(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) (13) T3 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (13) T3 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (51) Int. Cl. C07D305/14 ( ) (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej Europejski Biuletyn Patentowy 2008/42 EP B1 (54) Tytuł wynalazku: Sposób wyodrębniania paklitakselu (30) Pierwszeństwo: US P (43) Zgłoszenie ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2007/13 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 04/2009 (73) Uprawniony z patentu: IVAX Pharmaceuticals s.r.o., Opava, CZ (72) Twórca (y) wynalazku: PL/EP T3 BUCHTA Martin, Ludgerovice, CZ CVAK Ladislav, Opava-Zlatniky, CZ SOBOTIK Roman, Opava, CZ STVERKA Pavel, Velka Polom, CZ (74) Pełnomocnik: Przedsiębiorstwo Rzeczników Patentowych Patpol Sp. z o.o. rzecz. pat. Szczepańska Zofia Warszawa 130 skr. poczt. 37 Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 V2312PL00/ZO Opis DZIEDZINA WYNALAZKU [0001] Wynalazek obecny dotyczy sposobu oczyszczania na drodze chromatografii paklitakselu z mieszanin zawierających paklitaksel. PODSTAWA [0002] Paklitaksel, znany dawniej jako taksol, jest ważnym środkiem chemioterapeutycznym, użytecznym w leczeniu ludzkich nowotworów jajnika, sutka i płuc. Rokował on również nadzieję w wielu rakach u ludzi, a jego zastosowania kliniczne opisano w kilku artykułach przeglądowych, takich jak E.K. Rowinsky, Ann. Rev. Med. 48:353, 1997; D.D. Van Hoff, Semin. Oncol. 24:3 (1997); M.D. DeFuria, Phytomedicine 4:273 (1997) i E.A. Einsenhauer, J.B. Vermorken, Drugs 55:5 (1998). [0003] Paklitaksel jest związkiem naturalnym, wyizolowanym po raz pierwszy przez Wani i in., z kory cisu pacyficznego (Taxus brevifolia). J. Am. Chem. Soc. 93:2325 (1971). Od tego czasu badacze stwierdzili, że paklitaksel występuje we wszystkich pozostałych gatunkach Taxus genus, obejmujących cis europejski (Taxus baccata), cis himalajski (Taxus Wallichiana), cis chiński (Taxus celebita), cis japoński (Taxus cuspidata), cis kanadyjski (Taxus canadensis), cis meksykański (Taxus globosa), cis florydyjski (Taxus floridana) oraz cis ozdobny (Taxus media) i wszystkie ich krzyżowki i odmiany. [0004] Określono strukturalny wzór paklitakselu i przedstawiono go poniżej. [0005] Wyizolowanie paklitakselu ze wszystkich typów potencjalnych źródeł roślinnych jest złożone i trudne, częściowo ze względu na bardzo niskie stężenie w biomasie, a częściowo w związku z obecnością innych związków, głównie taksanów, które mają właściwości podobne do paklitakselu. Z uwagi na duże zapotrzebowanie i małą dostępność, intensywnie poszukuje się dodatkowych potencjalnych źródeł do przemysłowej produkcji paklitakselu (G.M. Gragg i in., J. Nat. Prod. 56:1657 (1993)). Niektóre spośród tych źródeł obejmują odnawialne części wszystkich typów roślin z gatunku Taxus (liście, wycinki i hydroponicznie hodowane całe roślin), fermentujące hodowle tkanek Taxus, fermentujące grzyby pasożytujące na Taxus, itd. 1

