WPŁYW METABOLITÓW PROPIONIBACTERIUM NA WZROST WYBRANYCH GRZYBÓW CHOROBOTWÓRCZYCH I WYTWARZANIE MIKOTOKSYN

Transkrypt

1 Progress in Plant Protection / Postępy w Ochronie Roślin, 46 (2) 2006 WPŁYW METABOLITÓW PROPIONIBACTERIUM NA WZROST WYBRANYCH GRZYBÓW CHOROBOTWÓRCZYCH I WYTWARZANIE MIKOTOKSYN DANIELA GWIAZDOWSKA 1, ROMUALD GWIAZDOWSKI 2, KATARZYNA CZACZYK 3 1 Akademia Ekonomiczna, Katedra Biochemii i Mikrobiologii Al. Niepodległości 10, Poznań d.gwiazdowska@ae.poznan.pl 2 Instytut Ochrony Roślin, Zakład Badania Środków Ochrony Roślin Miczurina 20, Poznań 3 Akademia Rolnicza, Katedra Biotechnologii i Mikrobiologii Żywności Wojska Polskiego 48, Poznań I. WSTĘP Bakterie fermentacji propionowej są znanym producentem związków o aktywności przeciwdrobnoustrojowej takich jak: lotne kwasy tłuszczowe (kwas propionowy, kwas octowy), nadtlenek wodoru, diacetyl oraz bakteriocyny związki o charakterze białkowym (Lyon i Glatz 1991; Grinstead i Barefoot 1992; Ratnam i wsp. 1999; Faye i wsp. 2000). W ostatnich latach obserwuje się wzrost zainteresowania właściwościami fungistatycznymi i antybakteryjnymi tych mikroorganizmów i możliwością ich potencjalnego zastosowania. Większość prowadzonych badań dotyczy żywności (Weinbrenner i wsp. 1997; Suomalainen i Mäyrä-Makinen 1999), natomiast w prezentowanej pracy oceniano aktywność fungistatyczną w stosunku do grzybów powodujących choroby roślin. Mikroorganizmy II. MATERIAŁ I METODY Jako mikroorganizmy testowe stosowano Propionibacterium freudenreichii ssp. z kolekcji Katedry Biotechnologii i Mikrobiologii Żywności Akademii Rolniczej w Poznaniu oraz Propionibacterium freudenreichii ssp. z kolekcji Uniwersytetu Warmińsko-Mazurskiego w Olsztynie. Jako mikroorganizmy wskaźnikowe zastosowano dziewięć grzybów chorobotwórczych: Alternaria alternata, Botrytis cinerea, Fusarium culmorum, F. graminearum, F. moniliforme, F. sambucinum, F. solani, Sclerotinia sclerotiorum i Trichothecium roseum. Grzyby pochodziły z Banku Patogenów Instytutu Ochrony Roślin w Poznaniu

2 544 Progress in Plant Protection / Postępy w Ochronie Roślin, 46 (2) 2006 oraz z kolekcji Katedry Biotechnologii i Mikrobiologii Żywności Akademii Rolniczej w Poznaniu. Przygotowanie płynów pohodowlanych (supernatantów) Hodowlę bakterii propionowych prowadzono na podłożu kazeinowym przez 10 dni w temperaturze 30ºC w warunkach względnie beztlenowych, korygując codziennie ph do poziomu 7,0. Po zakończeniu hodowli, próby odwirowywano (4 000 g, 15 minut), zlewano supernatant do jałowych kolb i ogrzewano przez 15 minut w 80ºC w celu inaktywacji enzymów proteolitycznych. Następnie supernatant filtrowano przez filtry niewiążące białka 0,45 µm, uzyskując filtraty wolne od komórek. Hodowla Fusarium z dodatkiem supernatantów otrzymanych z hodowli bakterii propionowych Do 70 ml pożywki PDA zaszczepionej odpowiednim grzybem (F. culmorum, F. graminearum i F. moniliforme) dodawano 30 ml supernatantu. Kontrolę stanowiły kolby, do których dodano 30 ml pożywki kazeinowej. Hodowle prowadzono przez 15 dni w temperaturze pokojowej na wytrząsarce przy mieszaniu 100 obr./min. Po zakończeniu hodowli przygotowywano próby do oznaczenia zawartości toksyn. Oznaczanie aktywności fungistatycznej metodą płytkową Aktywność fungistatyczną oznaczano metodą płytkową opisaną przez Boreckiego (1984), dodając do podłoża supernatant w stosunku objętościowym 2:10. Kontrolę stanowiły płytki bez dodatku płynu pohodowlanego. Zaszczepione płytki inkubowano w temperaturze pokojowej. Procent zahamowania wzrostu grzyba obliczano według wzoru: Procent zahamowania wzrostu = (K 0 F/K 0 )100, gdzie: K 0 średnica kultury w kombinacji kontrolnej, F średnica w kombinacji z preparatem bakteriocynowym Przygotowanie prób do oznaczania zawartości mikotoksyn Próby przygotowano według metodyki opisanej przez Perkowskiego (1993). Analizy chromatograficzne Zawartość kwasu propionowego i octowego w płynach pohodowlanych oraz stężenie mikotoksyn w hodowlach Fusarium oznaczano techniką chromatografii cieczowej (HPLC). Oznaczanie zawartości białka w płynach pohodowlanych Stężenie białka oznaczano metodą Bradforda (1976). III. WYNIKI I ICH OMÓWIENIE Badania prowadzono w dwóch etapach. W pierwszym etapie oceniono wpływ supernatantów otrzymanych z hodowli Propionibacterium na wzrost wybranych grzybów chorobotwórczych na podłożu stałym. W drugiej części pracy supernatant dodawano do

