BIODEGRADACJA ODPADÓW KERATYNOWYCH Z PRZEMYSŁU DROBIOWEGO PRZY UDZIALE BAKTERII Z RODZAJÓW BACILLUS I SARCINA

Transkrypt

1 Biotechnologia 3(1-2) 24, BIODEGRADACJA ODPADÓW KERATYNOWYCH Z PRZEMYSŁU DROBIOWEGO PRZY UDZIALE BAKTERII Z RODZAJÓW BACILLUS I SARCINA Wojciech Łaba, Anna Rodziewicz Akademia Rolnicza we Wrocławiu Streszczenie. Bakterie Bacillus i Sarcina zdolne są do wykorzystania keratyny piór kurzych jako źródła węgla i azotu w podłoŝu. W pracy oceniano poziom degradacji białek keratynowych w hodowlach wgłębnych, a takŝe wzrost komórek oraz syntezę keratynaz i proteinaz w obecności wybranych czynników redukujących. Cysteina i Na 2 SO 3 stymulowały syntezę proteinaz, natomiast Na 2 S keratynaz. Badane szczepy w ciągu czterodobowej hodowli utylizowały do 44% keratyny. Ubytki w strukturze keratyny wykazano przy zastosowaniu skaningowej mikroskopii elektronowej. Słowa kluczowe: Bacillus, Sarcina, keratyna piór, keratynazy, czynniki redukujące WPROWADZENIE Głównym odpadem keratynowym przemysłu drobiowego jest pierze, które, generowane w znacznych ilościach, stanowi powaŝny problem ekologiczny. Keratyna, jako podstawowy składnik budulcowy piór, jest białkiem włókienkowym, charakteryzującym się wysoką odpornością mechaniczną i chemiczną, m.in. ze względu na występowanie w jej strukturze duŝej ilości mostków disiarczkowych. Natywna keratyna jest odporna na działanie typowych enzymów proteolitycznych, m.in. pepsyny, trypsyny, papainy. Wszelkiego rodzaju odpady keratynowe są więc kłopotliwe ze względu na powolne tempo ich rozkładu w środowisku naturalnym. Standardowe metody utylizacji piór poprzez hydrolizę chemiczną lub termohydrolizę równieŝ obciąŝają środowisko oraz są nieekonomiczne. Powstała w związku z tym konieczność opracowania tanich, uŝytecznych i neutralnych dla środowiska metod utylizacji keratyny piór z udziałem mikroorganizmów [Ichida i in. 21]. Powszechna i ekonomicznie uzasadniona jest równieŝ produkcja mączek keratynowych, stanowiących wysokosiarkowy suplement paszowy. W tym przypadku konieczna jest jednak wstępna obróbka keratyny, mająca na Adres do korespondencji Corresponding author: Wojciech Łaba, Katedra Biotechnologii i Mikrobiologii śywności, Akademia Rolnicza we Wrocławiu, ul. C.K. Norwida 25, Wrocław, wlaba@poczta.onet.pl

2 11 W. Łaba, A. Rodziewicz celu podwyŝszenie jej strawności i zbilansowanie składu aminokwasowego. Biotechnologiczne metody obróbki keratyny stanowią obiecującą alternatywę dla uŝywanych obecnie metod fizycznych i chemicznych, co znajduje potwierdzenie w pomyślnym zastosowaniu tak wzbogaconych pasz w hodowlach drobiu [Onifade i in. 1998, Williams i in. 1991]. Rosnące wykorzystanie hydrolizatów keratynowych obserwowane jest w przemysłach kosmetycznym i farmaceutycznym. Prowadzone są ponadto projekty mające na