Opracowanie: Anna Kempińska-Żak Pracownia Biologiczna Centralne Laboratorium MPWiK S.A. w Krakowie. Kraków, r

Transkrypt

1 Porównanie i ocena właściwości fizycznych, mikrobiologicznych i jałowości pożywek sterylizowanych mikrofalowym enbiojet i autoklawie parowym Opracowanie: Anna Kempińska-Żak Pracownia Biologiczna Centralne Laboratorium MPWiK S.A. w Krakowie Kraków, 1.09.r

2 Spis treści 1 Wstęp 3 Cel i zakres badań Materiał i metodyka Opis materiału Pożywki użyte do badań Szczepy testowe użyte do badań Opis zastosowanych metod Kontrola właściwości fizycznych pożywek Sprawdzanie jałowości pożywek Kontrola właściwości mikrobiologicznych pożywek Wyniki badań właściwości fizycznych i jałowości pożywek Wyniki badań właściwości mikrobiologicznych pożywek Podsumowanie i wnioski. 94

3 1. Wstęp Na zlecenie Firmy Enbio Technology sp. z o.o. Centralne Laboratorium MPWiK S.A. w Krakowie przeprowadziło porównanie i ocenę właściwości fizycznych, mikrobiologicznych i jałowości pożywek sterylizowanych mikrofalowym enbiojet Firmy Enbio Technology i autoklawie parowym Varioklav używanym w Pracowni Biologicznej. Firma Enbio Technology dostarczyła i zainstalowała autoklaw do Pracowni Biologicznej Centralnego Laboratorium, gdzie zostały wykonane wszystkie czynności związane ze sprawdzeniem autoklawu mikrofalowego enbiojet. Centralne Laboratorium MPWiK S.A. w Krakowie pracuje zgodnie z wymaganiami wdrożonych norm: PN-EN ISO 9001:008, PN-EN ISO 14001:004 oraz PN-EN ISO/IEC 1705:005. W dniu 1 maja 004 r. niezależna jednostka certyfikująca - firma BVQI przeprowadziła audyt certyfikujący. W jego wyniku Krakowskie Wodociągi uzyskały pozytywną rekomendację dla otrzymania certyfikatu, a także bardzo wysoką ocenę sposobu opracowania i wdrożenia Systemu Zarządzania Jakością. Przyznany certyfikat o numerze obejmował obszar związany z ujmowaniem, uzdatnianiem, dystrybucją i sprzedażą wody. Od sierpnia 009 roku rozpoczęto wdrażanie systemu zarządzania środowiskowego wg normy ISO Wymagania normy ISO 9001 i ISO połączono w jeden Zintegrowany System Zarządzania (ZSZ). Audyt certyfikujący odbył się w dniach 19-1 maja 010 r. Pozytywna ocena ZSZ pozwoliła na otrzymanie certyfikatu nr PL /P wydanego przez BVQI Polska Sp. z o.o. Również w 004 roku Centralne Laboratorium rozpoczęło działania zmierzające do wdrożenia systemu zarządzania spełniającego wymagania normy PN-EN ISO/IEC 1705:001, następnie PN-EN ISO/IEC 1705:005 oraz dokumentów PCA dotyczących laboratoriów badawczych. W czerwcu 006 roku odbył się audyt, a w styczniu 007 roku Polskie Centrum Akredytacji przyznało Centralnemu Laboratorium Certyfikat Akredytacji Laboratorium Badawczego Nr AB 776. Certyfikat jest formalnym uznaniem kompetencji technicznych laboratorium do wykonywania określonych badań. Pracownia Biologiczna wdrożyła i utrzymuje wymagania obowiązującego dokumentu EA-04/10 Akredytacja laboratoriów mikrobiologicznych. Odpowiednie warunki lokalowe, kontrolowane warunki środowiskowe, nadzór nad wyposażeniem z zachowaniem spójności pomiarowej, kontrola jakości pożywek przy użyciu 3