3 [0006] Na ogół, paklitaksel wyizolowuje się najpierw przez ekstrakcję biomasy odpowiednimi rozpuszczalnikami, z wytworzeniem ekstraktów, które poddaje się rafinacji metodami ekstrakcji ciecz-ciecz. Po ekstrakcji, paklitaksel zwykle izoluje się dalej w etapie chromatografii z odwróconą fazą. W literaturze można znaleźć wiele przykładów takiej techniki, obejmujących: Wu Dauh-Rurng i in., J. Chrom. A., 702:233 (1995); Rao V. Koppaka i in., Pharm. Res. 12:1003 (1995) oraz Yang Xuefeng i in., J. Chrom. A., 813:301 (1998). Chromatografię z odwróconą fazę do końcowego oczyszczania paklitakselu opisano również w kilku patentach, takich jak patent USA nr 5,279,949; patent USA nr 5,380,916 i patent USA nr 5,969,165. Opracowywano również ciągły proces oparty na chromatografii z odwróconą fazą na symulowanym złożu ruchomym. Wu Dauh-Rurng i in., J. Chrom. A., 855:71 (1999). Jednakże, wadą stosowania chromatografii z odwróconą fazą jest konieczność stosowania rozpuszczalników zawierających wodę, które niekorzystnie powodują izomeryzację paklitakselu do niepożądanego 7-epi-paklitakselu. [0007] Do izolowania paklitakselu znane jest również stosowanie chromatografii z normalną fazą. Jednakże, w procesie tym stosuje się kosztowne fazy stacjonarne, takie jak alkilofenyl i pentafluorofenyl. Wu Dauh-Rurng i in., J. Chrom. A., 702:233 (1995). Najnowsze sposoby izolowania paklitakselu są oparte na skomplikowanych procedurach eluowania gradientem lub na kilkuetapowej chromatografii z zastosowaniem różnych kompozycji dla fazy ruchomej, albo na połączeniu obydwu chromatografii, z fazą normalną i z fazą odwróconą. Patrz, np. Park Young Kwang i in., J. Liq. Chrom. & Rel. Technol. 22(18):2755 (1999); Xue Jun i in., J. Liq. Chrom. & Rel. Technol. 23(16):2499 (2000); patent USA nr 5,478,736. Innym podejściem jest stosowanie chromatografii z odwróconą fazą z zastosowaniem tlenku glinu jako adsorbentu. Niestety, często wraz z tlenkiem glinu jako fazę ruchomą stosuje się chlorowane rozpuszczalniki organiczne. Ponadto, w tym układzie w zależności od czasu eluowania, ma miejsce zarówno epimeryzacja, jak i chemiczny rozkład paklitakselu. Z. Zhiquiang, S. Zhiguo, J. Liq. Chrom. & Rel. Technol. 23(17):2683 (2000). [0008] Ostatnio, w patencie USA nr 6,333,419 ujawniono izolowanie paklitakselu na drodze chromatografii z normalną fazą, z zastosowaniem krzemionki jako fazy stacjonarnej i estru kwasu karboksylowego jako fazy ruchomej. Opisany tu sposobów przeznaczony był do oddzielania paklitakselu od cefalomanniny. [0009] Jednakże, istnieje ciągłe zapotrzebowanie na sposób izolowania w skali przemysłowej paklitakselu od różnych składników niepożądanych z prostymi i skutecznymi operacjami oczyszczania. STRESZCZENIE WYNALAZKU [0010] Zaletą obecnego wynalazku jest prosty, niekosztowny i skuteczny sposób izolowania i wytwarzania wysoce czystego paklitakselu w skali przemysłowej. [0011] Te i inne korzyści są co najmniej w części zapewnione przez sposób izolowania paklitakselu od mieszaniny paklitakselu, z zastosowaniem chromatografii z normalną fazą opartą na związku poliamidowym opartym na poliamidzie. Sposób ten obejmuje wprowadzenie do zbiornika zawierającego związek oparty na poliamidzie mieszaniny wyjściowej obejmującej paklitaksel, a następnie wprowadzanie do zbiornika roztworu zawierającego jeden lub więcej ketonów dialkilowych razem z mniej polarnym rozpuszczalnikiem. Roztwór ten dodaje się w celu spowodowania, aby wraz z innymi składnikami mieszaniny wyeluował ze zbiornika. Następnie, zbiera się jedną lub więcej frakcji eluującego roztworu zawierającego paklitaksel. [0012] Sposób ten można korzystnie stosować do oczyszczania paklitakselu na wielką skalę. Wyjściowy materiał paklitakselu może pochodzić z dowolnego źródła, która zawiera paklitaksel i pewną ilość 2

4 niepożądanego składnika. Na przykład, wyjściową mieszaniną może być surowy lub oczyszczony ekstrakt otrzymany ze źródeł roślinnych lub przez ekstrakcję hodowli komórkowych lub szczepów bakteryjnych. Wyjściową mieszaniną może być, ale bez ograniczeń, mieszanina paklitakselu, cefalomanniny i innych taksanów. [0013] Wykonania obecnego wynalazku obejmują wprowadzenie około jednej części wagowej wyjściowej mieszaniny do zbiornika, np. kolumny, wypełnionego więcej niż około 20 częściami wagowymi związku opartego na poliamidzie, np. polikaprolaktamu, poliundekanolaktamu, polilaurylolaktamu lub poli(heksametylenoadypoamidu-ko-kaprolaktamu); wprowadzenie roztworu zawierającego aceton jako keton dialkilowy oraz toluen lub heksan jako mniej polarny rozpuszczalnik; oraz zwiększenie stężenia ketonu dialkilowego w stosunku do mniej polarnego rozpuszczalnik podczas wprowadzania roztworu do pojemnika. Czysty paklitaksel lub koncentrat paklitakselu można wyizolować przez odparowanie i krystalizację z odpowiednich frakcji zawierających najwyższe stężenia paklitakselu. [0014] Inne zalety obecnego wynalazku staną się oczywiste dla specjalisty w tej dziedzinie techniki po zapoznaniu się z następującym szczegółowym opisem, w którym przedstawiono i opisano jedynie korzystne wykonanie wynalazku jako ilustrację najlepszego sposobu rozważanego do jego przeprowadzenia. Oczywiste również będzie, że wynalazek obejmuje inne i różne wykonania, a niektóre spośród ujawnionych tu cech można w oczywisty sposób modyfikować bez wykraczania poza zakres wynalazku. Wynalazek można przeprowadzić bez niektórych lub wszystkich spośród szczegółowo opisanych tu elementów. W innych przypadkach, dobrze znanych operacji sposobu nie opisywano szczegółowo, aby nie komplikować niepotrzebnie obecnego wynalazku. A zatem, należy uważać, że rysunki i opis mają charakter ilustracyjny, a nie ograniczający zakres wynalazku. KRÓTKI OPIS RYSUNKÓW [0015] Nawiązuje się do załączonych rysunków, na których: [0016] Na Fig. 1 zilustrowano skład materiału wyjściowego, stosowanego w przykładzie 1, jak określono metodą analizy HPLC; odcięta oznacza czas eluowania w minutach, a rzędna oznacza jednostki absorbancji. [0017] Na Fig. 2 zilustrowano skład głównych frakcji z przykładu 1, jak określono metodą analizy HPLC; odcięta oznacza czas eluowania w minutach, a rzędna oznacza jednostki absorbancji. [0018] Na Fig. 3 zilustrowano skład materiału wyjściowego, stosowanego w przykładzie 2, jak określono metodą analizy HPLC; odcięta oznacza czas eluowania w minutach, a rzędna oznacza jednostki absorbancji. [0019] Na Fig. 4 zilustrowano skład głównych frakcji z przykładu 2, które wyeluowano w temperaturze około 40 C, jak określono metodą analizy HPLC; odcięta oznacza czas eluowania w minutach, a rzędna oznacza jednostki absorbancji. [0020] Na Fig. 5 zilustrowano skład głównych frakcji z przykładu 2, które wyeluowano w temperaturze około 70 C, jak określono metodą analizy HPLC; odcięta oznacza czas eluowania w minutach, a rzędna oznacza jednostki absorbancji. 3