celu wykorzystanie pierza jako naturalnego źródła włókien przydatnych w przemyśle tekstylnym oraz papierniczym [McGovern 2]. Spośród drobnoustrojów, zdolność do degradacji keratyny posiadają dermatofity, a takŝe saprofityczne mikroorganizmy glebowe, do których naleŝą zarówno bakterie, jak i grzyby strzępkowe. Mechanizm keratynolizy z udziałem drobnoustrojów nie został do tej pory wyczerpująco opisany. Proteolityczny rozkład keratyny poprzedzany jest prawdopodobnie sulfitolizą, polegającą na redukcji cystynowych mostków disiarczkowych, czego efektem jest zwiększenie dostępności tego białka dla enzymów hydrolitycznych [Kunert 1992]. W niniejszej pracy określano zdolność bakterii B. polymyxa i Sarcina sp. do biodegradacji keratyny piór kurzych. Oceniano wpływ związków redukujących, mogących potencjalnie wspomagać redukcję mostków disiarczkowych, na wzrost bakterii oraz na pozakomórkowe enzymy proteolityczne. Wstępnie scharakteryzowano keratynazy i proteinazy zawarte w nieoczyszczonym płynie pohodowlanym badanych bakterii. MATERIAŁ I METODY BADAŃ Przedmiot badań stanowiły szczepy bakterii: Bacillus polymyxa B2 oraz Sarcina sp. B1pŜ, wyizolowane z odpadów keratynowych w badaniach własnych [Rodziewicz i Łaba 24]. Hodowle wgłębne mikroorganizmów prowadzono przez 4 doby, w kolbach Erlenmayera o pojemności 25 cm 3, w 5 cm 3 podłoŝa, w temperaturze 28 o C i przy wstrząsaniu 17 obr./min. Stosowano podłoŝe mineralne (PM) o składzie (%): MgSO 4 7H 2 O,1; CaCl 2,1; KH 2 PO 4,1; FeSO 4 7H 2 O,1; wzbogacone ekstraktem droŝdŝowym,5. Podstawowe źródło węgla i azotu stanowiły odtłuszczone pióra kurze (rasa Leghorn) w ilości 1%. Dalszym badaniom poddano płyny pohodowlane, odwirowane przy 1 g. Alternatywnie stosowano dodatek czynników redukujących w postaci siarczku sodu, siarczanu (IV) sodu oraz cysteiny, o stęŝeniach (%):,1;,1;,3. Mikrohodowle w aparacie Bioscreen C. Badano wpływ czynników redukujących na wzrost bakterii w podłoŝu PM z dodatkiem ekstraktu droŝdŝowego oraz keratyny rozpuszczalnej (po,1%). Czynnikami redukującymi były (,1%): siarczek sodu, siarczan (IV) sodu, cysteina oraz zredukowany glutation (GSH). Wszystkie mikrohodowle wykonano w 5 powtórzeniach. Parametry hodowli w analizatorze Bioscreen C: filtr szerokozakresowy, λ=42 58 nm; wstrząsanie ciągłe, intensywnośćśrednia; temp. 3 o C; interwał pomiaru OD 15 minut. Na podstawie uzyskanych krzywych wzrostu wyznaczono: długość lag fazy wyraŝoną w godzinach; współczynnik maksymalnej szybkości właściwej wzrostu (µ max ) obliczony ze wzoru µ max =(lnod 2 -lnod 1 )/t 2 -t 1 oraz maksymalny plon biomasy wyraŝony w wartości gęstości optycznej (OD). Zdolność do degradacji keratyny natywnej oznaczano zmodyfikowaną metodą według Yu [Ignatova i in. 1999], podczas reakcji przebiegającej w mieszaninie o skła- Acta Sci. Pol.