4 szczepów wzorcowych z uznanej światowej kolekcji ATTC, dają maksimum pewności, że wynik przedstawiany klientowi jest wiarygodny. Badania mikrobiologiczne w Pracowni Biologicznej są wykonywane i nadzorowane przez personel posiadający wyższe wykształcenie w dziedzinie mikrobiologii lub równoważne. Biegłość personelu zgodnie z wymaganiami DA-5 wyd.5 z dnia Polityka dotycząca uczestnictwa w badaniach biegłości jest monitorowana poprzez systematyczny udział w badaniach biegłości organizowanych przez LGC Standards. Pracownia otrzymuje w badaniach biegłości zadawalające wyniki. Podczas audytu PCA, który odbył się roku, audytor techniczny dr Halina Wróblewska ( Kierownik Regionalnego Laboratorium Badań Żywności Genetycznie Zmodyfikowanej WSSE w Rzeszowie) jako mocną stronę pracowni wymieniła kompetentny i zaangażowany personel oraz szkolenia ukierunkowane na bieżące i przewidywane działania. Działania audytowe obejmowały także ocenę dokumentacji i czynności związanych z kontrolą jakości pożywek do badań mikrobiologicznych. Pracownia Biologiczna również w tym zakresie została oceniona wysoko.. Cel i zakres badań Wdrożenie systemu zarządzania jakością w laboratorium mikrobiologicznym wiąże się z koniecznością spełnienia wymagań normy ISO/IEC 1705 i dokumentów Polskiego Centrum Akredytacji (PCA). Jednym z takich dokumentów jest dokument EA-04/10: Akredytacja laboratoriów mikrobiologicznych, który zaleca przeprowadzać kontrolę pożywek zgodnie z następującymi dokumentami: PKN-CEN ISO/TS : dotyczące przygotowania i wytwarzania pożywek. Część 1: Ogólne wytyczne dotyczące kontroli jakości pożywek przygotowywanych w laboratorium. ISO/TS : Microbiology of food and animal feeding stuffs. Guidelines on preparation and production of culture media. Part Practical guidelines on performance testing of culture media. Celem badań była: ocena pożywek wykonanych i sterylizowanych mikrofalowym enbiojet, w Pracowni Biologicznej Centralnego Laboratorium zgodnie z wymaganiami w/w dokumentów. 4

5 Każda pożywka została sprawdzona siedmiokrotnie, równolegle z pożywką sporządzoną i sterylizowaną parowym. Zakres prac przeprowadzonych w ramach realizacji zlecenia obejmował: przygotowanie i sterylizację pożywek mikrofalowym enbiojet; przygotowanie i sterylizację pożywek parowym; kontrolę właściwości fizycznych pożywek; sprawdzenie jałowości pożywek; kontrolę właściwości mikrobiologicznych (żyzność i selektywność) pożywek; 3. Materiał i metodyka 3.1. Opis materiału Pożywki użyte do badań Do kontroli wybrano następujące agarowe i płynne. L.p Pożywki agarowe Producent 1. Agar z laktozą, TTC i tergitolem 7 Merck. Agar z ekstraktem drożdżowym Merck 3. Agar CASO tryptonowo sojowy (TSA) Merck 4. Agar z kanamycyną, eskuliną i azydkiem Merck 5. Agar CN dla Pseudomonas BTL 6. Agar Chapmana z mannitolem, solą i czerwienią fenolową Merck 7. Agar GVPC Oxoid 8. Agar BCYE z cysteiną Oxoid 9. Agar BCYE bez cysteiny Oxoid Pożywki płynne 10. Woda peptonowa (zbuforowana) Merck 11. Bulion z acetamidem BTL 1. Bulion RVS wg Rappaport i Vassiliadis Merck 13. DEV Bulion tryptofanowy Merck Pożywki te (z wyjątkiem agaru Chapmana, wody peptonowej (zbuforowanej) i bulionu RVS) są używane do badań wymaganych przez aktualnie obowiązujące Rozporządzenie Ministra Zdrowia z 9 marca 007 r. (Dz. U. Nr 61, Poz. 417) w sprawie jakości wody przeznaczonej do spożycia przez ludzi (z późniejszymi zmianami z 0 kwietnia 010 r., Dz. U. Nr 7, Poz. 466). 5

6 W załączniku nr 9 do Rozporządzenia przedstawiono zalecane normy metodyczne dla wymaganych parametrów mikrobiologicznych (Tab. 1). Tab.1. Parametry mikrobiologiczne, dla których określono metody badań Lp. Parametr Zalecane normy 1 Ogólna liczba mikroorganizmów w 36ºC i w ºC PN-EN ISO 6 Bakterie grupy coli, Escherichia coli PN-EN ISO Enterokoki PN-EN ISO Clostridium perfringens (łącznie ze sporami) - 5 Pseudomonas aeruginosa PN-EN Legionella sp. PN-ISO W każdej normie metodycznej przywołane są konieczne do wykonania badania (Tab.) Tab.. Pożywki, konieczne do zbadania parametrów mikrobiologicznych zgodnie z normami zalecanymi przez Rozporządzenie Ministra Zdrowia z 9 marca 007 r. (z późniejszymi zmianami). Parametr Zalecana norma Wymagana pożywka* Ogólna liczba mikroorganizmów w 36ºC i w ºC Bakterie grupy coli, Escherichia coli PN-EN ISO 6 PN-EN ISO Enterokoki (paciorkowce kałowe) PN-EN ISO Clostridium perfringens (łącznie ze sporami) Pseudomonas aeruginosa** Agar z ekstraktem drożdżowym Agar z laktozą, TTC i tergitolem 7, Agar CASO tryptonowo sojowy (TSA), DEV Bulion tryptofanowy Agar z kanamycyną, eskuliną i azydkiem - - PN-EN 1780 PN-EN ISO 1666 Agar CN dla Pseudomonas, Bulion z acetamidem Legionella sp. PN-ISO Agar GVPC, Agar BCYE z cysteiną, Agar BCYE bez cysteiny * - w kolumnie wymieniono tylko te, które wymagają sterylizacji; ** - Norma PN-EN ISO 1666 ukazała się później niż w/w Rozporządzenie, ale zarówno norma 1780 jak i 1666 przywołują takie same ; Normy: PN-EN ISO i PN-EN ISO cytowane są również w Rozporządzeniu Ministra Zdrowia z 8 kwietnia 011 r. (Dz. U. Nr 86, Poz. 478) w sprawie prowadzenia nadzoru nad jakością wody w kąpielisku i miejscu i miejscu wykorzystywanym do kąpieli. Pożywki związane z tymi normami (Tab.) są niezbędne do wykonania badań wymaganych przez w/w Rozporządzenie. Agar Chapmana służy do wykrywania ogólnej liczby gronkowców i gronkowców koagulazo-dodatnich w próbkach wody m. in. z basenów kąpielowych. 6

