Agata Czajgucka, Józefa Chrzanowska, Piotr Juszczyk, Marek Szołtysik, Maria Wojtatowicz

Transkrypt

1 Biotechnologia 2(1-2) 2003, AKTYWNOŚĆ PROTEOLITYCZNA SZCZEPÓW DROśDśY POCHODZĄCYCH Z SERÓW ROKPOL* Agata Czajgucka, Józefa Chrzanowska, Piotr Juszczyk, Marek Szołtysik, Maria Wojtatowicz Streszczenie. Przedmiotem badań było 7 szczepów droŝdŝy wyizolowanych z serów z przerostem pleśniowym Rokpol. NaleŜały one do takich gatunków, jak: Candida famata, C. sphaerica, C. intermedia, C. kefyr, Geotrichum penicillatum, Yarrowia lipolytica i Saccharomyces kluyveri. U wszystkich szczepów wykazano duŝe zróŝnicowanie w poziomie aktywności zewnątrz- i wewnątrzkomórkowych endopeptydaz. Enzymy te wykazywały teŝ róŝną dynamikę degradacji kazeiny. Najbardziej aktywne spośród nich były proteazy szczepu Y. lipolytica PII6a. NajwyŜszą aktywność pozakomórkowe proteazy wszystkich szczepów droŝdŝy wykazywały wobec kazeiny w ph , a wewnątrzkomórkowe w ph Ich aktywność ulegała hamowaniu pod wpływem PMSF i DFP. Natomiast optimum aktywności zewnątrzkomórkowych enzymów degradujących hemoglobinę przypadało w ph Słowa kluczowe: droŝdŝe, sery, aktywność proteolityczna, właściwości proteaz WSTĘP DroŜdŜe są waŝnym składnikiem mikroflory wielu typów serów, szczególnie miękkich i pleśniowych [Fleet 1987, Suzzi i in. 2001]. Stanowią one jednak bardzo zmienną grupę mikroorganizmów, które mogą wywierać tak pozytywny jak i negatywny wpływ na przebieg procesu dojrzewania serów [Fleet 1992]. W ostatnich latach podejmowane są szeroko zakrojone badania obejmujące charakterystykę metabolizmu i fizjologii droŝdŝy izolowanych z serów [Vivier 1994, Jakobsen i Narvhus 1996, Viljoen 1998]. Ich celem jest wyselekcjonowanie z tego środowiska szczepów o najbardziej przydatnych z technologicznego punktu widzenia cechach dla serowarstwa. Prowadzone są juŝ próby wykorzystania niektórych szczepów droŝdŝy jako ko-starterów w produkcji serowarskiej [Wyder i Puhan 1999a,b]. Pozwoli to na pełniejszą kontrolę tej mikroflory w serach, a tym samym moŝe zapewnić otrzymywanie produktów o wystandaryzowanych cechach jakościowych. Szczególnie przydatne, jako szczepionki, okazały się droŝdŝe charakteryzujące się wysoką aktywnością hydrolityczną, szczególnie proteolityczną [van Tempel i Jakobsen 1998]. Celem podjętych badań była ocena uzdolnień proteolitycznych wybranych w oparciu o wcześniej prze- * Praca została wykonana w ramach projektu badawczego Nr 5 PO6G finansowanego przez Komitet Badań Naukowych w latach

2 74 A. Czajgucka i in. prowadzone testy 7 spośród 113 szczepów droŝdŝy wyizolowanych z serów pleśniowych Rokpol [Czajgucka 2002, Juszczyk 2002]. METODYKA BADAŃ Przedmiotem badań było 7 szczepów droŝdŝy pochodzących z kolekcji Katedry Biotechnologii i Mikrobiologii śywności Akademii Rolniczej we Wrocławiu. Były to szczepy: Candida famata MI1a, Candida sphaerica FII7a, Geotrichum penicillatum EII6a, Yarrowia lipolytica PII6a, Candida kefyr PII1b, Saccharomyces kluyveri BII3a i Candida intermedia BI2a. Szczepy droŝdŝy przechowywano w temp. +4 ºC na skosach z podłoŝem YM, zawierającym w 1L: ekstrakt droŝdŝowy (3,0g), ekstrakt maltozowy (3,0g), baktopepton (5,0g), glukozę (10,0g) i agar (20,0g). Hodowle droŝdŝy i przygotowanie zewnątrz- i