(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/NL00/00152 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/NL00/00152 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , WO00/53787 PCT Gazette nr 37/00 (51) Int.Cl. C12N 15/40 ( ) C12N 7/04 ( ) C07K 14/08 ( ) A61K 39/12 ( ) (54) Replikony zespołu reprodukcyjnego i oddechowego świń (PRRSV), zastosowanie replikonów PRRSV, szczepionki zawierające replikony PRRSV i zastosowanie tych szczepionek (30) Pierwszeństwo: ,EP, (73) Uprawniony z patentu: BOEHRINGER INGELHEIM VETMEDICA GmbH,Ingelheim nad Renem,DE (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 08/03 (72) Twórca(y) wynalazku: Janneke Meulenberg,Amsterdam,NL Helene Verheije,Zeist,NL (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 01/10 (74) Pełnomocnik: Bartnik Urszula, POLSERVICE, Kancelaria Rzeczników Patentowych Sp z o.o. PL B1

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku są replikony zespołu reprodukcyjnego i oddechowego świń (PRRSV), zastosowanie replikonów PRRSV, szczepionki zawierające replikony PRRSV i zastosowanie tych szczepionek. Wirus zespołu reprodukcyjnego i oddechowego świń (porcine reproductive and respiratory syndrome virus - PRRSV) jest wirusem RNA o pozytywnej nici, należącym do rodziny arteriwirusów wraz z końskim wirusem zapalenia tętnic (equine arteritis virus - EAV), wirusem podwyższającym poziom dehydrogenazy mleczanowej (lactate dehydrogenase-elevating virus - LDV) i wirusem małpiej gorączki krwotocznej (simian hemorrhagic fever virus) (Meulenberg i wsp., 1993). Ostatnio Międzynarodowa Komisja ds. Taksonomii Wirusów zdecydowała o włączeniu tej rodziny do nowego rzędu wirusów - Nidovirales - wraz z Coronaviridae (długość genomowa kb) i Toroviridae (długość genomowa kb). Rząd Nidovirales zawiera wirusy RNA w otoczkach, zawierające genom RNA o nici dodatniej i wytwarzające w czasie replikacji umiejscowiony na 3' zestaw RNA subgenomowych. Subgenomowe RNA koronawirusów i arteriwirusów zawierają sekwencję liderową, pochodzącą z końca 5' genomu wirusa. Subgenomowe RNA torowirusów nie zawierają sekwencji liderowej. Podczas gdy ORF 1a i 1b, kodujące zależną od DNA polimerazę RNA, ulegają ekspresji z RNA genomowego, mniejsze ORF na końcu 3' genomów Nidovirales, kodujące białka strukturalne, ulegają ekspresji z mrna subgenomowego. W niniejszym opisie replikon definiuje się jako pochodzący z rekombinowanego kwasu nukleinowego. Chociaż pojawiają się informacje na temat genomu PRRSV, nie wiadomo na przykład, gdzie mogą być umiejscowione delecje lub modyfikacje w genomie PRRSV, aby powstały rekombinowany kwas nukleinowy można było zastosować jako replikon czynnościowy, umożliwiający replikację RNA in vivo, w (komplementarnych) komórkach wykazujących lub nie, ekspresję zasadniczych białek wirusowych (PRRS) takich jak polimeraza lub białka strukturalne (otoczkowe), lub umożliwiający niezależną replikację RNA in vivo u zwierząt, takich jak świnie, po szczepieniu szczepionką zawierającą kwas nukleinowy, kodujący taki replikon PRRS. PRRSV (wirus Lelystad) został po raz pierwszy wyizolowany w 1991 r. przez Wensvoorta i wsp. (1991) i udowodniono, że jest on przyczyną nowej choroby, znanej obecnie jako zespół reprodukcyjny i oddechowy świń (PRRS). Głównymi objawami choroby są zaburzenia oddechowe u świń i poronienia u macior, niekiedy powikłane padnięciem maciory. Chociaż ustały największe epidemie, takie jak obserwowane po raz pierwszy w Stanach Zjednoczonych w roku 1987 i w Europie w 1991, wirus ten, w swoich rozmaitych mniej lub bardziej zjadliwych postaciach, nadal powoduje znaczne straty ekonomiczne w stadach w Stanach Zjednoczonych, Europie i Azji. PRRSV preferencyjnie rozwija się w makrofagach pęcherzyków płucnych (Wensvoort i wsp., 1991). Na wirus podatnych jest również kilka linii komórkowych, takich jak CL2621 i inne linie komórkowe, klonowane z małpiej linii komórek nerkowych MA-104. Niektóre dobrze znane szczepy PRRSV znane są pod numerem CNCM I-1102, I-1140, I-1387, I-1388, ECACC V lub ATCC VR 2332, VR 2385, VR 2386, VR 2429, VR 2474 i VR Genom PRRSV ma długość 15 kb i zawiera geny kodujące zależną od RNA polimerazę RNA (ORF1a i ORF1b) i geny kodujące białka strukturalne (ORF 2-7; Meulenberg i wsp., 1993 i Meulenberg i wsp., 1996). ORF 5 koduje główną glikoproteinę otoczki, oznaczoną jako GP 5. ORF 2, 3 i 4 kodują, odpowiednio, glikoproteiny oznaczone jako GP 2, GP 3 i GP 4. Glikoproteiny te nie są tak szeroko obecne w oczyszczonych wirionach izolatów wirusa Lelystad PRRSV. Białko GP 5 tworzy połączony dwusiarczkami heterodimer z białkiem błonowym M kodowanym przez ORF6. Białko nukleokapsydu N jest kodowane przez ORF7. Analiza sekwencji genomowej izolatów PRRSV z Europy i Ameryki Północnej i ich reaktywność z przeciwciałami monoklonalnymi dowiodła, że stanowią one dwa różne typy antygenów. Izolaty z tych kontynentów są genetycznie różne i rozwój ich, od wspólnego przodka, musiał podążyć inną drogą względnie dawno temu (Murtaugh i wsp., 1995). Świnie zarażają się PRRSV przez pysk i jamę nosową. Wirus w płucach jest wychwytywany przez makrofagi w pęcherzykach płucnych i w komórkach tych replikacja PRRSV dokonuje się w ciągu 9 godzin. PRRSV przemieszcza się z płuc do węzłów chłonnych płuc w czasie 12 godzin i do obwodowych węzłów chłonnych, szpiku kostnego i śledziony w ciągu 3 dni. W miejscach tych tylko nieliczne komórki barwią się dodatnio w kierunku antygenu wirusowego. Wirus obecny jest we krwi przez co najmniej 21 dni, a często znacznie dłużej. Po 7 dniach stwierdza się obecność przeciwciał przeciwko PRRSV we krwi. Jednoczesna obecność wirusa i przeciwciał u świń zakażonych PRRS wskazuje, że

3 PL B1 3 zakażenie wirusem może utrzymywać się długo, chociaż na niskim poziomie, mimo obecności przeciwciał. Przez co najmniej 7 tygodni populacja komórek pęcherzyków płucnych różni się od prawidłowych płuc SPF. PRRSV wymaga zakażenia świń swą otoczką przez pysk i jamę nosową, a fizjologiczna reakcja immunologiczna świni obejmuje zatem między innymi wytwarzanie neutralizujących przeciwciał, skierowanych przeciwko jednemu lub więcej białku otoczki; przeciwciała te mogą wyeliminować zakaźność wirusa. Po dojściu do makrofagów pęcherzyków płucnych wirus wytwarza jednak również nagie kapsydy, utworzone z RNA zamkniętego w kapsydzie z białka M i/lub N, niekiedy częściowo zawierających którąkolwiek z glikoprotein. Wewnątrz- i zewnątrzkomórkową obecność tych niekompletnych cząstek wirusowych lub (częściowo) nagich kapsydów można wykazać w mikroskopii elektronowej. Niekiedy można stwierdzić obecność nagich kapsydów bez zawartości kwasu nukleinowego. Nagie kapsydy wykazują rozmieszczenie w całym organizmie, przenosząc się z krwią, i są wychwytywane z krwi przez makrofagi w śledzionie, węzłach chłonnych i szpiku kostnym. Nie jest możliwa neutralizacja tych nagich, lecz zakaźnych kapsydów wirusowych przez przeciwciała wytworzone przez organizm świni, co wyjaśnia utrzymywanie się zakażenia wirusowego w obecności przeciwciała. W ten sposób potomstwo makrofagów z zakażonych komórek szpiku kostnego szerzy zakażenie wirusowe do nowych okolic ciała. Ponieważ nie wszystkie komórki linii makrofagów szpiku kostnego są zakażone, jedynie niewielka liczba makrofagów na obwodzie jest zakażona i wytwarza wirusy. Kapsydy PRRSV, złożone jedynie z białek ORF7, mogą tworzyć się w nieobecności innych białek wirusowych, poprzez na przykład zakażenie makrofagów rekombinacyjnym wektorowym wirusem wścieklizny rzekomej ORF7. Wirus PRV poddano manipulacji tak, aby zawierał genetyczną informację ORF7 PRRSV. Po 18 godzinach od zakażenia cytoplazma zakażonych komórek zawiera dużą liczbę małych, pustych struktur sferycznych o wymiarach nukleokapsydów wirusa PRRS. Chociaż dostępne są obecnie żywe atenuowane i zabite szczepionki PRRSV, wykazano, że ogólnie nie są one dostatecznie immunogenne, lub są zbyt zjadliwe dla pewnych grup świń, na przykład dla młodych prosiąt lub macior w trzecim trymestrze ciąży. Oczywiste jest, że niedostatecznie immunogenna szczepionka PRRSV nie utrzyma się na rynku. Jednakże niektóre z istniejących szczepionek immunogennych nie są bezpieczne, co ilustruje konieczność wprowadzenia atenuowanych szczepionek PRRSV o zmniejszonej zjadliwości. Ponadto, znów w szczególnych okolicznościach, niektóre z istniejących szczepionek szerzą się w populacji, i mogą w niezamierzony sposób zakażać inne świnie, nie wymagające szczepienia lub takie, u których szczepienie jest przeciwwskazane, co ilustruje konieczność wprowadzenia nie szerzących się szczepionek PRRSV. Ponadto, dostępnych szczepionek nie można zwykle odróżnić od wirusa typu dzikiego, co ilustruje konieczność wprowadzenia tak zwanej szczepionki markerowej, uzyskanej na przykład poprzez mutagenezę genomu, tak aby świnie zaszczepione można było odróżnić od świń zakażonych wirusem dzikim na podstawie różnicy przeciwciał w surowicy. Ponadto szczepionki PRRS, szeroko stosowane na całym świecie, i zwykle nie zakażające zwierząt innych, niż świnie, byłyby potencjalnie atrakcyjnymi szczepionkami do przenoszenia obcych antygenów pochodzących z innych (świńskich) patogenów dla zapewnienia ochrony przez tymi innymi patogenami, co ilustruje konieczność opracowania nośnika PRRSV lub szczepionek wektorowych, umożliwiających szczepienie przeciwko tym innym patogenom lub pozwalających na pozytywną identyfikację markera. Oczywiste jest, że korzystne byłoby sporządzenie takiej szczepionki PRRSV, która łączyłaby w sobie kilka tych cech, niniejszy wynalazek zapewnia tą właśnie potrzebę. Przedmiotem wynalazku jest replikon wirusa zespołu reprodukcyjnego i oddechowego świń (PRRSV), charakteryzujący się tym, że co najmniej niektóre z jego oryginalnych kwasów nukleinowych PRRSV uległy delecji, przy czym replikon ten zdolny jest do replikacji RNA in vivo i zawiera co najmniej elementy sekwencji z regionu niekodującego 5' ORF1a-ORF1b-ORF7-regionu niekodującego 3' PRRSV i kwas nukleinowy, odpowiadający regionowi między nukleotydami z ORF7 PRRSV. Replikon według wynalazku zawiera ponadto kwas nukleinowy pochodzący z co najmniej jednego drobnoustroju heterologicznego, oraz korzystnie zawiera ponadto substytucje lub delecje kwasu nukleinowego w genie ORF7, kodującym białko N, powodujące, że jest niezdolny do tworzenia kapsydu białka N.