7 Od 00 roku do chwili obecnej brak przepisów prawnych, dotyczących stałego nadzoru nad jakością wody w basenach kąpielowych. Ostatnim aktem prawnym w tym zakresie było Rozporządzenie Ministra Zdrowia z 4 września 000 roku w sprawie warunków, jakim powinna odpowiadać woda do picia i na potrzeby gospodarcze, woda w kąpieliskach oraz zasad sprawowania kontroli jakości wody przez organy Inspekcji Sanitarnej (Dz. U. nr 8 poz. 937). W rozporządzeniu tym nie przedstawiono jednak normy metodycznej według której należy prowadzić badania. Metodyka PZH ZHK:007 Badania w kierunku wykrywania i izolacji gronkowców koagulazo-dodatnich z środowiska wodnego oraz norma PN-Z : Butelkowane naturalne wody mineralne i lecznicze. Wymagania jakościowe i badania dotyczące butelkowanych wód leczniczych. Załącznik A: Metoda oznaczania gronkowców koagulazo-dodatnich zalecają aby próbki wody sączyć przez sterylny filtr membranowy, a następnie inkubować na podłożu Chapmana. Wyrosłe kolonie poddać badaniom potwierdzającym. Pożywki: Woda peptonowa (zbuforowana) i Bulion RVS wg Rappaport- Vassiliadis używane są do badań w kierunku obecności bakterii Salmonella, wymaganych przez aktualnie obowiązujące Rozporządzenie Ministra Środowiska z dnia 7 listopada 00 r. (Dz. U. Nr 04, Poz. 178) w sprawie wymagań jakim powinny odpowiadać wody powierzchniowe wykorzystywane do zaopatrzenia ludności w wodę przeznaczoną do spożycia, Rozporządzenie Ministra Środowiska z dnia 4 lipca 006 r. (Dz. U. Nr 137, Poz. 984) w sprawie warunków jakie należy spełnić przy wprowadzaniu ścieków do wód lub ziemi oraz w sprawie substancji szczególnie szkodliwych dla środowiska wodnego oraz Rozporządzenie Ministra Środowiska z dnia 13 lipca 010 r. (Dz. U. nr 137, poz. 94). w sprawie komunalnych osadów ściekowych. W Rozporządzeniach tych nie przedstawiono norm metodycznych (z wyjątkiem Rozporządzenia Ministra Środowiska z dnia 4 lipca 006r.) natomiast podano wymaganie, iż hodowle należy prowadzić na pożywkach namnażających i różnicująco-selektywnych, a wyniki potwierdzić badaniami biochemicznymi. W metodyce wykrywania i izolacji Salmonella z wód powierzchniowych i ścieków, wydanej przez Państwowy Zakład Higieny autorki precyzują, iż preinkubację prowadzi się w wodzie peptonowej (zbuforowanej), a jako podłoża różnicującoselektywnego należy użyć bulion RVS wg Rappaport- Vassiliadis. W Rozporządzeniu Ministra Środowiska z dnia 4 lipca 006 r. cytuje się m. in. normę PN-EN ISO 6579:003, która również zaleca prowadzić przednamnażanie w wodzie peptonowej (zbuforowanej), a selektywne namnażanie w bulionie RVS wg Rappaport- Vassiliadis. 7

