PL B1. POLITECHNIKA ŁÓDZKA, Łódź, PL

Transkrypt

1 PL B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (62) Numer zgłoszenia, z którego nastąpiło wydzielenie: (13) B1 (51) Int.Cl. C12P 7/64 ( ) C12R 1/785 ( ) (54) Sposób wytwarzania strukturyzowanych triacylogliceroli (73) Uprawniony z patentu: POLITECHNIKA ŁÓDZKA, Łódź, PL (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 20/14 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 11/16 (72) Twórca(y) wynalazku: MIROSŁAWA SZCZĘSNA-ANTCZAK, Łódź, PL TADEUSZ ANTCZAK, Łódź, PL STANISŁAW BIELECKI, Łódź, PL KATARZYNA STRUSZCZYK-ŚWITA, Rosanów, PL ŁUKASZ STAŃCZYK, Łódź, PL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Ewa Kaczur-Kaczyńska

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania strukturyzowanych triacylogliceroli w reakcji acydolizy olejów roślinnych z nasyconymi kwasami tłuszczowymi, katalizowanej lipazą. W czasopiśmie Process Biochemistry 2009, t. 44, s opisano sposób otrzymywania strukturyzowanych gliceroli w wyniku interesestryfikacji oleju siemienia lnianego z olejem arachidowym katalizowanej przez lipazę Rhizomucor miehei. Z czasopisma Fett/Lipid 1998, t. 100, s jest znany sposób otrzymywania strukturyzowanych glicerydów reakcji oleju nasion bawełny, trioleinianu glicerolu i kwasu kaprylowego katalizowanej przez lipazy: Aspergillus niger (ANL), Rhizopus delemar (RDL), Rhizopus javanicus (RJL), Rhizopus oryzae (ROL), Candida rugosa (CRL) i Rhizomucor miehei (RML), Chromobacterium viscosum (CVL). W czasopiśmie European Journal of Lipid Science and Technology 2000, t. 102, s , ujawniono metody otrzymywania strukturyzowanych triacylogliceroli z różnych substratów, w których jako katalizator stosuje się lipazy: CCL, Candida cylindracea, CVL, Chromobacterium viscosum, Lipozyme IM, Rhizomucor miehei (RML), PPL, Rhizopus arrhizus, Rhizopus delemar, Rhizopus javanicus, Rhizopus sp. W czasopiśmie Biochemical Engineering Journal 2009, t. 46, s opisano otrzymywanie strukturyzowanych triacylogliceroli w reakcji oleju z tuńczyka i kwasu kaprylowego katalizowanej przez lipazy Rhizopus delemar i Mucor miehei. W czasopiśmie Journal of Food Engineering 2010, t. 98, s opisano metodę otrzymywania strukturyzowanych triacylogliceroli z oleju słonecznikowego i kwasów palmitynowego i stearynowego w obecności lipazy Lipozyme RM IM. Z czasopisma Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 2010, t. 66, s jest znane otrzymywanie strukturyzowanych triglicerydów katalizowane przez lipazę Rhizomucor miehei (RML). W czasopiśmie Journal of Food Engineering 2008, t. 84. s ujawniono reakcję acydolizy oleju słonecznikowego z mieszaniną kwasów palmitynowego/stearynowego katalizowaną przez lipazy Rhizomucor miehei, Thermomyces lanuginosa lub lipazę z trzustki wieprzowej. W czasopiśmie Bioresource Technology 2009, t. 100, s opisano reakcję oleju oliwkowego z kwasami: palmitynowym, stearynowym katalizowane przez lipazę Mucor miehei. Znane jest także, z czasopisma Food Chemistry 2005, t. 92, s otrzymywanie strukturyzowanych triglicerydów z oleju palmowego i kwasu kaprylowego katalizowane przez lipazę Rhizomucor miehei. W czasopiśmie LWT Food Science and Technology 2010, t. 43, s opisano zastosowanie lipazy Lipozyme TLlM w procesach okresowej i ciągłej interestryfikacji pomiędzy olejeni słonecznikowym i uwodorowanym olejem sojowym. Z opisów patentowych PL , PL i PL są znane sposoby otrzymywania estrów z kwasów tłuszczowych i alkoholi za pomocą lipaz, w środowisku rozpuszczalników organicznych w obecności dietanoloaminy, trietanoloaminy, pirydyny, dimetyloformamidu lub piperydyny. W kolekcji Instytutu Biochemii Technicznej Politechniki Łódzkiej znajduje się selektant szczepu pleśni Mucor racemosus