(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/EP01/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/EP01/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , WO02/12288 (13) B1 (51) Int.Cl. C12N 15/38 ( ) C12N 1/21 ( ) A61K 31/70 ( ) A61K 39/112 ( ) (54) Szczepionka, rekombinowany genom wirusowy, zastosowania genomu i zastosowanie szczepionki (30) Pierwszeństwo: , EP, (73) Uprawniony z patentu: LOHMANN ANIMAL HEALTH GMBH & CO. KG, Cuxhaven, DE (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 26/04 (72) Twórca(y) wynalazku: FRANK FEHLER, Cuxhaven, DE KLAUS OSTERRIEDER, Insel Riems, DE (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 02/11 (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Marta Kawczyńska PL B1

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest szczepionka skierowana przeciwko zakażeniu powodowanemu przez zasadniczo powiązanego z komórką gospodarza herpeswirusa, rekombinowany genom wirusowy pochodzący z herpeswirusa zasadniczo powiązanego z komórką gospodarza, zastosowania takiego genomu i zastosowanie szczepionki. Wynalazek dotyczy szczepionki przeciwko tak zwanym powiązanym z komórką gospodarza herpeswirusom, takim jak wirus choroby Mareka (MDV) drobiu oraz wirus ospy wietrznej i półpaśca (Varicella zoster, VZV, powodujący ospę wietrzną i półpasiec w wyniku ponownej aktywacji ze stanu uśpienia) człowieka, oraz szczepienia przeciwko chorobie powodowanej przez te wirusy, w szczególności chorobie drobiu, a zwłaszcza dziedziny szczepienia przeciwko chorobie Mareka. Wraz z rozpoczęciem intensywnej produkcji mięsa drobiowego w przemyśle drobiarskim szczególnym problemem stała się choroba Mareka. Jest to choroba wywoływana przez herpeswirusa, który wywołuje rozmaite objawy kliniczne, poczynając od immunosupresji, zaburzeń neurologicznych, anemii i nieswoistych apatii, a kończąc na ciężkich nowotworach limfatycznych w późniejszych stadiach zakażenia. W początkach historii choroby Mareka nie istniały ani sposoby leczenia, ani środki zapobiegawcze. Następnie wyizolowano z indyków pokrewny niepatogenny wirus (serotyp 3) (HVT) i stosowano go początkowo do szczepienia. Jednakże jakiś czas po wprowadzeniu szczepionki HVT, choroba Mareka pojawiła się znowu i stało się oczywiste, że krążące wirusy wirusy terenowe (ang. field virus) zmieniły się, aby obejść zabezpieczenie indukowane przez szczep HVT. W tym czasie odkryto nowy wirus niepatogenny (szczep Rispens), który generalnie ma ten sam serotyp co wirusy powodujące chorobę. Szczepionkę z tym szczepem wprowadzono na rynek bardzo szybko i uzyskano bardzo dobre wyniki szczepienia. Jednak po około dziesięciu latach znowu pojawiły się nowe wybuchy choroby, znowu wirusy terenowe zmieniły się, aby obejść zabezpieczenie indukowane szczepem w aktualnie stosowanej szczepionce. Potem do zabezpieczania zwierząt stosowano połączenie obu szczepionek (HVT i Rispens), jednak zadowalające wyniki były widoczne jedynie tymczasowo. Aktualnie, mimo tych wszystkich szczepień następują nowe wybuchy choroby. Przyczyna nie jest jeszcze znana, lecz istnieje wyraźna potrzeba wprowadzenia nowych, silnych szczepionek. Problemy związane ze szczepieniami przeciwko chorobie Mareka są takie, że mimo tego, że szczepionki przeciwko chorobie Mareka były produkowane przez długi okres czasu, metoda wytwarzania szczepionek nie mogła być ulepszona. Powodem tego jest to, że generalnie wirus zasadniczo powiązany z komórką gospodarza, może być hodowany zasadniczo tylko na pierwotnych komórkach gospodarza, takich jak w przypadku MDV lub HVT, w komórkach pierwotnych, takich jak fibroblasty otrzymane z drobiu, takiego jak kurczęta, wolnych od patogenów, a w przypadku wirusa ospy wietrznej i półpaśca, w (zasadniczo pierwotnych) ludzkich komórkach (ponownie oczywiście wolnych od zanieczyszczających patogenów) i nie mogą być uzyskane, lub tylko z wielką trudnością, poza kontekstem konkretnej komórki odpowiedniego gospodarza. Czyni to generalnie wytwarzanie szczepionki skierowanej przeciwko zakażeniom wirusowym lub chorobie powodowanej przez te rodzaje wirusów, trudnym na poziomie praktycznym, o ile nie prawie niemożliwym, a zatem kosztownym. Przykładowo, szczepionka Rispens skierowana przeciwko chorobie Mareka, która obecnie uważana jest za jedyną wystarczająco silną, jest, jak wszystkie wirusy Mareka o serotypie 1, ściśle powiązana z komórką gospodarza. Zdolność zakażania wirusa powiązanego z komórką (takiego jak np. serotypu 1 lub 2) jest kompletnie tracona podczas zwykłego zamrażania lub liofilizacji. Zatem wytworzenie szczepionki obejmuje bardzo skomplikowany i kosztowny etap, w którym całe komórki muszą być zamrożone w ciekłym azocie. Szczepionka musi być przechowywana i transportowana oraz utrzymywana w ciekłym azocie aż do użycia, a zatem generuje olbrzymie koszty i problemy podczas transportu. Następnie, na miejscu, szczepionka musi być stosowana bardzo ostrożnie, ponieważ zakażone komórki są bardzo wrażliwe na czynniki środowiskowe. Czynniki, takie jak podwyższona temperatura, światło i pozostałości detergentów w stosowanych urządzeniach szklanych, często uszkadzają wirusa tak, że nie można wytworzyć wystarczająco żywej partii szczepionki, co prowadzi do całkowitego niepowodzenia szczepionki. Takie niepowodzenia można rozpoznać tylko w przypadku, gdy choroba już wybucha i dotknięty nią drób wykazuje objawy choroby. W skrócie, aż do teraz wszystkie próby dostarczenia inaktywowanych, podjednostkowych lub rekombinowanych szczepionek zabezpieczających przed chorobą Mareka, zawiodły, a zatem nie ist-

3 PL B1 3 nieje aktualnie alternatywa do żywych, powiązanych z komórką szczepionek zawierających wirusa choroby Mareka. Choroba Mareka musi być kontrolowana przez stosowanie jako szczepionek preparatów zakażonych komórek. Preparaty te nie tylko zawierają żywe komórki zawieszone w pożywkach zawierających DMSO oraz różnorodne antygeny komórkowe, ale muszą być także przechowywane w ciekłym azocie. W konsekwencji, należy utrzymywać zimny łańcuch od wyprodukowania szczepionki do użytkownika szczepionki i aż do podania. Poza tym po rozmrożeniu szczepionkę należy podać w ciągu bardzo krótkiego czasu i należy zaszczepić każdego ptaka. Kilka z tych problemów dotyczy również tych, którzy mają nadzieję wytworzyć szczepionki przeciw innym zasadniczo powiązanym z komórką herpeswirusom, takim jak wirus ospy wietrznej i półpaśca. Wirus choroby Mareka (MDV) jest członkiem podrodziny Alphaherpesvirinae z Herpesviridae, (Lee i inni, 2000, Murphy i inni, 1995). Na podstawie wirulencji w stosunku do kurcząt i zdolności do indukcji chłoniaków z limfocytów T, MDV grupuje się generalnie w trzy serotypy (MDV-1, MDV-2 i MDV-3). MDV-3 