8 3.1.. Szczepy testowe użyte do badań W celu zapewnienia spójności pomiarowej Pracownia Biologiczna Centralnego Laboratorium stosuje szczepy pochodzące z uznanej kolekcji kultur (American Type Culture Collection). Szczepy testowe to drobnoustroje ogólnie stosowane do kontroli przydatności pożywek. W przypadku pożywek różnicująco-selektywnych, sprawdzanie przeprowadzono z użyciem szczepów dodatnich i/lub ujemnych. W przypadku pożywek nieselektywnych, takich jak agar z ekstraktem drożdżowym, agar CASO tryptonowo sojowy (TSA) i woda peptonowa (zbuforowana) kontrolę przeprowadzono z użyciem odpowiednich szczepów dodatnich. Szczep dodatni to szczep testowy, dobrany tak, aby wykazywał silną reakcję wzrostową lub biochemiczną na testowanej pożywce. Szczep ujemny to szczep, którego wzrost jest całkowicie lub częściowo zahamowany. Szczepy testowe dobrano głównie w oparciu o certyfikaty jakości pożywek, dostarczanych przez (Tab.3). Tab.3. Szczepy kontrolne użyte do badań właściwości mikrobiologicznych wybranych pożywek. L.p. pożywka szczep dodatni nr szczep ujemny nr 1. Agar z laktozą, TTC i tergitolem 7 Escherichia coli Bacillus cereus Agar z ekstraktem drożdżowym Escherichia coli Pseudomonas fluorescens Agar CASO tryptonowo sojowy (TSA) Staphylococcus aureus Agar z kanamycyną, eskuliną i azydkiem Enterococcus faecalis Escherichia coli 5. Agar CN dla Pseudomonas 6. Agar Chapmana z mannitolem, solą i czerwienią fenolową 7. Agar GVPC 8. Agar BCYE z cysteiną Pseudomonas aeruginosa 7853 Staphylococcus aureus 593 Staphylococcus epidermidis 18 Legionella pneumophila sg Legionella pneumophila sg Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli - 8

9 9. Agar BCYE bez cysteiny Woda peptonowa (zbuforowana) Salmonella typhimurium 1408 Legionella pneumophila sg Bulion z acetamidem 1. Bulion RVS wg Rappaport i Vassiliadis 13. DEV Bulion tryptofanowy Pseudomonas aeruginosa 7853 Salmonella typhimurium 1408 Escherichia coli Salmonella typhimurium Escherichia coli Opis zastosowanych metod Wszystkie użyte do badań zostały przygotowane w pożywkarni w Pracowni Biologicznej. Do przygotowania pożywek Pracownia wykorzystuje gotowe, suche podłoża w formie granulatu lub proszku. Etapy przygotowania : Uwadnianie pożywek Pożywki są uwadniane zgodnie z instrukcją. Do przygotowania pożywek stosuje się wodę dejonizowaną, o następujących parametrach: Odczyn ph 5,5-7,5; Przewodnictwo właściwe < 5 µs/cm; Liczba bakterii heterotroficznych metodą płytkową <1000 jtk/1ml; Uwodnioną pożywkę rozdzielano na dwie równe części. Jedną część sterylizowano parowym, a drugą mikrofalowym enbiojet. Sterylizacja pożywek parowym i mikrofalowym enbiojet W autoklawie parowym sterylizowane są zawsze zgodnie z zaleceniami. Warunki sterylizacji: temperatura, czas i ciśnienie monitorowane są przez system LimaTherm wraz z aplikacją komputerową LoggySoft. Do kontroli procesu sterylizacji każdorazowo stosuje się test TST i taśmę kontrolną TAS. Sterylizację mikrofalowym enbiojet przeprowadzono zgodnie z wszystkimi zaleceniami autoklawu. Pomiar wartości ph Wartość ph przygotowywanych pożywek sprawdzane było każdorazowo, po sterylizacji. W przypadku pożywek stałych ph kontrolowane jest po zestaleniu się przy użyciu elektrody na wkłucie. 9

10 Rozlane na płytki lub do probówek sterylne, które nie użyto bezpośrednio po przygotowaniu przechowywane były w chłodziarkach, w których temperatura jest monitorowana przy pomocy Systemu Bezprzewodowego Monitoringu i Rejestracji Temperatury Q-MSystem. Każda z badanych pożywek została przygotowana według w/w schematu w siedmiu powtórzeniach (siedem partii). Na etapie przygotowywania pożywek brały udział dwie osoby: specjalista ds. analiz i biolog. Każdą partię danej, sterylizowaną parowym i mikrofalowym enbiojet zbadano równolegle pod kątem jej właściwości fizycznych, jałowości i właściwości mikrobiologicznych Kontrola właściwości fizycznych pożywek oceniane są głównie poprzez wizualną, makroskopową ocenę wyglądu. Kontrola obejmowała ocenę: wyglądu zewnętrznego, tj. zabarwienia, klarowności, obecności artefaktów; konsystencji i stabilności żelu; grubości warstwy na płytce, objętości rozlanej ; wartości ph; Ocenę prowadzono w oparciu o wytyczne Sprawdzanie jałowości pożywek Badanie przeprowadza się inkubując probówki lub płytki Petriego z pożywką w warunkach stosowanych rutynowo dla określonej i ocenia (Tab. 4). W przypadku zaobserwowania jakiegokolwiek wzrostu mikroorganizmów całą partię należy usunąć. Tab. 4 Warunki inkubacji pożywek, w celu sprawdzenia ich jałowości i właściwości mikrobiologicznych. pożywka Agar z laktozą, TTC i tergitolem 7 szczepy bakteryjne Escherichia coli Bacillus cereus temperatura inkubacji czas inkubacji 36± C 1±3h Agar z ekstraktem drożdżowym Agar CASO tryptonowo sojowy (TSA) Escherichia coli Pseudomonas fluorescens 36± C ± C 44±4 h 68±4 h Staphylococcus aureus 36± C 1±3h 10