A27/3sTAG. Z opisu zgłoszenia patentowego P jest znany sposób otrzymywania grzybni selektanta pleśni Mucor racemosus A27/3sTAG zawierającej preparat lipaz, polegający na tym, że zarodniki hoduje się na podłożu stałym zawierającym w częściach wagowych: części agaru, 1000 części brzeczki piwowarskiej o stężeniu 8 Be, a nadto 0,5 1 części tripalmitynianu glicerolu, w temperaturze C w czasie 3 5 dni. Następnie zmywa się wyhodowane zarodniki sterylną solą fizjologiczną z dodatkiem surfaktanta, zaszczepia zawiesiną zarodników wysterylizowane, ciekłe podłoże aktywujące zawierające w częściach wagowych: oliwy części z oliwek lub oleju, części namoku kukurydzianego, 1000 części wody wodociągowej, a nadto 0,5 1 części tripalmitynianu glicerolu, stosując 1 cm 3 zarodników na 100 cm 3 podłoża i prowadzi hodowlę wstrząsaną inokulum selekt anta w temperaturze C w czasie 18 godzin przy stopniu napełnienia kolb 20% i szybkości obrotowej wstrząsarki 180 minut -1, przy czym używa się wodę o barwie większej niż 5 mg Pt (PN-EN ISO 7887 : 2002), mętności nie większej niż 0,4 NTU (PN-EN ISO 7027 : 2003), przewodności nie większej niż 500 S/cm (PN-EN : 1999), ph w zakresie 7,1 7,4 (PN-90/C ), ChZT nie większym niż 1,75 (PN-ISO : 2005 PB : 2009), twardości nie większej niż 15 0 n, o zawartości azotanów nie większej niż 4 mg/l (PB : 2008) i żelaza nie większej niż 0,2 mg/l (PN-ISO 6332 : 2001).

3 PL B1 3 Otrzymanym inokulum zaszczepia się wysterylizowane i wstępnie napowietrzone sterylnym powietrzem, ciekłe podłoże produkcyjne zawierające w częściach wagowych: części oliwy z oliwek lub oleju, części namoku kukurydzianego oraz 1000 części wody wodociągowej o właściwościach jak podano wyżej, stosując inokulum w ilości 10% objętościowych stosunku do objętości podłoża i prowadzi hodowlę produkcyjną selektanta w temperaturze C w czasie 72 godzin w obecności środków przeciwdziałających pienieniu, w trakcie napowietrzania sterylnym powietrzem doprowadzanym w ilości 1 część objętościowa na 1 część objętościową podłoża w czasie 1 minuty, przy mieszaniu zawartości fermentora z szybkością obrotową 120 minut -1 za pomocą mieszadła, do którego przymocowuje się rozłącznie porowaty nośnik hodowanego selektanta w postaci prostopadłościennych płatów pianki poliuretanowej na bazie poliolu poliestrowego, o całkowicie otwartej strukturze komórkowej, charakteryzującej się gęstością kg/m 3 wytrzymałością na rozciąganie 100 kpa, średnicą porów 2,30 3,30 mm, o wymiarach 250 x 120 x 10 mm. Otrzymane w wyniku hodowli płaty pianki z przerośniętą biomasą selektanta Mucor racemosus A27/3sTAG oddziela się od cieczy pohodowlanej, przemywa się wodą destylowaną w celu odmycia rozpuszczalnych produktów metabolizmu, odwadnia acetonem schłodzonym do temperatury 4 C, ekstrahuje eterem naftowym i suszy w temperaturze pokojowej lub przemywa wodą destylowaną, zamraża do temperatury -45 C, liofilizuje, przemywa acetonem, eterem naftowym i suszy w temperaturze pokojowej. Przemycie wodą monitoruje się pomiarem absorbancji A < 0,05 dla długości fali = 280 nm, odwodnienie acetonem prowadzi 3-krotnie stosując 15 części wagowych acetonu na 1 część wagową pianki przerośniętej biomasą w czasie 10 minut w zakrytym naczyniu umieszczonym na wytrząsarce o szybkości obrotowej 120 minut -1, zaś suszenie prowadzi się na powietrzu w czasie 12 godzin. Sposób wytwarzania strukturyzowanych triacylogliceroli w reakcji acydolizy oleju rzepakowego, sojowego Iub słonecznikowego z kwasem stearynowym lub palmitynowym, katalizowanej lipazą, w środowisku rozpuszczalnika organicznego, według wynalazku polega na tym, że acydolizę prowadzi się przy stosunku molowym oleju do kwasu od 1:5 do 1:6, w środowisku eteru naftowego w obecności preparatu