4 4 PL B1 Ponadto, bardziej korzystnie, zawiera modyfikację kwasu nukleinowego, polegającą na delecji cysteiny w białku N w pozycjach 27 i/lub 76. W innej korzystnej odmianie wynalazku, replikon zawiera modyfikację kwasu nukleinowego prowadzącą do zmiany aminokwasu regionu B, zawierającego aminokwasy 25-30, i regionu D, zawierającego aminokwasy i/lub aminokwasów białka N. Do replikona według wynalazku, korzystnie można także wprowadzić umożliwiający rozróżnienie serologiczne. W takim wykonaniu wynalazku, korzystnie replikon zawiera ponadto modyfikację kwasu nukleinowego prowadzącą do zmiany aminokwasów oryginalnej reszty asparaginowej w pozycji 62 białka N, a modyfikacja kwasu nukleinowego może korzystnie prowadzić do zmiany aminokwasów w ORF2, 3, 4, 5 i/lub 6. Replikon według wynalazku zawiera modyfikację kwasu nukleinowego w markerze wirulencji PRRSV, przy czym korzystnie modyfikację kwasu nukleinowego ma miejsce w ORF6, kodującej białko M przezbłonowe. Ta modyfikacja replikonu według wynalazku modyfikuje białko M między jego drugim a trzecim fragmentem przechodzącym przez błonę. Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie replikonu jak zdefiniowano powyżej do wytwarzania szczepionki. Korzystnie, szczepionka wytworzona w zastosowania według wynalazku jest szczepionką nierozprzestrzeniającą się, a bardziej korzystnie szczepionka ta jest szczepionką markerową. Przedmiotem wynalazku jest także szczepionka zawierająca replikon jak zdefiniowano powyżej. Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie szczepionki jak zdefiniowano powyżej do szczepienia świń. Kolejno, przedmiotem wynalazku jest replikon wirusa zespołu reprodukcyjnego i oddechowego świń (PRRSV), zdolny do replikacji RNA in vivo, charakteryzujący się tym, że zawiera co najmniej elementy sekwencji z regionu niekodującego 5' ORF1a-ORF1b-ORF7-region niekodujący 3' PRRSV i kwas nukleinowy, odpowiadający regionowi nukleotydom między nukleotydami z regionu ORF7 PRRSV i ponadto zawierający kwas nukleinowy pochodzący z co najmniej jednego heterologicznego drobnoustroju. Replikon według wynalazku zawiera ponadto substytucje lub delecje w genie ORF7, kodującym białko N, powodujące, że jest niezdolny do tworzenia kapsydu białka N. Modyfikacje kwasu nukleinowego, polegają w tym replikonie według wynalazku, na delecji cysteiny w białku N w pozycjach 27 i/lub 76. W innym korzystnym wykonaniu, modyfikacja kwasu nukleinowego może też prowadzić do zmiany aminokwasu regionu B, zawierającego aminokwasy 25-30, i regionu D, zawierającego aminokwasy i/lub aminokwasów białka N. Replikon według wynalazku ma wprowadzony marker umożliwiający rozróżnienie serologiczne. W kolejnym korzystnym rozwiązaniu replikon według wynalazku zawiera modyfikację kwasu nukleinowego prowadzącą do zmiany aminokwasów oryginalnej reszty asparaginowej w pozycji 62 białka N, a bardziej korzystnie replikon zawiera modyfikację kwasu nukleinowego prowadzącą do zmiany aminokwasów w ORF2, 3, 4, 5 i/lub 6, lub także może zawierać modyfikację kwasu nukleinowego w markerze wirulencji PRRSV. W najbardziej korzystnym wykonaniu replikon zawiera modyfikację kwasu nukleinowego w ORF6, kodującą białko M przechodzące przez błonę, a modyfikacja ta modyfikuje białko M między jego drugim a trzecim fragmentem przechodzącym przez błonę. Replikon według wynalazku zawierający ponadto kwas nukleinowy pochodzący z co najmniej jednego heterologicznego mikroorganizmu charakteryzuje się tym, że ten drobnoustrój heterologiczny zawiera patogen, a patogenem tym korzystnie jest wirus. Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie replikonu jak zdefiniowano powyżej do wytworzenia szczepionki. Szczepionka wytworzona zgodnie z zastosowaniem według wynalazku jest szczepionką nie rozprzestrzeniającą się, lub bardziej korzystnie szczepionką markerową. Przedmiotem wynalazku jest także szczepionka zawierająca replikon jak zdefiniowano powyżej. Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie tej szczepionki według wynalazku do szczepienia świń. Jak to zdefiniowano powyżej szczegółowo przedmiotem niniejszego wynalazku jest replikon zespołu reprodukcyjnego i oddechowego świń (PRRSV), zawierający co najmniej niektóre z oryginalnych delecji kwasów nukleinowych PRRSV, zawierający również substytucje, przy czym replikon ten

5 PL B1 5 zdolny jest do replikacji RNA in vivo, a ponadto pozbawiony jest co najmniej kilku z oryginalnych kwasów nukleinowych PRRSV i/lub został uzupełniony kwasami nukleinowymi pochodzącymi z heterologicznego drobnoustroju. Nieoczekiwanie stwierdzono, że genom PRRSV można pozbawić dość dużej ilości jego kwasów nukleinowych. Niezależny i funkcjonalny replikon PRRSV, zdolny do niezależnej replikacji RNA in vivo, może nadal istnieć, jeżeli delecji i/lub modyfikacji uległ odcinek kwasu nukleinowego, kodujący ORF2-ORF6. Dysponowanie replikonem, w którym tak długi odcinek kwasu nukleinowego uległ delecji lub modyfikacji, otwiera szerokie możliwości dodania do tego replikonu heterologicznego kwasu nukleinowego, pochodzącego z dowolnego organizmu innego, niż PRRSV, zapewniając w ten sposób replikon wektora PRRSV o dużych możliwościach nośnikowych. Jednocześnie niniejszy wynalazek zapewnia identyfikację konkretnych regionów kwasu nukleinowego w genomie wirusa zespołu reprodukcyjnego i oddechowego świń, istotnych dla atenuacji wirusa, do nadania im właściwości nieszerzenia się, lub szerzenia się w niewielkim stopniu, lub w celu wprowadzenia markera, bez uszkadzania wirusowego kwasu nukleinowego w takim stopniu, aby nie mógł zapewniać replikacji RNA in vivo. Ponadto twórcy wynalazku wykazali, że replikon PRRSV można stosować jako wektor ekspresji obcych antygenów, korzystnie, pochodzących z innych (świńskich) patogenów, umożliwiając szczepienie przeciwko tym innym patogenom i pozytywną identyfikację markera. Minimalnymi wymaganiami co do sekwencji dla replikonu PRRSV lub replikonu wektora PRRSV według niniejszego wynalazku są zasadnicze elementy, zawierające niekodujący region 5'-ORF1a- -ORF1b-ORF7-region kodujący 3' (na przykład z regionu polimerazy PRRSV), przez co region kodujący ORF7 można poddać dalszej delecji, na przykład według danych ukazanych na fig. 2. W korzystnym wykonaniu przedmiotem niniejszego wynalazku jest replikon PRRSV lub wektor, zawierający co najmniej zasadnicze elementy z regionu polimerazy PRRSV, takie na przykład, jak to opisano poniżej i/lub zawierający co najmniej kwas nukleinowy, pochodzący z zasadniczego regionu 44 nukleotydów między nukleotydami a w genie ORF7 (jak to zidentyfikowano w sekwencji kwasu nukleinowego izolatu wirusa Lelystad PRRSV, jednakże specjalista może łatwo ocenić przez wyrównanie, w którym dowolnym innym genomie PRRSV dany zasadniczy element się znajduje). W innym wykonaniu przedmiotem niniejszego wynalazku jest replikon PRRSV, zawierający co najmniej kwas nukleinowy, pochodzący z zasadniczych elementów sekwencji z ORF1a i ORF1b, lub z regionu polimerazy PRRSV, i w którym delecji poddano kwas nukleinowy z ORF2, ORF3, ORF4, ORF5, ORF6 lub niezasadnicze elementy z ORF7, umożliwiając insercję obcego kwasu nukleinowego, zapewniając w ten sposób replikonowi wektora PRRSV zdolności kodowania obcego antygenu. Pozostaje to w kontraście w stosunku do opisu WO98/55626, w którym polimerazę homologiczną zastępuje się heterologiczną polimerazą arteriwirusową w celu uzyskania ekspresji ORF2-ORF7, w zasadzie bez opisywania ekspresji obcych antygenów, pochodzących z innych (świńskich) patogenów dla zapewnienia ochrony przed tymi innymi patogenami (i tym bardziej, w którym kwas nukleinowy genomu PRRSV, kodujący obce antygeny, może być umiejscowiony tak, aby dostarczyć replikonu wektora PRRSV, lub którego zasadnicze elementy sekwencji powinny pozostać). Uważa się, że poliproteina replikazowa PRRSV, kodowana przez ORF1, ulega cięciu na 13 ulegających obróbce produktów końcowych (zwanych białkami niestrukturalnymi - nonstructural proteins - nsps) i dużą liczbę produktów pośrednich. Poliproteina jest rozszczepiana przez domeny proteazowe, zlokalizowane w nsp1α, nsp1β, nsp2 i nsp4. Zidentyfikowano zasadnicze motywy RNA- -zależnej polimerazy RNA PRRSV i wiązania trójfosforanu nukleozydu/helikazy RNA, odpowiednio, w nsp9 i nsp10. Inną zachowaną (zasadniczą) domenę odkryto w nsp11, zachowaną domenę bogatą w Cys/His znaleziono w nsp10. Wykazano na przykład, że to ostatnie białko odgrywa rolę w syntezie mrna subgenomowego. W innym wykonaniu przedmiotem niniejszego wynalazku jest replikon PRRSV, zdolny do niezależnej replikacji RNA in vivo, przy czym replikon ten jest transkryptem RNA zakaźnego cdna-kopii. Dla wielu RNA nici dodatniej wykazano, że ich regiony 5' i/lub 3'-końcowe zawierają zasadnicze sygnały, kontrolujące zapoczątkowanie syntezy nici plus i minus RNA. Dla PRRSV nie ustalono, czy same te sekwencje wystarczają do replikacji. Podobnie jak w przypadku większości wirusów RNA, PRRSV zawiera zwięzły genom i oczekuje się, że większość informacji genetycznej ma znaczenie zasadnicze. Ponadto nie jest jeszcze znana maksymalna zdolność integracji obcych genów do genomu PRRSV. Dodatkowym ograniczeniem jest to, że ORF, kodujące białka strukturalne PRRSV, częściowo nakładają się na siebie. Wprowadzenie mutacji do tych nakładających się regionów często