11 Agar z kanamycyną, eskuliną i azydkiem Agar CN dla Pseudomonas Agar Chapmana z mannitolem, solą i czerwienią fenolową Agar GVPC Agar BCYE z cysteiną Enterococcus faecalis Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Escherichia coli Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Escherichia coli Legionella pneumophila sg 1 Escherichia coli Legionella pneumophila sg 1 44±0,5 C 1±3h 36± C 44±4h 36± C 44±4h 36± C 10 dni 36± C dni Agar BCYE bez cysteiny Legionella pneumophila sg 1 36± C dni Woda peptonowa (zbuforowana) Salmonella typhimurium 36± C 18±h Bulion z acetamidem Pseudomonas aeruginosa 36± C ±h Bulion RVS wg Rappaport i Vassiliadis DEV Bulion tryptofanowy Salmonella typhimurium Escherichia coli Escherichia coli Salmonella typhimurium 41,5±1 C 4±3h 44±0,5 C 1±3h Kontrola właściwości mikrobiologicznych pożywek Jest to ocena z użyciem szczepów testowych. Do oceny mikrobiologicznej pożywek zastosowano metody: ilościową - w przypadku oceny pożywek stałych; jakościową - do oceny stałej BCYE z cysteiną i BCYE bez cysteiny; jakościową (wizualna ocena intensywności wzrostu) - w przypadku oceny płynnej; półilościową do oceny Bulion RVS wg Rappaport- Vassiliadis; Metoda ilościowa Ilościowa ocena nieselektywnej polega na obliczeniu współczynnika żyzności P R. Ilościowa ocena selektywnej polega na obliczeniu współczynnika żyzności P R i współczynnika selektywności S F 11

12 tryb postępowania: w jałowych probówkach sporządzono zawiesinę wyjściową kultur roboczych szczepów dodatnich i ujemnych (lub tylko dodatnich), właściwych dla danej (Tab. 4), posługując się densytometrem; przygotowano 10-krotne rozcieńczenia zawiesiny szczepów dodatnich i ujemnych (lub tylko dodatnich). Do rozcieńczeń użyto płynu Ringera 1:4, w przypadku L. pneumophila użyto płynu Ringera 1:40; z dwóch lub trzech ostatnich rozcieńczeń naniesiono po 100 μl zawiesiny szczepu dodatniego na dwie płytki badanej i dwie płytki referencyjnej (dla każdego rozcieńczenia) i rozprowadzono jałową głaszczką po powierzchni do całkowitego wchłonięcia zawiesiny; z dwóch lub trzech ostatnich rozcieńczeń naniesiono po 100 μl zawiesiny szczepu ujemnego na dwie płytki badanej i dwie płytki referencyjnej (dla każdego rozcieńczenia) i rozprowadzono jałową głaszczką po powierzchni do całkowitego wchłonięcia zawiesiny; inkubację przeprowadzono w warunkach odpowiednich dla badanej (Tab.4); oceniono wzrost na pożywce pod względem wyglądu, morfologii kolonii i oczekiwanej ilości; policzono wyrosłe kolonie i obliczono współczynnik żyzności (P R ) dla szczepu dodatniego: P R =Ns/No gdzie, Ns liczba kolonii na pożywce testowanej No liczba kolonii na pożywce referencyjnej Kryterium oceny: P R dla nieselektywnej powinien wynosić co najmniej 0,7 P R dla selektywnej powinien wynosić co najmniej 0,1 obliczyć współczynnik selektywności (S F ) dla szczepu ujemnego: S F =Do-Ds gdzie, Do najwyższe rozcieńczenie wykazujące wzrost przynajmniej 10 kolonii na pożywce referencyjnej, Ds - najwyższe rozcieńczenie wykazujące wzrost przynajmniej 10 kolonii na pożywce badanej. Wartość SF jest wyrażana w log10. 1