3 Wpływ metabolitów Propionibacterium płynnych hodowli wybranych gatunków grzybów z rodzaju Fusarium, oceniając wpływ na wytwarzanie przez nie mikotoksyn. Zawartość głównych metabolitów o działaniu antagonistycznym, to jest kwasu propionowego i kwasu octowego oraz substancji białkowych przedstawiono w tabeli 1. Związki o charakterze białkowym uwzględniono, ponieważ wcześniejsze badania ujawniły, że szczepy testowe i mają zdolność do wytwarzania bakteriocyn białkowych metabolitów o działaniu antagonistycznym wobec niektórych drobnoustrojów. Tabela 1. Stężenie kwasów organicznych i białka w supernatantach z hodowli bakterii propionowych Table 1. The concentration of organic acids and protein in supernatants from propionibacteria cultures Szczep testowy Test strain Propionibacterium freudenreichii ssp. Propionibacterium freudenreichii ssp. Stężenie w supernatancie Concentration in supernatant [g/l] Kwas propionowy propionic acid Kwas octowy acetic acid Białko protein 30,13 14,05 2,8 21,32 11,34 2,92 W testach płytkowych stwierdzono, że wszystkie badane grzyby były wrażliwe na substancje zawarte w supernatantach (tab. 2). Obserwowano jednak duże zróżnicowanie w zależności od szczepu testowego oraz od gatunku grzyba. Najsilniej hamowane były S. sclerotiorum i B. cinerea. W przypadku S. sclerotiorum nie obserwowano żadnego przyrostu grzybni, natomiast B. cinerea był hamowany w 77,8 do 83,3%. Silne zaha- Tabela 2. Wpływ supernatantów z hodowli bakterii propionowych na wzrost wybranych grzybów na podłożu stałym Table 2. The influence of supernatants from propionibacteria cultures on the growth of some fungi in solid medium Procent zahamowania wzrostu grzyba przez supernant Gatunek Species Percent of growth inhibition in supernatant P. shermanii (41) P. freudenreichii (111) Alternaria alternata 57,8 38,8 Botrytis cinerea 83,3 77,8 Fusarium culmorum 56,1 62,7 Fusarium graminearum 17,2 8,7 Fusarium moniliforme 29,5 36,2 Fusarium sambucinum 33,3 43,3 Fusarium solani 15,6 7,8 Sclerotinia sclerotiorum Trichotecium roseum 66,7 52,2