5 [0021] Na Fig. 6 zilustrowano skład materiału wyjściowego, stosowanego w przykładzie 3, jak określono metodą analizy HPLC; odcięta oznacza czas eluowania w minutach, a rzędna oznacza jednostki absorbancji. [0022] Na Fig. 7 zilustrowano skład głównych frakcji z przykładu 3, jak określono metodą analizy HPLC; odcięta oznacza czas eluowania w minutach, a rzędna oznacza jednostki absorbancji. [0023] Na Fig. 8 zilustrowano skład krystalicznego produktu z przykładu 3, jak określono metodą analizy HPLC; odcięta oznacza czas eluowania w minutach, a rzędna oznacza jednostki absorbancji. [0024] Na Fig. 9 zilustrowano skład materiału wyjściowego, stosowanego w przykładzie 4, jak określono metodą analizy HPLC; odcięta oznacza czas eluowania w minutach, a rzędna oznacza jednostki absorbancji. [0025] Na Fig. 10 zilustrowano skład głównych frakcji z przykładu 4, jak określono metodą analizy HPLC; odcięta oznacza czas eluowania w minutach, a rzędna oznacza jednostki absorbancji. [0026] Na Fig. 11 zilustrowano skład materiału wyjściowego, stosowanego w przykładzie 5, jak określono metodą analizy HPLC; odcięta oznacza czas eluowania w minutach, a rzędna oznacza jednostki absorbancji. [0027] Na Fig. 12 zilustrowano skład głównych frakcji z przykładu 5, jak określono metodą analizy HPLC; odcięta oznacza czas eluowania w minutach, a rzędna oznacza jednostki absorbancji. [0028] Na Fig. 13 zilustrowano skład materiału wyjściowego z przykładu 6, jak określono metodą analizy HPLC; odcięta oznacza czas eluowania w minutach, a rzędna oznacza jednostki absorbancji. [0029] Na Fig. 14 zilustrowano skład głównych frakcji z przykładu 6, jak określono metodą analizy HPLC; odcięta oznacza czas eluowania w minutach, a rzędna oznacza jednostki absorbancji. SZCZEGÓŁOWY OPIS WYNALAZKU [0030] Obecny wynalazek opracowano podczas badania procesów izolowania paklitakselu na wielką skalę. Po eksperymentach i badaniu stwierdzono, że paklitaksel można skutecznie oczyścić metodą chromatografii, gdy faza stacjonarna obejmuje adsorbent oparty na poliamidzie i gdy faza ruchoma obejmuje mieszaninę jednego lub więcej ketonów dialkilowych razem z innym mniej polarnym ko-rozpuszczalnikiem. Wynalazek obecny korzystnie umożliwia wyodrębnienie paklitakselu z mieszanin zawierających zanieczyszczenia taksanowe, które są trudne do usunięcia innymi sposobami, ale na ogół towarzyszą mieszaninom paklitakselu. [0031] Jeśli w kontekście wyraźnie nie zaznaczono inaczej, stosowane w niniejszym opisie formy pojedyncze obejmują również formy liczby mnogiej terminów, do których się odnoszą. [0032] Stosowane tu określenie około oznacza w przybliżeniu, w obszarze, mniej więcej lub w pobliżu. Gdy określenie około stosuje się w powiązaniu z zakresem liczbowym, modyfikuje ono ten zakres wykraczając powyżej i poniżej granic podanych wartości liczbowych. Na ogół, określenie około stosuje się tu do modyfikowania wartości liczbowych o różnicę 20% powyżej i poniżej podanej wartości. [0033] Należy rozumieć, że wyrażenia obejmują(e) lub obejmujący stosowane w tym opisie, zarówno w zwrotach nawiązujących, jak i w treści zastrzeżeń, mają znaczenie otwarte. Oznacza to, że wyrażenia te należy rozumieć synonimicznie z wyrażaniem zawierający co najmniej lub obejmujący co najmniej. Gdy wyrażenie obejmujący stosuje się w kontekście sposobu, oznacza ono, że sposób obejmuje co najmniej 4