3 Biodegradacja odpadów keratynowych dzie: 4 mg rozdrobnionych i odtłuszczonych piór kurzych, 3,6 cm 3 buforu glicynowego o ph 1,2 oraz,4 cm 3 płynu pohodowlanego. Alternatywnie stosowano dodatek CaCl 2 o stęŝeniu końcowym,5 mm. Inkubacja przebiegała w temperaturze 5 o C w łaźni wodnej, przez okres 4 godzin, przy wstrząsaniu 14 obr./min. Aktywność wyraŝono w JK. Przyrost rozpuszczalnych białek i peptydów oznaczano metodą Lowry ego [Lowry i in. 1951]. Uwalnianie aminokwasów określano poprzez oznaczenie stęŝenia wolnych grup aminowych z uŝyciem kwasu trójnitrobenzosulfonowego (TNBS) [Snyder i Sobociński 1975]. Obecność wolnych grup sulfhydrylowych oznaczano kolorymetrycznie, za pomocą reakcji z kwasem 5,5 -ditio-bis-2-nitrobenzoesowym (DTNB), według metody Ellman a [Riener i in. 22]. Ubytek keratyny piór w podłoŝu oceniano po czterech dobach hodowli, metodą wagową, w temperaturze 15 o C. Aktywności enzymatyczne. Badano pozakomórkowe proteinazy i keratynazy oraz warunki ich aktywności. Aktywność keratynolityczną oznaczano przy uŝyciu keratyny rozpuszczalnej [Wawrzkiewicz i in. 1987]. Mieszanina reakcyjna zawierała,9 cm 3 substratu o stęŝeniu,1% w odpowiednim buforze oraz,1 cm 3 płynu pohodowlanego. Reakcję prowadzono w temperaturze 4 o C przez 2 minut, przy wstrząsaniu 3 obr./min w aparacie Thermomixer Comfort firmy Eppendorf. Reakcję przerywano 1, cm 3 6% TCA. Po 15 minutach próby wirowano (1 min, 1g), a następnie oznaczano absorbancję przy λ=28 nm wobec kontroli. Jednostkę aktywności (JK) definiowano jako wzrost absorbancji o,1 w przeliczeniu na 1 cm 3 płynu pohodowlanego na 1 minutę. Aktywność proteolityczną oznaczano analogicznie do aktywności keratynolitycznej. Substratem była kazeina BDH (1%) w,1 M buforze boranowym o ph 7,5. Reakcję prowadzono w temperaturze 4 o C przez 2 minut. Jednostka aktywności JP oznacza wzrost absorbancji A 28 o,1, w przeliczeniu na 1 cm 3 w czasie 1 minuty. Wpływ inhibitorów i aktywatorów na aktywność keratynolityczną i proteolityczną. Badano wpływ: N-etylowego imidu kwasu maleinowego (NEM), 5 1 mm w bezwodnym alkoholu etylowym, fluorku fenylometylosulfonowego (PMSF), 1 mm w izopropanolu, soli sodowej kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), 5 1 mm oraz cysteiny, 1 5 mm i CaCl 2, 1 mm. Inhibitory preinkubowano z płynem pohodowlanym w temperaturze 5 o C przez 2 minut, po czym dodawano substrat. Oznaczenia wykonano w 4 powtórzeniach, w ph optymalnym. Wpływ temperatury i ph na aktywność keratynolityczną i proteolityczną. Temperatury badano w zakresie 3 6 o C, natomiast ph 4,4 11,. W badaniach wpływu ph stosowano bufory:,2 M bufor uniwersalny Brittona i Robinsona w zakresie ph 5, 11,; fosforanowy,1 M w zakresie ph 4,4 7,; boranowy,2 M w zakresie ph 7,6 8,6; glicynowy,2 M w zakresie ph 9, 1,8. Oznaczenia wykonano w 4 powtórzeniach. Zdjęcia mikroskopowe wykonano techniką skaningowej mikroskopii elektronowej, przy uŝyciu mikroskopu SEM LEO 435 VP, w zakresie powiększeń WYNIKI I DYSKUSJA Keratyna zawarta w piórach drobiowych moŝe stanowić źródło węgla i azotu dla drobnoustrojów, zdolnych do jej degradacji. Bakterie z rodzajów Bacillus i Sarcina wykazały taką zdolność podczas hodowli w poŝywce mineralnej z dodatkiem piór kurzych. Jednak do zapoczątkowania wzrostu bakterii wymagany jest niewielki dodatek Biotechnologia 3(1-2) 24