6 6 PL B1 powoduje powstanie dwóch zmutowanych białek strukturalnych, bardziej prawdopodobne jest zatem wytworzenie nieżywotnego wirusa. Wytworzenie klonu zakaźnego umożliwiło analizę sygnałów replikacji w genomie PRRSV. W badaniu tym dokonano mapowania elementów sekwencji o działaniu cis, koniecznych do replikacji, przez wprowadzenie delecji do klonu zakaźnego. Nieoczekiwanie wykazano, że również elementy sekwencji o działaniu cis z regionu genomu, kodującego białka strukturalne, mają zasadnicze znaczenie dla właściwej replikacji. Wykazano, że transkrypty pochodzące z klonów cdna, w których brak jest genu ORF7, nie ulegają replikacji. Bardziej systematyczna analiza delecji wykazała, że region 44 nukleotydów między nukleotydami a w genie ORF7 miał zasadnicze znaczenie dla replikacji RNA PRRSV. Było to interesujące odkrycie, ponieważ sekwencje o zasadniczym znaczeniu dla replikacji większości wirusów RNA o nici dodatniej są obecne w regionach niekodujących 5' i 3'. Jest to stwierdzenie ważne dla badań, których celem jest opracowanie replikonów wirusowych, które można ocalić jedynie poprzez uzupełnienie liniami komórkowymi, wykazującymi ekspresję ORF, które uległy delecji. Minimalne wymagania sekwencji dla tych RNA są umiejscowione w regionie niekodującym 5'-ORF1a-ORF1b-ORF7-regionie niekodującym 3'. RNA wirusowe lub replikony zawierające te elementy sekwencji, uzupełnione wyborem fragmentów z innych otwartych ramek odczytu PRRSV lub fragmentów otwartych ramek odczytu, wykazujących ekspresję antygenów lub innych (heterologicznych) patogenów, można pakować do cząstek wirusa, gdy białka zasadnicze dla wytworzenia wirusa dostępne są w postaci trans. Gdy cząstki te podaje się świniom, na przykład jako szczepionkę, będą wchodzić do swoistych komórek-gospodarzy, takich jak makrofagi antygeny wirusowe lub heterologiczne ulegają ekspresji i indukują reakcje immunologiczne z uwagi na replikujący RNA. Jednakże ponieważ RNA nie wykazuje ekspresji (wszystkich) białek koniecznych do pakowania i wytwarzania nowych cząstek, replikon nie może szerzyć się dalej, tworząc bardzo skuteczną, lecz bezpieczną i nie szerzącą się szczepionkę rekombinacyjną, skutecznie działającą przeciwko PRRSV i/lub patogenom heterologicznym. W korzystnym wykonaniu przedmiotem niniejszego wynalazku jest replikon według niniejszego wynalazku, niezdolny do tworzenia kapsydu N-białkowego. Na przykład obecne są dwie reszty Cys w pozycjach 27 i 76 w sekwencji białka N i poddanie mutacji lub delecji Cys-27 i Cys-76 z białka N hamuje wytwarzanie zakaźnych cząstek PRRSV. Gen ORF7, kodujący białko N, poddano mutacji jako taki, tak że podstawiono reszty Cys za reszty Asn i Leu, jednakże substytucja innym aminokwasem lub delecja sekwencji kodującej prowadzi również do pożądanego wyniku, jak to można na przykład zobaczyć poniżej. Następnie mutacje Cys-27 i Cys-76 wprowadzono do zakaźnego klonu pabv437 izolatu wirusa Lelystad PRRSV, tworząc plazmidy pabv (Cys-27 Asn) i pabv (Cys-76 Leu). RNA transkrybowano z tych zmutowanych klonów zakaźnych i transfekowano do komórek BHK-21. Białka strukturalne uległy odpowiedniej ekspresji, te zmutowane RNA poddano replikacji i uzyskano syntezę RNA subgenomowego. Jednakże nie doszło do wydzielenia zakaźnych cząstek, ponieważ przeniesienie nadsączu z transfekowanych komórek BHK-21 do makrofagów nie spowodowało wytwarzania białek wirusowych w makrofagach ani też indukcji cpe. Tak więc reszty te mają zasadnicze znaczenie dla właściwej struktury, czynności lub i struktury, i czynności białka N w tworzeniu wirusa PRRSV. Białko N bierze udział w pierwszych etapach powstawania wirusa, wiązaniu wirusowego RNA genomowego i tworzeniu struktury kapsydu. Ponieważ transkrypty klonów cdna o długości genomowej, zawierające delecję Cys-27 i/lub Cys-76, ulegały replikacji na poziomie typu dzikiego, mutacje w resztach Cys niszczą wiązanie RNA przez białko N. Zamiast tego indukują one różną strukturę białka N, hamującego tworzenie się prawidłowych kapsydów. Defekt w zamykaniu wirusowego genomu RNA w kapsydzie można uzupełnić poprzez przejściową lub stałą ekspresję białka N typu dzikiego w linii komórkowej BHK-21. W ten sposób wytwarzany jest wirus zdolny do ukończenia tylko jednego cyklu zakażenia/replikacji. Tak więc wirus taki uważa się za bardzo bezpieczną szczepionkę do ochrony przed PRRSV u świń. Zgodnie z innym przykładem wynalazek dostarcza replikon niezdolny do tworzenia kapsydu białka N, w którym substytucje w genomie kodującym okolicę białka N, zawierającą dwa regiony antygenowe, oznaczone B i D, hamują wytwarzanie zakaźnych cząstek wirusowych. Region B zawiera aminokwasy (QLCQLL), region D; aminokwasy (PEKPHFPLAAEDDIRHH), region D i aminokwasy (ISTAFNQGAGT) białka N PRRSV. Przy wyrównywaniu białek N tych szczepów znajduje się odpowiednie miejsce w VR2332 i innych szczepach amerykańskich. Ponieważ replikacja

7 PL B1 7 RNA i synteza mrna genomowego wydawała się pozostawać na poziomie właściwym dla typu dzikiego, mutacje te najprawdopodobniej zapobiegały tworzeniu właściwych kapsydów przez białko N. Wynalazek dostarcza ponadto replikon do którego wprowadzono marker umożliwiający rozróżnienie serologiczne. Na przykład wynikiem mutagenezy pojedynczego aminokwasu w regionie D (Asp-62 lub należące do niego aminokwasy) białka N jest powstanie replikonu o profilu wiązania MAb różnym od PRRSV i wszystkich innych wirusów PRRSV. Replikon taki indukuje różne spektrum przeciwciał u świń, w porównaniu z tymi innymi izolatami PRRSV. Tak więc można go odróżnić od wirusa dzikiego na podstawie przeciwciał w surowicy i jest mutantem doskonale nadającym się do dalszego rozwoju szczepionek markerowych przeciwko PRRSV. Powyższy przykład obejmuje subtelną modyfikację, dającą w wyniku replikon nadający się do szczepionki markerowej. Obecnie są jednak możliwe bardziej szerokie zmiany, jeżeli wie się, że można częściowo lub całkowicie usunąć kwas nukleinowy kodujący białka strukturalne 2, 3, 4, 5 i/lub 6 bez hamowania właściwości replikacyjnych powstałego replikonu. Replikon PRRSV nie posiadający jednego lub kilku (antygenowych) fragmentów tych białek strukturalnych jest korzystny, ponieważ nie dochodzi do powstawania reakcji immunologicznej, konkretniej, do wytwarzania przeciwciał przeciwko tym usuniętym fragmentom, na przykład po szczepieniu szczepionką zawierającą taki replikon. Ponownie, taki replikon indukuje spektrum przeciwciał u świń różne od spektrum dla PRRSV typu dzikiego. Tak więc można go odróżnić od wirusa dzikiego na podstawie przeciwciał w surowicy i jest on doskonałym mutantem do dalszego rozwoju szczepionek markerowych przeciwko PRRSV. Ponadto wynalazek dostarcza replikon, zawierający modyfikację kwasu nukleinowego w markerze wirulencji PRRSV. Nie wyjaśniono dokładnie znaczenia markerów wirulencji PRRSV, mimo tego, że obserwowano rozmaite różnice w wirulencji. Dla powodzenia w atenuowaniu PRRSV lub jego replikonu wiedza ta jest jednak przydatna, do doboru najmniej zjadliwego, lecz najbardziej immunogennego możliwego replikonu lub wirusa. Obecnie, kiedy wiadomo, że możliwa jest delecja lub modyfikacja regionu ORF2-ORF6 bez wpływu na właściwości replikacji RNA in vivo, takie markery wirulencji można łatwo wykrywać. Na przykład przedmiotem niniejszego wynalazku jest replikon, zawierający modyfikację kwasu nukleinowego w ORF6, kodującym białko M błonę przechodzące przez. Stwierdzono, że to białko błonowe wpływa na tworzenie wirusa, stabilność wirusa lub wchodzenie wirusa do makrofagów; wszystkie te czynniki przyczyniają się do wirulencji PRRSV. Białko M jest najbardziej zachowanym białkiem strukturalnym wśród arteriwirusów i koronawirusów. Białko to jest integralnym białkiem błonowym, zawierającym trzy N-końcowe hydrofobowe domeny, przechodzące przez błonę (Rottier, 1995). Białko to przechodzi przez błonę, trzykrotnie opuszczając krótką domenę N-końcową poza wirionem i krótką domenę C-końcową wewnątrz wirionu. Wykazano, że białko M koronawirusów odgrywa ważną rolę w tworzeniu wirusa (Vennema i wsp., 1996), lecz nie stwierdzono wówczas, aby był czynnikiem wirulencji. W szczególności, przedmiotem niniejszego wynalazku jest replikon, w którym modyfikacja ta zmienia białko M między jego drugim a trzecim fragmentem przechodzącym przez błonę, mającym zasadnicze znaczenie w określaniu wirulencji danego izolatu PRRSV. Na przykład przedmiotem niniejszego wynalazku jest replikon, zawierający vabv575. Mutacja Thr-59 Asn jest umiejscowiona między drugim a trzecim przechodzącym przez błonę fragmentem M w vabv575. Mutacja ta wpływa na tworzenie wirusa, stabilność wirusa lub wchodzenie wirusa do PAM. Przedmiotem niniejszego wynalazku jest ponadto replikon według niniejszego wynalazku, w którym heterologiczny drobnoustrój zawiera patogen. Ponieważ PRRSV swoiście zakaża makrofagi, można go stosować jako wektor do podawania ważnych antygenów lub innych (oddechowych) czynników do tej swoistej komórki układu immunologicznego. Zakaźny klon cdna umożliwia nam wprowadzenie mutacji swoistej dla miejsca, delecji i insercji do genomu wirusa. W korzystnym wykonaniu przedmiotem niniejszego wynalazku jest replikon, w którym patogen jest wirusem. Z powodzeniem stosowaliśmy PRRSV jako wektor do ekspresji antygenu obcego białka, epitopu HA hemaglutyniny wirusa grypy A. Wytworzono rekombinacyjne replikony wektora PRRSV, wytwarzające tag HA, który uległ fuzji z końcem N lub C białka N. Ponadto stworzono mutant PRRSV, zawierający tag HA, jak również proteazę 2A wirusa pryszczycy (foot-and-mouth-disease - FMDV), poddaną fuzji z końcem N białka N. Ponadto przedmiotem niniejszego wynalazku jest szczepionka, zawierająca replikon lub replikon wektora według niniejszego wynalazku. Szczepionki PRRSV wykazują obecnie szczególną antygenowość lub immunogenność, i są na przykład dodatkowo dostatecznie bezpieczne dla określonej grupy świń, na przykład dla młodych prosiąt lub macior w trzecim trymestrze ciąży.