6 opisane etapy, ale może obejmować etapy dodatkowe. Gdy wyrażenie to stosowane jest w kontekście kompozycji lub związku, oznacza wówczas, że związek lub kompozycja obejmuje co najmniej podane cechy lub składniki, ale może również obejmować cechy lub składniki dodatkowe. [0034] Stosowane w niniejszym opisie odniesienia do zakresu liczbowego dla zmiennej oznaczają, że wynalazek można prowadzić stosując zmienne równe dowolnej wartości w ramach danego zakresu. A zatem, dla zmiennej, która jest z natury skokowa, zmienna może być równa dowolnej całkowitej wartości w zakresie liczbowym, łącznie z końcowymi punktami tego zakresu. Podobnie, dla zmiennej, która jest z natury ciągła, zmienna może być równa każdej rzeczywistej wartości w zakresie numerycznym, łącznie z końcowymi punktami tego zakresu. Przykładowo, w przypadku zmiennych z natury skokowych, zmienna, którą opisano jako zmienną o wartościach w zakresie od 0 do 2, może oznaczać 0, 1 lub 2, a w przypadku zmiennych, które z natury są ciągłe, zmienna taka może oznaczać 0,0, 0,1, 0,01, 0,001 lub każdą inną wartość rzeczywistą. [0035] Jeśli konkretnie nie wskazano inaczej, słowo albo stosuje się tu w znaczeniu włączającym i/albo, a nie w znaczeniu wykluczającym albo/albo. [0036] W dalszej części opisano szczegółowo konkretne wykonania wynalazku. Aczkolwiek wynalazek opisano w połączeniu z tymi konkretnymi wykonaniami, należy rozumieć, że nie ogranicza się on do tych konkretnych wykonań. W następującym opisie liczne szczegóły zamieszczono dla lepszego zrozumienia wynalazku. Wynalazek obecny można prowadzić bez kilku lub wszystkich spośród tych konkretnych szczegółów. W innych przypadkach, dobrze znanych operacji sposobu nie opisywano szczegółowo, aby nie komplikować niepotrzebnie obecnego wynalazku. [0037] Do przeprowadzenia obecnego wynalazku można stosować dowolne odpowiednie materiały i/lub sposoby znane specjalistom w tej dziedzinie techniki. Jednakże, opisano tu korzystne materiały i sposoby. Jeśli nie stwierdzono inaczej, materiały, reagenty i tym podobne, które przedstawiono w opisie i przykładach, są dostępne w handlu. [0038] Wyjściowa mieszanina paklitakselu może pochodzić z dowolnej źródła, które zawiera paklitaksel oraz pewną ilość niepożądanego składnika. W praktyce obecnego wynalazku, można stosować każdą wyjściową mieszaninę paklitakselu. Przykładowo, wyjściową mieszaniną może być mieszanina paklitakselu, cefalomanniny i innych taksanów, ale nie wyłącznie. Wyjściową mieszaniną może być również surowy lub częściowo oczyszczony ekstrakt paklitakselu, który można otrzymać ze zwykłych źródeł, na przykład przez ekstrakcję ze świeżej lub wysuszonej kory, korzeni, liści i/lub gałęzi albo całej rośliny z rośliny zawierającej paklitaksel, np. z rośliny Taxus. Do stosowania w praktyce obecnego wynalazku rozważa się również inne źródła, obejmujące surowy lub oczyszczony ekstrakt otrzymany z hodowli komórek hodowanej rośliny Taxus, z brzeczki fermentacyjnej wytworzonej przez hodowanie grzybów produkujących taksan; z brzeczki fermentacyjnej wytworzonej przez hodowanie konkretnych szczepów bakteryjnych genetycznie modyfikowanych w celu produkowania paklitakselu. [0039] Stosowane w wynalazku mieszaniny paklitakselu mogą być różnego pochodzenia i mogą zawierać paklitaksel w szerokim zakresie stężeń. Ściśle określone mieszaniny o wysokiej zawartości paklitakselu i innych taksanów (cefalomanniny, dihydrocefalomanniny, taksolu C, 7-epi-paklitakselu, itd.), określane na ogół jako surowy krystaliczny paklitaksel lub krystaliczny koncentrat paklitekselu, można zasadniczo oczyści w jednoetapowym procesie chromatografii, z zastosowaniem opartego na poliamidzie adsorbentu. Wyjściowym materiałem może być dowolny koncentrat paklitakselu wytworzony znanymi sposobami z 5

7 biomasy zawierającej paklitaksel. Gdy stosuje się złożony materiał wyjściowy, proces oczyszczania może być skomplikowany na skutek obecności zanieczyszczeń nie-taksanowych. Wyjście ze złożonej mieszaniny paklitakselu może spowodować wyizolowanie paklitakselu z czystością, która jest niższa od pożądanej. A zatem, w wynalazku obecnym rozważa się więcej niż jeden etapów oczyszczania paklitakselu, takich jak powtórzony etap chromatografii lub etap krystalizacji. [0040] W jednym z aspektów obecnego wynalazku, paklitaksel oddziela się od niepożądanych składników na drodze chromatografii z fazą normalną. W chromatografii z fazą normalną, mieszaninę, która ma być oczyszczona, wprowadza się do kolumny lub do zbiornika z absorbentem. Następnie do kolumny wprowadza się rozpuszczalnik lub mieszaninę rozpuszczalników, tj. fazę ruchomą, co powoduje, że składniki mieszaniny przechodzą i eluują z kolumny. Fazę ruchomą można wprowadzać grawitacyjnie lub stosując pompy i/lub zawory mechaniczne, aby zachować bardziej dokładną kontrolę procesu, co jest znane w technice chromatografii. W odpowiednich warunkach składniki mieszaniny rozdzielają się i eluują z końca kolumny w różnych odstępach czasowych. [0041] W praktycznych wykonaniach obecnego wynalazku, mieszaninę paklitakselu wprowadza się do zbiornika, np. do kolumny, zawierającej związek oparty na poliamidzie, co stanowi początek oczyszczania mieszaniny. Aczkolwiek uważa się, że stosowany w obecnym wynalazku związek oparty na poliamidzie ułatwia rozdzielenie różnych składników, w związku z zasadami adsorpcji, wynalazek nie ogranicza się to tych zasad i niekoniecznie przebiega zgodnie z nimi. Zasady, w oparciu o które paklitaksel oddziela się od mieszaniny zgodnie z obecnym wynalazku, nie są związane z żadną teorią. [0042] Uważa się, że stosowanie opartego na poliamidzie adsorbentu jako fazy stacjonarnej w chromatografii z fazą normalną, nie jest powszechne. Jednakże, sądzi się, że poliamidy wykazują dobrą stabilność chemiczną i fizyczną w szerokim zakresie rozpuszczalników organicznym, co ułatwia ich stosowanie do rozdzielania składników mieszaniny. Zgodnie z wykonaniami obecnego wynalazku, sposób chromatografii jest oparty na poliamidzie jako fazie stacjonarnej. Aczkolwiek istnieje wiele potencjalnych odmian w chemicznym składzie struktury poliamidowej, we wszystkich przypadkach obecna jest centralna jednostka strukturalna wiązanie amidowe (-CO-NH-). Uważa się, że za skuteczność rozdzielania dla konkretnego polimeru poliamidowego odpowiedzialne są kolejność i liczba jednostek metylenowych pomiędzy dwoma wiązaniami amidowymi. [0043] Na podstawie eksperymentów stwierdzono, że polilaktamy, a zwłaszcza polikaprolaktam, wykazują najlepsze własności rozdzielania w stosowanych warunkach. Substancje te wykazały wysoki stopień stabilności po powtórzonych operacjach chromatografii, bez zauważalnej zmiany w skuteczności rozdzielania. Stabilność i skuteczność rozdzielania nie zmieniły się nawet wówczas, gdy stosowano etapu eluowania gradientem, np. gdy zwiększano stężenie ketonu dialkilowego w stosunku do mniej polarnego rozpuszczalnika podczas dodawania i eluowania roztworu do i z kolumny. Własności poliamidowej fazy stacjonarnej kontrastują z własnościami nieorganicznych faz stacjonarnych, takich jak krzemionka. Przykładowo, przełączenia fazy ruchomej z polarnej na niepolarną można dokonać bardzo szybko, bez potrzeby stosowania dużej ilości niepolarnej fazy ruchomej do eliminacji polarnego rozpuszczalnika z centrów aktywnych lub suszenia fazy stacjonarnej. Stosowanie poliamidu w chromatografii z fazą normalną prowadzi do niższej i stałej wydajności spęczniania w porównaniu ze stosowaniem go w chromatografii z fazą odwróconą, z fazą ruchomą zawierającą wodę. 6