4 112 W. Łaba, A. Rodziewicz łatwo przyswajalnego źródła C i N. Ponadto sugeruje się, Ŝe degradacja keratyny łatwiej przebiega w środowisku redukcyjnym, które zarazem jest niekorzystne dla wzrostu mikroorganizmów. Analiza wzrostu bakterii B. polymyxa B2 w podłoŝu mineralnym, zawierającym keratynę rozpuszczalną oraz ekstrakt droŝdŝowy, potwierdziła niekorzystny wpływ dodatku czynników redukujących na wzrost komórek (tab. 1). Zamieszczone na rysunku 1 krzywe reprezentują hodowle z dodatkiem poszczególnych czynników redukujących oraz kontroli. W przebiegu krzywych charakterystyczna jest obecność dwóch logarytmicznych faz wzrostu, co związane jest z obecnością w podłoŝu dwóch źródeł węgla i azotu. OD 1,2 1,,8,6,4,2, Kontrola siarczek sodu/sodium sulfide glutation zredukowany/glutathione reduced cysteina/cysteine czas [h] time [h] siarczan (IV) sodu/sodium (IV) sulfate Rys. 1. Krzywe wzrostu szczepu B. polymyxa B2 w podłoŝu mineralnym z dodatkiem keratyny rozpuszczalnej i ekstraktu droŝdŝowego, w obecności czynników redukujących Fig. 1. Growth curves of B. polymyxa B2 in mineral medium containing of soluble keratin and yeast extract, in the presence of reducing agents Pierwszy etap, trwający 5 7 godzin, obrazuje wzrost komórek korzystających ze źródła łatwiej przyswajalnego, w tym przypadku ekstraktu droŝdŝowego. Na tym etapie widoczna jest stymulacja wzrostu przez dodatek Na 2 SO 3. Czas rozpoczęcia drugiego etapu wzrostu, związany z początkiem utylizacji keratyny w podłoŝu, był zróŝnicowany dla poszczególnych związków. Jedynie cysteina spowodowała niewielkie przyspieszenie wzrostu na keratynie. Najmniej korzystnym dodatkiem był siarczan (IV) sodu, który wydłuŝył czas wystąpienia drugiej lag fazy z 17 do 29 godzin. Maksymalny plon biomasy, wyraŝony wartością gęstości optycznej (OD), we wszystkich omawianych przypadkach uległ redukcji w stosunku do hodowli kontrolnej. Najmniejszy spadek plonu biomasy spowodowany był przez dodatek cysteiny. Ponadto, jedynie cysteina nie powodowała spadku maksymalnej szybkości właściwej wzrostu podczas utylizacji keraty- Acta Sci. Pol.

5 Biodegradacja odpadów keratynowych ny (tab.1). Efekt hamowania wzrostu nasilał się wraz ze wzrostem stęŝenia substancji redukujących. Podczas czterodobowych hodowli bakterii w podłoŝu z dodatkiem piór kurzych zmieniał się odczyn środowiska i potencjał oksydoredukcyjny. Wyjściowa wartość ph 7,2 zmieniała się do 8,9 i stabilizowała się na tym poziomie. ObniŜenie potencjału oksydoredukcyjnego podłoŝa podczas wzrostu obu szczepów było największe w drugiej i trzeciej dobie hodowli (rys. 2). MoŜna sądzić, Ŝe alkalizacja poŝywki wynikała z deaminacji aminokwasów pochodzących z keratyny [Wawrzkiewicz i in. 1987, Kunert 1992, Zaghloul 1998], co poprzedzone było uwalnianiem rozpuszczalnego białka do środowiska. Tabela 1. Wybrane parametry wzrostu obliczone na podstawie krzywych wzrostu B. polymyxa B2 w hodowlach z dodatkiem czynników