wewnątrzkomórkowych ekstraktów enzymów droŝdŝowych prowadzono według Gduli i in. [2002]. Oznaczanie aktywności proteolitycznej Aktywność proteolityczną określano wobec hemoglobiny i kazeiny jako substratów w ph odpowiednio 3.0 i 7.5 [Chrzanowska i Kołaczkowska 1998]. Wyznaczanie optimum ph i temperatury proteaz droŝdŝowych Optimum ph proteaz oznaczono w 0,2 M buforze fosforanowo-cytrynianowym wobec hemoglobiny i kazeiny jako substratów w zakresie ph od 3.0 do 8.0. Natomiast optimum temperatury oznaczono w zakresie temperatury: od 5 ºC do 60 ºC, co 5 ºC. Oznaczanie enzymów proteolitycznych droŝdŝy w elektroforezie natywnej w Ŝelu poliakrylamidowym [Leluk i in. 1985]. Elektroforetyczny rozdział białek prowadzono w 8% Ŝelu poliakrylamidowym w buforze TRIS-glicyna (ph 8.3). Po zakończonej elektroforezie Ŝel poliakrylamidowy z aktywnymi enzymami droŝdŝy nałoŝono na Ŝel agarozowy z wbudowaną edestyną i inkubowano w buforze o ph 7.5 dla proteaz zasadowych i ph 3.0 dla proteaz kwaśnych. Po transferze enzymów Ŝel agarozowy wybarwiano czernią amidową. W miejscach działania enzymu edestyna była trawiona, co powodowało powstawanie przejaśnień w Ŝelu. Hydroliza enzymatyczna kazeiny Hydrolizę kazeiny izoelektrycznej (1%) z udziałem proteaz droŝdŝowych prowadzono w temp. 30 ºC przez 48 h w 50 mm buforze boraks-hcl ph 6.5. Podczas inkubacji enzymu z substratem pobierano próby, w których oznaczano przyrost wolnych grup aminowych według zmodyfikowanej metody Kuchroo i in. [1983] oraz analizowano zmiany jakościowe metodą elektroforezy w Ŝelu poliakrylamidowym według Andrews [1983]. OMÓWIENIE I DYSKUSJA WYNIKÓW W tabeli 1 przedstawiono aktywność proteolityczną 7 szczepów droŝdŝy pochodzących z sera Rokpol, które wybrano w oparciu o wyniki badań skriningowych z kolekcji liczącej 113 szczepów, jako potencjalnych ko-starterów serowarskich [Wojtatowicz i in. Acta Sci. Pol.

3 Aktywność proteolityczna , Czajgucka 2002]. Szczepy te wykazywały istotne róŝnice w poziomie aktywności pozakomórkowych proteaz. Zdecydowanie najwyŝszą aktywność obserwowano u droŝdŝy Y. lipolytica PII6a. Ich kwaśne proteazy osiągały wartości aktywności średnio U x mg -1, natomiast kazeinolityczne enzymy działające w środowisku zasadowym przejawiały aktywność na poziomie 47.2 U x mg -1. U pozostałych szczepów droŝdŝy aktywność zewnątrzkomórkowych proteaz kwaśnych i zasadowych zawierała się w przedziale odpowiednio U x mg -1 i U x mg -1. Wyniki te są zgodne z wcześniejszymi obserwacjami innych autorów, którzy wykazywali duŝe zróŝnicowanie w poziomie pozakomórkowej aktywności proteolitycznej u szczepów droŝdŝy izolowanych z serów, szczególnie w obrębie gatunku C. sphaerica i C. kefyr [Choisy i in. 1987, Devoyod 1990, Welthagen i Viljoen 1998, Roostita i Fleet 1996]. Wielu autorów stwierdzało teŝ szczególnie wysokie, w porównaniu z innymi gatunkami, uzdolnienia hydrolityczne droŝdŝy Y. lipolytica, które zdolne są do biosyntezy pozakomórkowych proteinaz, tak zasadowych serynowych, jak i kwaśnych aspartylowych [Ogrydziak 1993, Sinigaglia i in. 1994, Glover i in. 1997, van Tempel i Jakobsen 1998, Suzzi i in. 2001]. Tabela 1. Zewnątrz- i wewnątrzkomórkowa aktywność proteolityczna szczepów droŝdŝy Table 1. Extracellular and intracellular