reprezentuje herpeswirusa indyków (HVT), który był szeroko stosowany do szczepienia przeciwko chorobie związanej z MDV. Jednak po nieudanych szczepieniach i rozwinięciu się tak zwanych wirulentnych lub bardzo wirulentnych szczepów MDV-1 (Witter, 1985) w preparatach szczepionek stosowano atenuowane szczepy MDV-2, a później atenuowane szczepy MDV-1 (np. szczepu CVI 988 Rispens) (Witter, 1985). W ostatnich latach pojawiły się, a po raz pierwszy zostały opisane w Stanach Zjednoczonych, jeszcze bardziej wirulentne odmiany MDV-1 MDV-1, tak zwane bardzo wirulentne plus (vv+), i powodowały one wiele przypadków choroby Mareka oraz śmiertelność wywołaną przez rozwój nowotworu i immunosupresję niedługo po zakażeniu (Witter, 1997). Jeden szczep vv+, 584A, pasażowano ponad 100 razy na fibroblastach zarodków kurzych (CEF) i wykazano utratę jego patogenności w stosunku do kurcząt (Witter, 1997). Jednakże podstawa molekularna zwiększonej patogenności MDV-1 vv+ i podobnie utraty jego wirulencji jest słabo rozumiana, ponieważ analizy molekularne MDV-1 są trudne do przeprowadzenia. Z jednej strony w hodowanych komórkach nie są uwalniane wirusy potomne, lub jedynie ich małe ilości, z drugiej strony wytworzenie rekombinantów MDV-1 jest pracochłonne i z powodu charakteru silnego powiązania z komórką czynnika w hodowli komórkowej potrzebnych jest wiele rund oczyszczania rekombinantów wirusowych (Cantello i inni, 1991; Sakaguchi i inni, 1993; Parcells i inni, 1994; Schat i inni, 1998; Anderson i inni, 1998). Wreszcie, jak już wspomniano powyżej, szczepienie nie gwarantuje zabezpieczenia zwierząt przed wszystkimi terenowymi wirusami choroby Mareka. Wirus, jak wszystkie herpeswirusy, jest zdolny do znajdowania dróg ucieczki przed odpowiedzią immunologiczą indukowaną przez szczepionki. Zatem potrzebne byłoby szybkie dostosowywanie szczepionek do sytuacji w terenie. Aktualnie dokonuje się tego przez izolację izolatów terenowych (takich jak HVT lub Rispens) i/lub dodatkową atenuację in vitro. Sama izolacja powoduje olbrzymie problemy ze względu na trudności z pobraniem od kurcząt zakaźnego wirusa powiązanego z komórką i zakażenia komórek w hodowli komórkowej. Etapy atenuacji, które następują potem są bardzo pracochłonne i czasochłonne szczególnie dlatego, że oczyszczanie łysinek jest niezwykle trudne, co znowu jest spowodowane powiązanym z komórką charakterem wirusa. Wynik atenuacji nie jest zwykle określony. W konsekwencji tych faktów przez długi czas nie weszła na rynek żadna szczepionka, która zapewniałaby poprawę tam, gdzie aktualne szczepionki typu HVT i Rispens zawodzą. Poza tym podczas produkowania szczepionki często zachodzi nadmierna atenuacja, ponieważ wirus pasażowano zbyt wiele razy. To dodatkowo pogarsza niską skuteczność szczepionek typu HVT i Rispens w terenie. W skrócie, następujące problemy stanowią przeważającą część aktualnego impasu w dziedzinie kontrolowania MDV. Istnieje mała powtarzalność produkcji klasycznej szczepionki, obserwuje się nadmierną atenuację wirusa szczepionkowego, nieswoistą atenuację wirusa szczepionkowego, wysokie koszty produkcji, wysokie koszty przechowywania i transportu, wysoką wrażliwość szczepionki na czynniki środowiskowe oraz zbyt wolny rozwój nowych szczepów szczepionkowych, zwłaszcza w przypadku wirusów powiązanych z komórką. Te problemy pogarsza fakt, że obecnie występujące wirusy terenowe wzbudzają wysokie miana przeciwciał w stadzie produkcyjnym drobiu, przez co te wysokie miana przeciwciał są przekazywane potomstwu poprzez przeciwciała matczyne w jajach. Wpływ tych matczynych przeciwciał podczas początkowego zakażenia wirusem aktualnej szczepionki dodatkowo zmniejsza aktualną skuteczność szczepienia przeciwko chorobie Mareka. Przedmiotem wynalazku jest szczepionka skierowana przeciwko zakażeniu powodowanemu przez zasadniczo powiązanego z komórką gospodarza herpeswirusa wybranego spośród wirusa choroby Mareka (MDV) i wirusa ospy wietrznej i półpaśca (VZV), przy czym wymieniona szczepionka

4 4 PL B1 zawiera rekombinowany genom pochodzący z wymienionego herpeswirusa, i przy czym wymieniony genom pozwala na rekombinację zasadniczo niezależnie od wymienionej komórki gospodarza, i przy czym wymieniony genom zawiera sekwencję wektora sztucznego chromosomu bakteryjnego (BAC). Korzystnie wymieniony genom zawiera funkcjonalną delecję w genie zasadniczym dla replikacji i/lub rozprzestrzeniania się wymienionego herpeswirusa z komórki gospodarza, przy czym gen wybrany jest z grupy składającej się z UL1, UL5, UL8, UL9, UL15, UL18, UL19, UL22, UL26, UL26.5, UL27, UL28, UL29, UL30, UL52, UL53 i ICP4. Korzystnie wymieniony genom zawiera funkcjonalną delecję w genie zasadniczym dla wzbudzania markerowej odpowiedzi immunologicznej specyficznej dla wymienionego herpeswirusa, pozwalając na rozróżnienie między osobnikiem szczepionym wymienioną szczepionką i osobnikiem zakażonym wymienionym zasadniczo powiązanym z komórką herpeswirusem, przy czym gen stanowi gen wybrany z grupy składającej się z gc, gd, ge i gm. Korzystnie wymieniony genom zawiera zasadniczo pełnej długości kopię pochodzącą z wymienionego herpeswirusa. Korzystnie szczepionka zawiera ponadto kwas nukleinowy co najmniej kodujący substancję antygenową dodatkowego patogenu, przy czym kwas nukleinowy pochodzi z wirusa choroby Newcastle, gatunków Eimeria, gatunków Salmonella, wirusa zakaźnej anemii kurcząt, wirusa grypy, wirusa zakaźnej choroby kaletek lub reowirusa. Korzystnie wymieniony herpeswirus obejmuje wirusa choroby Mareka. Korzystniej wymieniony wirus choroby Mareka obejmuje serotyp 1. Korzystniej wymieniony wirus choroby Mareka pochodzi z wirulentnego, bardzo wirulentnego albo bardzo wirulentnego plus wirusa terenowego. Przedmiotem wynalazku jest ponadto rekombinowany genom wirusowy pochodzący z herpeswirusa zasadniczo powiązanego z komórką gospodarza wybranego spośród wirusa choroby Mareka (MDV) i wirusa ospy wietrznej i półpaśca (VZV), przy czym wymieniony genom pozwala na rekombinację zasadniczo niezależnie od wymienionej komórki gospodarza i przy czym wymieniony genom zawiera sekwencję wektora sztucznego chromosomu bakteryjnego (BAC). Korzystnie zawiera on co najmniej minigenom zdolny do replikacji. Korzystnie zawiera on zasadniczo pełnej długości kopię pochodzącą z wymienionego herpeswirusa. Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie genomu jak określono powyżej do wytwarzania szczepionki skierowanej przeciwko chorobie powodowanej przez zakażenie zasadniczo powiązanym z komórką gospodarza herpeswirusem. Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie genomu jak określono powyżej do wytwarzania leku do ograniczania ryzyka nabycia przez osobnika choroby albo pełnego ujawnienia choroby powodowanej przez zakażenie zasadniczo powiązanym z komórką gospodarza herpeswirusem. Korzystnie osobnikiem jest ptak. Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie szczepionki jak określono powyżej do wytwarzania leku do ograniczania ryzyka nabycia przez osobnika choroby albo pełnego ujawnienia choroby powodowanej przez zakażenie zasadniczo powiązanym z komórką gospodarza herpeswirusem. Korzystnie osobnikiem jest ptak. Zgodnie z wynalazkiem opisano szczepionkę skierowaną przeciwko zakażeniu powodowanemu przez herpeswirusa, który jest zasadniczo powiązany z komórką gospodarza, zawierającą rekombinowany genom wirusowy pochodzący z wymienionego herpeswirusa, przy czym wymieniony genom pozwala na rekombinację zasadniczo niezależnie od wymienionej komórki gospodarza. W tym celu wynalazek dostarcza rekombinowany genom wirusowy pochodzący z herpeswirusa uznawanego za zasadniczo powiązanego z komórką gospodarza, przy czym wymieniony genom dogodnie jest zdolny do co najmniej pewnej miary replikacji w wymienionej komórce gospodarza i w tym samym czasie pozwala na rekombinację zasadniczo poza lub niezależnie od wymienionej komórki gospodarza, a homologiczna rekombinacja w komórkach eukariotycznych nie jest już wymagana. W szczegółowym opisie opisano taki genom wirusa podobnego do wirusa choroby Mareka. W niniejszym zgłoszeniu, jako przykład genomu wirusa choroby Mareka serotypu 1 (MDV-1) klonowano szczep 584Ap80C w Escherichia coli jako sztucznym chromosomie bakteryjnym (BAC). Sekwencje wektora BAC wprowadzono do lokus U s 2 genomu MDV-1 przez homologiczną rekombinację po kotransfekcji fibroblastów zarodków kurzych (CEF) wirusowym DNA i rekombinowanym plazmidem pds-pha1, który zawierał sekwencje BAC oraz gen Eco-gpt zamiast genu MDV-1 U s 2 oraz sekwencje flankujące. Potomstwo transfekcyjne pasażowano na komórkach CEF w obecności kwasu

5 PL B1 5 mykofenolowego oraz ksantyny/hipoksantyny. Po czterech rundach selekcji wytworzono DNA wirusa i użyto go do transformacji szczepu Escherichia coli DH10B. Zidentyfikowano kilka kolonii posiadających pełny genom MDV-1. Te MDV-1 BAC transfekowano do komórek CEF i po 3 dniach od transfekcji odzyskano zakaźny MDV-1. Wzrost MDV-1 odzyskanego z różnych BAC był niemożliwy do odróżnienia od wzrostu wirusa rodzicielskiego, co oceniono przez tworzenie łysinek i określenie krzywych wzrostu. Zgodnie z wynalazkiem opisano sposób wytwarzania lub otrzymywania rekombinowanego zasadniczo powiązanego z komórką gospodarza genomu herpeswirusa, obejmujący (jeśli to konieczne prawie kompletny lub kompletny) zakaźny kwas nukleinowy herpeswirusa pochodzący z izolatu MDV i/lub VZV. Oczywiście, obecnie ten zasadniczo kompletny genom jest otrzymywany w postaci wolnej od komórek gospodarza, z którymi, jak początkowo uważano, był mocno powiązany. Wynalazek dostarcza także genomu według wynalazku, który pozwala na pełne stosowanie wszystkich technik rekombinacyjnych dostępnych fachowcowi z dziedziny biologii molekularnej, dostarcza więc także szczepionkę według wynalazku obejmującą co najmniej (zdolny do replikacji) minigenom. Przykładowo, wynalazek dostarcza minigenom, który zapewnia jedynie ekspresję tylko pary glikoprotein (takich jak gb, gc, gd lub ich kombinacji) oraz np. ICP4 lub innego produktu genowego, który jak wykazano indukuje odporność komórkową, w herpeswirusach. Taki minigenom służy np. do identyfikacji genów, które są ważne dla zabezpieczenia, biorąc pod uwagę, że replikacja genomu w (eukariotycznych) komórkach gospodarza nie jest już zapewniana. Dodanie np. promotora HCMV lub SV40 na początku każdego genu lub konstrukcji genowej, zapewniłoby końcową identyfikację najmniejszego ugrupowania zabezpieczającego. W przypadku minigenomu zdolnego do replikacji zgodnie z wynalazkiem opisano także delecję całości lub głównej części regionu US, przez co otrzymany miniwirus replikuje także w komórkach gospodarza. W innej postaci realizacji, opisano taki genom, który obejmuje zasadniczo pełnej długości kopię otrzymaną z wymienionego herpeswirusa, przy czym zasadniczo pełnej długości wskazuje tu, że większa część genów wymienionego genomu wirusa jest obecna, z wyjątkiem niektórych, które są dogodnie (przynajmniej funkcjonalnie) usunięte, tak jak gen zasadniczy dla replikacji lub rozprzestrzeniania wirusa w gospodarzu lub hodowli komórek gospodarza, jak opisano tu w w szczegółowym opisie. Tamże, przykładowo, w jednym z odzyskanych genomów według wynalazku, BAC20, sekwencje kodujące glikoproteinę B(gB) usunięto przez jednoetapową mutagenezę za pośrednictwem rece, przy użyciu liniowego fragmentu DNA. MDV-1 ujemny pod względem glikoproteiny B odtworzony po transfekcji DNA BAC20 ujemnym pod względem gb (20DgB) był zdolny do wzrostu jedynie w komórkach dostarczających gb w układzie trans, pokazując, że gb jest niezbędna dla wzrostu MDV-1 w hodowanych komórkach gospodarza. Inne geny niezbędne do wzrostu oraz dla których można dostarczyć komórek, które produkują produkt genowy w układzie trans, to gh, ICP4, UL15, UL28 i UL9 albo inny gen uważany za niezbędny do wzrostu, taki jak wymieniono poniżej. Ponadto, zgodnie z wynalazkiem opisano zastosowanie genomu według wynalazku do wytwarzania szczepionki, przy czym w jednej postaci realizacji taka szczepionka skierowana jest przeciwko chorobie powodowanej przez zakażenie zasadniczo powiązanym z komórką gospodarza herpeswirusem, jednakże w innej postaci realizacji taka szczepionka może być stosowana jako szczepionka wektorowa i może obejmować inne lub dodatkowe patogeny lub nici kwasu nukleinowego je kodujące. Dla MDV, zalecany dodatkowy kwas nukleinowy patogenu obejmuje kwas nukleinowy pochodzący np. z wirusa choroby Newcastle, gatunków Eimeria, gatunków Salmonella, wirusa zakaźnej anemii kurcząt, wirusa grypy, wirusa zakaźnej choroby kaletek, reowirusa lub innych patogenów powszechnie spotykanych u drobiu. Tak więc, wynalazek zapewnia także szczepionkę, w której wymieniony genom obejmuje funkcjonalną delecję w genie zasadniczym dla replikacji i/lub rozprzestrzeniania się wymienionego herpeswirusa w komórce gospodarza, albo w której wymieniony genom wirusowy obejmuje co najmniej kwas nukleinowy kodujący substancję antygenową zdolną do wzbudzania (dogodnie zasadniczo zabezpieczającej) odpowiedzi immunologicznej przeciwko zakażeniu osobnika wymienionym herpeswirusem. Typowym zasadniczym genem lub jego fragmentem, który się usuwa, może być np. homolog MDV UL1 = glikoproteina L; UL5; UL8; UL9; UL15; UL18; UL19; UL22 = glikoproteina H; UL26; UL26.5; UL27 = glikoproteina B; UL28; UL29; UL30; UL52; UL53; ICP4 lub geny albo ich fragmenty wybrane spośród regionu US genomu (fig. 1).