13 Kryterium oceny: S F dla szczepu ujemnego na pożywce selektywnej powinna wynosić co najmniej. Metoda jakościowa dla oceny BCYE z cysteiną i BCYE bez cysteiny tryb postępowania: w jałowych probówkach sporządzono zawiesinę wyjściową kultur roboczych szczepu dodatniego i ujemnego (Tab. 4), posługując się densytometrem; przygotowano 10-krotne rozcieńczenia zawiesiny szczepu dodatniego i ujemnego. Do rozcieńczeń użyto płynu Ringera 1:40; W przypadku szczepu dodatniego hodowlę roboczą rozcieńczono tak aby uzyskać od 10 3 do 10 4 jtk w 1 µl. W przypadku szczepu ujemnego hodowlę roboczą rozcieńczono tak aby uzyskać od 10 4 do 10 6 jtk w 1 µl; z w/w rozcieńczeń pobrano ezą o pojemności 1 µl materiał bakteryjny i wykonano posiew rysowy (posiew wykonuje się w postaci prostych linii); inkubację przeprowadzono w warunkach odpowiednich dla badanej (Tab. 4); po inkubacji oceniono wygląd wyrosłych kolonii i intensywność wzrostu. Ocenę przeprowadzono z zastosowaniem skali punktowej jako: 0 brak wzrostu 1 wzrost słaby; 1-10 jtk wzrost dobry; jtk Kryterium oceny: Żyzność badanej jest właściwa jeżeli liczba punktów wynosi i wzrost szczepu dodatniego jest typowy. Selektywność badanej jest właściwa jeżeli wzrost szczepu ujemnego jest całkowicie zahamowany (0 pkt.). Metoda jakościowa dla pożywek płynnych tryb postępowania: w jałowych probówkach sporządzono zawiesinę wyjściową kultur roboczych szczepów dodatnich i ujemnych (lub tylko dodatnich), właściwych dla danej (Tab. 4), posługując się densytometrem; przygotowano 10-krotne rozcieńczenia zawiesiny szczepów dodatnich i ujemnych (lub tylko dodatnich). Do rozcieńczeń użyto płynu Ringera 1:4; 13

14 w przypadku szczepu dodatniego hodowlę roboczą rozcieńczono tak aby uzyskać od 10 do 100 jtk w 1 µl. W przypadku szczepu ujemnego hodowlę roboczą rozcieńczono tak aby uzyskać od 10 4 do 10 6 jtk w 1 µl; z płynnej kultury roboczej szczepu dodatniego pobrano materiał ezą o pojemności 1 µl i przeniesiono do jednej probówki z badaną pożywką; z płynnej kultury roboczej szczepu ujemnego pobrano materiał ezą o pojemności 1 µl i przeniesiono do drugiej probówki z badaną pożywką; inkubację przeprowadzono w warunkach odpowiednich dla badanej ; ocenę przeprowadzono w sposób wizualny, z zastosowaniem skali punktowej na podstawie zmętnienia: 0 brak zmętnienia 1 zmętnienie nieznaczne zmętnienie średnie lub znaczne Kryterium oceny: Żyzność badanej płynnej jest właściwa jeżeli zmętnienie wynosi pkt. Selektywność badanej płynnej jest wystarczająca jeżeli wzrost szczepu ujemnego jest całkowicie lub częściowo zahamowany (0-1 pkt.) oceniono również wystąpienie odpowiednich reakcji biochemicznych; Metoda półilościowa do oceny Bulion RVS wg Rappaport- Vassiliadis, tryb postępowania: w jałowych probówkach sporządzono zawiesinę wyjściową kultur roboczych szczepu dodatniego i ujemnego (Tab. 4), posługując się densytometrem; przygotowano 10-krotne rozcieńczenia zawiesiny szczepu dodatniego i ujemnego. Do rozcieńczeń użyto płynu Ringera 1:4; w przypadku szczepu dodatniego hodowlę roboczą rozcieńczono tak aby uzyskać od jtk. W przypadku szczepu ujemnego hodowlę roboczą rozcieńczono tak aby uzyskać >1000 jtk; zaszczepiono jedną probówkę z badaną pożywką mieszaną kulturą złożoną z szczepu dodatniego i ujemnego, pobraną za pomocą ezy o pojemności 1 µl, delikatnie wymieszano; zaszczepiono drugą probówkę z badaną pożywką kulturą szczepu ujemnego, pobraną za pomocą ezy o pojemności 1 µl, delikatnie wymieszano; inkubowano w warunkach odpowiednich dla RVS (Tab.4); 14