8 8 PL B1 Ponadto przedmiotem niniejszego wynalazku są nieszerzące się szczepionki PRRSV, zawierające replikon lub replikon wektorowy, na przykład niezdolne do tworzenia kapsydu z białka N, lub niezdolne do dalszego zakażania ze względu na nieobecność (fragmentów) białek strukturalnych, kodowanych przez ORF 2-6, bez hamowania ich właściwości replikacji RNA in vivo, umożliwiając wytwarzanie białek, przeciwko którym korzystne jest uzyskanie reakcji immunologicznej. Ponadto przedmiotem niniejszego wynalazku jest szczepionka, którą można rozróżnić od wirusa typu dzikiego, tak zwana szczepionka markerowa, wytworzona na przykład poprzez mutagenezę genomu, tak że świnie zaszczepione można odróżnić od świń zakażonych wirusem typu dzikiego na podstawie różnic w przeciwciałach w surowicy. Ponadto szczepionki PRRSV, tak szeroko stosowane na świecie, zwykle niezakaźne dla zwierząt innych, niż świnie, dostarcza się obecnie jako szczepionki wektorowe do przenoszenia obcych antygenów, pochodzących z innych (świńskich) patogenów, umożliwiając szczepienie przeciwko tym innym patogenom i dodatnią identyfikację markera. Zastosowanie szczepionki według niniejszego wynalazku jest szczególne korzystne do szczepienia świń, ponieważ PRRSV jest zwykle bardzo swoisty w odniesieniu do gospodarza i replikuje się w makrofagach świń, ukierunkowując się na ważną komórkę prezentującą antygen układu immunologicznego. Niniejszy wynalazek dokładniej objaśniono w szczegółowym opisie, poniżej. Szczegółowy opis 1. Mutacja Cys-27 i Cys-76 w białku N hamuje wytwarzanie zakaźnych cząstek PRRSV Nukleokapsydowe białko N (ulegające ekspresji przez ORF7) obecne jest w postaci monomeru w oczyszczonych wirionach PRRSV. Jednakże w niektórych doświadczeniach wykrywaliśmy również homodimer N. Na przykład przy immunoprecypitacji białka N z oczyszczonych wirionów z N-swoistymi MAb i jego elektroforezie na żelu z soli sodowej siarczanu poliakrylamidowego (SDS-PAGE), obserwowano głównie białko o ciężarze 15 kda w zredukowanych warunkach (Meulenberg i wsp., 1996). Jednakże, kiedy stosowano związki takie, jak N-metylomaleimid lub jodoacetamid, do zapobiegania tworzeniu się nieswoistych wiązań dwusiarczkowych, nie wykrywano tych dimerów N. Wskazuje to, że dimery N tworzą się wskutek tworzenia nieswoistych wiązań dwusiarczkowych w czasie obróbki lizatów komórek do analizy. W sekwencji białka N obecne są dwie reszty cysteinowe. Powstaje pytanie, które reszty cysteinowe są odpowiedzialne za tworzenie nieswoistych wiązań dwusiarczkowych i pytanie, czy reszty cysteinowe mają znaczenie dla struktury i czynności białka N. W celu uzyskania odpowiedzi na to pytanie zmutowaliśmy indywidualnie dwie reszty cysteinowe w zakaźnym klonie cdna PRRSV i badaliśmy zakaźność powstałych zmutowanych wirusowych RNA genomowych. 2. Wprowadzenie markera do białka N Białko N PRRSV zawiera 4 miejsca antygenowe, oznaczone A-D (Meulenberg i wsp., 1998). Dwa miejsca, B i D, zawierają epitopy, zachowane w europejskich i północnoamerykańskich izolatach PRRSV. W celu wytworzenia wirusów, które można serologicznie odróżnić od wirusów typu dzikiego, do zakaźnego klonu cdna PRRSV wprowadzono mutacje w domenie B i D, rozrywające wiązanie N-swoistych MAbs. Analizowano transkrypty powstałych zmutowanych, pełnej długości klonów cdna pod kątem replikacji RNA poprzez wykrywanie ekspresji białek strukturalnych i wytwarzanie zakaźnego wirusa. 3. Wyjaśnienie sygnałów replikacji, obecnych w regionie kodującym białka strukturalne wirusa Lelystad Wirusy RNA o nici dodatniej zawierają niekodujące regiony 3' i 5', mające zasadnicze znaczenie dla replikacji. Sekwencje RNA końca 5' i 3' zwykle mają swoistą strukturę drugorzędową, rozpoznawaną przez zależną od wirusowego RNA polimerazę RNA w celu zapoczątkowania syntezy nici dodatniej i ujemnej i w przypadku arteriwirusów syntezy RNA subgenomowego. Poddaliśmy delecji gen ORF7 z zakaźnego klonu ORF7 PRRSV (Meulenberg i wsp., 1998) w pierwszej próbie wytworzenia defektywnego replikonu RNA, który można byłoby uzupełnić do wytwarzania cząstek zakaźnych po transfekcji do komórki, wykazującej ekspresję białka N. Gen ORF7 precyzyjnie usunięto, nie uszkadzając nie kodującego regionu 3' wirusa. Nieoczekiwanie RNA tego mutanta delecyjnego nie ulegał replikacji w komórkach BHK-21. Sugerowało to, że w regionie kodującym ORF7 znajdują się sygnały replikacji RNA. Celem tego badania była dalsza lokalizacja tych sygnałów replikacyjnych. Poprzez rozległą analizę delecji regionu kodującego i leżących w kierunku końca 5' sekwencji ORF7 byliśmy w stanie zidentyfikować 44-nukleotydowy region w genie ORF7, ważny dla replikacji RNA PRRSV.

9 PL B Wytwarzanie atenuowanego wirusa PRRSV przez delecję miejsca Ndel w ORF6 Ostatnio ustaliliśmy jaki jest cdna klonu zakaźnego PRRSV (Meulenberg i wsp., 1998). Pełnej długości klon cdna zawiera dwa miejsca Ndel, pierwsze na nukleotydzie (ORF3) i drugie na nukleotydzie (w ORF6) w sekwencji genomowej. W celu ułatwienia mutagenezy i wymiany fragmentów w regionie kodującym białka strukturalne (ORF 2-7) wirusa, zniszczyliśmy drugie miejsce Ndel przez mutagenezę kierowaną PCR. Spowodowało to substytucję aminokwasu w pozycji 59 w białku M (Thr Asn). Poddano analizie właściwości wzrostu wirusa wytworzonego ze zmutowanego, pełnej długości klonu cdna, zawierającego unikalne miejsce Ndel. 5. Wirus Lelystad jako wektor ekspresji obcych antygenów lub białek Wytworzenie zakaźnego klonu cdna PRRSV (Meulenberg i wsp., 1998) jest przełomem w badaniach nad PRRSV i otwiera nowe możliwości rozwoju nowych wektorów wirusowych. Ponieważ PRRSV swoiście zakaża makrofagi, można go stosować jako wektor do dostarczania ważnych antygenów innych (oddechowych) środków do tej swoistej komórki układu immunologicznego. Zakaźny klon cdna umożliwia nam wprowadzenie swoistych dla miejsca mutacji, delecji i insercji do genomu wirusowego. Jednakże nadal nie wiadomo, które regiony genomu PRRSV mają zasadnicze znaczenie lub umożliwiają mutagenezę. Podobnie jak w przypadku większości wirusów RNA, PRRSV zawiera zwięzły genom i oczekuje się, że większość informacji genetycznej będzie informacją o zasadniczym znaczeniu. Ponadto nie jest jeszcze znana maksymalna zdolność do integracji obcych genów do genomu PRRSV. Dodatkowym ograniczeniem jest to, że ORF kodujące białka strukturalne PRRSV częściowo nakładają się na siebie. Wprowadzenie mutacji do tych nakładających się regionów powoduje powstanie dwóch zmutowanych białek strukturalnych, a zatem częściej można spodziewać się powstania w wyniku tego nieżywotnego wirusa. Celem niniejszego badania było zidentyfikowanie regionów w genomie PRRSV, umożliwiających wprowadzenie obcych antygenów, które byłyby eksponowane na układ immunologiczny świni po zakażeniu zmutowanym wirusem. W pierwszym podejściu wybraliśmy mały epitop 9 aminokwasów ludzkiej hemaglutyniny grypy A do ekspresji w PRRSV. Metody Komórki i wirusy Komórki BHK-21 hodowano w pożywce BHK-21 (Gibco BRL), uzupełnionej 5% FBS,10% bulionem z fosforanem tryptozy (Gibco BRL), 20 mm HEPES ph 7,4 (Gibco BRL) i 200 mm glutaminy, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny. Makrofagi pęcherzyków płucnych świni (PAM) utrzymywano w pożywce MCA-RPMI-1640, zawierającej 10% FBS, 100 μg/ml kanamycyny, 200 U/ml penicyliny i 200 μg/ml streptomycyny. Zapas wirusa wytworzono poprzez seryjne pasażowanie rekombinacyjnych wirusów PRRSV, wydzielonych w nadsączu hodowli transfekowanych komórek BHK-21 na PAM. Wirus zebrano, gdy PAM wykazały efekt cytopatyczny (cpe), co następowało zwykle w 48 godzin po zakażeniu. Oznaczono miana wirusów (wyrażone jako dawki zakażające 50% hodowli tkankowych [TCID 50 ] na ml na PAM, stosując rozcieńczenie punktu końcowego (Wensvoort i wsp., 1986). Mutageneza 1. Mutageneza Cys-27 i Cys-76 Cys-27 poddano mutacji do Asn poprzez ukierunkowaną PCR mutagenezę z primerami LV108 i LV97. Sekwencje primerów zastosowanych w tym badaniu przedstawiono w tabeli 1. Wytworzony fragment PCR poddano trawieniu Hpal i Pflml i insercji do genu ORF7 w pabv431, poddanym trawieniu tym samym enzymem. W ten sposób powstał plazmid pabv451. Cys-76 poddano mutacji do Leu przez ukierunkowaną PCR mutagenezę z primerami LV108 i LV100. Wytworzony fragment poddano trawieniu Hpal i ClaI i insercji do genu ORF7 w pabv431, poddanemu trawieniu tymi samymi enzymami. Spowodowało to powstanie pabv452. Zmutowane geny ORF7 przeniesiono następnie do klonu cdna o długości genomowej pabv437 (Meulenberg i wsp., 1998) z unikalnym miejscem Hpal (nt 14581) i PacI (nt 14981), w celu wytworzenia plazmidów pabv (Cys-27 Asn) i plazmidów pabv (Cys-76 Leu; fig. 1). 2. Mutageneza miejsc antygenowych B i D w białku N Miejsca antygenowe B (aminokwasy 25-30) i D (aminokwasy i 80-90) białka N PRRSV poddano mutacji przez substytucję aminokwasów, odpowiednio, EAV i LDV. Plazmidy pabv455, pabv463 i pabv453, zawierające te odpowiednie mutacje, opisali uprzednio Meulenberg i wsp. (1998). Ponadto Asp w pozycji 62 w regionie D białka N uległo mutacji do Tyr w PCR z primerami LV108 i LV188. Sekwencje tych primerów ukazano w tabeli 1. Fragment PCR poddano trawieniu Hpal