6 6 PL B1 W korzystnej postaci realizacji, wynalazek zapewnia szczepionkę obejmującą delecję funkcjonalną w genie zasadniczym dla wzbudzenia markerowej odpowiedzi immunologicznej specyficznej dla wymienionego herpeswirusa, pozwalając na rozróżnienie immunologiczne pomiędzy osobnikiem zaszczepionym wymienioną szczepionką i osobnikiem zakażonym wymienionym zasadniczo powiązanym z komórką herpeswirusem. Korzystne markerowe odpowiedzi skierowane są np. przeciwko gc, gm, gd lub ge, co wyjaśniono dodatkowo w szczegółowym opisie (tutaj w przypadku gm) tak jak delecja w genie zasadniczym dla wzbudzania markerowej odpowiedzi immunologicznej. Ponadto, zgodnie z wynalazkiem opisano szczepionkę, w której wymieniony genom wirusowy obejmuje co najmniej kwas nukleinowy kodujący substancję białkową zdolną do modulowania transkrypcji i/lub translacji kwasu nukleinowego kodującego substancję antygenową zdolną do wzbudzania odpowiedzi immunologicznej przeciwko zakażeniu osobnika wymienionym herpeswirusem. Wymieniona szczepionka dogodnie zawiera zasadniczo pełnej długości kopię otrzymaną z wymienionego herpeswirusa tak, aby utrzymywała jak najwięcej funkcji wymaganych dla efektywnej modulacji transkrypcji i/lub translacji genomu szczepionkowego w szczepionym gospodarzu, przy czym opisano tu również szczepienie minigenomowe. Dla zapewnienia szczepionki według wynalazku zawierającej kwas nukleinowy kodujący dodatkowy patogen oczywiście zalecane jest skuteczne modulowanie transkrypcji i/lub translacji kwasu nukleinowego kodującego obcy patogen lub otrzymaną z niego substancję antygenową, podczas ekspresji dodatkowego patogenu lub substancji antygenowej otrzymanej z wymienionego genomu i można rozważać, aby także obce (czyli nie pochodzące z herpeswirusa) elementy regulatorowe były dostarczone do wymienionego genomu. W szczególności, zgodnie z wynalazkiem opisano szczepionkę, w której wymieniony herpeswirus obejmuje wirus podobny do wirusa choroby Mareka. Szczególnie zaleca się szczepionkę, w której wymieniony wirus podobny do wirusa choroby Mareka obejmuje serotyp 1. Ponadto, ponieważ obecnie dostarczono sposoby manipulacji badanym genomem poza kontekstem komórki gospodarza, z którym genom początkowo był powiązany, opisano też szczepionkę, która zamiast być otrzymana z normalnych atenuowanych lub awirulentnych izolatów wirusa podobnego do wirusa choroby Mareka, jest otrzymana z wirulentnego, bardzo wirulentnego lub bardzo wirulentnego plus wirusa terenowego, ponieważ obecnie możliwa jest szybka izolacja zakaźnych klonów z izolatów terenowych, co pozwala na wytwarzanie szczepionek DNA do zapobiegania, za pomocą szczepionek, chorobie Mareka u kurcząt i indyków, gdzie do genomu można bardzo szybko wprowadzić mutacje. Ten sam system można stosować także w przypadku innych zasadniczo powiązanych z komórką herpeswirusów, takich jak wirus ospy wietrznej i półpaśca. Zastosowanie zdolnych do replikacji genomów wirusowych tu opisanych, zawierających części lub całość genomu zakaźnego wirusa choroby Mareka (MDV-1), otwiera rozmaite nowe możliwości stworzenia skuteczniejszych, biologicznie bezpiecznych i stabilnych szczepionek MDV-1. W związku z faktem, że rekombinowane MDV-1 są odzyskiwane z klonowanego DNA, wirusy potomne otrzymane z transfekcji DNA można lepiej scharakteryzować i uniknąć nadmiernej atenuacji' wirusów w szczepionce. Przykładowo liczbę powtórzeń 132 pz, jaka okazuje się być związana z atenuacją (Maotani i inni, 1986) można dokładnie określić i, jeśli trzeba, zmniejszyć lub zwiększyć według potrzeb przy produkcji szczepionek albo sytuacji w terenie (patrz poniżej). Wytworzenie zmutowanego MDV-1 jest znacznie łatwiejsze. Jak dotąd, mutanty MDV-1 wytwarza się przez pracochłonne i czasochłonne procedury rekombinacji i selekcji w komórkach eukariotycznych. Te procedury selekcyjne, jak donoszono dla innych herpeswirusów, często skutkują powstaniem mutacji genomowych innych niż te oczekiwane, w szczególności dlatego, że w przypadku MDV-1 nie można otrzymać wirusa będącego wolnym od komórki, co czyni procedury selekcyjne oraz odzyskiwania i namnażania mutantów jeszcze bardziej skomplikowanymi. W przeciwieństwie do tego, wynalazek zapewnia sposób manipulowania genomem wirusowym oparty na mutagenezie poprzez gen λ gam hamujący gen rece, rect i recb/c obecny w plazmidzie pgetrec (Narayanan i inni, 1999). Zalety tego systemu są takie, że (i) potrzebne są ramiona homologii jedynie o 30 do 50 pz aby namierzyć konkretną sekwencję, która ma być usunięta, to znaczy można uzyskać delecję każdej otwartej ramki odczytu bez potrzeby klonowania kaset rekombinacji, (ii) sposób jest bardzo szybki, oraz (iii) wektor pgetrec, zawierający układ mutagenezy i powodujący ekspresję oporności na ampicylinę, ulega szybkiej utracie z komórek bakteryjnych przy braku ampicyliny. Przy użyciu silnej techniki wykorzystującej tak zwane procedury klonowania E/T możliwa jest jednoetapowa mutacja i selekcja w Escherichia coli (Muyrers i inni, 1999; Narayanan i inni, 1999; Zhang i inni, 1998). Technika ta pozwala także na delecję zasadniczych genów MDV-1 bez potrzeby

7 PL B1 7 stosowania uzupełniających linii komórkowych, ponieważ replikacja zmutowanych genomów MDV-1 jakie tu opisano nie wymaga transkomplementacji usuniętego zasadniczego genu. Poza tym, procedury klonowania są zupełnie niepotrzebne. Zgodnie z wynalazkiem opisano też sposób wytwarzania BAC MDV-1 lub innych wirusów (herpeswirusów zasadniczo powiązanych z komórką), obejmujący transformowanie np. komórek DH10B Escherichia coli plazmidem pbadαβγ, pgetrec lub każdym innym plazmidem, który w sposób indukowalny albo stabilny wykazuje ekspresję genu rece, rect oraz λ gam, następnie wytworzenie kolistego DNA wirusa z komórek zakażonych litycznie lub w sposób latentny, pobranych np. ex vivo lub z hodowli komórkowych. W równoległej lub oddzielnej procedurze zapewnia się liniowy DNA posiadający sekwencje wektora BAC oraz sekwencje pozwalające na rekombinację homologiczną sekwencji wektora BAC z wirusowym DNA. Ten liniowy DNA można np. otrzymać przez PCR lub linearyzację DNA plazmidowego. Następnie zapewnia się ekspresję genu rece, rect i gam w Escherichia coli (np. Sambrook i inni, 1989). Wirusowy DNA wprowadza się następnie metodą elektroporacji razem z liniowym DNA obejmującym sekwencje wektora BAC do kompetentnych komórek Escherichia coli. Posianie na płytkę agarową zawierającą odpowiednie antybiotyki pozwala na zebranie jednej lub wielu kolonii, a DNA BAC można wytworzyć jak np. opisano w niniejszym szczegółowym opisie. Zakaźność klonowanego wirusowego DNA BAC sprawdza się przez transfekcję wrażliwych komórek. Zgodnie z wynalazkiem opisano sposób genetycznej rekombinacji genomu herpeswirusowego zasadniczo powiązanego z komórką gospodarza, otrzymanego z komórki lub tkanki gospodarza bez potrzeby przeprowadzania (homologicznej) rekombinacji w komórkach eukariotycznych, pozwalając na otrzymanie (jeśli to konieczne prawie kompletnego lub kompletnego) zakaźnego genomu lub kwasu nukleinowego herpeswirusa uzyskanego z izolatów terenowych lub podobnych izolatów atenuowanych. Opisany tu sposób pozwala także na dodatkową atenuację MDV-1 - kandydata do szczepionki albo na wytworzenie mutantów MDV-1 zawierających geny innych ważnych patogenów kurcząt. Poza tym, pojawiającym się izolatom terenowym MDV-1 o możliwie odmiennych i zmieniających się właściwościach antygenowych, można zaradzić przez zapewnienie szczepionki opartej na wymianie odpowiednich zmutowanych genów między klonowanym MDV-1 i aktualnym izolatem terenowym (aktualnymi izolatami terenowymi). Zmiany te, jak opisano powyżej, można przeprowadzić za pomocą tej samej techniki klonowania E/T i jako takie zapewniają one możliwość bardzo szybkiego reagowania na zmiany MDV-1 w terenie. Jednak atrakcyjną zaletą odzyskania zakaźnego MDV-1, jak tu opisano, jest wykorzystanie genomu jaki tu opisano, jako szczepionki DNA. Aż do dzisiaj, choroba Mareka jest kontrolowana przez stosowanie preparatów zakażonych komórek. Preparaty te nie tylko zawierają żywe komórki zawieszone w pożywkach zawierających DMSO, ale także różnorodne antygeny komórkowe, a ponadto muszą być one przechowywane w ciekłym azocie. W konsekwencji musi być zachowany zimny łańcuch od wyprodukowania szczepionki do użytkownika szczepionki i aż do podania. Poza tym, po rozmrożeniu szczepionka musi być podana w bardzo krótkim czasie i zaszczepiony musi być każdy ptak. Stosując genomowy DNA MDV-1 tu opisany, oczyszczanie 'szczepionki' (DNA) jest łatwe do uzyskania i powtarzalne. DNA jest niezwykle stabilny, utrzymanie zimnego łańcucha nie jest konieczne, a zakaźny DNA może być podawany kilkoma drogami (domięśniowo, śródskórnie, do jaja, doustnie, drogami oddechowymi i temu podobnymi) oraz w różnych preparatach (z nośnikiem lub bez, itd.). Ponadto, obecność matczynych przeciwciał nie zakłóca pierwotnego wstrzyknięcia immunogenu. Zatem opisane tu genomy MDV-1, jako takie, umożliwiają po raz pierwszy wyprodukowanie i skonstruowanie skutecznych i biologicznie bezpiecznych szczepionek przeciwko onkogennej i ekonomicznie istotnej chorobie. Zgodnie z wynalazkiem opisano więc sposób ograniczenia ryzyka nabycia przez osobnika lub pełnego ujawnienia choroby powodowanej przez zakażenie zasadniczo powiązanym z komórką gospodarza herpeswirusem, obejmujący podawanie wymienionemu osobnikowi szczepionki według wynalazku lub genomu według wynalazku. Szczegółowy opis: Wirus choroby Mareka (MDV) jest członkiem podrodziny Alphaherpesvirinae Herpesviridae (van Regenmortel i inni, 1999). Na podstawie wirulencji w stosunku do kurcząt, zdolności do indukcji chłoniaków z limfocytów T oraz właściwości antygenowych, MDV grupuje się w trzy serotypy (MDV-1, MDV-2 i MDV-3) (Payne, 1985). MDV-3 reprezentuje herpeswirusa indyków (HVT), którego szeroko stosowano do szczepień przeciwko chorobom pokrewnym MDV. Zgodnie z najnowszym nazewnictwem MDV-1 klasyfikuje się jako gallid herpesvirus 2 (GHV-2), MDV-2 jako GHV-3, a HVT jako mele-

8 8 PL B1 agrid herpesvirus. Wszystkie trzy wirusy należą do nowego rodzaju wirusów podobnych do choroby Mareka wewnątrz Alphaherpesvirinae. Kontrolę zakażenia MDV-1 uzyskano przez szczepienie przede wszystkim HVT, jednak po niepowodzeniach szczepienia oraz opisie tak zwanego bardzo wirulentnego" MDV-1 (Witter, 1989), w preparatach szczepionek stosowano szczepy MDV-2 i później atenuowane szczepy MDV-1 (np. szczep CVI 988 Rispens) (Witter, 1985). W ostatnich latach pojawiły się, a po raz pierwszy opisano je w Stanach Zjednoczonych, jeszcze bardziej wirulentne odmiany MDV-1, tak zwane bardzo wirulentne plus" (vv+) odmiany MDV-1 i powodowały wysoką śmiertelność nawet u ptaków szczepionych (Witter, 1997). Jeden z tych szczepów vv+, 584A, pasażowano seryjnie na fibroblastach zarodków kurzych (CEF) i wykazano utratę jego patogenności w stosunku do kurcząt (Witter, 1997). Podstawa molekularna zwiększonej patogenności MDV-1 vv+ i podobnie utraty wirulencji są słabo rozumiane, ponieważ analizy molekularne MDV-1 są trudne do przeprowadzenia. Z jednej strony, w hodowanych komórkach nie uwalniają się zakaźne wirusy potomne, z drugiej strony wytwarzanie rekombinantów MDV-1 jest pracochłonne i z powodu charakteru silnego stopnia powiązania z komórką czynnika in vitro, potrzebnych jest wiele rund oczyszczania rekombinantów wirusowych (Cantello i inni, 1991; Sakaguchi i inni, 1993; Parcells i inni, 1994, 1995; Schat i inni, 1998; Anderson i inni, 1998). Poza tym, do hodowli MDV-1 muszą być użyte komórki pierwotne (Payne), czego rezultatem jest fakt, że analiza zasadniczych genów MDV-1 jest niemal niemożliwa, ponieważ nie da się wytworzyć transkomplementujących linii komórkowych. Przy użyciu tej techniki jako zakaźne BAC sklonowano genomy mysiego i ludzkiego cytomegalowirusa (MCMV i HCMV; Messerle i inni, 1997; Borst i inni, 1999), wirusa opryszczki zwykłej typu 1 (HSV-1; Suter i inni, 1998), wirusa wścieklizny rzekomej (PrV; Smith i inni, 1999, 2000) oraz wirusa Epsteina-Barra (EBV; Delecluse i inni, 1998). Celem tego badania było dostarczenie podstawy do szybkiej i wydajnej produkcji rekombinantów MDV-1 przez klonowanie kompletnego genomu wielkości 180 kpz w Escherichia coli. Zakaźny MDV-1 łatwo odzyskano po transfekcji klonowanego DNA BAC MDV-1 przy użyciu komórek CEF i BAC MDV-1 były stabilne po kilku rundach hodowli bakteryjnej lub seryjnego namnażania w komórkach CEF. Wreszcie, ponieważ możliwa była jednoetapowa delecja zasadniczego genu MDV-1 w Escherichia coli, system może potencjalnie bardzo ułatwiać przyszłą analizę zasadniczych i niezasadniczych genów MDV-1 i służyć jako narzędzie do produkcji biologicznie skutecznego modyfikowanego żywego wirusa i/lub szczepionek DNA. Materiały i metody: Wirus i komórki. Pierwotne lub wtórne fibroblasty zarodków kurzych (CEF) lub komórki mięśnia przepiórki (QM7) utrzymywano w modyfikowanej podstawowej pożywce Dulbecco (DMEM) uzupełnionej 5-10% płodowej surowicy cielęcej (FCS). Szczep MDV-1, 584Ap80C, dostarczył Dr. Richard Witter, ADOL, East Lansing, Michigan, U.S.A. Szczep 584Ap80C reprezentuje awirulentną pasażowaną hodowlę komórkową potomną szczepu vv+ 584A (Witter, 1997), hodowaną na pierwotnych lub wtórnych komórkach CEF jak opisano wcześniej (Osterrieder, 1999). Komórki QM7 testowano pod względem braku sekwencji MDV-1 za pomocą PCR i hybrydyzacji Southern blot namierzając różne regiony genomu przed użyciem ich do namnożenia MDV-1 (Zelnik i Osterrieder, niepublikowane). Wykonano krzywe wzrostu wirusa zgodnie z opisem, z drobnymi modyfikacjami (Parcells i inni, 1994). W skrócie, użyto 100 jednostek tworzących łysinki (pfu) do zakażenia 2 x 10 6 świeżo posianych komórek CEF. W różnym czasie po zakażeniu (0, 12, 24, 48, 72, 96, 120 godzin) zakażone komórki poddano działaniu trypsyny i miareczkowano na świeże komórki CEF. Określono liczbę łysinek a wyniki przedstawiają średnią z dwóch niezależnych doświadczeń. Otrzymano linię komórkową QM7 wykazującą konstytutywną ekspresję gb MDV-1 przez transfekcję 1 x 10 6 komórek QM7 za pomocą 10 μg pcmgb (fig. 1), który oparty jest na pcdna3 (Invitrogen) i zawiera gen gb MDV-1 ze szczepu CVI988 Rispens pod kontrolą bezpośredniego wczesnego promotora ludzkiego cytomegalowirusa. Wyselekcjonowano komórki QM7 zawierające pcmgb, w obecności 1 mg/ml G418 i zidentyfikowano klony wykazujące ekspresję gb, przy użyciu przeciwciała monoklonalnego (mab) anty-gb 2K11 (dostarczonego przez Dr Jean-Francois Vautherot, INRA, Tours, Francja). Uzyskaną linię komórkową z ekspresją gb MDV-1 nazwano MgB1. Konstrukcja BAC MDV-1. DNA MDV-1 oczyszczono z zakażonych komórek przez ekstrakcję dodecylosiarczanem sodu-proteinaza K, zgodnie z wcześniejszym opisem (Morgan i inni, 1990). Pla-