redukujących Table 1. Selected growth parameters calculated according to growth curves of B. polymyxa B2 in cultures with an addition of reducing agents Czynnik redukujący Reducing agent Lag faza I Lag phase I [h] µ max I [h -1 ] Lag faza II Lag phase II [h] µ max II [h -1 ] OD max Na 2S 1,222 23,2,54 Na 2SO 3 1,294 29,24,43 Glutation zred. Glutathione reduced Cysteina Cysteine Kontrola Control 1,222 23,25,54 1,222 19,4,79 1,222 17,4,8 redox [mv] , 9, 8, 7, ph B.polymyxa B2- redox Sarcina B1pŜ- redox , 5, 4, kontrola (control) redox B.polymyxa B2- ph , 2, Sarcina B1pŜ- ph 5 1, kontrola (control) ph czas [doby] time [days], Rys. 2. Zmiany potencjału red-ox oraz ph w hodowlach B.polymyxa B2 i Sarcina sp. B1pŜ Fig. 2. Changes of red-ox potential and ph in cultures of B.polymyxa B2 and Sarcina sp. B1pŜ Biotechnologia 3(1-2) 24

6 114 W. Łaba, A. Rodziewicz W hodowli szczepu B. polymyxa B2 maksymalny przyrost stęŝenia białka, wynoszący 475 µg cm -3, wykazano w drugiej dobie, a grup NH 2 w trzeciej i czwartej. RównieŜ synteza enzymów proteolitycznych przez ten szczep podlegała ciągłemu wzrostowi, co znalazło odzwierciedlenie w przyroście stęŝenia wolnych grup SH w trzeciej i czwartej dobie hodowli (rys. 3). StęŜenie wolnych grup aminowych osiągało poziom 41,7 µg cm -3. Podczas hodowli Sarcina sp. B1pŜ przyrost stęŝenia białka był skorelowany z poziomem syntezy proteinaz do drugiej doby i wynosił 21,9 µg cm -3, a w czwartej dobie wzrastał do 346,9 µg cm -3. NiŜszy poziom przyrostu tych wskaźników mógł być spowodowany wolniejszym tempem namnaŝania się biomasy bakterii. Ogółem przyrost stęŝenia wolnych grup aminowych osiągał poziom 22,6 µg cm -3 (rys. 4). Przyrost st. białka [µg*cm -3 ] Protein conc. Increase [µg*cm -3 ] czas [doby] time [days] NH2 [µg/cm -3 ]; -SH [µg*cm -3 ] Rys. 3. Zmiany stęŝenia białka ( ) oraz wolnych grup aminowych ( ) i sulfhydrylowych ( ) w hodowli B.polymyxa B2 Fig. 3. Changes in concentration of protein ( ), free amino- ( ) and sulfhydryl groups ( ) in culture of B.polymyxa B2 Wysoka oporność keratyny na degradację przypisywana jest m.in. duŝej ilości mostków disiarczkowych, stabilizujących jej strukturę, zatem skuteczność rozkładu tego białka zaleŝy od stopnia zerwania wiązań między cząsteczkami cystyny. Zwraca się tu uwagę na rolę substancji redukujących, wydzielanych do podłoŝa przez mikroorganizmy [Kunert 1989]. Sugerowane jest równieŝ istnienie enzymów o charakterze reduktaz, katalizujących ten proces, a zarazem wspomagających działanie keratynaz [Yamamura i in. 22]. Pomimo Ŝe mechanizm keratynolizy nie jest całkowicie poznany, wielu autorów sugeruje kluczową rolę sulfitolizy w tym procesie. W niniejszej pracy monitorowano przyrost stęŝenia grup sulfhydrylowych, obrazujący stopień zrywania mostków disiarczkowych i uwalniania cysteiny lub tiocysteiny [Kunert 1992]. W hodowli szczepu B. polymyxa B2 maksymalny poziom grup SH wynoszący 1,13 µg cm -3, w przeliczeniu na cysteinę, wykazano w trzeciej dobie hodowli. Poziom ten w przypadku szczepu Sarcina sp. B1pŜ był nieco niŝszy i wynosił 8,76 µg cm -3 i został osiągnięty w czwartej dobie. Acta Sci. Pol.