10 10 PL B1 i CiaI i insercji do genu ORF7 w pabv431, trawionym tymi samymi enzymami. Spowodowało to powstanie pabv582. Geny ORF7, zawierające mutacje, wprowadzono do pabv437 z zastosowaniem unikalnego Hpal (nt 14581) i PacI (nt 14981) (Fig. 1). 3. Tworzenie mutantów delecyjnych w klonie cdna pełnej długości PRRSV Dokonano kilku delecji w klonie cdna pełnej długości PRRSV (fig. 2). Najpierw delecji poddano ORF2, ORF3, ORF4, ORF5 i połowę 5' ORF6. pabv437 poddano trawieniu EcoRI i Nhel i miejscom nadano tępość" fragmentem Klenowa (Pharmacia Biotech). Fragment oczyszczono i poddano ligacji. Spowodowało to powstanie plazmidu klonu pabv594. Po drugie, ORF7 poddano delecji z zakaźnej kopii PRRSV. W tym celu zakaźny pełnej długości klon cdna pabv442, zawierający miejsce restrykcyjne Swal, bezpośrednio w kierunku końca 3' od kodonu stop ORF7 poddano trawieniu Hpal i Swal i ligacji. Spowodowało to powstanie plazmidu klonu pabv521. Po trzecie, w celu dokonania delecji końca 3' ORF6 przeprowadzono mutagenezę z primerami LV198 i LV199. Primery zastosowane w mutagenezie PCR wymieniono i opisano w tabeli 1. Wytworzony produkt poddano trawieniu Hpal i Nhel i ligacji w odpowiednich miejscach pabv437. Spowodowało to powstanie plazmidu pabv627. Po czwarte dokonano kilku delecji w kierunku końca 5' od regionu kodującego ORF7. Przeprowadzono mutagenezę PCR z primerami ku przodowi" LV lub LV i odwrotnym primerem LV112. Wytworzone produkty poddano trawieniu Hpal i PacI i ligacji w tych samych miejscach restrykcyjnych pabv437, w wyniku czego powstały plazmidy pabv i pabv Plazmidy przekształcono do DH5α Escherichia coli i hodowano w temperaturze 32 C w obecności 20 μg kanamycyny na ml. Dla każdego konstruktu dokonano sekwencjonowania dwóch klonów zawierających fragmenty dwóch niezależnych PCR dla potwierdzenia właściwej struktury klonów. Powstałe mutanty przedstawiono na Fig Mutageneza miejsca Ndel w pozycji w zakaźnym klonie cdna pabv437 PRRSV W celu zmutowania miejsca Ndel w pozycji 14265, powielono fragment 1,7 kb metodą PCR z zastosowaniem primerów LV27 (nt 12526) i LV182 (nt 14257; tabela 1). Primer LV182 zawiera miejsce Asel. Asel i Ndel mają kompatybilne końce, jednak ligacja ich końców wzajemnie ze sobą niszczy oba miejsca restrykcyjne. Fragment PCR poddano trawieniu Ndel i Asel i ligacji z pabv437 strawionym Ndel. Pełnej długości klon pabv575 (fig. 3), zawierający fragment PCR we właściwej orientacji, nie posiadał miejsca Ndel w pozycji i nie miał innych mutacji między a z uwagi na błędy PCR, wybrano do dalszej analizy. 5. Wytwarzanie pełnej długości mutantów cdna genomowego PRRSV, kodujących antygenowy tag HA Zastosowano mutagenezę PCR do wytworzenia mutantów w zakaźnym klonie PRRSV. Po pierwsze wprowadzono sekwencję 27 nukleotydów, kodujących epitop ludzkiej hemaglutyniny grypy A (tag HA; Kolodziej i wsp., 1991) bezpośrednio w kierunku końca 3' od kodonu start ORF7 w mutancie PacI klonu cdna długości genomu wirusa Lelystad (pabv437; Meulenberg i wsp., 1998). Przeprowadzono dwa sekwencyjne PCR z primerami LV192 i LV112 i z primerami LV193 i LV112. Primery zastosowane do wytworzenia fragmentów PCR wymieniono i opisano w tabeli 1. Po drugie zarówno ten tag HA, jak i sekwencja 51 nukleotydów kodujących proteazę 2A wirusa pryszczycy (Percy i wsp., 1994) wprowadzono bezpośrednio w kierunku końca 3' od kodonu start ORF7. Przeprowadzono dwie sekwencyjne reakcje PCR z primerami LV139 i LV112 i z primerami LV140 i LV112. Po trzecie, tag HA wprowadzono na końcu 3' genu 0RF7 w PCR z primerami LV108 i LV194. Trzy wytworzone fragmenty PCR poddano trawieniu Hpal i PacI i ligacji do pabv437, trawionego tym samym enzymem. Przeprowadzono standardowe procedury klonowania w sposób w zasadzie zgodny z opisem Sambrook i wsp. (1989). Plazmidy transformowano do DH5α Escherichia coli i hodowano w temperaturze 32 C w obecności 20 μg kanamycyny na ml. Dla każdego konstruktu dokonano sekwencjonowania dwóch klonów zawierających fragmenty dwóch niezależnych PCR dla potwierdzenia właściwej struktury klonów. Wprowadzenie epitopu HA na końcu 5' ORF7 spowodowało wytworzenie klonu pabv525, wprowadzenie zarówno tagu HA, jak i proteazy 2A na końcu 5' ORF7 spowodowało wytworzenie klonu pabv523, a wprowadzenie epitopu HA na końcu 3' ORF7 spowodowało powstanie klonu pabv526 (fig. 4). Analiza sekwencji Wytworzone klony cdna analizowano poprzez sekwencjonowanie oligonukleotydów. Sekwencje oligonukleotydów oznaczono zestawem do sekwencjonowania cyklicznego PRISM Ready Dye Deoxy Terminator i automatycznym urządzeniem do sekwencjonowania (Applied Biosystems).

11 PL B1 11 Transkrypcja i transfekcja RNA in vitro Pełnej długości klony cdna genomowego i ich pochodne linearyzowano Pvul, znajdującym się bezpośrednio w kierunku końca 3' obszary poli(a). Linearyzowane plazmidy strącano etanolem i 1,5 μg tych plazmidów zastosowano do transkrypcji in vitro polimerazą T7 RNA sposobami opisanymi dla SFV przez Liljeströma i Garoffa (1991). RNA transkrybowane in vitro strącono izopropanolem, przemyto 70% etanolem i przechowywano w temperaturze -20 C do użycia. Komórki BHK-21 posiano w 35-mm zagłębieniach (około 10 6 komórek/zagłębienie) i transfekowano 2,5 μg RNA transkrybowanego in vitro, zmieszanego z 10 ml lipofektyny in optimem, jak to opisywano uprzednio (Meulenberg i wsp., 1998). Zamiast tego, RNA wprowadzano do komórek BHK-21 w 20-mm zagłębieniach z 0,5 μg transkrybowanego in vitro RNA, zmieszanego z 2 ml lipofektyny in optimem. Pożywkę zebrano 24 godziny po transfekcji i przeniesiono do komórek CL2621 lub PAM dla ocalenia zakaźnego wirusa. Transfekowane i zakażone komórki badano pod kątem ekspresji białek PRRSV w teście jednowarstwowej immunoperoksydazy (IPMA), w zasadzie w sposób opisany przez Wensvoort i wsp. (1986). Do barwienia w tym teście zastosowano przeciwciała monoklonalne (MAbs) , i skierowane, odpowiednio, przeciwko GP 3, GP 4, białku M (van Nieuwstadt i wsp., 1996). Do badania ekspresji białka N zastosowano panel MAbs (122.17, 125.1, 126.9, , 130.2, 130.4, 131.7, 131.9, , WBE1, WBE4, WBE5, WBE6, SDOW17, NS95 i NS99) skierowany przeciwko czterem różnym miejscom antygenowym A-D (Meulenberg i wsp., 1998). Do wykrywania ekspresji epitopu HA zastosowano Mab 12CA5, nabyte w firmie Boehringer Mannheim. Ponadto analizowaliśmy ekspresję białek PRRSV przez znakowanie metaboliczne transfekowanych lub zakażonych komórek i następnie immunoprecypitację z zastosowaniem swoistych przeciwciał monoklonalnych lub surowic peptydowych skierowanych przeciwko białkom strukturalnym PRRSV, jak to opisał Meulenberg i wsp., (1996). Analiza sekwencyjna RNA genomowego wirusów rekombinacyjnych Zastosowano nadsącz hodowli PAM zakażonych pasażem 3 wirusów wykazujących ekspresję HA do analizy RNA wirusowego przez RT-PCR. Do 500 μl nadsączu dodano objętość 500 μl bufora proteinazy K (100 mm Tris-HCl [ph 7,2], 25 mm EDTA, 300 mm NaCl, 2% [masa/obj.] soli sodowej siarczanu dodecylowego) i 0,2 mg proteinazy K. Po inkubacji przez 30 minut w temperaturze 37 C ekstrahowano RNA fenolem-chloroformem i strącono etanolem. RNA poddano odwrotnej transkrypcji primerem LV76. Następnie przeprowadzono PCR primerami LV37 i LV112 w celu powielenia fragmentów vabv523 i vabv525 i primerami LV37 i LV75 w celu powielenia fragmentów vabv526 (tabela 1). Przeprowadzono analizę sekwencyjną w celu określenia, czy zmutowane wirusy pasażu 4 nadal zawierają wprowadzone obce sekwencje. Wyniki 1. Mutacja Cys-27 i Cys-76 w pełnej długości klonie cdna pabv437 W sekwencji białka N obecne są dwie reszty Cys w pozycjach 27 i 76. Gen ORF7, kodujący białko N, poddano takiej mutacji, że reszty Cys podstawiono, odpowiednio, za reszty Asn i Leu. Mutacje Cys-27 i Cys-76 wprowadzono następnie do zakaźnego klonu izolatu wirusa Lelystad PRRSV, uzyskując plazmidy pabv (Cys-27 Asn) i pabv (Cys-76 Leu; fig. 1). RNA transkrybowano z tych zmutowanych klonów zakaźnych i transfekowano do komórek BHK-21. Komórki te barwiły się dodatnio N-swoistymi MAb w IPMA. Analiza białka N, syntetyzowanego przez pabv i pabv w immunoprecypitacji i SDS-PAGE wykazała, że jej widoczna masa cząsteczkowa była podobna do masy cząsteczkowej białka N typu dzikiego i przemieszczała się w 15 kda w warunkach redukujących. Następnie analizowaliśmy białko N w warunkach nieredukujących w nieobecności maleimidu N-metylowego i jodoacetamidu. W tych warunkach białko N, którego ekspresja pochodziła z pabv (Cys-76 Leu) przypominało białko N typu dzikiego i było wykrywane głównie jako dimer, natomiast białko N, którego ekspresja pochodziła z pabv (Cys-27 Asn) było wykrywane jako monomer. Wskazuje to, że reszta Cys w pozycji 27 była odpowiedzialna za tworzenie nieswoistych wiązań dwusiarczkowych. Wytwarzanie innych białek strukturalnych, takich jak GP 3, GP 4 i M, było również wykrywane w IPMA i immunoprecypitacja po transfekcji pełnej długości RNA z plazmidów pabv (Cys-27 Asn) i pabv (Cys-76 Leu; fig. 1). Ponieważ białka strukturalne ulegały ekspresji we właściwy sposób, te zmutowane RNA ulegały replikacji i syntetyzowano RNA subgenomowe. Jednakże nie dochodziło do wydzielania zakaźnych cząstek, ponieważ transfer nadsączu transfekowanych komórek BHK-21 do PAM nie spowodował wytwarzania białek wirusowych w PAM ani indukcji cpe. Tak więc obie reszty Cys mają zasadnicze znaczenie dla właściwej struktury lub czynności, lub i struktury, i czynności, białka n w całości wirusa.