proteolytic activity of selected yeast strains Szczepy droŝdŝy Yeast strain Aktywność [U x mg -1 ] Activity [U x mg -1 ] Zewnątrzkomórkowa Extracellular Wewnątrzkomórkowa Intracellular ph 7,5 ph 3,0 ph 7,5 C. famata MI1a 17,2 ± 1,8 11,6 ± 1,8 34,7 ± 3,2 C. sphaerica FII7a 17,9 ± 2,1 151,5 ± 4,2 27,3 ± 1,0 G. penicillatum EII6a 11,2 ± 0,8 15,8 ± 1,3 45,8 ± 0,5 C. kefyr PII1b 17,8 ± 2,0 11,2 ± 1,3 43,0 ± 3,1 Y. lipolytica PII6a 47,2 ± 3,6 456,5 ± 15,2 93,3 ± 5,2 C. intermedia BI2a 10,2 ± 1,4 10,8 ± 2,6 99,8 ± 6,2 S. kluyveri BII3a 11,1 ± 1,2 10,1 ± 0,7 46,0 ± 3,8 Aktywność wewnątrzkomórkowych proteaz degradujących kazeinę była mniej zróŝnicowana u badanych droŝdŝy, najwyŝsze jej wartości stwierdzono u szczepów: C. intermedia (99.8 U x mg -1 ) i Y. lipolytica (93.3 U x mg -1 ), a najmniejsze w granicach U x mg -1 u C. sphaerica i C. famata. W celu uwidocznienia aktywnych frakcji ekstrakty enzymów proteolitycznych badanych szczepów droŝdŝy poddano rozdziałowi elektroforetycznemu w Ŝelu poliakrylamidowym w warunkach natywnych, a następnie dokonano ich transferu na Ŝel agarozowy z wbudowaną edestyną. W oparciu o uzyskane zymogramy (rys. 1) moŝna stwierdzić u wszystkich 7 szczepów droŝdŝowych pojedyncze pasma proteaz, tak poza- jak i wewnątrzkomórkowych, zdolnych do degradacji białka roślinnego w środowisku kwaśnym i zasadowym. Jakkolwiek, w zaleŝności od szczepu, proteazy te przejawiały róŝnice w poziomie aktywności, co przejawiało się wielkością stref przejaśnień w Ŝelu agarozowym po strawieniu edestyny. Spośród pozakomórkowych enzymów proteolitycznych największą degradację edestyny prowadziły proteazy kwaśne Y. lipolytica Biotechnologia 2(1-2) 2003

4 A. Czajgucka i in. 76 PII6a oraz C. sphaerica FII7a, a takŝe proteazy działające w środowisku zasadowym pierwszego z tych szczepów. Enzymy wewnątrzkomórkowe wszystkich badanych szczepów droŝdŝy pozostawiały w Ŝelu większe obszary zdegradowanego białka niŝ pozakomórkowe proteazy, ale najbardziej aktywne spośród nich były protezy Y. lipolytica PII6a i C. intermedia BI2a. A./ B./ C./ Rys. 1. Zymogramy proteaz zewnątrzkomórkowych aktywnych w środowisku zasadowym A/ i kwaśnym B/ oraz wewnątrzkomórkowych (zasadowych) C/ szczepów droŝdŝy: 1/ C. famata MI1a, 2/ Y. lipolytica PII6a, 3/ C. sphaerica FII7a, 4/ C. kefyr PII1b, 5/ C. intermedia BI2a, 6/ G. penicillatum EII6a, 7/ S. kluyveri BII3a Fig. 1. Zymograms of extracellular proteases active at acidic A/ and alkaline ph B/ and intracellular proteases (active at alkaline ph) C/ of yeast strains: 1/ C. famata MI1a, 2/ Y. lipolytica PII6a, 3/ C. sphaerica FII7a, 4/ C. kefyr PII1b, 5/ C. intermedia BI2a, 6/ G. penicillatum EII6a, 7/ S. kluyveri BII3a Wewnątrzkomórkowe proteazy wszystkich szczepów droŝdŝy hamowane były całkowicie przez PMSF (tab. 2). Podobne działanie wywierał DFP, który obniŝał ich aktywność do 5 25%. Natomiast EDTA jak i amid kwasu jodooctowego nie miał istotnego wpływu na aktywność tych enzymów. Pozakomórkowe kazeinolityczne endopeptydazy droŝdŝy, podobnie jak enzymy wewnątrzkomórkowe, okazały się najbardziej wraŝliwe na działanie PMSF i DFP, ulegały teŝ znacznemu hamowaniu przez EDTA. Natomiast aktywność proteaz degradujących hemoglobinę w kwaśnym ph, syntetyzo- Acta Sci. Pol.