7 Biodegradacja odpadów keratynowych Przyrost st. białka [µg*cm -3 ] Protein conc. Increase [µg*cm -3 ] NH2 [µg/cm -3 ]; -SH [µg*cm -3 ] czas [doby] time [days] Rys. 4. Zmiany stęŝenia białka ( ) oraz wolnych grup aminowych ( ) i sulfhydrylowych ( ) w hodowli Sarcina sp. B1pŜ Fig. 4. Changes in concentration of protein ( ), free amino- ( ) and sulfhydryl groups ( ) in culture of Sarcina sp. B1pŜ JP B.polym yxa B2 AP B.polym yxa B2 AK Sarcina B1pŜ AP Sarcina B1pŜ AK 1 2 czas [doby] time [days] Rys. 5. Aktywność keratynolityczna i proteolityczna płynów pohodowlanych B. polymyxa B2 oraz Sarcina sp. B1pŜ w podłoŝu mineralnym z dodatkiem piór kurzych Fig. 5. Keratinolytic and proteolytic activity in culture media of B. polymyxa B2 and Sarcina sp. B1pŜ in mineral medium containing chicken feathers Biotechnologia 3(1-2) 24

8 116 W. Łaba, A. Rodziewicz Keratyna piór, obecna w podłoŝu hodowlanym, wykorzystywana była przez badane bakterie jako źródło węgla i azotu z udziałem proteinaz keratynolitycznych. Keratynazy wydzialane przez B. polymyxa B2 osiągały aktywność 2,96 JK, a ich synteza była opóźniona o jedną dobę w stosunku do proteinaz. Keratynazy Sarcina sp. B1pŜ osiągały aktywność 4,74 JP, a ich synteza wyprzedzała syntezę proteinaz (rys. 5). Ogółem, bakterie w trwającym cztery doby procesie, degradowały 35 44% keratyny obecnej w środowisku. W badaniach innych autorów bakterie naleŝące do rodzajów Bacillus, Stenotrophomonas oraz Flavobacterium upłynniały chorągiewki piór po czasie dwóch do czterech dni hodowli [Riffel i Brandelli 1992, Yamamura i in. 22, Zaghloul 1998]. Głęboką dezintegrację włókien keratynowych piór przez bakterie obrazują zdjęcia mikroskopowe. Widoczne są znaczne ubytki oraz rozluźnienie struktury stosiny i chorągiewki pióra (Fot. 1 B-D), w porównaniu do kontroli (Fot. 1 A). Fot. 1. Degradacja struktury keratyny piór przez B.polymyxa B2. A kontrola, pow. 1 ; B, C, D stan keratyny po czterech dobach hodowli; pow. odpowiednio 1, 4, 12 Photo. 1. Degradation of feather keratin by B.polymyxa B2. A- control, mag. 1 ; B, C, D the condition of keratin after four days of culture; mag. 1, 4, 12 respectively Związki redukujące stosowane w badaniach wywierały znaczący wpływ nie tylko na bakterie, ale takŝe na enzymy pozakomórkowe. Obecność jonów S -2 spowodowała znaczny spadek aktywności keratynaz, natomiast dodatek cysteiny powodował jej wzrost z 2,96 do 5, JK. Proteinazy były silnie aktywowane przez jony SO -2 3 (wzrost Acta Sci. Pol.