12 12 PL B1 2. Charakterystyka pełnej długości klonów cdna, zawierających mutacje w miejscach antygenowych białka N PRRSV Miejsca B (aminokwasy 25-30) i D (aminokwasy i 80-90) są dwoma regionami antygenowymi, zachowanymi w europejskich i północnoamerykańskich izolatach PRRSV. Kiedy poddajemy mutacji miejsce B i D przez substytucję ich sekwencji aminokwasowej odpowiednimi aminokwasami białka N LDV lub EAV, wiązanie białka N, odpowiednio, przez MAb B-swoiste i D-swoiste ulega zaburzeniu (Meulenberg i wsp., 1998). W celu wytworzenia wirusa PRRSV antygenowo różnego od wirusów dzikich PRRSV, wprowadziliśmy geny ORF7, zawierające zmutowany region B lub D, do naszego klonu zakaźnego pabv437. Spowodowało to powstanie pabv , zawierających zmutowane miejsce B (aminokwasy 25-30), i pabv zawierających zmutowaną domenę D (aminokwasy 80-90) (fig. 1). Po transfekcji RNA tych pełnej długości klonów do komórek BHK-21 komórki te barwiły się dodatnio N-swoistymi MAb w 24 godziny po transfekcji. Jak tego oczekiwano, białko N, którego ekspresję wykazywały pabv , było rozpoznawane przez A-, C- i D-swoiste MAb, lecz nie przez MAb B-swoiste. Z drugiej strony białko N, którego ekspresję wykazywały pabv i pabv były rozpoznawane przez MAb A-, B- i C-swoiste, lecz nie przez MAb B-swoiste. Barwienie komórek transfekowanych RNA pochodzącym z pabv , pabv i pabv przez MAb skierowane przeciwko GP 3, GP 4 i M, było podobne do barwienia obserwowanego w transfekcjach RNA pochodzącym z pabv437 typu dzikiego. Sugeruje to, że mutacje nie wpłynęły na replikację RNA i syntezę mrna subgenomowego. Kiedy nadsącz komórek transfekowanych RNA pochodzącym z pabv , pabv i pabv przeniesiono do PAM, nie dochodziło do wytwarzania cpe. Najprawdopodobniej mutacje w regionach B i D niszczyły czynność białka N w zakresie tworzenia prawidłowej struktury kapsydu. Ponieważ mutacja 4 aminokwasów w domenie B i 5 lub 9 aminokwasów w domenie D nie umożliwiła wytworzenia cząstek zakaźnych, dokonaliśmy bardziej subtelnej mutacji 1 aminokwasu w regionie D. Wprowadziliśmy Asp-62 do mutacji Tyr w białku N w zakaźnym klonie PRRSV. Aminokwas Asp-62 w białku N PRRSV zmutowano do Tyr przez kierowaną PCR mutagenezę i przeniesiono do pabv437, otrzymując pabv600. RNA transkrybowany z pabv600 transfekowano do komórek BHK-21. Komórki te barwiły się dodatnio MAb skierowanymi przeciwko GP 3, GP 4, M i N w 24 godziny po transfekcji, sugerując, że doszło do replikacji RNA i syntezy mrna subgenomowego. Po przeniesieniu nadsączu z komórek BHK-1 transfekowanych transkryptami z pabv600 do PAM, wykrywano cpe w 2-3 dni po tym przeniesieniu. Zakażone komórki barwiły się dodatnio MAB skierowanymi swoiście przeciwko PRRSV, co stanowiło dalsze potwierdzenie wytwarzania zakaźnego wirusa. Tak więc mutacja Asp-62 do Tyr w białku N jest tolerowana w wirusie i nie powoduje zniszczenia czynności białka N. Zmutowany wirus vab600 typowano dalej panelem N-Swoistych MAb (tabela 2). Nie tylko wiązanie D-swoistego MAb SDOW17, lecz również wiązanie D-swoistych MAb 130.2, 130.4, i i WBE1 do vabv600 było znacznie zmniejszone. Po rozcieńczeniu nadsączu hodowli hybrydoma tych MAb do 0,3-0,5 μg/ml obserwowano intensywne barwienie dla PRRSV typu dzikiego, jednak nie obserwowano barwienia dla vabv600. Jednakże po oczyszczeniu IgG MAb 130.2, 130.4, i i zastosowaniu ich w większym stężeniu (10 μg IgG/ml), obserwowano słabe barwienie. Barwienie vabv600 A- i B-swoistymi MAb było porównywalne z PRRSV. Dane te wskazują, że wytworzyliśmy wirus antygenowo odmienny od PRRSV typu dzikiego i północnoamerykańskich wirusów PRRS. 3. Identyfikacja sygnałów replikacji na końcu 3' genomu PRRSV W celu określenia sekwencji działających cis, będących zasadniczymi sygnałami replikacji RNA (synteza nici plus i/lub minus i/lub synteza mrna subgenomowego) dokonano kilku delecji w zakaźnym klonie cdna i transkrypty pochodzące z tych mutantów delecyjnych poddano analizie w kierunku replikacji w komórkach BHK-21. Po transfekcji transkryptów z pabv521, w których nie był obecny cały gen ORF7, do komórek BHK-21, nie można było wykryć ekspresji białka N w IPMA (fig. 2). Co ciekawe, transkrypty te były również defektywne w zakresie ekspresji innych białek strukturalnych, takich jak GP 3, GP 4 i M. Wskazuje to, że te RNA nie ulegały replikacji i nie wytwarzały mrna subgenomowych. Z drugiej strony delecja ORF2, ORF3, ORF4, ORF5 na końcu 5' ORF6 z zakaźnej kopii (pavb594) spowodowała to, że RNA wirusowe było nadal zdolne do replikacji. Tak więc sygnały replikacji są obecne w regionie kodującym ORF7, lecz nie w regionie kodującym ORF 2-6. W celu zbadania tego i dalszej lokalizacji regionów biorących udział w replikacji, wytworzono mutanty zawierające mniejsze delecje w ORF7. Transkrypty z tych konstruktów badano pod kątem ich zdolności do replikacji poprzez wykrywanie ekspresji białek PRRSV w IPMA transfekowanych komórek BHK (fig. 2).

13 PL B1 13 Z wyników tych można wyciągnąć wniosek, że między nukleotydami a obecne są zasadnicze sygnały replikacji genomu PRRSV. RNA wirusowe nie zawierające tego regionu były defektywne w replikacji. 4. Analiza pełnej długości klonu cdna pabv575, nie posiadającego miejsca Ndel w ORF6 Wytworzono pełnej długości klon cdna - pabv575 - posiadający unikalne miejsce Ndel w pozycji z powodu mutacji drugiego miejsca Ndel w pozycji przez PCR. RNA wytwarzano z pabv575 i transfekowano do komórek BHK-21 wraz z RNA z jego klonu macierzystego pabv437. Po 24 godzinach po transfekcji RNA pabv575 i RNA pabv437 jednakowa liczba komórek barwiła się dodatnio w IPMA M-swoistymi i N-swoistymi MAb (fig. 3). Ponadto intensywność barwienia była podobna. Jednakże, kiedy nadsącz transfekowanych komórek BHK-21 przenoszono do PAM i inkubowano przez 24 godziny, liczba komórek zakażonych vabv575 była dużo mniejsza, niż obserwowana dla vabv437. Ponadto cpe rozwijał się znacznie wolniej w PAM zawierających vabv575, niż w PAM zawierających vabv437. Chociaż replikacja RNA i synteza RNA subgenomowych vabv575 w BHK-21 wydawała się pozostawać na poziomie właściwym dla typu dzikiego, wytworzony wirus był znacznie mniej zakaźny dla makrofagów. Było to najprawdopodobniej spowodowane mutacją aminokwasu w białku M (Thr Asn), która była wynikiem zniszczenia miejsca NdeI w pozycji Wprowadzenie tagu HA do zakaźnego klonu PRRSV Epitop hemaglutyniny grypy A (tag HA; Kolodziej i wsp., 1991) ulegał ekspresji w różnych rekombinacyjnych wirusach PRRSV. Epitop HA wybrano jako obcy antygen do ekspresji w PRRSV przede wszystkim z dwóch powodów. Po pierwsze tag ma ograniczoną wielkość (27 nukleotydów), co zmniejsza szansę na zaburzenie replikacji wirusa lub ekspresji lub czynności białka, z którym uległ fuzji. Po drugie, dostępne są przeciwciała do wykrywania ekspresji tego epitopu. Tag HA wprowadzono na końcu 5' ORF7 (pabv525) i na końcu 3' ORF7 (pabv526; fig. 4) tak, że nie indukował on mutacji w innych ORF. Spodziewaliśmy się uzyskania dużej ekspresji obcego antygenu przez insercję do niego genu ORF7, ponieważ przekaźnik subgenomowy RNA7 (kodujący ORF7) jest produkowany w największych ilościach w komórkach zakażonych. Ponieważ nie mogliśmy przewidzieć wpływu epitopu HA na czynność i strukturę białka N, dokonaliśmy dodatkowej insercji w ramce 16-aminokwasowej samorozszczepiającej się proteazy 2A wirusa pryszczycy (FMDV; Percy i wsp., 1994). Proteazę tę wprowadzono w kierunku końca 3' tagu HA na końcu 5' ORF7, w wyniku czego uzyskano klon pabv523 (fig. 4). Oczekiwaliśmy, że spowoduje to ekspresję poliproteiny, która mogłaby ulegać proteolitycznemu rozszczepieniu z uwolnieniem zarówno tagu HA, jak i białka N. 5. Analiza rekombinantów PRRSV wykazujących ekspresję epitopu HA Po pierwsze zbadano ekspresje białek strukturalnych przez różne transkrypty z rekombinacyjnych pełnej długości klonów cdna w IPMA. Komórki BHK-21, transfekowane transkryptami pabv523, 525 i 526, barwiły się dodatnio z MAb skierowanymi przeciwko GP 3, GP 4, białku M i białku N, co wskazuje, że te białka PRRSV ulegały ekspresji w sposób właściwy (fig. 4). Komórki barwiły się również dodatnio MAb skierowanym przeciwko HA, co wskazuje, że epitop HA ulegał ekspresji we wszystkich trzech RNA. Tak więc transkrypty wykazujące ekspresję HA ulegały replikacji w komórkach BHK-21. Ponadto białko N, z którym tag HA uległ fuzji, ulegało nadal ekspresji w zmutowanych RNA. W celu zbadania, czy transkrypty pabv523, 525 i 526 były zdolne do wytworzenia zakaźnych wirusów, zastosowano nadsącz hodowli transfekowanych komórek BHK-21 do zakażania PAM. PAM nie tylko barwiły się dodatnio MAb skierowanymi przeciwko białkom PRRSV GP 3, GP 4, białku M i białku N w IPMA, lecz również MAb 12CA5, skierowanym przeciwko epitopowi HA. Jednakże, jeżeli PAM barwiły się podwójnie, zarówno MAb skierowanymi przeciwko tagowi HA, jak i białku N, wykrywaliśmy również PAM, które barwiły się tylko MAb skierowanymi przeciwko białku N, lecz nie przeciwko tagowi HA. Dla wirusów pochodzących z pabv525 i pabv526 odsetek komórek, barwiących się tylko MAb N-swoistymi, był wyższy, niż dla wirusów pochodzących z pabv523, zawierających dodatkową proteazę 2A. Wskazuje to, że tag HA, bezpośrednio przyłączony do końca N lub C białka N, zaburzał w pewnym stopniu pakowanie RNA wirusowego lub zakaźność wirusa. Jednakże po wprowadzeniu proteazy 2A w celu odszczepienia tagu HA od białka N przez proteazę 2A, korzystne właściwości powstałego wirusa (vabv523) nie były zredukowane lub były zredukowane tylko w niewielkim stopniu (fig. 4). Wirusy rekombinacyjne oznaczono jako vabv523, vabv525 i vabv526. Analiza aktywności proteazy 2A w vabv523 Aktywność proteazy 2A analizowano dalej przez radioimmunoprecypitację. Oprócz białka 15 kda immunoprecypitacji poddano dodatkowe białko o masie około 18 kda z N-swoistym MAb