15 pobrano jedno oczko ezy 10 µl materiału z hodowli mieszanej i posiano na pożywkę agarową selektywną XLD; pobrano jedno oczko ezy 10 µl materiału z hodowli szczepu ujemnego i posiano na agar nieselektywny TSA; obie płytki inkubowano w temperaturze 36 ± C przez 1 ± 3h; Interpretacja wyników Żyzność badanej RVS jest odpowiednia jeżeli na agarze selektywnym wyrośnie co najmniej 10 jtk szczepu dodatniego. Selektywność badanej jest odpowiednia jeżeli na agarze nieselektywnym szczep ujemny nie wykaże wzrostu. Do oceny wszystkich pożywek używano 4 godzinnych kultur roboczych szczepów ożywianych na agarze TSA lub w przypadku L. pneumophila 48 godzinnej kultury ożywianej na agarze BCYE. Na etapie kontroli właściwości fizycznych i mikrobiologicznych, jałowości pożywek i dokumentacji fotograficznej brały udział cztery osoby: specjalista ds. analiz i trzech biologów. 4. Wyniki badań właściwości fizycznych i jałowości pożywek Pożywka: Agar z laktozą, TTC i tergitolem 7 Producent: Merck Seria: VM Partia: 1 Data przygotowania : wartość ph 7, ± 0, 7,09 7,01 zielona jasnozielona jasnozielona - prawidłowa Prawidłowa obecność artefaktów - brak Brak - właściwa Właściwa Partia: Data przygotowania :

16 wartość ph 7, ± 0, 7,13 7,8 zielona - jasnozielona prawidłowa ciemnozielona Prawidłowa obecność artefaktów - brak Brak - właściwa Właściwa Jałowość - pożywka sterylna, pożywka sterylna, Partia: 3 Data przygotowania : wartość ph 7, ± 0, 7,06 7,1 zielona jasnozielona ciemnozielona - prawidłowa Prawidłowa obecność artefaktów - brak Brak - właściwa Właściwa Jałowość - pożywka sterylna, pożywka sterylna, Partia: 4 Data przygotowania : wartość ph 7, ± 0, 7,00 7,9 zielona jasnozielona ciemnozielona - prawidłowa Prawidłowa obecność artefaktów - brak Brak - właściwa Właściwa Partia: 5 Data przygotowania : wartość ph 7, ± 0, 7,10 7,4 zielona jasnozielona ciemnozielona - prawidłowa Prawidłowa obecność artefaktów - brak Brak - właściwa Właściwa Jałowość - pożywka sterylna, pożywka sterylna, Partia: 6 16

17 Data przygotowania : wartość ph 7, ± 0, 7,10 7,30 zielona jasnozielona ciemnozielona - prawidłowa Prawidłowa obecność artefaktów - brak Brak - właściwa Właściwa Jałowość - pożywka sterylna, pożywka sterylna, Partia: 7 Data przygotowania :.07. wartość ph 7, ± 0, 7,07 7,38 zielona jasnozielona ciemnozielona - prawidłowa Prawidłowa obecność artefaktów - brak Brak - właściwa Właściwa Jałowość - pożywka sterylna, pożywka sterylna, 17

18 Fot. 1. Agar z laktozą, TTC i tergitolem 7 ocena właściwości fizycznych po sterylizacji parowym i mikrofalowym; Fot.. Agar z laktozą, TTC i tergitolem 7 ocena jałowości po inkubacji w temp. 36 ± C przez 1 ± 3h; 18

19 Pożywka: Agar z ekstraktem drożdżowym Producent: Merck Seria: VM Partia: 1 Data przygotowania : wartość ph 7, ± 0, 7,0 7,03 klarowna z lekko żółtym zabarwieniem klarowna, jasnożółta klarowna, jasnożółta - prawidłowa Prawidłowa obecność artefaktów - brak Brak - właściwa Właściwa Partia: Data przygotowania : wartość ph 7, ± 0, 7,03 7,03 klarowna z lekko żółtym zabarwieniem klarowna, jasnożółta klarowna, jasnożółta - prawidłowa Prawidłowa obecność artefaktów - brak Brak - właściwa Właściwa Partia: 3 Data przygotowania : wartość ph 7, ± 0, 7,10 7,09 klarowna z lekko żółtym zabarwieniem klarowna, jasnożółta klarowna, jasnożółta obecność artefaktów - Brak brak Partia: 4 Data przygotowania : wartość ph 7, ± 0, 7,10 7,1 klarowna z lekko żółtym zabarwieniem klarowna, jasnożółta klarowna, jasnożółta 19

20 obecność artefaktów - Brak brak Partia: 5 Data przygotowania : Pożywka sterylizowana wartość ph 7, ± 0, 7,09 7,14 klarowna z lekko żółtym zabarwieniem klarowna, jasnożółta klarowna, jasnożółta obecność artefaktów - Brak brak Partia: 6 Data przygotowania : mikrofalowym ENBIOJET wartość ph 7, ± 0, 7,08 7,11 klarowna z lekko żółtym zabarwieniem klarowna, jasnożółta klarowna, jasnożółta, Partia: 7 Data przygotowania : mikrofalowym ENBIOJET wartość ph 7, ± 0, 7,10 7,14 klarowna z lekko żółtym zabarwieniem klarowna, jasnożółta klarowna, jasnożółta 0

21 Fot. 3. Agar z ekstraktem drożdżowym ocena właściwości fizycznych po sterylizacji parowym i mikrofalowym; Fot. 4. Agar z ekstraktem drożdżowym ocena jałowości po inkubacji w temp. 36 ± C przez 44 ± 4 h; 1