8 [0044] Poliamidy wytwarza się w skali przemysłowej w szerokim zakresie wielkości cząstek. Najbardziej odpowiednia wielkość cząstek do rozdzielania w skali przemysłowej wynosi około 0,05-0,16 mm, co umożliwia wysoki przerób fazy ruchomej przy niskim spadku ciśnienia. Dobre rozdzielania paklitakselu uzyskano nawet wówczas, gdy stosowano jedynie około 20 części wagowych poliamidu na około jedną część materiału wyjściowego. Niemniej jednak, ilość fazy stacjonarnej zależy od składu materiału wyjściowego i żądanej czystości końcowego produktu, paklitakselu. Odpowiednie poliamidy, które można stosować w praktyce obecnego wynalazku, obejmują polikaprolaktam, poliundekanolaktam, polilaurylolaktam, poli(heksametylenoadypoamid-ko-kaprolaktam), itd. [0045] Inną zaletą rozdzielania materiałów zawierających paklitaksel na poliamidowej fazie stacjonarnej jest poprawiona selektywność rozdzielania obserwowana przy wzrastającej temperaturze. Stwierdzono, że stosowanie wyższych temperatur podczas procesu prowadzi do poprawy rozdzielania pomiędzy poszczególnymi taksanami. Stwierdzono, że przez utrzymanie fazy stacjonarnej lub ruchomej w temperaturze powyżej temperatury otoczenia, np. około C, uzyskuje się lepsze oddzielenie paklitakselu od jego analogu, cefalomanniny, która ma bardzo podobne własności rozdzielania. Ponadto, wyższe temperatury obniżają lepkość fazy ruchomej i w konsekwencji powinny również obniżyć koszty produkcji. Stosowanie wysokiej temperatury w chromatografii nie jest łatwe w innych procesach rozdzielania, zwłaszcza w tych, w których stosuje się chromatografię z odwróconą fazą, z uwagi na epimeryzację paklitakselu w rozpuszczalnikach zawierających wodę. W przeciwieństwie do tego, epimeryzacja paklitakselu w roztworze zasadniczo nie zawierającym wody lub w alkoholu, jest nieistotna, a zatem nie ogranicza procesu do niższych temperatur. [0046] Na skuteczność rozdzielania ma wpływ dobór odpowiednich rozpuszczalników do fazy ruchomej. Stwierdzono, że najlepsze oddzielenie paklitakselu od zanieczyszczeń obecnych w surowym materiale zawierającym paklitaksel uzyskuje się w procesie eluowania gradientem. W jednym z wykonań obecnego wynalazku, do związku poliamidowego wprowadza się mieszaninę paklitakselu, a następnie pierwszą fazę ruchomą, która zawiera niskie stężenie ketonu dialkilowego w mniej polarnym rozpuszczalniku, w której np. roztwór zawiera keton dialkilowy w stosunku do mniej polarnego rozpuszczalnika około 5% (obj./obj.) do około 15% (obj./obj.). Po wprowadzeniu wystarczającej ilości pierwszej fazy ruchomej do związku poliamidowego w warunkach izokratycznych, tj. bez zmiany składu rozpuszczalnika, wprowadza się drugą fazę ruchomą w warunkach gradientowych, co oznacza, że stężenie ketonu dialkilowego wzrasta od stężenia niskiego do wysokiego. [0047] Uważa się, że w warunkach izokratycznych wszystkie lipofilowe substancje eluują z kolumny z pierwszą fazą ruchomą, a gdy stężenie ketonu dialkilowego w fazie ruchomej wzrasta, wówczas eluują wszystkie pozostałe substancje. Ten typ profilu eluowania może skutecznie rozdzielić nie tylko substancje nie-taksanowe, ale również może zapewnić dobre rozdzielenie wszystkich substancji zawierających szkielet taksanu. W praktyce pewnych wykonań obecnego wynalazku zaobserwowano, że paklitaksel eluuje jako ostatnia substancja spośród wszystkich znanych taksanów. W tych okolicznościach uważa się, że występuje efekt wyrugowania paklitakselu i zaobserwowano, że strefa eluowania paklitakselu jest ostra i nie nakłada się na eluujące uprzednio substancje. W konsekwencji, eluowanie paklitakselu jako ostatniego taksanu może wykluczyć skutki przyłączania się, które stanowiły problem w przeszłości. [0048] W oparciu o badania laboratoryjne wykazano, że paklitaksel można skutecznie oddzielić od innych substancji metodą chromatografii z zastosowaniem opartej na poliamidzie fazy stacjonarnej oraz mieszanin 7