14 14 PL B1 z komórek transfekowanych transkryptami pabv523. Białko 15 kda miało podobną wielkość do białka N typu dzikiego; białko 18 kda przypominało oczekiwaną wielkość poliproteiny proteazy 2A-N HA. Dane te wskazują, że proteaza 2A FMDV jest zdolna do rozszczepienia proteazy HA poliproteiny 2A-N w komórce, czego skutkiem jest uwolnienie tagu HA z białka N. 5. Charakterystyka wzrostu w wirusach wykazujących ekspresję HA Ilość wirusa wytworzonego przez komórki BHK-21, transfekowane transkryptami z pabv437 i pabv523, była zwykle większa, niż ilość wirusa wytworzonego przez komórki BHK-21, transfekowane transkryptami z pabv525 i pabv526. Seryjny pasaż wirusów wykazujących ekspresję HA na PAM spowodował powstanie zapasów vabv523, vabv525 i vabv526 z mianami około 10 7 TCID 50 /ml. Należy wyjaśnić, czy wirusy wykazujące ekspresję HA mają takie same właściwości wzrostu, jak wirus typu dzikiego zakaźnej kopii PRR- SV (vabv437). Będzie to zbadane w krzywych wzrostu. 5. Analiza stabilności wirusów wykazujących ekspresję HA W celu określenia stabilności wirusów wykazujących ekspresję HA zbadano RNA wirusowe w pasażu 4. W tym celu przeprowadzono RT-PCR na izolowanym wirusowym RNA. Część genu ORF7, miejsce, w którym dokonano insercji tagu HA, powielono metodą PCR i uzyskane fragmenty analizowano na żelu agarozowym. Uzyskaliśmy dwa fragmenty dla vabv523 i vabv525 i jeden fragment dla vabv526. Analiza sekwencji fragmentu powielonego w największej ilości wykazała, że vabv523 w pasażu 4 nadal zawierał odpowiednio umieszczoną sekwencję nukleotydową, kodującą tag HA i gen proteazy 2A. Przeciwnie, zarówno vabv525, jak i vabv526 straciły wprowadzoną sekwencję nukleotydową wprowadzoną sekwencję nukleotydową, kodującą tag HA. 1. Mutacja Cys-27 i Cys-76 w białku N hamuje wytwarzanie zakaźnych cząstek PRRSV W badaniu tym stwierdziliśmy, że mutacja Cys-27 Asn i Cys-76 Leu w białku N PRRSV interferuje z wytwarzaniem cząstek zakaźnym w komórkach BHK-21. Wyciągnęliśmy wniosek, że reszty te mają zasadnicze znaczenie dla prawidłowej struktury lub czynności, lub i struktury, i czynności, białka n w zespole wirusa PRRSV. Białko N bierze udział w pierwszych etapach wytwarzania wirusa, wiązaniu wirusowego RNA genomowego i tworzeniu struktury kapsydowej. Ponieważ transkrypty klonów cdna długości genomowej, zawierające Cys-27 Asn i Cys-76 Leu ulegały replikacji na poziomie wirusa typu dzikiego, mutacje w resztach Cys niszczą wiązanie RNA przez białko N. Zamiast tego indukują one różną strukturę białka N, hamującą tworzenie się prawidłowych kapsydów. Defekt w tworzeniu kapsydów z wirusowym genomem RNA można uzupełnić białkiem N typu dzikiego, ulegającym przejściowo lub ciągle ekspresji w linii komórkowej (BHK-21). W ten sposób tworzy się wirus zdolny do ukończenia tylko jednego cyklu zakażenia/replikacji. Tak więc wirus taki uważa się za bardzo bezpieczną szczepionkę do ochrony świń przed PRRSV. 2. Wprowadzenie markera do białka N PRRSV Celem tego badania było wytworzenie zmutowanych wirusów PRRS, które można serologicznie odróżnić od wirusa typu dzikiego, są zatem obiecującymi mutantami do opracowywania szczepionki markerowej przeciwko PRRSV. Białko N dobrano jako pierwszego kandydata do mutagenezy w celu wytworzenia wirusa z markerem serologicznym, ponieważ wiele badań wykazało, że białko N jest najbardziej antygenowym białkiem PRRSV. Na przykład świnie zakażone PRRSV rozwijają silną reakcję przeciwciał przeciwko białku N PRRSV (Meulenberg i wsp., 1995). Ponadto białko N zawiera dwa regiony antygenowe, oznaczone B i D, zachowane w europejskich i północnoamerykańskich izolatach PRRSV, i dostępne są MAb skierowane na te regiony (Meulenberg i wsp., 1998). Tutaj wykazaliśmy, że mutacja 4 aminokwasów w miejscu B do odpowiednich aminokwasów białka N EAV i mutacja 5-9 aminokwasów w domenie D do odpowiednich aminokwasów białka n LDV hamuje wytwarzanie zakaźnych cząstek wirusa. Ponieważ replikacja RNA i synteza mrna subgenomowego wydawały się pozostawać na poziomie właściwym dla typu dzikiego, mutacje te najprawdopodobniej zapobiegały tworzeniu prawidłowych kapsydów przez białko N. Jednakże mutageneza pojedynczego aminokwasu w regionie D (Asp-62 Tyr) umożliwiła wytworzenie wirusa vabv600 o odmiennym od PRRSV i innych wirusów PRRSV profilu wiązania MAb. VABV600 indukuje różne spektrum przeciwciał u świń w porównaniu z tymi innymi izolatami PRRSV. Tak więc vabv600 można odróżnić od wirusa typu dzikiego na podstawie przeciwciał w surowicy i jest to mutant doskonale nadający się do dalszego opracowywania szczepionek markerowych przeciwko PRRSV.

15 PL B Wyjaśnienie sygnałów replikacji ORF7 wirusa Lelystad Dla wielu wirusów nici dodatniej RNA wykazano, że ich regiony niekodujące 5' i/lub 3' zawierają zasadnicze sygnały, kontrolujące zapoczątkowanie syntezy RNA nici plus i minus. Dla PRRSV nie ustalono jeszcze, czy same te sekwencje wystarczają do replikacji. Wytwarzanie klonu zakaźnego umożliwiło nam zanalizowanie sygnałów replikacji w genomie PRRSV. W badaniu tym mapowaliśmy elementy sekwencji o działaniu cis, konieczne do replikacji, przez wprowadzanie delecji do klonu zakaźnego. Wykazaliśmy, że transkrypty pochodzące z klonów cdna, nie zawierających genu ORF7, nie ulegają replikacji. Bardziej systematyczna analiza delecji wykazała, że ważne znaczenie dla replikacji RNA PRRSV miał region 44 nukleotydów między nukleotydami a w genie ORF7. Było to bardzo interesujące odkrycie, ponieważ sekwencje o zasadniczym znaczeniu dla replikacji u większości wirusów RNA nici dodatniej znajdują się w regionach niekodujących 5' i 3'. Jest to również stwierdzenie interesujące dla badań, których celem jest opracowanie replikonów wirusowych, które można ocalić jedynie poprzez uzupełnienie linii komórkowych, wykazujących ekspresje ORF, które uległy delecji. Minimalnymi wymaganiami dla tych RNA są region niekodujący 5' -ORF1a- -ORF1b-region niekodujący 3'. Wirusowe RNA lub replikony, zawierające te elementy sekwencji, uzupełnione wyborem fragmentów z innych otwartych ramek odczytu PRRSV lub fragmentów otwartych ramek odczytu, wykazujących ekspresję antygenów innych (heterologicznych) patogenów, można upakować do cząstek wirusa, gdy białka zasadnicze dla wytworzenia wirusa obecne są w postaci trans. Przy podawaniu tych cząstek świniom, na przykład w postaci szczepionki, będą one wchodzić do swoistych komórek gospodarza, takich jak makrofagi i antygeny wirusowe lub heterologiczne ulegają ekspresji i indukują reakcje immunologiczne z powodu replikacji RNA. Jednakże, ponieważ RNA nie wykazuje ekspresji (wszystkich) białek koniecznych do pakowania i wytwarzania nowych cząstek, replikon nie może szerzyć się dalej, stanowi więc bardzo skuteczną, lecz bezpieczną i nieszerzącą się szczepionkę rekombinacyjną, skuteczną przeciwko PRRSV i/lub patogenom heterologicznym. 4. Wytwarzanie atenuowanego wirusa PRRSV przez delecję miejsca Ndel w ORF6 W badaniu tym wytworzyliśmy zmutowany wirus PRRSV vabv575 o charakterystyce wzrostu w PAM innej, niż dla szczepu macierzystego vabv437. Nie obserwowano różnicy w ekspresji białek strukturalnych w komórkach BHK-21 przez RNA vabv575 lub vabv437, wirus vabv575 wytwarzany w komórkach BHK-21 zakażał PAM wolniej, niż vabv437. Konieczna jest dalsza analiza kinetyki wzrostu vabv575 przez krzywe wzrostu w PAM. W klonie cdna pabv575, który zastosowano do wytworzenia vabv575, mutacji poddano miejsce NdeI w pozycji w ORF6. Spowodowało to zmianę aminokwasów Thr-59 Asn w białku M. Zmutowane białko M nadal ulegało wiązaniu z M-swoistym MAb Białko M jest najbardziej zachowanym białkiem strukturalnym wśród arteriwirusów i koronawirusów. Białko jest integralnym białkiem błonowym, zawierającym trzy N-końcowe hydrofonowe domeny obejmujące błony (Rottier, 1995). Białko przechodzi przez błonę trzy razy, pozostawiając krótką domenę N-końcową na zewnątrz wirionu i krótką domenę C-końcową wewnątrz wirionu. Wykazano, że białko M koronawirusów odgrywa istotną rolę w tworzeniu wirusa (Vennema i wsp., 1996). Mutacja Thr-59 Asn umiejscowiona jest między drugim a trzecim rozciągającym się na błony fragmentem M w vabv575. Mutacja ta wpływa na tworzenie się wirusa, stabilność wirusa lub wchodzenie wirusa do PAM. 5. Ekspresja epitopu HA w rekombinacyjnych wirusach PRRSV W badaniu tym z powodzeniem stosowaliśmy PRRSV jako wektor do ekspresji obcego antygenu, epitopu HA hemaglutyniny wirusa grypy A. Wytworzono rekombinacyjne wirusy PRRSV, wytwarzające tag HA, połączony z końcem N lub C białka N. Ponadto wytworzono mutant PRRSV, zawierający tag HA, jak również proteazę 2A FMDV, poddany fuzji z końcem N białka N. Proteaza 2A była funkcjonalnie czynna w kontekście wirusa PRRSV i odszczepiała tag HA od białka N. Powodowało to wytworzenie białka N, identycznego z białkiem N typu dzikiego, z wyjątkiem aminokwasów pierwszego i drugiego (Met i Ala), których w mutancie nie ma. Analiza genetyczna pasażu 4 wirusów rekombinacyjnych wskazała, że zmutowany wirus, zawierający zarówno tag HA, jak i proteazę 2A był bardziej stabilny, niż zmutowane wirusy, wykazujące ekspresję białek fuzyjnych HA-N. Można zauważyć, że brak pierwszej metioniny i mutacja drugiego aminokwasu na końcu N białka N są lepiej tolerowane przez wirusa, niż addycja tagu HA z 9 aminokwasów do końca N lub C białka N. Konieczne są dalsze analizy genetyczne i czynnościowe w celu wyjaśnienia różnic stabilności, obserwowanych dla tych wirusów. Ponadto w celu ustalenia, czy indukowane są reakcje przeciwciał przeciwko epitopowi HA, konieczne jest zakażenie świń tymi mutantami wykazującymi ekspresję HA.

16 16 PL B1 Gen ORF7 dobrano do insercji tagu HA przede wszystkim z dwóch powodów (I) subgenomowe RNA7, wykazujące ekspresję tego genu, jest występującym w największej ilości RNA subgenomowym, wytwarzanym w zakażonych komórkach i (II) tag HA można wprowadzać bez poddawania mutacji innych ORF, ponieważ ORF7 w bardzo małym stopniu zachodzi na ORF6 na końcu 5' i nie zachodzi na inne ORF na końcu 3'. Jednakże można wytwarzać podobne konstrukty poprzez wprowadzenie tagu HA i proteazy 2A na końcu 5' ORF2 i na końcu 5' ORF5 bez wpływu na inne ORF. Dokonana z powodzeniem ekspresja tagu HA w połączeniu z proteazą 2A na końcu 5' ORF7 tworzy nowe możliwości ekspresji innych obcych antygenów, takich jak białko E2 cholery świń lub epitopy limfocytów B parwowirusa, w PRRSV. Ponieważ PRRSV swoiście zakaża makrofagi, komórki układu immunologicznego o zdolności do prezentowania antygenu i obróbki, PRRSV mógłby być doskonałym wektorem do ekspresji antygenów i indukcji odporności na te antygeny u świń. Opis rysunków Fig. 1. Właściwości pełnej długości klonów cdna PRRSV, zawierających mutacje w genie ORF7. Zmutowane geny ORF7 wprowadzono do zakaźnego klonu cdna pabv437 z unikalnymi miejscami Hpal i PacI, które wskazano. Ukazano liczbę plazmidów (pabv) powstałych konstruktów. Oznaczono replikację RNA poprzez wykrywanie ekspresji białek strukturalnych w IPMA po transfekcji transkryptów pełnej długości klonów cdna w komórkach BHK-21. Wytwarzanie białka N oznaczono w IPMA lub immunoprecypitacji. Wytwarzanie zakaźnego wirusa osiągnięto przez przeniesienie nadsączu transfekowanych komórek BHK-21 do PAM i wykrywanie cpe. Fig. 2. Właściwości pełnej długości klonów cdna PRRSV, zawierających delecje w regionie kodującym białka strukturalne LV w celu wyjaśnienia obecności sygnałów replikacji w tym regionie. Ukazano regiony, które uległy delecji (słupki kropkowane), nadal obecne regiony ORF7 (słupki zamalowane) i liczbę plazmidów (pabv) powstałych klonów. Ustalono replikację RNA poprzez wykrywanie ekspresji białek strukturalnych i w szczególności ekspresję białka N, obu w IPMA. Wytwarzanie zakaźnego wirusa ustalono poprzez zakażenie PAM nadsączem z transfekowanych komórek BHK-21. Przeprowadzono IPMA celem wykrycia ekspresji białek LV. Fig. 3. Właściwości zakaźnego klonu cdna pabv575. Klon ten skonstruowano poprzez mutację miejsca Ndel w pozycji w ORF6. Replikację RNA oznaczono poprzez wykrywanie ekspresji białek strukturalnych w IPMA po transfekcji transkryptów pełnej długości klonów cdna w komórkach BHK-21. Wytwarzanie zakaźnego wirusa ustalono poprzez przeniesienie nadsączu transfekowanych komórek BHK-21 do PAM i wykrywanie cpe. Fig. 4. Wprowadzenie markera antygenowego do zakaźnego klonu PRRSV. Wskazano insercję tagu HA i sekwencji proteazy 2A w plazmidach pabv 525, 523 i 526. Replikację RNA określono przez wykrywanie ekspresji białek strukturalnych w IPMA po transfekcji transkryptów pełnej długości klonów cdna. Ekspresję N i HA również ustalono w IPMA. Wytwarzanie zakaźnego wirusa ustalono poprzez przeniesienie nadsączu transfekowanych komórek BHK-21 do PAM i wykrywanie cpe. Piśmiennictwo 1. Liljeström, P. and Garoff, H. (1991). A new generation of animal cell expression vectors based on the Semliki Forest virus replicon. Biotechnol. 9, Kolodziej, P.A. and Young, R.A. Epitope tagging and protein surveillance Methods Enzymol. 194, Meulenberg, J.J.M., Bende, R.J., Pol, J.M., Wensvoort, G., and Hoormann, R.J.M. (1995). Nucleocapsid protein N of Lelystad virus: expression by recombinant baculovirus, immunological properties, and suitability for detection of serum antibodies. Clin. Diagn. Laboratory Immunol. 2, Meulenberg, J.J.M., Hulst, M.M., de Meijer, E.J., Moonen, P.L.J.M., den Besten, A., de Kluyver, E.P., Wensvoort, G., i Moormann, R.J.M. (1993). Lelystad virus, the causative agent of porcine epidemic abortion and respiratory syndrome (PEARS) is related to LDV and EAV. Virology 192, Meulenberg, J.J.M., and Petersen-den Besten, A. (1996). Identification and characterization of a sixth structural protein of Lelystad wirus: The glycoprotein GPZ encoded by ORF2 is incorporated in virus particles. Virology 225, Meulenberg, J.J.M., Bos-de Ruijter, J.N.A, van de Graaf, R., i Wensvoort, G., i R.J.M. Moormann. (1998) Infectious transcripts from cloned genome-length cdna of porcine reproductive and respiratory syndrome wirus. J. of Virology 72,