9 Biodegradacja odpadów keratynowych z 15,65 do 117,3 JP) (rys. 7). Kunert [1992] uzyskał analogiczny efekt stymulacji keratynolizy przez enzymy grzyba Microsporum gypseum, przy zastosowaniu cysteiny o stęŝeniu,1 1, mm i jonów SO 3-2 o stęŝeniu 3 3 mm, w stosunku do sierści świnki morskiej. JK Kontrola Control Siarczek sodu Sodinum sulphide Siarczan (IV) sodu Sodium (IV) sulphate Cysteina Cysteine JP Kontrola Control Siarczek sodu Sodium sulphide Siarczan (IV) sodu Sodium (IV) sulphate Cysteina Cysteine Rys. 6. Wpływ czynników redukujących na aktywność keratynolityczną (AK) i proteolityczną (AP) enzymów szczepu B.polymyxa B2 Fig.6. Effect of reducing agents on the keratinolytic (AK) and proteolytic activity (AP) of enzymes from B.polymyxa B2 Proteinazy i keratynazy zawarte w płynie pohodowlanym zostały scharakteryzowane na podstawie ich wraŝliwości na temperaturę i obecność inhibitorów. Szczep B. polymyxa B2 syntetyzował mieszaninę enzymów róŝniących się właściwościami. Keratynazy B. polymyxa B2 były proteinazami alkalicznymi, o najwyŝszej aktywności w ph 1,2, natomiast proteinazy były metaloenzymami, wykazującymi maksymalną aktywność w ph 6,6. Optymalną temperaturą dla obu enzymów było 5 o C. Enzymy Sarcina sp. B1pŜ stanowiły mieszaninę keratynaz serynowo-tiolowych, o najwyŝszej aktywności w ph 9,4 oraz proteinaz serynowych, wraŝliwych na Ca +2 (tab. 2, 3). Biotechnologia 3(1-2) 24

10 118 W. Łaba, A. Rodziewicz Tabela 2. Optymalne wartości temperatury i ph dla aktywności keratynolitycznej (AK) i proteolitycznej (AP) badanych enzymów Table 2. Optimal temperature and ph values for keratinolytic (AK) and proteolytic (AP) activity of tested enzymes Temperatura Temperature B. polymyxa B2 Sarcina sp. B1pŜ AK AP AK AP 5 o C 5 o C 55 o C 5 o C ph 1,2 6,6 9,4 8,6 Tabela 3. Wpływ inhibitorów i aktywatorów na aktywność keratynolityczną i proteolityczną enzymów szczepu B. polymyxa B2 Table 3. Effect of inhibitors and activators on keratinolytic and proteolytic activity of enzymes from B. polymyxa B2 Inhibitor Aktywator Inhibitor Activator StęŜenie Concentration [mm] Resztkowa aktywność Residual activity [%] AK AP PMSF 1 57,4 31,5 EDTA 5 36,4 13,7 NEM 5 86,4 5,6 Cysteina 1 15, 95,2 Cysteine 5 96,7 87,1 CaCl ,2 78,3 Keratynazy zawarte w płynie pohodowlanym B.polymyxa B2 degradowały zarówno keratynę rozpuszczalną, jak i natywną (rys. 7). AK [J/ml*min],7,6,5,4,3,2,1 B.polymyxa B2 Sarcina sp. B1pŜ Rys. 7. Hydroliza keratyny natywnej w obecności i przy braku CaCl 2 (,5mM) Fig. 7. Hydrolysis of native keratin, in the presence and absence of CaCl 2 (,5mM ) Acta Sci. Pol.