9 ketonów dialkilowych i mniej polarnego organicznego rozpuszczalnika jako fazy ruchomej. Odpowiednie ketony dialkilowe, które można stosować w praktyce obecnego wynalazku, obejmują aceton, keton metylowo-izobutylowy, 2-butanon, keton metylowo-etylowy, itd. Spośród tej grupy ketonów dialkilowych najkorzystniejszymi rozpuszczalnikami są aceton i keton metylowo-izobutylowy. Są one nietoksyczne i niekosztowne. Jednakże, zwykle są one zbyt polarne, aby mogły być stosowane jako jeden składnik fazy ruchomej. Tak więc, polarność fazy ruchomej zmniejsza się przez dodanie jednego lub więcej mniej polarnych ko-rozpuszczalników, takich jak alifatyczny węglowodór, aromatyczny węglowodór lub eter dialkilowy. [0049] W jednym z wykonań obecnego wynalazku, temperatury wrzenia rozpuszczalników stosowanych jako faza ruchoma powinny być niższe niż około 130 C. Powodem tego jest fakt, że produkt korzystnie odzyskuje się z frakcji chromatograficznych przez odparowanie. Jednakże, gdy temperatury wrzenia rozpuszczalników są zbyt niskie, ich odparowanie stwarza problemy dla środowiska. A zatem, korzystne mniej polarne rozpuszczalniki, stosowane w praktyce obecnego wynalazku, obejmują alifatyczne (C 5 -C 8 ) węglowodory, takie jak heksan lub heptan; aromatyczne (C 6 -C 8 ) węglowodory, takie jak toluen; etery (C 1 -C 4 ) dialkilowe, takie jak eter dibutylowy, eter diizobutylowy lub eter metylowo-tert-butylowy; lub ich mieszaniny. [0050] Z odpowiednich rozpuszczalników można wytwarzać wiele kombinacji roztworów. W celu poprawienia skuteczności procesu, poszczególne rozpuszczalniki można odzyskać po procesie rozdzielania, np. przez destylację. Korzystnie stosuje się kombinację rozpuszczalników, które mają dużą różnicę w temperaturach wrzenia, co ułatwia ich rozdzielenie przez destylację. W oparciu o temperatury wrzenia, spośród grupy mniej polarnych rozpuszczalników korzystnym rozpuszczalnikiem jest toluen. [0051] Inne kryteria dotyczące wyboru rozpuszczalników do stosowania jako faza ruchoma zależą od materiału do rozdzielenia. Na ogół, złożone mieszaniny z niską zawartością paklitakselu zawierają również pewną ilość bardzo polarnych zanieczyszczeń, które należy usunąć. Zanieczyszczenia te muszą na końcu być wypłukane z kolumny. Wydaje się, że takie mieszaniny paklitakselu rozdziela się łatwiej, gdy jako fazę ruchomą stosuje się kombinację acetonu i toluenu. [0052] Wyeluowane frakcje zawierające wysokie stężenie paklitakselu można następnie wyizolować przez odparowanie próżniowe. Zakres suszenia będzie zależny od tego, czy produktem końcowym jest jest lepka pozostałość, czy sucha masa, z których każdy można krystalizować z odpowiednich rozpuszczalników, uzyskując paklitaksel w krystalicznej postaci. Stosowanie całkowicie organicznego układu rozpuszczalników w połączeniu z ich szybkim odparowaniem korzystnie zmniejsza lub całkowicie eliminuje niepożądaną izomeryzację paklitakselu do 7-epi-paklitakselu. Stanowi to następną zaletę w porównaniu ze znanymi sposobami izolowania opartymi na chromatografii z odwróconą fazą. PRZYKŁADY [0053] Następujące przykłady ilustrują dalej pewne korzystne wykonania wynalazku, ale nie ograniczają jego zakresu. Specjaliści w tej dziedzinie techniki, bez wykraczania poza rutynowe eksperymenty, będą ustalić i stwierdzić wiele ekwiwalentów dla opisanych tu substancji i procedur. Przykład 1 8