5 Aktywność proteolityczna wanych przez Y. lipolytica PII6a i C. sphaerica FII7a, ulegała całkowitemu hamowaniu w obecności pepstatyny (wyniki niepodawane). Tabela 2. Wpływ inhibitorów na aktywność wewnątrzkomórkowych proteaz droŝdŝowych Table 2. Effect of the inhibitors on the intracellular proteases of yeast Inhibitor Inhibitor C. famata MI1a C. intermedia BI2a Szczepy droŝdŝy [% aktywności] Yeast strains [% activity] Y. lipolytica C. kefyr S. kluyveri PII1b BII3a PII6a C. sphaerica FII7a G. penicillatum EII6a Kontrola Control Jodoacetic amid PMSF DFP BPTI EDTA PMSF fluorek fenylometylosulfonowy, DFP diizopropylofluorofosforan, BPTI zasadowy trzustkowy inhibitor trypsyny, EDTA kw. etylenodiaminotetraoctowy. Optymalne dla działania tak zewnątrzkomórkowych jak i wewnątrzkomórkowych kazeinolitycznych proteaz większości analizowanych szczepów droŝdŝy było ph w zakresie (rys. 2). Natomiast kwaśne pozakomórkowe proteinazy z droŝdŝy C. sphaerica FII7a i Y. lipolytica PII6a najwyŝszą aktywność wobec hemoglobiny przejawiały w ph 3.5, a enzymy pozostałych szczepów w ph 4.0. Optymalne dla działania wszystkich endopeptydaz droŝdŝowych były temperatury w przedziale C (wyniki niepodawane). Aktywność Activity [%] ph C.famata MI1a C.intermedia BI2a C.kefyr PII1b C.sphaerica FII7a Y.lipolytica PII6a G.penicillatum BI6a S.kluyveri BII3a Rys. 2. Optimum ph wewnątrzkomórkowych proteaz droŝdŝowych Fig. 2. Optimum ph of intracellular proteases of yeasts Biotechnologia 2(1-2) 2003

6 78 A. Czajgucka i in. Gripon i in. [1991], badając enzymy, tak zewnątrz-, jak i wewnątrzkomórkowe droŝdŝy z rodzaju Kluyveromyces, Debaryomyces, Saccharomyces oraz Geotrichum, pochodzących równieŝ z sera, stwierdził, Ŝe wykazywały one optimum aktywności kazeinolitycznej w ph 6.0. Według Ogrydziaka [1993] natomiast pozakomórkowe zasadowe proteazy droŝdŝy Y. lipolytica optymalnie działały w ph w temperaturze 40 C. Natomiast wewnątrzkomórkowe endopeptydazy syntetyzowane przez droŝdŝe z gatunku C. kefyr / K. marxianus, C. famata / D. hansenii oraz C. sphaerica / K. lactis najwyŝsze aktywności wobec kazeiny osiągały w zakresie ph od 5.0 do 7.0 [Choisy i in. 1987, Lenoir 1984]. A./ K h 48h B./ K h 48h Rys. 3. Rozdział elektroforetyczny kazeiny hydrolizowanej przez wewnątrzkomórkowe proteazy droŝdŝy A./ C. intermedia, B./ Y. lipolytica Fig. 3. Poliacrylamide gel electrophoresis of casein degraded by intracellular proteases of yeast strains A/C. intermediabi2a, B./ Y. lipolytica PII Acta Sci. Pol.