9 PL B1 9 zmid pds-pha1 skonstruowano w następujący sposób. Fragmenty o 2,1 i 3,1 kpz po obu stronach genu U s 2 MDV-1 (fig. 1) powielono przy użyciu łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) stosując standardowe startery zawierające odpowiednie miejsca enzymów restrykcyjnych (tabela 1) i oba fragmenty klonowano do ptz18r (Pharmacia-Amersham). Wektor BAC zawierający gen Eco-gpt pod kontrolą bezpośredniego wczesnego promotora HCMV uwolniono z plazmidu pha1 (dostarczonego przez Dr M.Messerle, LMU, Munich, Niemcy; Messerle i inni, 1997) i wprowadzono do miejsc PacI wprowadzonych do obu fragmentów 2,1 i 3,1 kpz występujących w plazmidzie pds (fig. 1). Pierwotne komórki CEF poddano kotransfekcji 2 μg DNA 584Ap80C i 10 μg pds-pha1. 5 dnia po transfekcji komórki posiano na płytkach z pierwotnymi komórkami CEF w obecności 250 μg/ml kwasu mykofenolowego (MPA), 50 μg/ml ksantyny i 100 μg/ml hipoksantyny. Selekcję z użyciem MPA/ksantyny/hipoksantyny powtórzono w sumie cztery razy. Po wystąpieniu całkowitego efektu cytopatycznego (cpe) po czwartej rundzie selekcji, z zakażonych komórek wypreparowano wirusowy DNA i 1 μg DNA z zakażonych komórek wprowadzono za pomocą elektroporacji do komórek DHB10 Escherichia coli. Kolonie wykrywano od 16 godziny po transfekcji na płytkach agarowych zawierających 30 μg/ml chloramfenikolu (Sambrook i inni, 1989). Zebrano pojedyncze kolonie i wytworzono DNA BAC z Escherichia coli postępując zgodnie ze standardowym protokołem lizy alkalicznej (Sambrook i inni, 1989). Wytwarzanie DNA BAC na wielką skalę przeprowadzono za pomocą chromatografii powinowactwa na bazie krzemionki, przy użyciu dostępnych na rynku zestawów (Qiagen, Mecherey & Nagel). Do dalszej analizy wybrano trzy klony BAC MDV-1 584Ap80C (BAC19, BAC20, BAC24). Mutageneza BAC MDV-1. Do mutagenezy klonowanego DNA MDV-1 w Escherichia coli przeprowadzono reakcje katalizowane przez rece, pobudzające homologiczną rekombinację między fragmentami liniowego DNA, przytaczane jako klonowanie E/T (Zhang i inni, 1998; Narayanan i inni, 1999). Plazmid pgetrec (dostarczony przez Dr Panos loannou, Murdoch Institute, Melbourne, Australia) obejmujący gen rece, rect i bakteriofagowy gam 1, transformowano do komórek DH10B zawierających BAC20 (Narayanan i inni, 1999). Po indukcji rece, rect i gam przez dodanie 0,2% arabinozy, wytworzono elektrokompetentne komórki zasadniczo zgodnie z opisem (Narayanan). Aby usunąć gen gb z BAC20, powielono przez PCR gen oporności na kanamycynę (kan R ) plazmidu pegfp-n1 (Clontech). Zaprojektowane startery zawierały ramiona homologii o 50 nukleotydach ograniczających żądaną delecję w gb oraz 20 nukleotydów do powielenia kan R (tabela 1). Uzyskany fragment o 1,6 kpz oczyszczono z żelu agarozowego (Qiagen) i poddano elektroporacji w komórkach BAC20 zawierających pgetrec. Kolonie posiadające geny cam R i kan R zidentyfikowano na płytkach zawierających oba antybiotyki (Narayanan i inni, 1999). Analizy DNA. BAC lub wirusowy DNA 584Ap80C cięto za pomocą EcoRI, BamRl, BglII lub Stul i rozdzielono na 0,8% żelach agarozowych. Fragmenty DNA przeniesiono na dodatnio naładowane błony nylonowe (Pharmacia-Amersham) i przeprowadzono hybrydyzację Southern blot przy użyciu DNA BAC19 znakowanego digoksygeniną lub poszczególnych fragmentów BamHl szczepu GA MDV-1 (Fukuchi i inni, 1991; Osterrieder, 1999). Ponadto wytworzono sondę specyficzną dla gb z plazmidu pcgb oraz sondę obejmującą gen kan R, do analizy BAC MDV-1 ujemnych pod względem gb. Wykonano detekcję chemoluminescencyjną hybryd DNA przy użyciu CSPD zgodnie z instrukcjami producenta (Roche Biochemicals). Pośrednia immunofluorescencja. Do pośrednich analiz immunofluorescencji (IIF) komórki hodowano w 6-cio lub 24-studzienkowych płytkach (Greiner) lub na szkiełkach przykrywkowych, a następnie zakażano we wskazanych miejscach. Komórki utrwalono 90% acetonem w różnym czasie po zakażeniu lub transfekcji i wykonano IIF dokładnie jak opisano (Meindl i Osterrieder, 1999). Próbki analizowano przez mikroskopię fluorescencyjną lub współogniskową laserową mikroskopię skaningową (CLSM). Użytymi przeciwciałami były mab 2K11 anty-gb, mab H19 anty-pp38 (dostarczone przez Dr Lucy Lee, ADOL, East Lansing, MI) lub zdrowej surowicy od kurcząt zakażonych MDV-1 (MDSI). Wyniki: Konstruowanie i analiza BAC zawierających kompletne genomy MDV-1. Jeden milion pierwotnych CEF zakażono 1 x 10 4 pfu szczepu MDV-1, to znaczy zakażone komórki wymieszano z komórkami niezakażonymi. Po wystąpieniu całkowitego efektu cytopatycznego z zakażonych komórek wypreparowano DNA i 2 μg wirusowego DNA transfekowano 1 x 10 6 pierwotnych komórek CEF razem z 10 μg plazmidowego DNA pds-pha1. Pięć dni po transfekcji komórki posiano wspólnie ze świeżymi CEF i nadlano pożywkę selekcyjną. Procedurę tę powtarzano w sumie cztery razy. Na koniec, DNA z rekombinowanego MDV-1, który był zdolny do wzrostu w obecności MPA/ksantyny/hipoksantyny wyizolowano i poddano analizie

10 10 PL B1 Southern blot stosując znakowany pha1 jako sondę. Można było pokazać, że część wirusowego DNA zawierała wprowadzone sekwencje plazmidu F (dane nie ukazane). Jeden mikrogram tego wirusowego DNA wykorzystano do transformowania komórek DH10B Escherichia coli. Transformowane bakterie posiano na płytkach agarowych zawierających 30 μg/ml chloramfenikolu i zebrano pojedyncze kolonie. DNA z kolonii bakteryjnych ekstrahowano stosując standardowe procedury preparatyki plazmidów (Sambrook i inni, 1989) i rozdzielono na 0,8% żelach agarozowych. Okazało się, że kilka z kolonii bakteryjnych zawiera pozachromosomowy DNA o wysokiej masie cząsteczkowej, a trzy klony (BAC19, BAC20 i BAC24) wybrano do dalszej analizy (fig. 2). Aby dodatkowo scharakteryzować wyizolowane klony BAC, przeprowadzono analizę Southern blot DNA 584Ap80C i BAC po cięciu BamHl lub EcoRl, ze znakowanym DNA BAC19 jako sondą. Można było pokazać, że DNA BAC19, BAC20 i BAC24 wykazywały prawie identyczne wzory fragmentów enzymów restrykcyjnych przy porównywaniu z rodzicielskim 584Ap80C (fig. 3A i B). Jednakże łatwo rozpoznano dwa znaczące