lipaz w postaci odwodnionej grzybni selektanta pleśni Mucor racemosus A27/3sTAG użytej w ilości 10% w stosunku do masy substratów, immobilizowanej w porach pianki poliuretanowej, korzystnie o średnicy porów 2,3 3,3 mm, wypełniającej ciągły reaktor kolumnowy, przy czym przez reaktor najpierw przepuszcza się eter naftowy z szybkością 1 cm 3 /minutę w czasie 600 minut, a następnie mieszaninę oleju i kwasu w eterze naftowym użytym w nadmiarze 1,8 5,1 w stosunku do masy substratów, z szybkością zapewniającą przebywanie substratów w reaktorze przez godzin, w temperaturze 35 C. Po zakończeniu reakcji acydolizy z mieszaniny reakcyjnej izoluje wytworzone strukturyzowane triacyloglicerole. Wolne kwasy tłuszczowe usuwa się z mieszaniny po acydolizie w drodze zmydlania wodorotlenkiem potasu. Sposób według wynalazku umożliwia otrzymanie strukturyzowanych triacylogliceroli z wydajnością 58 97% (mierzoną metodą GC) i liczoną względem ilości użytego oleju. Proces wytwarzania strukturyzowanych triglicerydów jest katalizowany przez naturalny, otrzymany na drodze biosyntezy, preparat lipazy Mucor racemosus A27/3sTAG, którego mycelium w procesie hodowli ulega immobilizacji na porowatym nośniku. Preparat ten po odwodnieniu i usunięciu lipidów wykazuje w środowisku niewodnym bardzo wysoką katalityczną aktywność i trwałość w reakcji acydolizy olejów roślinnych. W reakcji tej ulega aktywacji w obecności niewielkich stężeń amin. W procesach ciągłych, prowadzonych w reaktorach kolumnowych, zachowuje aktywność katalityczną dłużej niż 1 rok; po inaktywacji łatwo ulega całkowitej biodegradacji w środowisku ziemi lub kompostu. Sposób według wynalazku ilustrują poniższe przykłady. P r z y k ł a d 1 W celu otrzymania grzybni selektanta pleśni Mucor racemosus A27/3sTAG zawierającej preparat lipaz, selektant Mucor racemosus A27/3sTAG. wysiano na wysterylizowane termicznie w czasie 15 minut w temperaturze 121 C podłoże stałe o składzie w częściach wagowych: 1 część tripalmitynianu glicerolu, 30 części agaru, 1000 części brzeczki piwowarskiej o stężeniu 8 Be i po 3 dniach hodowli w temperaturze C zarodniki selektanta zmywano sterylną solą fizjologiczną zawierającą 0,01% Tritonu X-100 stosując 8 ml soli fizjologicznej ma 1 skos. Otrzymaną zawiesiną zarodników szczepiono wysterylizowane w czasie 30 minut w temperaturze 121 C, podłoże hodowlane o składzie w częściach wagowych: 0,5 części tripalmitynianu glicerolu 27 części oliwy z oliwek, 37 części namoku kukurydzianego oraz 1000 części wody wodociągowej o właściwościach jako podano wyżej, stosując 1 cm 3 zarodników na 100 cm 3 podłoża i prowadzono hodowlę wstrząsaną w temperaturze C, w czasie 18 godzin, przy stopniu napełnienia kolb 20% objętościowych i szybkości obroto-

4 4 PL B1 wej wstrząsarki 180 min -1. Otrzymanym w wyniku tej hodowli inokulum zaszczepiono, uprzednio wysterylizowane w czasie 30 minut w temperaturze 121 C, podłoże o objętości 18 litrów wprowadzone do fermentoru o objętości całkowitej 24 litrów, wstępnie napowietrzone sterylnym powietrzem, o składzie analogicznym jak w hodowli inokulum, ale bez dodatku tripalmitynianu glicerolu, stosując 10% objętościowych inokulum w stosunku do objętości podłoża. Do mieszadła umieszczonego w fermentorze zamocowano w powtarzalny sposób prostopadłościenne płaty pianki poliuretanowej na bazie polioiu poliestrowego o całkowicie otwartej strukturze komórkowej pianki retykulowanej. Uzyskanej w wyniku procesu termicznej retykulacji, o numerze klasyfikacyjnym S28280, charakteryzującej się gęstością kg/m 3, wytrzymałością na rozciąganie 100 kpa, średnicą porów 2,30 3,30 mm, o wymiarach 250 x 120 x 10 mm. Hodowlę prowadzono w temperaturze C w czasie 72 godzin, w obecności środków przeciwdziałających