10 [0054] Około 0,71 g surowej mieszaniny zawierającej około 8,38% paklitakselu i około 2,23% cefalomanniny (jak przedstawiono na Fig. 1) rozpuszczono w około 10 ml mieszaniny zawierającej aceton i toluen w stosunku 10:90 (obj./obj.). Roztwór wprowadzono do kolumny wypełnionej około 45 g adsorbentu opartego na poliamidzie (Polyamide Roth, wielkość cząstek około m). Następnie kolumnę eluowano około 600 ml roztworu acetonu i toluenu 10:90 (obj./obj.). Następnie do kolumny dodano około 1200 ml roztworu acetonu i toluenu, jednocześnie zwiększając liniowo gradient acetonu od wyjściowego stosunku 10:90 (obj./obj.) do końcowego 100:0 (obj./obj.). Podczas całego etapu eluowania przepływ fazy ruchomej utrzymywano na poziomie około 50 ml/minutę. Od czasu wstrzyknięcia do końcowego czasu eluowania gradientem pobierano po około 50 ml frakcji roztworu do eluowania i analizowano metodą HPLC. Frakcje roztworu eluującego zawierające paklitaksel odparowano do suchości i otrzymano około 0,14 g produktu zawierającego około 37,54% paklitakselu i około 6,80% cefalomanniny (analiza HPLC przedstawiona na Fig. 2). Przykład 2 [0055] Około 0,75 g surowej mieszaniny zawierającej około 1,99% paklitakselu i około 0,89% cefalomanniny (jak przedstawiono na Fig. 3) rozpuszczono w 15 ml mieszaniny acetonu i toluenu, 10:90 (obj./obj.). Roztwór wprowadzono do kolumny wypełnionej około 45 g poliamidu (Polyamide Roth, wielkość cząstek około m). Następnie kolumnę eluowano około 600 ml roztworu acetonu i toluenu 10:90 (obj./obj.), utrzymując temperaturę na poziomie około 40 C. Następnie do kolumny dodano około 1200 ml kombinacji acetonu i toluenu, jednocześnie zwiększając liniowo gradient acetonu od wyjściowego stosunku 10:90 (obj./obj.) do końcowego 100:0 (obj./obj.). Pobierano po 50 ml frakcji roztworu eluującego. Frakcje analizowano metodą HPLC. To samo badanie prowadzono z identycznym materiałem wyjściowym i w tych samych warunkach, z tą różnicą, że temperaturę w kolumnie utrzymywano na poziomie około 50 C, 60 C lub 70 C. Odpowiednie frakcje zawierające paklitaksel z czterech rożnych rozdziałów oceniano pod kątem zawartości paklitakselu i cefalomanniny. Stwierdzono, że wzrost temperatury prowadzi do lepszego rozdziału dwóch substancji od stosunku około 3,89:1 przy 40 C (analiza HPLC przedstawiona na Fig. 4) do stosunku około 5,31:1 przy temperaturze 70 C (analiza HPLC przedstawiona na Fig. 5). Przykład 3 [0056] Około 198,0 g surowej mieszaniny paklitakselu zawierającej około 7,3% paklitakselu i około 2,3% cefalomanniny (początkowy stosunek paklitaksel/cefalomanniny wynosił około 3,17:1, zgodnie z analizą metodą HPLC, jak przedstawiono na Fig. 6) rozpuszczono w 4 l acetonu i toluenu (10:90, obj./obj.). Roztwór wprowadzono do kolumny wypełnionej około 6830 g poliamidu (Polyamide Roth, wielkość cząstek około m). Następnie kolumnę eluowano 100 l acetonu i toluenu (10:90, obj./obj.). Kolumnę eluowano dalej 200 l mieszaniny acetonu i toluenu, jednocześnie zwiększając liniowo gradient acetonu od wyjściowego stosunku 10:90 (obj./obj.) do końcowego 100:0 (obj./obj.). Pobierano frakcje po 20 ml roztworu eluującego i analizowano metodą HPLC. Frakcje zawierające czysty paklitaksel odparowano do suchości i otrzymano około 22,42 g produktu zawierającego około 60,5% paklitakselu i około 1,3% cefalomanniny (analiza metodą 9

11 HPLC przedstawiona na Fig. 7). Czystość paklitakselu po krystalizacji z mieszaniny acetonu i heksanu (50:50, obj./obj.) wynosiła około 98,9% (analiza metodą HPLC przedstawiona na Fig. 8). Przykład 4 [0057] Około 68,3 g surowej mieszaniny paklitakselu zawierającej około 55,0% paklitakselu i około 19,0% cefalomanniny (początkowy stosunek paklitaksel/cefalomanniny wynosił około 2,89:1, zgodnie z analizą HPLC, jak przedstawiono na Fig. 9) rozpuszczono w 2 l acetonu i toluenu (10:90 obj./obj.). Następnie roztwór wprowadzono do kolumny wypełnionej 6830 g poliamidu (Polyamide Roth, wielkość cząstek około m). Następnie kolumnę eluowano w temperaturze 50 C 100 l acetonu i toluenu (10:90 obj./obj.), a następnie eluowano jeszcze 200 l acetonu i toluenu, jednocześnie zwiększając liniowo gradient acetonu od wyjściowego stosunku 10:90 (obj./obj.) do końcowego 100:0 (obj./obj.). Pobierano frakcje po 20 l i analizowano je metodą HPLC. Frakcje zawierające czysty paklitaksel odparowano do suchości i otrzymano około 28,61 g produktu zawierającego około 83,1% paklitakselu i około 1,0% cefalomanniny (analiza metodą HPLC przedstawiona na Fig. 10). Przykład 5 [0058] Około 0,33 g surowej mieszaniny paklitakselu zawierającej około 15,28% paklitakselu i około 3,35% cefalomanniny (jak przedstawiono na Fig. 11) rozpuszczono w 8 ml acetonu i heksanu 31:69 (obj./obj.). Następnie roztwór wprowadzono do kolumny wypełnionej około 45 g poliamidu (Polyamide Roth, wielkość cząstek około m). Następnie kolumnę eluowano 600 l mieszaniny acetonu i heksanu 20:80 (obj./obj.), po czym eluowano jeszcze 1200 ml acetonu i heksanu, jednocześnie zwiększając liniowo gradient acetonu od wyjściowego stosunku 20:80 (obj./obj.) do końcowego stosunku 100:0 (obj./obj.). Pobierano po 50 ml frakcji roztworu eluującego i analizowano metodą HPLC. Frakcje zawierające czysty paklitaksel odparowano do suchości i otrzymano około 0,07 g produktu zawierającego około 29,7% paklitakselu i około 3,5% cefalomanniny (analiza metodą HPC przedstawiona na Fig. 12). Przykład 6 [0059] Około 0,35 g koncentratu paklitakselu zawierającego około 65,78% paklitakselu i około 2,08% taksolu C (jak przedstawiono na Fig. 13) rozpuszczono w 20 ml acetonu i toluenu (15:85 obj./obj.). Następnie roztwór wprowadzono do kolumny wypełnionej około 35 g poliamidu (Polyamide Roth, wielkość cząstek 315 m). Następnie kolumnę eluowano 750 ml mieszaniny acetonu i toluenu 15:85 (obj./obj.). Kolumnę eluowano jeszcze 750 ml mieszaniny acetonu i toluenu, jednocześnie zwiększając liniowo gradient acetonu od wyjściowego stosunku 15:85 (obj./obj.) do końcowego stosunku 50:50 (obj./obj.). Pobierano po 50 ml frakcji roztworu eluującego i analizowano metodą HPLC. Frakcje zawierające czysty paklitaksel odparowano do suchości i otrzymano około 0,25 g produktu zawierającego około 68,63% paklitakselu i około 0,63% taksolu C (analiza metodą HPLLC przedstawiona na Fig. 14). [0060] W niniejszym opisie ujawniono jedynie korzystne wykonania wynalazku, ale również kilka przykładów potwierdzających jego uniwersalność. Należy rozumieć, że wynalazek można stosować w 10