22 Fot. 5. Agar z ekstraktem drożdżowym ocena jałowości po inkubacji w temp. ± C przez 68 ± 4 h; Pożywka: Agar CASO tryptonowo sojowy (TSA) Producent: Merck Seria: VM Partia: 1 Data przygotowania : wartość ph 7,3 ± 0, 7,6 7,9 przeźroczysta, żółtawobrązowa* przeźroczysta, żółta przeźroczysta, żółta Partia: Data przygotowania : wartość ph 7,3 ± 0, 7,19 7, przeźroczysta, żółtawobrązowa* przeźroczysta, żółta przeźroczysta, żółta

23 Partia: 3 Data przygotowania : wartość ph 7,3 ± 0, 7,3 7,6 przeźroczysta, żółtawobrązowa* przeźroczysta, żółta przeźroczysta, żółta Partia: 4 Data przygotowania : wartość ph 7,3 ± 0, 7,3 7,5 przeźroczysta, żółtawobrązowa* przeźroczysta, żółta przeźroczysta, żółta Partia: 5 Data przygotowania : wartość ph 7,3 ± 0, 7,1 7,3 przeźroczysta, żółtawobrązowa* przeźroczysta, żółta przeźroczysta, żółta Partia: 6 Data przygotowania :

24 wartość ph 7,3 ± 0, 7,7 7,8 przeźroczysta, żółtawobrązowa* przeźroczysta, żółta przeźroczysta, żółta Partia: 7 Data przygotowania :.07. wartość ph 7,3 ± 0, 7,8 7,30 przeźroczysta, żółtawobrązowa* przeźroczysta, żółta przeźroczysta, żółta * - pożywka w kolbie lub butelce ma kolor żółtawobrązowy, po rozlaniu na szalki Petriego jest jaśniejsza; 4

25 Fot. 6. Agar CASO tryptonowo sojowy (TSA) ocena właściwości fizycznych po sterylizacji w autoklawie parowym i mikrofalowym; Fot. 7. Agar CASO tryptonowo sojowy (TSA) ocena jałowości po inkubacji w temp. 36 ± C przez 1± 3h; 5

26 Pożywka: Agar z kanamycyną, eskuliną i azydkiem Producent: Merck Seria: VM017 Partia: 1 Data przygotowania : wartość ph 7,1 ± 0, 7,0 7,04 niebieskawobrązowa* żółtobrązowa żółtobrązowa Partia: Data przygotowania : wartość ph obecność artefaktów 7,1 ± 0, 7,10 7,05 niebieskawobrązowa* żółtobrązowa żółtobrązowa - brak brak Partia: 3 Data przygotowania : wartość ph 7,1 ± 0, 7,0 7,03 niebieskawobrązowa* żółtobrązowa żółtobrązowa Partia: 4 Data przygotowania : wartość ph 7,1 ± 0, 7,06 7,04 niebieskawobrązowa* żółtobrązowa żółtobrązowa 6

27 Partia: 5 Data przygotowania : wartość ph obecność artefaktów 7,1 ± 0, 7,11 7,10 niebieskawobrązowa* żółtobrązowa żółtobrązowa - brak brak Partia: 6 Data przygotowania : wartość ph 7,1 ± 0, 7,16 7,19 niebieskawobrązowa* żółtobrązowa żółtobrązowa Partia: 7 Data przygotowania :.07. wartość ph 7,1 ± 0, 7,15 7,19 niebieskawobrązowa* żółtobrązowa żółtobrązowa Jałowość - pożywka sterylna pożywka sterylna * - pożywka w kolbie lub butelce ma kolor niebieskawobrązowy, po rozlaniu na szalki Petriego jest jaśniejsza 7

28 Fot. 8. Agar z kanamycyną, eskuliną i azydkiem - ocena właściwości fizycznych po sterylizacji parowym i mikrofalowym; Fot. 9. Agar z kanamycyną, eskuliną i azydkiem ocena jałowości po inkubacji w temp. 44 ± 0,5 C przez 1 ± 3h; 8

29 Pożywka: Agar CN dla Pseudomonas Producent: BTL Seria: P Partia: 1 Data przygotowania : wartość ph 7,1 ± 0, 7,1 7,15 przeźroczysta, żółta przeźroczysta, jasnożółta przeźroczysta, jasnożółta, Partia: Data przygotowania : wartość ph 7,1 ± 0, 7,16 7,16 przeźroczysta, żółta przeźroczysta, jasnożółta przeźroczysta, jasnożółta Partia: 3 Data przygotowania : wartość ph 7,1 ± 0, 7,19 7,18 przeźroczysta, żółta przeźroczysta, jasnożółta przeźroczysta, jasnożółta Partia: 4 Data przygotowania : wartość ph 7,1 ± 0, 7,9 7,8 9