17 PL B Meulenberg, J.J.M., van Nieuwstadt, A.P., van Essen-Zandbergen, A., Bos-de Ruijter, J.N.A.,Langeveld, J.P.M., i Meloen, R.H. (1998) Localization and fine mapping of antigenic sites on the nucleocapsid protein N of porcine reproductive and respiratory syndrome virus with monoclonal antibodies. Virology, 252, Murtaugh, M.P., Elam, M.R., i Korkach, L.T., (1995). Comparison of the structural protein coding sequences of the VR-2332 and Lelystad virus strains of the PRRS wirus. Arch. Virol. 140, Percy, N., Barclay, W.S., Garcia-Sastre, A. and Palese, P. Expression of a foreign protein by influenza A virus J. Virol. 68: Rottier, P.J.M. (1995) The coronavirus membrane protein, p In: S.D. Siddell (ed.), The coronaviridae. Plenum Press, New York N.Y. 11. Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. Molecular cloning a laboratory manual wydanie II, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York 12. van Nieuwstadt, A.P., Meulenberg, J.J.M., van Essen15 Zandbergen, A., Petersen-den Hesten, A., Bende, R.J., Moormann, R.J.M., and Wensvoort, G. (1996). Proteins encoded by ORFs 3 and 4 of the genome of Lelystad wirus (Arteriviridae) are structural proteins of the virion. J. Virol. 70, Wensvoort, G., Terpstra, C, Pol, J.M.A., Ter Laak, E.A., Bloemraad, M., de Kluyver, E.P., Kragten, C, van Buiten, L., den Besten, A., Wagenaar, F., Broekhuijsen, J.M., Moonen, P.L.J.M., Zetstra, T., de Boer, E.A., Tibben, H.J., de Jong, M.F., van 't Veld, P., Groenland, G.J.R., van Gennep, J.A., Voets, M.Th., Verheijden, J.H.M., and Braamskamp, J. (1991). Mystery swine disease in the Netherlands: the isolation of Lelystad wirus. Vet. Quart. 13, Vennema, H., Godeke, G.-J., Rossen, J.W.A., Voorhout, W.F., Horzinek, M.C., Opstelten, D.-J.E., and Rottier, P.J.M. (1996) Nucleocapsid-independent assembly of coronavirus-like patricales by viral envelope protein genes. EM80 J. 15, Wensvoort, G., Terpstra, C, Boonstra, J., Bloemraad, M., and van Zorane, D. (1986). Production of monoclonal antibodies against swine fever virus and their use in laboratory diagnosis. Vet. Microbiol. 12,

18 18 PL B1

19 PL B1 19 T a b e l a 2. Barwienie LV4.2.1, vabv600 (mutacja Asp-62 Tyr), ATCCVR2332-podobny PRRSV, zawierający mutację Asp61 Tyr w białku N, i ATCC-YR2332 z rozmaitymi N-swoistymi MAb w IPMA. MAb Miejsce LV4.2.1 vabv600 (Asp-62 Tyr) ATCCVR2332- podobny (Asp-61 Tyr) ATCC-VR A NS99 B D D ) D ) D ) D ) - + SDOW17 D ) - 1) + + WBE1 D WBE4 D WBE5 D WBE6 D VO17? ) brak barwienia w IPMA przy rozcieńczeniu nadsączu hodowli hybrydoma do 0,3-0,5 μg/ml, słabe barwienie IgG oczyszczonym z nadsączu hodowli rozcieńczonego do 10 μg/ml. Zastrzeżenia patentowe 1. Replikon wirusa zespołu reprodukcyjnego i oddechowego świń (PRRSV), znamienny tym, że co najmniej niektóre z jego oryginalnych kwasów nukleinowych PRRSV uległy delecji, przy czym replikon ten zdolny jest do replikacji RNA in vivo i zawiera co najmniej elementy sekwencji z regionu niekodującego 5' ORF1a-ORF1b-ORF7-regionu niekodującego 3' PRRSV i kwas nukleinowy, odpowiadający regionowi między nukleotydami z ORF7 PRRSV. 2. Replikon według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera ponadto kwas nukleinowy pochodzący z co najmniej jednego drobnoustroju heterologicznego. 3. Replikon według zastrz. 1, albo 2, znamienny tym, że zawiera ponadto substytucje lub delecje kwasu nukleinowego w genie ORF7, kodującym białko N, powodujące, że jest niezdolny do tworzenia kapsydu białka N. 4. Replikon według zastrz. 3, znamienny tym, że zawiera modyfikację kwasu nukleinowego, polegającą na delecji cysteiny w białku N w pozycjach 27 i/lub Replikon według zastrz. 3, znamienny tym, że zawiera modyfikację kwasu nukleinowego prowadzącą do zmiany aminokwasu regionu B, zawierającego aminokwasy 25-30, i regionu D, zawierającego aminokwasy i/lub aminokwasów białka N. 6. Replikon według zastrz. 1, albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, znamienny tym, że wprowadzono marker umożliwiający rozróżnienie serologiczne. 7. Replikon według zastrz. 6, znamienny tym, że zawiera ponadto modyfikację kwasu nukleinowego prowadzącą do zmiany aminokwasów oryginalnej reszty asparaginowej w pozycji 62 białka N. 8. Replikon według zastrz. 6, albo 7, znamienny tym, że zawiera modyfikację kwasu nukleinowego prowadzącą do zmiany aminokwasów w ORF2, 3, 4, 5 i/lub Replikon według zastrz. 1, abo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, albo 7, albo 8, znamienny tym, że zawiera modyfikację kwasu nukleinowego w markerze wirulencji PRRSV.

20 20 PL B1 10. Replikon według zastrz. 9, znamienny tym, że zawiera modyfikację kwasu nukleinowego w ORF6, kodującą przezbłonowe białko M. 11. Replikon według zastrz. 10, znamienny tym, że ta modyfikacja modyfikuje białko M między jego drugim a trzecim fragmentem przechodzącym przez błonę. 12. Zastosowanie replikonu jak zdefiniowano w zastrz. od 1 do 11 do wytwarzania szczepionki. 13. Zastosowanie według zastrz. 12, znamienne tym, że szczepionka jest szczepionką nierozprzestrzeniającą się. 14. Zastosowanie według zastrz. 12 albo 13, znamienne tym, że szczepionka jest szczepionką markerową. 15. Szczepionka zawierająca replikon jak zdefiniowano w zastrz od 1 do Zastosowanie szczepionki jak zdefiniowano w zastrz. 15 do szczepienia świń. 17. Replikon wirusa zespołu reprodukcyjnego i oddechowego świń (PRRSV), zdolny do replikacji RNA in vivo, znamienny tym, zawiera co najmniej elementy sekwencji z regionu niekodującego 5'-ORF1a-ORF1b-ORF7-region niekodujący 3' PRRSV i kwas nukleinowy, odpowiadający regionowi nukleotydom między nukleotydami z regionu ORF7 PRRSV i ponadto zawierający kwas nukleinowy pochodzący z co najmniej jednego heterologicznego drobnoustroju. 18. Replikon według zastrz. 17, znamienny tym, że zawiera ponadto substytucje lub delecje w genie ORF7, kodującym białko N, powodujące, że jest niezdolny do tworzenia kapsydu białka N. 19. Replikon według zastrz. 18, znamienny tym, że zawiera modyfikację kwasu nukleinowego, polegającą na delecji cysteiny w białku N w pozycjach 27 i/lub Replikon według zastrz. 18, znamienny tym, że zawiera modyfikację kwasu nukleinowego prowadzącą do zmiany aminokwasu regionu B, zawierającego aminokwasy 25-30, i regionu D, zawierającego aminokwasy i/lub aminokwasów białka N. 21. Replikon według zastrz. 17, albo 18, albo 19, albo 20, znamienny tym, że wprowadzono marker umożliwiający rozróżnienie serologiczne. 22. Replikon według zastrz. 21, znamienny tym, że zawiera modyfikację kwasu nukleinowego prowadzącą do zmiany aminokwasów oryginalnej reszty asparaginowej w pozycji 62 białka N. 23. Replikon według zastrz. 21, albo 22, znamienny tym, że zawiera modyfikację kwasu nukleinowego prowadzącą do zmiany aminokwasów w ORF2, 3, 4, 5 i/lub Replikon według zastrz. 21, abo 22, albo 23, znamienny tym, że zawiera modyfikację kwasu nukleinowego w markerze wirulencji PRRSV. 25. Replikon według zastrz. 24, znamienny tym, że zawiera modyfikację kwasu nukleinowego w ORF6, kodującą białko M przechodzące przez błonę. 26. Replikon według zastrz. 25, znamienny tym, że ta modyfikacja modyfikuje białko M między jego drugim a trzecim fragmentem przechodzącym przez błonę. 27. Replikon według zastrz. 17, znamienny tym, że drobnoustrój heterologiczny zawiera patogen. 28. Replikon według zastrz. 27, znamienny tym, że patogenem tym jest wirus. 29. Zastosowanie replikonu jak zdefiniowano w zastrz. od 17 do 28 do wytworzenia szczepionki. 30. Zastosowanie według zastrz. 29, znamienne tym, że szczepionka jest szczepionką nie rozprzestrzeniającą się. 31. Zastosowanie według zastrz. 29 lub 30, znamienne tym, że szczepionka jest szczepionką markerową. 32. Szczepionka zawierająca replikon jak zdefiniowano w zaostrz. od 17 do Zastosowanie szczepionki jak zdefiniowano w zastrz. 31 do szczepienia świń.