7 Aktywność proteolityczna Wewnątrzkomórkowe proteazy wszystkich badanych szczepów intensywniej hydrolizowały kazeinę niŝ enzymy pozakomórkowe, powodując w tym samym czasie kilku- lub nawet kilkunastokrotnie wyŝsze przyrosty wolnych grup aminowych (wyniki niepodawane). Najbardziej aktywne były endopeptydazy z droŝdŝy Y. lipolytica Pll6a i C. intermedia BI2a, co widoczne jest równieŝ w obrazach elektroforetycznych (rys. 3). Bardziej podatna na działanie tych enzymów okazała się frakcja β niŝα S1 -kazeiny. Po 180 min hydrolizy prowadzonej z udziałem enzymów Y. lipolytica Pll6a następował prawie całkowity zanik pierwszej z tych frakcji. Obserwacje te są zbieŝne z wynikami badań Guerzoni i in. [1993], które potwierdziły głębszą degradacjęβ- niŝα S1 -kazeiny pod wpływem zewnątrzkomórkowych proteaz pochodzenia droŝdŝowego. Wyniki te wskazują na róŝnice między proteazami droŝdŝowymi a enzymami syntetyzowanymi przez inne mikroorganizmy (np. grzyby pleśniowe), wykorzystywane w produkcji serowarskiej, a których aktywność proteolityczna skierowana jest głównie wobec frakcji α S1 -kazeiny [Chrzanowska i in. 1993]. WNIOSKI 1. Szczepy droŝdŝy, pochodzące z serów pleśniowych Rokpol, wykazują szczególnie duŝe zróŝnicowanie w poziomie aktywności pozakomórkowych enzymów proteolitycznych. 2. NajwyŜszą aktywność przejawiały proteazy tak zewnątrz- jak i wewnątrzkomórkowe droŝdŝy Y. lipolytica PII6a. 3. Kazeinolityczne proteazy droŝdŝowe, tak poza- jak i wewnątrzkomórkowe, najbardziej wraŝliwe były na inhibitory proteinaz serynowych: PMSF i DFP, natomiast kwaśne pozakomórkowe enzymy ulegały inaktywacji pod wływem pepstatyny. 4. Najkorzystniejsze warunki dla działania kazeinolitycznych proteaz droŝdŝowych to ph w zakresie , a dla kwaśnych pozakomórkowych w ph oraz temp C. PIŚMIENNICTWO Andrews A.T., Proteases in normal bovine milk and their action on caseins. J. Dairy Res. 50, Choisy C., Gueguen M., Lenoir J., Schmidt J. L., The ripening of cheese microbiological aspects, Cheese making: Science and Technology ed. A. Eck, Lavoisier, New York. Chrzanowska, J. and Kołaczkowska, M., Production of extracellular proteolytic enzymes by Beauveria bassiana, Acta Mycologica, 33, Chrzanowska, J., Kołaczkowska, M. and Polanowski, A., Production of exocellular proteolytic enzymes by various species of Penicillium, Enzyme Microb. Technol., 15, Czajgucka A., Charakterystyka uzdolnień hydrolitycznych szczepów droŝdŝy wydzielonych z serów pleśniowych. Praca doktorska, Akademia Rolnicza we Wrocławiu. Devoyod, J.J., Yeasts in cheese-making, In: Yeast technology, J.F.T.Spencer & D.M.Spencer (Eds.), Springer-Verlag. Fleet, G.H., Mian M.A., The occurence and growth of yeasts in dairy products, Int. J. Food Microbiol. 4, Fleet G.H., Spoilage Yeast s, Crit. Rev. in Biotechnol., 12, Biotechnologia 2(1-2) 2003

8 80 A. Czajgucka i in. Gdula A., Chrzanowska J., Szołtysik M., KieŜel X., Wojtatowicz M., Factors affecting hydrolytic enzymes production by Yarrowia lipolytica strains. Acta Sci. Pol. Biotechnologia. 1 2, Glover D.J., McEwen R.K., Thomas C.R., Young T.W., ph-regulated expression of the acid and alkaline extracellular proteases of Yarrowia lipolytica. Microbiology, 143, Gripon J.C., Monnet V., Lambert G., Desmazeaud M.J., Microbial enzymes in cheese ripening. Food enzymology in cheese ripening. Vol.1. Ed. Fox P.F.Elsevier Science Publishers.LTD. Guerzoni M.E., Lanciotti R., Marchetti, R., Survey of the physiological properties of the most frequent yeasts associated with commercial chilled foods, Int. J. Food Microbiol. 