12 różnych innych kombinacjach i warunkach, jak również wprowadzać zmiany i modyfikacji w zakresie przedstawionej tu idei wynalazczej. A zatem, przykładowo specjaliści w tej dziedzinie techniki, bez wykraczania poza rutynowe eksperymenty, uznają lub będą mogli stwierdzić wiele ekwiwalentów dla opisanych tu substancji i procedur. Takie ekwiwalenty wchodzą w zakres wynalazku i są objęte następującymi zastrzeżeniami. Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób oczyszczania paklitakselu, obejmujący etapy: a) wprowadzenia mieszaniny wejściowej zawierającej paklitaksel do zbiornika zawierającego związek oparty na poliamidzie; b) wprowadzenia do tego zbiornika roztworu eluującego zawierającego jeden lub więcej ketonów dialkilowych zmieszanych z mniej polarnym rozpuszczalnikiem; c) eluowania mieszaniny wyjściowej; oraz d) zebrania jednej lub więcej frakcji roztworu eluującego zawierających paklitaksel. 2. Sposób według zastrz. 1, w którym mieszaniną wyjściową jest surowy lub oczyszczony ekstrakt otrzymany przez ekstrakcję materiału z grupy obejmującej całą roślinę Taxus, jej świeżą lub wysuszoną korę, korzenie, liście lub gałęzie. 3. Sposób według zastrz. 1, w którym mieszaniną wyjściową jest surowy lub oczyszczony ekstrakt otrzymany przez ekstrakcję hodowli komórek uzyskanych z rośliny Taxus. 4. Sposób według zastrz. 1, w którym mieszaniną wyjściową jest surowy lub oczyszczony ekstrakt otrzymany przez ekstrakcję brzeczki fermentacyjnej wytworzonej w wyniku hodowli grzybów produkujących taksan. 5. Sposób według zastrz. 1, w którym mieszaniną wyjściową jest surowy lub oczyszczony ekstrakt otrzymany przez ekstrakcję brzeczki fermentacyjnej wytworzonej w wyniku hodowli konkretnych szczepów bakteryjnych modyfikowanych genetycznie w celu produkowania paklitakselu. 6. Sposób według zastrz. 1, w którym mieszaniną wyjściową jest mieszanina paklitakselu, cefalomanniny i innych taksanów. 7. Sposób według zastrz. 1, w którym jeden lub więcej ketonów dialkilowych jest wybranych z grupy obejmującej aceton, 2-butanon lub keton metylowo-izobutylowy. 8. Sposób według zastrz. 1, w którym mniej polarny rozpuszczalnik jest wybrany z grupy obejmującej alifatyczny (C 5 -C 8 ) węglowodór, aromatyczny (C 6 -C 8 ) węglowodór, eter (C 1 -C 4 ) dialkilowy lub ich mieszaniny. 9. Sposób według zastrz. 8, w którym alifatycznym (C 5 -C 8 ) węglowodorem jest heksan lub heptan. 11

13 10. Sposób według zastrz. 8, w którym aromatycznym (C 6 -C 8 ) węglowodorem jest toluen. 11. Sposób według zastrz. 8, w którym eter (C 1 -C 4 ) dialkilowy jest wybrany z grupy obejmującej eter dibutylowy, eter diizobutylowy i eter tert-butylowo-metylowy. 12. Sposób według zastrz. 1, w którym do kolumny wypełnionej przez więcej niż około 20 części wagowych związku opartego na poliamidzie wprowadza się około jedną część wagową mieszaniny wyjściowej. 13. Sposób według zastrz. 1, w którym poliamid jest wybrany z grupy obejmującej polikaprolaktam, poliundekanolaktam i polilaurylolaktam. 14. Sposób według zastrz. 1, w którym poliamidem jest poli(heksametylenoadypoamid-ko-kaprolaktam). 15. Sposób według zastrz. 1, w którym roztwór obejmuje jeden lub więcej ketonów dialkilowych w stosunku do mniej polarnego rozpuszczalnika wynoszącym około 5% (obj./obj.) do około 100% (obj./obj.). 16. Sposób według zastrz. 15, w którym roztwór zawiera aceton jako jeden lub więcej ketonów dialkilowych i toluen lub heksan jako mniej polarny rozpuszczalnik. 17. Sposób według zastrz. 1 albo 16, obejmujący ponadto zwiększanie stężenia ketonu dialkilowego do mniej polarnego rozpuszczalnik podczas wprowadzania roztworu do zbiornika. 12

14 13

15 14

16 15

17 16

18 17

19 18

20 19

21 20

22 21

23 22

24 23

25 24

26 25

27 26