pienieniu, przy mieszaniu z szybkością obrotową 120 minut -1, doprowadzając powietrze w ilości 1 część objętościowa na 1 część objętościową podłoża w czasie 1 minuty. Otrzymane w wyniku hodowli produkcyjnej płaty pianki poliuretanowej, przerośnięte biomasą Mucor racemosus A27/3sTAG, po oddzieleniu od cieczy pohodowlanej na drodze filtracji, przemywano wodą w celu odmycia rozpuszczalnych produktów metabolizmu monitorowanego pomiarem absorbancji A < 0,05 dla długości fali = 280 nm, zalewano kolejno 3 porcjami acetonu schłodzonego do temperatury 4 C, stosowanym w ilości 15 części wagowych na 1 część wagową pianki przerośniętej biomasą i odwadniano 10 minut w zakrytym naczyniu umieszczonym na wytrząsarce o szybkości obrotowej 120 minut -1, a następnie ekstrahowano eterem naftowym. Odwodnioną i odlipidowaną biomasę, zaadsorbowaną w porach pianki poliuretanowej, suszono na powietrzu w czasie 12 godzin w temperaturze pokojowej. Przez reaktor kolumnowy o objętości 368 cm 3 i wymiarach: długość 75 cm, średnica 2,5 cm, upakowywany piankami poliuretanowymi o kształcie sześcianów o rozmiarach 10 x 10 x 10 min i średniej wielkości porów 2,3 3,3 mm z osadzonym w nich w ilości 16,1 g 30 s.m. grzybnią pleśni Mucor racemosus A27/3sTAG, przepuszczano eter naftowy z szybkością 1 cm 3 /min przez 600 minut. Następnie do reaktora podawano w sposób ciągły z szybkością 0,15 cm 3 /minutę mieszaninę 44,2 g oleju rzepakowego, 64 g kwasu palmitynowego i 800 ml eteru naftowego. Czas przebywania reaktantów w reaktorze wynosił 30 godzin, temperatura acydolizy 35 C. Proces ciągłej acydolizy prowadzono w temperaturze 35 C w czasie 2,5 miesiąca. Otrzymano strukturyzowane triacyloglicerole ze stałą wydajnością podstawienia kwasu w pozycje Sn-1 i Sn-3, mierzoną metodą GC i liczoną względem ilości użytego oleju, równą 81%. Wolne kwasy tłuszczowe z mieszanin po acydolizie oddzielano metodą zmydlania 0,5 M wodorotlenkiem sodu w 40% wodnym roztworze etanolu stosując 4-molowy nadmiar zasady w stosunku do wolnych kwasów tłuszczowych zawartych w danej próbie, delikatnie mieszając 0,5 godziny w temperaturze C, próby pozostawiono w temperaturze C na około 2 3 godziny do rozdziału na fazy wodną (dolną, zawierająca mydła) oraz górną fazę organiczną z rozpuszczonymi modyfikowanymi w reakcji acydolizy triacyloglicerolami. Z fazy górnej odparowano w wyparce próżniowej rozpuszczalnik. Pozostałość stanowiącą mieszaninę strukturyzowanych triacylogliceroli, w której stężenie wolnych kwasów tłuszczowych nie przekraczało 0,2%, przechowywano w 4 C. P r z y k ł a d 2 Grzybnię selektanta pleśni Mucor racemosus A27/3sTAG zawierającą preparat lipaz otrzymano postępując jak w przykładzie 1. Przez reaktor kolumnowy o objętości 368 cm 3 i wymiarach: długość 75 cm, średnica 2,5 cm, upakowywany piankami poliuretanowymi o kształcie sześcianów o rozmiarach 10 x 10 x 10 mm i średniej wielkości porów 2,3 3,3 mm z osadzonym w nich w ilości 16,9 g s.m. mycelium pleśni Mucor racemosus A27/3sTAG, przepuszczano eter naftowy z szybkością 1 cm 3 /minutę przez minimum 600 minut. Następnie do reaktora podawano w sposób ciągły z szybkością 0,15 cm 3 /minutę mieszaninę substratów sporządzoną z 44,2 g oleju słonecznikowego, 64 g kwasu palmitynowego, 800 ml eteru naftowego. Czas przebywania reaktantów w reaktorze wynosił 30 godzin, temperatura acydolizy 35 C. Proces ciągłej acydolizy prowadzono w temperaturze 35 C w czasie minimum 2,5 miesiąca. Otrzymano strukturyzowane triacyloglicerole ze stałą wydajnością podstawienia kwasu w pozycję Sn-1 i Sn-2, mierzoną metodą GC i liczoną względem ilości użytego oleju, równą 84%. Wolne kwasy tłuszczowa oddzielono z mieszaniny po acydolizie metodą zmydlania postępując jak w przykładzie 1.