17, Jakobsen, M., Narvhus, J., Yeasts and their possible beneficial and negative effects on the quality of dairy products. Int. Dairy J., 6, Juszczyk P., Charakterystyka mikroflory droŝdŝowej serów z przerostem pleśni. Praca doktorska, Akademia Rolnicza we Wrocławiu. Kuchroo C.N., Rahilly J., Fox, P.F., Assessment of proteolysis in cheese by reaction with trinitrobenzene sulphonic acid. Irish J. Food Sci Technol. 7, Leluk J., Pham T.C., Kielczewa J., Zastosowanie edestyny do oznaczania aktywności proteolitycznej i inhibitorów proteaz. XXI Zjazd PTBioch., Kraków. Streszczenia Lenoir J., The surface flora and its role in the ripening of cheese. Int. Dairy Federation Bulletin. Brussels, Belgium, 171, Ogrydziak, D.M., Yeast extracellular protease. Crit. Rev. Biotechnol. 13, Roostita R., Fleet G.H., The occurence and growth of yeasts in Camembert and Blueveined cheese. Int. J. Food Microbiol. 28, Sinigaglia M., Lanciotti R., Guerzoni, M.E., Biochemical and physiological characteristics of Yarrowia lipolytica strains in relation to isolation source. Can. J. Microbiol. 40, Suzzi G., Lanorte M.T., Galgano F., Andrighetto C., Lombardi A., Lanciotti, R., Guerzoni, M.E., Proteolytic, lipolytic and molecular characterization of Yarrowia lipolytica isolated from cheese. Int. J. Food Microbiol. 69, Van den Tempel T., Jakobsen, M., Yeast associated with Danablu. Int. Dairy J. 8, Viljoen, B.C., The ecological diversity of yeasts in dairy products, In: FIL-IDF "Yeast in the dairy industry: positive and negative aspects", Jakobsen M., Narvhus J., Viljoen B.C., (Eds.). Copenagen, Denmark, 1996, Vivier D., Rivemale M., Reverbel J.P., Ratomahenina R., Galzy, P., Study of the growth of yeasts from feta cheese. Int. J. Food Microbiol. 22, Welthagen J.J., Viljoen B.C., Yeast profile in Gouda cheese during processing and ripening. Int. J. Food Microbiol. 41, Wojtatowicz M., Chrzanowska J., Juszczyk P., Skiba A., Gdula A., Identification and biochemical characteristics of yeast microflora of Rokpol cheese. Int. J. Food Microbiol. 69, Wyder M.T., Puhan, Z., 1999a. Role of selected yeasts in cheese ripening: an evaluation in aseptic cheese curd slurries, Int. Dairy J. 9, Wyder M.T., Bachmann H.P., Puhan Z., 1999b. Role of selected yeasts in cheese ripening: an evaluation in foil wrapped Raclette cheese. Lebensm.-Wiss. Technol. 32, Acta Sci. Pol.

9 Aktywność proteolityczna PROTEOLYTIC ACTIVITY OF YEAST STRAINS ORIGINATING FROM ROKPOL CHEESE Abstract. The proteolytic activity of 7 yeast strains belonging to species Candida famata, C. sphaerica, C. intermedia, C. kefyr, Geotrichum penicillatum, Yarrowia lipolytica i Saccharomyces kluyveri were determined. It was shown big variations in the level of activity especially of extracellular proteases of yeasts. The most active were extra- and intracellular proteases of strain Y. lipolytica PII6a. Caseinolytic proteases of all strains were inhibited by PMSF and DFP. Majority of them exhibited optimum at ph Extracellular proteases of yeasts active against hemoglobin had optimum at ph Key words: yeast, cheese, proteolytic activity, protease properties Agata Czajgucka, Józefa Chrzanowska, Marek Szołtysik, Katedra Technologii Surowców Zwierzęcych; Piotr Juszczyk, Maria Wojtatowicz, Katedra Biotechnologii i Mikrobiologii śywności, Akademia Rolnicza we Wrocławiu, ul. C.K. Norwida 25, Wrocław Biotechnologia 2(1-2) 2003