wyjątki. Fragment o 20 kpz BamHI-A obecny w DNA 584Ap80C był nieobecny we wszystkich analizowanych klonach BAC. Zamiast tego w DNA BAC19, BAC20 i BAC24 wykrywano fragmenty o wielkości 16 i 10 kpz (fig. 3B). Te dwa prążki reprezentowały powiększony fragment BamHI-A, w którym dzięki insercji plazmidu F i delecji sekwencji U s 2 wprowadzono dodatkowe miejsce BamHl (fig. 1). W DNA BAC trawionym EcoRI obserwowano jeden dodatkowy prążek wielkości 5,8 kpz (sekwencje BAC) i pomniejsze zmiany wielkości fragmentów spowodowane przez delecję genu U s 2 (fig. 1 i 3B). Prawidłowa insercja sekwencji BAC w różnych klonach była dodatkowo analizowana przez hybrydyzację Southern blot za pomocą znakowanych insertów plazmidu pds lub pha1 jako sondy, i obserwowano oczekiwany wzór reakcji w DNA trawionym BamHI lub EcoRl. W DNA BAC trawionych BamHl, fragmenty BamHl wielkości 16 i 10 kpz specyficznie reagowały z sondą pds podczas gdy z sondą otrzymaną z plazmidu pha1 reaktywny był tylko fragment o wielkości 10 kpz (fig. 1; fig. 3C i D). W DNA BAC19, BAC20 lub BAC24 trawionym EcoRl, fragmenty o wielkości 4,3, 2,8 i 1,7 kpz specyficznie reagowały z sondą pds, podczas gdy fragmenty o wielkości 5,8 i 1,7 kpz specyficznie hybrydyzowały z sondą pha1 (Fig. 1, fig. 3C i D). Fragmenty te dokładnie odpowiadały tym przewidywanym po insercji sekwencji pha1 (fig. 1) i wyciągnięto wniosek, że sekwencje plazmidu F były prawidłowo wprowadzone zamiast ORF U s 2 we wszystkich analizowanych BAC MDV-1. Poza tym zauważono pewne odmiany we wzorach prążkowania BAC19, BAC20 i BAC24 w DNA trawionym BamHl albo EcoRI, np. dodatkowy prążek wielkości około 6,2 kpz w DNA BAC19 trawionym BamHl lub dodatkowe prążki w DNA BAC20 i BAC24 trawionym EcoRl (fig. 2, 3A i B). Aby wyjaśnić kwestię obserwowanych zmian wielkości poszczególnych fragmentów enzymów restrykcyjnych, przeprowadzono hybrydyzację ze znakowanym fragmentem BamHl, ponieważ zmiany wielkości w terminalnych i wewnętrznych powtórzeniach unikalnego regionu długiego (TRL i IRL) są powszechne. Southern blotting wykazał, że dodatkowe fragmenty obserwowane w DNA BAC19, BAC20 lub BAC24 trawionym albo BamHl albo EcoRI wynikały w rzeczywistości ze zmian w TRL i IRL. Podczas gdy wykryto dwie szerokie smugi z sondą BamHl w wirusowym DNA 584Ap80C trawionym BamHl, której zakres wielkości wynosił od 9 do 15 kpz i od 4 do 8 kpz (odpowiadając odpowiednio fragmentom BamHI-D oraz -H wirulentnego MDV-1; fig. 1), oddzielne lecz inne prążki obserwowano we wszystkich analizowanych klonach BAC (fig. 4). Wszystkie inne fragmenty enzymów restrykcyjnych różnych klonów BAC okazały się identyczne jak fragmenty wirusowego DNA 584Ap80C. Potwierdzono to stosując kilka innych znakowanych fragmentów BamHl jako sondy, włączając fragmenty BamHI-A, -B, -C i I 2 (dane dla sondy BamHI-C są przykładowo ukazane w fig. 4). Odtworzenie zakaźnego MDV-1 z klonowanego DNA. DNA BAC19, BAC20 lub BAC24 transfekowano do pierwotnych CEF. W 3 do 7 dni po transfekcji pojawiły się łysinki specyficzne dla wirusa MDV-1, co ukazano przez IIF przy użyciu mab gb anty-mdv-1. MDV-1 odzyskany po transfekcji różnymi BAC posiano potem wspólnie ze świeżymi CEF i wielkości łysinek porównano z tymi indukowanymi przez rodzicielski 584Ap80C. Jak przykładowo pokazano dla łysinek barwionych w dniu 2 po zakażeniu, nie wykryto widocznych różnic wielkości łysinek między wirusami rekombinowanymi i rodzicielskimi (fig. 5A). Aby dodatkowo scharakteryzować właściwości biologiczne MDV-1 odzyskanego po transfekcji BAC, kinetykę wzrostu tych wirusów porównano z kinetyką rodzicielskiego 584Ap80C. W przypadku BAC, wirus odzyskany w dniu 5 po transfekcji był użyty do zakażenia świeżych komórek CEF posianych na 6-studzienkowych płytkach (użyto 50 pfu wirusa do zakażenia jednej studzienki zawierającej 1 x 10 6 komórek). Podobnie użyto 50 pfu 584Ap80C do zakażenia świeżych CEF w ten sam sposób.

11 PL B1 11 W różnym czasie po zakażeniu, wirus był zbierany i miareczkowany przez współposianie 10-krotnych rozcieńczeń wirusa ze świeżymi komórkami CEF. Wyniki tych doświadczeń są podsumowane w fig. 5B. Można było pokazać, że wszystkie testowane BAC MDV-1 wykazywały cechy wzrostu, które były niemal identyczne jak rodzicielskiego 584Ap80C (fig. 5B). Miana maksymalne zostały osiągnięte w 72 godziny po zakażeniu i pozostawały właściwie stałe do końca okresu obserwacji w 120 godzin po zakażeniu. Z wielkości łysinek i cech wzrostu Zgłaszający wywnioskowali, że właściwości biologiczne BAC MDV-1 in vitro były rzeczywiście nie do odróżnienia od cech szczepu rodzicielskiego. Aby zapewnić stabilność wirusów pochodzących od BAC, potomstwo transfekcji BAC BAC19 i BAC20 pasażowano cztery razy i wytworzono wirusowy DNA. Wirusowy DNA cięto BamHl lub EcoRl, rozdzielono przez elektroforezę na 0,8% żelu agarozowym i przeniesiono na błony nylonowe. Hybrydyzację przeprowadzono przy użyciu sondy pds lub pha1. Obserwowano podobne fragmenty DNA jak opisano powyżej i wzór prążkowania nie zmieniał się wraz z szeregiem pasaży potomstwa transfekcyjnego, zgodnie z analizą z użyciem dwóch sond (fig. 6). Z tych wyników Zgłaszający wywnioskowali, że sekwencje pochodzące z plazmidu F pozostawały stabilnie wprowadzone w genomach 584Ap80C odzyskanych z poszczególnych klonów BAC MDV-1 nawet po seryjnym pasażowaniu w komórkach CEF. Jednakże, jak wykazała hybrydyzacja z fragmentem BamHl i analiza PCR, zmienność sekwencji powtórzeń 132 pz była przywrócona, a w DNA ciętym BamHl lub BcoRI potomstwa transfekcyjnego obserwowano rozlaną smugę reaktywnych prążków zaraz po pierwszym pasażu wirusa (dane nie ukazane). Mutageneza BAC20 i delecja sekwencji kodujących gb. W następnych doświadczeniach stosowano ostatnio opracowaną metodę mutagenezy BAC, aby usunąć 2,3 kpz z 2,8 kpz genu gb z BAC20 (fig. 7). Po transformacji plazmidu pgetrec (Narayanan) do DH10B zawierających BAC20, gen kan R powielono z użyciem starterów pozwalających na rekombinację homologiczną z sekwencjami gb MDV-1 (tabela 1; fig. 8) i poddano elektroporacji do komórek BAC20-pGETrec. Bakterie posiano na płytki agarowe z LB zawierające chloramfenikol i kanamycynę i zebrano podwójnie oporne kolonie. Po wyizolowaniu DNA z poszczególnych kolonii przeprowadzono analizę Southern blot rekombinowanych BAC20 posiadających delecję w genie gb (20DgB). Sonda specyficzna dla kan R oraz gb wykrywała fragmenty 20DgB po cięciu BamHl, EcoRI, BglII lub Stul, które były w doskonałej zgodności z tymi obliczonymi po insercji genu oporności kan R do sekwencji kodujących gb (fig. 9). Zauważono, że, jak donoszono wcześniej, pgetrec, który nadaje oporność na ampicylinę był łatwo tracony z komórek Escherichia coli hodowanych przy braku antybiotyku (fig. 9). Z tych wyników Zgłaszający wywnioskowali, że otwarta ramka odczytu gb była prawie całkowicie usunięta z 20DgB. Analiza MDV-1 ujemnych pod względem gb odtworzonych z 20DgB. Ponieważ gb jest zasadniczy dla wzrostu wszystkich herpeswirusów analizowanych do dzisiaj (przegląd u Pereira), utworzono linię komórkową QM7 wykazującą ekspresję gb MDV-1 pod kontrolą wczesnego promotora HCMV. Pośrednie analizy immunofluorescencyjne pokazały, że rzeczywiście każda komórka linii komórkowej MgB1 wykazywała konstytutywną ekspresję gb MDV-1, co pokazano stosując mab 2K11 lub kurzą surowicę ozdrowieńczą (MDSI) (fig. 10). Aby przeanalizować wzrost BAC20 i 20DgB w różnych liniach komórkowych, sporządzono DNA i użyto go do transfekcji komórek CEF, QM7 lub MgB1. 