5 PL B1 5 P r z y k ł a d 3 Grzybnię selektanta pleśni Mucor racemosus A27/3sTAG zawierającą preparat lipaz otrzymano postępując jak w przykładzie 1. Przez reaktor kolumnowy o objętości 368 cm 3 i wymiarach: długość 75 cm, średnica 2,5 cm, upakowywany handlowo dostępnymi piankami poliuretanowymi o kształcie walca o średnicy 25 mm. wysokości 5 mm i średniej wielkości porów 2,3 3,3 mm z osadzonym w nich w ilości 22,3 g s.m. mycelium pleśni Mucor racemosus A27/3sTAG, przepuszczano eter naftowy z szybkością 1 cm 3 /min przez minimum 600 minut. Następnie do reaktora podawano w sposób ciągły z szybkością 0,15 cm 3 /minutę mieszaninę substratów sporządzoną z 66 g oleju rzepakowego, 128 g kwasu stearynowego, 705 ml eteru naftowego. Czas przebywania reaktantów w reaktorze wynosił 30 godzin, temperatura acydolizy 35 C. Proces ciągłej acydolizy prowadzono w temperaturze 35 C w czasie 2,5 miesiąca. Otrzymano strukturyzowane triacyloglicerole ze stałą wydajnością podstawienia kwasu w pozycje Sn-1 i Sn-2, mierzoną metodą GC i liczoną względem ilości użytego oleju, równą średnio 83%. Wolne kwasy tłuszczowe oddzielono z mieszaniny po acydolizie metodą zmydlania postępując jak w przykładzie 1. P r z y k ł a d 4 Grzybnię selektanta pleśni Mucor racemosus A27/3sTAG zawierającą preparat lipaz otrzymano postępując jak w przykładzie 1. Przez reaktor kolumnowy o objętości 368 cm 3 i wymiarach: długość 75 cm. Średnica 2,5 cm, upakowywany piankami poliuretanowymi o kształcie sześcianów o rozmiarach 10 x 10 x 10 mm i średniej wielkości porów 2,3 3,3 mm z osadzonym w nich w ilości 22,0 g s.m. mycelium pleśni Mucor racemosus A27/3sTAG, przepuszczano eter naftowy z szybkością 2 cm 3 /minutę przez 300 minut. Następnie do reaktora podawano w sposób ciągły z szybkością 0,25 cm 3 /minutę mieszaninę substratów z 37,1 g oleju słonecznikowego, 64 g kwasu palmitynowego i 800 ml eteru naftowego. Czas przebywania reaktantów w reaktorze wynosił 21 godzin, temperatura acydolizy 34 C. Proces ciągłej acydolizy prowadzono w temperaturze 34 C w czasie 2,5 miesiąca. Otrzymano strukturyzowane triacyloglicerole ze stałą wydajnością podstawienia kwasu w pozycję Sn-1 i Sn-2, mierzoną metodą GC i liczoną względem ilości użytego oleju, równą średnio 91%. Wolne kwasy tłuszczowe oddzielono z mieszaniny po acydolizie metodą zmydlania postępując jak w przykładzie 1. Zastrzeżenie patentowe Sposób wytwarzania strukturyzowanych triacylogliceroli w reakcji acydolizy oleju rzepakowego, sojowego lub słonecznikowego z kwasem stearynowym lub palmitynowym, katalizowanej lipazą, w środowisku rozpuszczalnika organicznego, znamienny tym, że acydolizę prowadzi się przy stosunku molowym oleju do kwasu od 1:5 do 1:6, w środowisku eteru naftowego w obecności preparatu lipaz w postaci odwodnionej grzybni selektanta pleśni Mucor racemosus A27/3sTAG użytej w ilości 10% w stosunku do masy substratów, immobilizowanej w porach pianki poliuretanowej o średnicy porów korzystnie 2,3 3,3 mm, wypełniającej ciągły reaktor kolumnowy, przy czym przez reaktor najpierw przepuszcza się eter naftowy z szybkością 1 cm 3 / minutę w czasie 600 minut, a następnie mieszaninę oleju i kwasu w eterze naftowym użytym w nadmiarze 1,8 5,1 w stosunku do masy substratów, z szybkością zapewniającą przebywanie substratów w reaktorze przez godzin, w temperaturze 35 C, a po zakończeniu reakcji z mieszaniny reakcyjnej izoluje wytworzone strukturyzowane triacyloglicerole, zaś wolne kwasy tłuszczowe usuwa się z mieszaniny po acydolizie w drodze zmydlania wodorotlenkiem potasu.

6 6 PL B1 Departament Wydawnictw UPRP Cena 2,46 zł (w tym 23% VAT)