); 2,55 (sept, J=7 Hz, 1H); 3,94 (d, J=11 Hz, 1H); 4,21 (m, 2H); 4,36 (d, J=11 Hz, 1H); 7,16 (s, 1H); 7,25-7,56 (m, 3H); 7,78-7,80 (m, 2H). 13 C-NMR; δ [ppm]: 12,41; 15,68; 15,88; 29,81; 60,39; 62,67; 68,51; 125,18; 126,87; 130,00; 132,79; 166,07; 170,20 Ester etylowy ( )--acetylo-n-benzoilo-α-izopropyloseryny (3) otrzymano z (±)-2 zgodnie z metodyką opisaną w [5]. Wydajność 88%. Słomkowy olej. Czystość >99% (HPLC). 1 H-NMR; δ [ppm]: 0,99 (d, J=7 Hz, 3H); 1,05 (d, J=7 Hz, 3H); 1,31 (t, J=7 Hz, 3H); 1,94 (s, 3H); 2,81 (sept, J=7 Hz, 1H); 4,30 (q, J=7 Hz, 2H); 4,74 (d, J=11 Hz, 1H); 5,17 (d, J=11 Hz, 1H); 7,20 (s, 1H); 7,40-7,48 (m, 3H); 7,78-7,80 (m, 2H). 13 C-NMR; δ [ppm]: 12,40; 15,74; 16,09; 18,87; 29,59; 60,44; 61,76; 65,06; 125,08; 126,81; 129,77; 133,15; 164,67; 168,46; 169,57 Reakcje enzymatyczne prowadzono w szklanych fiolkach z korkami PE w termostatowanej wytrząsarce Biosan Environmental Shaker-Incubator ES-20. Analizy TLC przeprowadzono na płytkach Kieselgel 60 (Merck, nr kat. 5715) stosując wywoływanie parami jodu lub roztworem kwasu fosforomolibdenowego. Do chromatograficznego oczyszczenia związku (±)-2 użyto Kieselgel 60 (Merck) z elucją mieszaniną heksan/etac. Analizy HPLC wykonano na aparacie ASI 100 Dionex z detektorem UVD 340S stosując kolumnę analityczną z chiralną fazą stacjonarną Chiralcel D (250 4,60 mm) i mieszaninę 8

9 heksan/izopropanol 95:5 jako fazę ruchomą (0,5 ml/min.) przy temperaturze 25 C. Detekcja UV przy długości fali 225 nm. Widma 1 H- i 13 C-NMR zostały wykonane na aparacie Bruker DPX 200 Avance (250 MHz dla widm protonowych, 62,5 MHz dla widm węglowych) w CDCl 3 wobec TMS jako wzorca wewnętrznego. 9

10 LITERATURA: 1. ishi T, Ando K, Inomiya K, Sato H, Iida M, Chida N. Total Synthesis of (+)-Myriocin and (-)- Sphingofungin E from Aldohexoses Using verman Rearrangement as the Key Reaction, Bull. Chem. Soc. Jpn., 2002, 75: Stevens CL, Gasser RJ, Mukherjee TK, Haskell TH. The structure of amicetin, a new dimethylamino sugar. J. Am. Chem. Soc. 1956, 78: Wang H-F, Ma G-H, Yang S-B, Han R-G, Xu P-F. A concise synthesis of (+)-conagenin and its isomer using chiral tricyclic iminolactones Tetrahedron: Asymmetry 2008, 19: Fernández-Tejada A, Corzana F, Busto JH, Avenoza A, Peregrina JM. Conformational Effects of the Non-natural α-methylserine on Small Peptides and Glycopeptides J. rg. Chem. 2009, 74: Koźniewski B, Kamińska JE. Resolution of α-methylserine derivatives via lipase mediated acetylation. Biotechnol Food Sci, 2010, 74: Kamiński ZJ, Leplawy MT, Zabrocki J. α-hydroxymethylation of α-amino acids. Synthesis 1973, Chen C-H., Fujimoto Y., Girdaukas G., Sih C.J. Quantitative analyses of biochemical kinetic resolutions of enantiomers. J. Am. Chem. Soc. 1982, 104: , 8. Faber K. Biotransformations in organic chemistry, 5th Edition, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg Nowy Jork, 2004, strony