3 do 5 dni po transfekcji obserwowano łysinki wirusa we wszystkich komórkach transfekowanych BAC20 (fig. 10). Jednakże po transfekcji DNA 20DgB łysinki obserwowano tylko w komórkach MgB1 z ekspresją gb (fig. 11). W komórkach CEF i QM7 transfekowanych 20DgB pojedyncze komórki wykazywały ekspresję wczesnego genu pp38, co pokazano przez reaktywność z mab H19 (Lee i inni) lecz tworzenie się łysinek było zahamowane (fig. 11). Te wyniki, że gb jest zasadniczy dla rozprzestrzeniania się MDV-1 z komórki do komórki in vitro, potwierdzono przez wspólne posianie komórek MgB1 zakażonych 20DgB z komórkami CEF, QM7 lub świeżymi MgB1. Jak okazało się po pierwotnej transfekcji, tworzenie łysinek obserwowano jedynie po wspólnym posianiu z komórkami z ekspresją gb (tabela 2). Z tych wyników Zgłaszający wywnioskowali, że gb MDV-1 jest zasadniczo konieczny do rozprzestrzeniania się MDV-1 z komórki do komórki w hodowli komórkowej. Chociaż wirus choroby Mareka jest istotnym patogenem kurcząt, który powoduje nowotwory limfocytów T i wysoką śmiertelność wśród zakażonych zwierząt, mało wiadomo o funkcji poszczególnych genów i produktów genowych w litycznej, utajonej czy nowotworowej fazie zakażenia. Analiza genów MDV-1 i produktów genowych została bardzo zaburzona z dwóch głównych powodów. Po pierwsze, hodowane komórki zakażone MDV-1 nie dawały wolnego zakaźnego wirusa, a po drugie, efektywny

12 12 PL B1 wzrost MDV-1 w hodowanych komórkach jest ograniczony do pierwotnych lub wtórnych fibroblastów zarodków kurzych. Skutkiem tego, mutageneza przy użyciu konwencjonalnej rekombinacji homologicznej stosowanej do mutowania innych Alphaherpesvirinae jest pracochłonna, czasochłonna i wymaga stałego zaopatrzenia w pierwotne komórki. Podczas gdy mutageneza HSV i PrV jest z pewnością ułatwiona przez stosowanie technologii BAC, konwencjonalna mutageneza polegająca na rekombinacji homologicznej w komórkach eukariotycznych reprezentuje standardową technikę dla tych dwóch wirusów i wytworzone zostały liczne zmutowane wirusy. Dla kontrastu, dla mutagenezy BAC MDV-1 klonowanie i mutageneza są główną zaletą. Po sklonowaniu genomu MDV-1 jako BAC i umożliwieniu stabilnego utrzymywania w Escherichia coli, tworzenie mutantów i analiza zasadniczych genów powinna być stosunkowo łatwa. W rzeczywistości, możliwe było klonowanie kompletnego genomu szczepu 584Ap80C jako zakaźnego BAC. Szczep 584Ap80C jest potomstwem bardzo wirulentnego plus (vv+) szczepu MDV-1 584A po 80 seryjnych pasażach na komórkach CEF (Witter, 1997). Analiza klonowanych genomów MDV-1 występujących w BAC19, BAC20 i BAC24 pokazała, że odmiany wzorów enzymów restrykcyjnych są oczywiste. Tę heterogenność można było przypisać odmianom we fragmentach BamHl-D oraz -H. Wiadomo, że zmienne liczby tandemowych powtórzeń 132 pz występują w różnych szczepach MDV-1 oraz że liczba powtórzeń zwiększa się po seryjnym pasażowaniu w hodowanych komórkach (Maotani, Silva, Fukuchi). Poza tym liczba tandemowych powtórzeń 132 pz była związana z utratą onkogenności, ponieważ w szczepach wirulentnych wykazano stałą liczbę tych ugrupowań (Fukuchi i inni, 1985; Bradley i inni, 1989), chociaż ostatnie prace nad szerokim zastosowaniem szczepionki szczepu CVI 988 Rispens pokazały, że może nie być żadnej bezpośredniej korelacji między małą liczbą powtórzeń 132 pz a wirulencją. W przypadku szczepu 584Ap80C MDV-1, hybrydyzacja wirusowego DNA trawionego enzymem restrykcyjnym z fragmentem BamHI-D dała rozlane wzory prążkowe wskazując na zmienną liczbę powtórzeń występujących w populacji wirusa. Dla kontrastu, zidentyfikowano tylko pojedyncze silnie reaktywne prążki w każdym z klonów BAC z tą samą sondą. Jednakże wielkości reaktywnych prążków po cięciu BacHI lub EcoRI różniły się między BAC19, BAC20 i BAC24 wskazując, że genomy zawierające różne liczby powtórzeń 132 pz zostały sklonowane. Tę interpretację uzasadniono poprzez analizy PCR namierzające powtórzenia 132 pz. Podczas gdy typowy, podobny do drabinki wygląd produktów PCR otrzymano dla DNA 584Ap80C (Becker i inni, 1993), w przypadku BAC19, BAC20 lub BAC24 z klonowanego wirusowego DNA powielono oddzielne prążki. Wywnioskowano zatem, że zmienne wzory dla enzymów restrykcyjnych różnych klonów BAC wynikały z różnych liczb tandemowych powtórzeń 132 pz występujących w poszczególnych klonach, które nie wpływały na zakaźność klonowanego DNA, ponieważ zakaźny wirus odzyskano po transfekcji DNA wyizolowanego z każdego z różnych klonów BAC. Po klonowaniu kompletnego genomu MDV-1 i udowodnieniu zakaźności klonowanego DNA MDV-1, do usunięcia sekwencji kodujących gb z BAC20 użyto ostatnio opracowany system mutagenezy, w którym liniowy fragment DNA może być rekombinowany do DNA rezydującego w bakterii i który jest katalizowany przez rece (Narayanan, muyrers). Mutageneza opiera się na genie rece, rect i gam λ hamującym recb/c, występującym na plazmidzie pgetrec (Narayanan i inni, 1999). Dużą zaletą systemu, który wykorzystano po raz pierwszy do manipulacji genomem wirusa jest to, że: (i) do namierzenia specyficznej sekwencji do usunięcia potrzeba ramion homologii mających tylko 30 do 50 pz, czyli delecję każdej otwartej ramki odczytu można osiągnąć bez potrzeby klonowania kaset rekombinacji, (ii) metoda jest bardzo szybka, oraz (iii) że wektor pgetrec nadający systemowi mutagenezy i powodujący ekspresję oporności wobec ampicyliny, jest szybko tracony z komórek bakteryjnych przy nieobecności ampicyliny. Po elektroporacji produktu PCR bez gb do komórek BAC20 zawierających pgetrec, otrzymano między 10 a 30 kolonii o podwójnej oporności cam R i kan R. Jedną z kolonii nazwano 20DgB-1 i wybrano do dalszych analiz, ponieważ utraciła ona pge- Trec zaraz po posianiu na płytce agarowej zawierającej chloramfenikol i kanamycynę. Analizy Southern blot wykazały powodzenie delecji genu gb i insercję genu kan R w 20DgB-1. MDV-1 odzyskany po transfekcji komórek CEF z użyciem 20DgB-1 był niezdolny do przenoszenia z zakażonych komórek do sąsiednich komórek, wskazując, że gb MDV-1 podobnie jak jego odpowiedniki w innych wirusach opryszczki jest zasadniczy dla przenoszenia zakaźności z komórki do komórki. Ponieważ MDV-1 jest w wysokim stopniu powiązany z komórką i nie uwalnia zakaźnego wirusa do pożywki hodowlanej. Zgłaszający nie mieli możliwości prześledzenia możliwej roli gb MDV-1 we wnikaniu wirusa. Wytworzony mutant gb reprezentuje pierwszy przykład MDV-1 z delecją zasadnicze-