4 546 Progress in Plant Protection / Postępy w Ochronie Roślin, 46 (2) 2006 mowanie wzrostu, przekraczające 50% obserwowano w przypadku F. culmorum, T. roseum oraz A. alternata, ale tylko w obecności supernatantu z hodowli P. freudenreichii ssp.. Z kolei najmniejszy wpływ metabolitów bakterii propionowych odnotowano wobec F. graminearum i F. solani, przy czym zdecydowanie słabsze oddziaływanie wykazywał supernatant otrzymany z hodowli freudenreichii 111. Do drugiego etapu badań wybrano trzy gatunki grzybów z rodzaju Fusarium: F. culmorum, F. graminearum i F. moniliforme. Przy wyborze grzybów kierowano się przede wszystkim faktem, iż są to gatunki toksynotwórcze, a wytwarzane przez nie mikotoksyny należą do najgroźniejszych. Wybrane mikotoksyny: nivalenol, deoksynivalenol, zearalenon i fumonizynę oznaczano po przeprowadzeniu hodowli Fusarium z dodatkiem supernatantów z hodowli Propionibacterium. Wyniki przedstawiono w tabeli 3. Tabela 3. Wpływ supernatantów z hodowli bakterii propionowych na wytwarzanie niektórych mikotoksyn przez grzyby z rodzaju Fusarium Table 3. The influence of the supernatants from propionibacteria cultures on production of some mycotoxins by fungi belonging to Fusarium genus Stężenie toksyny Concentration of toxin [µg/ml] Test strain fumonizyna nivalenol fumonisin Fusarium culmorum deoksynivalenol deoxynivalenol zearalenon zearalenone Kontrola Control nb 5,084 ± 0,20 a 1,085 ± 0,28 a 32,31 ± 6,36 a nb 0,000 ± 0,00 b 0,000 ± 0,00 a 0,000 ± 0,00 b nb 0,000 ± 0,00 b 0,000 ± 0,00 a 0,000 ± 0,00 b Fusarium graminearum Kontrola Control nb 40,27 ± 0,54 a 5,583 ± 0,67 a 0,000 ± 0,0 nb 39,74 ± 4,52 a 4,374 ± 0,91 a 0,000 ± 0,0 nb 26,32 ± 1,30 a 3,490 ± 0,46 a 0,000 ± 0,0 Fusarium moniliforme Kontrola Control 25,11 ± 0,59 a nb nb nb 5,574 ± 0,93 b nb nb nb 5,422 ± 0,01 b nb nb nb nb nie badano, not tested a, b różnice statystycznie istotne przy α < 0,05, significant the differences at α < 0.05 W hodowlach F. culmorum obecność wszystkich badanych mikotoksyn wykryto tylko w próbach kontrolnych, natomiast w obecności supernatantów Propionibacterium ich stężenie było niewykrywalne. W przypadku F. graminearum nie stwierdzono obec-

5 Wpływ metabolitów Propionibacterium ności zearalenonu w żadnej z prób. Z kolei nivalenol i deoksynivalenol były wytwarzane w mniejszych ilościach w obecności supernatantów Propionibacterium niż w próbach kontrolnych, jednak nie były to różnice istotne. W hodowlach F. moniliforme oznaczano tylko charakterystyczną dla tego gatunku fumonizynę B 1 i stwierdzono istotnie mniejsze ilości tej toksyny w próbach z dodatkiem metabolitów bakterii propionowych. Część prezentowanych wyników finansowana była z interdyscyplinarnego grantu AE-AR IV. LITERATURA Borecki Z Fungicydy Stosowane w Ochronie Roślin. PWN, W-wa: Bradford M.M A rapid and sensitive method for quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72: Faye T., Lansgrud T., Nes I. F., Holo H Biochemical and genetic characterization of propionicin T1, a new bacteriocin from Propionibacterium thoenii. Appl. Environ. Microbiol. 66: Grinstead D.A., Barefoot S.F Jenseniin G, a heat stable bacteriocin produced by Propionibacterium jensenii P126. Appl. Environ. Microbiol. 1: Lyon W., Glatz B Partial purification and characterization of a bacteriocin produced by Propionibacterium thoenii. Appl. Environ. Microbiol. 3: Perkowski J Wyznaczanie odzysku toksyn fuzaryjnych oznaczanych różnymi metodami. Rocz. AR Pozn. Technol. Żyw. 46: Ratnam P., Barefoot S., Prince L., Bodine A., McCaskill L.H Partial purification and characterization of the bacteriocin produced by Propionibacterium jensenii B1264. Lait 79: Suomalainen T.H., Mäyrä-Makinen A.M Propionic acid bacteria as protective cultures in fermented milks and breads. Lait 79: Weinbrenner D.R., Barefoot S.F., Grinstead D.A Inhibition of yoghurt starter cultures by jenseniin G, a Propionibacterium bacteriocins. J. Dairy Sci. 80: DANIELA GWIAZDOWSKA, ROMUALD GWIAZDOWSKI, KATARZYNA CZACZYK THE INFLUENCE OF PROPIONIBACTERIUM METABOLITES ON THE GROWTH OF SOME PATHOGENIC FUNGI AND PRODUCTION OF MYCOTOXINS SUMMARY In the presented work the influence of extracellular metabolites of Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii and ssp. freudenreichii on the growth of some pathogenic fungi and production of mycotoxins by three species of Fusarium was investigated. The effect of supernatants obtained from propionibacteria cultures towards the chosen fungi was evaluated by the plating method. All examined pathogens were sensitive on the substances in supernatants, but this sensitivity depended on the fungal species as well as tested strain. The most inhibited were Sclerotinia sclerotiorum i Botrytis cinerea. In the second part of this work the influence of propionibacteria metabolites on the production of mycotoxins by fungi belonging to Fusarium genus in liquid cultures was estimated. It was found that the concentration of examined mycotoxins in cultures with addition of supernatants was lower than in control samples, but the observed differences were not always significant. Key words: Propionibacterium, pathogenic fungi, mycotoxins