11 Biodegradacja odpadów keratynowych Aktywność keratynaz podwyŝszał dodatek jonów Ca +2, co moŝe mieć związek ze wzrostem stabilności enzymów [Ignatova i in. 1999]. RównieŜ aktywność proteinaz Sarcina wzrastała trzykrotnie w obecności jonów wapnia oraz hamowana była przez EDTA. WNIOSKI 1. Bakterie Bacillus polymyxa B2 oraz Sarcina sp. B1pŜ wykazały zdolność do degradacji keratyny piór kurzych, którą wykorzystywały jako źródło węgla i azotu w podłoŝu. 2. W obecności czynników redukujących w środowisku zwiększała się synteza proteinaz przez B. polymyxa B2 (Na 2 S, Na 2 SO 3, cysteina) oraz keratynaz (cysteina); jednak związki te wpływały niekorzystnie na wzrost bakterii. 3. Badane bakterie wydzielały do środowiska pozakomórkowe proteinazy, które stanowiły mieszaninę metaloproteinaz, proteinaz tiolowych i serynowych, wykazujących najwyŝszą aktywność w temperaturze 5 o C. 4. Keratynazy syntetyzowane przez bakterie były alkalicznymi proteinazami, róŝniącymi się nieznacznie optymalnym ph działania. 5. Podczas czterodobowej hodowli bakterie degradowały 35 45% keratyny piór. PIŚMIENNICTWO Ichida J.M., Krizova L., LeFevre C.A., Keener H.M., Elwell D.L., Burtt Jr. E.H., 21. Bacterial inoculum enhances keratin degradation and biofilm formation in poultry compost. J. Microbiol. Meth., 47, Ignatova Z., Gousterova A., Spassov G., Nedkov P., Isolation and partial characterisation of extracellular keratinase from a wool degrading thermophilic strain Thermoactinomyces candidus. Can. J. Microbiol., 45, Kunert J., Biochemical mechanism of keratin degradation by the actinomycete Streptomyces fradiae and the fungus Microsporum gypseum: A comparison. J. Basic Microbiol., 29, Kunert J., Effect of reducing agents on proteolytic and keratinolytic activity of enzymes of Microsporum gypseum. Mycoses, 35, McGovern V., 2. Recycling poultry feathers: more bang for the cluck. Environ. Health Perspect., 18 (8). Onifade A.A., Al-Sane N.A., Al-Musallam A.A., Zarban S., A review: Potentials for biotechnological applications of keratin-degrading microorganisms and their enzymes for nutritional improvement of fearhers and other keratins as livestock feed resources. Biores. Technol., 66, Riener C.R., Kada G., Gruber H.J., 22. Quick measurment of protein sulfhydryls with Ellman s reagent and with 4,4 -dithiodipyridine. Anal. Bioanal. Chem., 373, Riffel A., Brandelli A., 22. Isolation and characterization of a feather-degrading bacterium from the poultry processing industry. J. Industr. Microbiol. Biotechnol., 29, Rodziewicz A., Łaba W., 24. Biological degradation of feather keratin by saprophytic bacteria. Pol. J. Chem. Technol. (w druku). Snyder S.L., Sobociński P.Z., An improved 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid method for the determination of amines. Anal. Biochem., 64, Biotechnologia 3(1-2) 24

12 12 W. Łaba, A. Rodziewicz Wawrzkiewicz K., Łobarzewski J., Wolski T., Intracellular keratinase of Trichophyton gallinae. J. Med. Vet. Mycol., 25, Williams C.M., Lee C.G., Garlich J.D., Shih J.C.H., Evaluation of a bacterial feather fermentation product, feather-lysate, as a feed protein. Poultry Sci., 7, Yamamura S., Morita Y., Hasan Q., Rao S.R., Murakami Y., Yokoyama K., Tamiya E., 22. Characterization of a new keratin-degrading bacterium isolated from deer fur. J. Biosci. Bioeng., 93 (6), Yamamura S., Morita Y., Hasan Q., Yokoyama K., Tamiya E., 22. Keratin degradation: a cooperative action of two enzymes from Stenotrophomonas sp. Biochem. Biophys. Res. Com., 294, Zaghloul T.I., Cloned Bacillus subtilis alkaline protease (apra) gene showing high level of keratinolytic activity. Appl. Biochem. Biotechnol., Vol. 7-72, BIODEGRADATION OF KERATINOUS WASTES FROM POULTRY INDUSTRY INVOLVING BACTERIA OF GENERA BACILLUS AND SARCINA Abstract. Bacteria from genera Bacillus and Sarcina are capable of using chicken feather keratin as a source of carbon and nitrogen in the medium. We investigated the process of feather degradation in submerged cultures, as well as cell growth and keratinase and protease synthesis levels in presence of selected reducing agents. Cysteine and Na 2 SO 3 stimulated the synthesis of proteases, while Na 2 SO 3 and Na 2 S, keratinases. The deterioration of keratin structure was observed by the means of scanning electron microscopy. Key words: Bacillus, Sarcina, feather keratin, keratinases, reducing agents Zaakceptowano do druku Accepted for print: Acta Sci. Pol.