Wykład VI. Regulacja ekspresji genów w terapii genowej

Transkrypt

1 Wykład VI Regulacja ekspresji genów w terapii genowej

2 Promotory Konstytutywne Indukowalne Wirusowe SV40 CMV eukariotyczne

3 Promotory Naturalne złożone (chimerowe) Wirusowe Eukariotyczne Konstytutywne, o szerokim zakresie działania indukowalne Promotor genu terapeutycznego Promotory tkankowo-specyficzne

4 Promotory Naturalne Złożone (chimerowe) Regulowane przez antybiotyki Regulowane przez hormony Regulowane przez doksycyklinę Regulowane przez rapamycynę progesteron ekdyzon

5 Clontech Regulacja ekspresji genów

6

7 Tet-off off/tet-on strategy in vitro (1)

8 Tet-off off/tet-on strategy in vitro (2)

9 Tet-off off/tet-on strategy in vitro (3)

10 Tet-off off/tet-on strategy in vitro (4)

11 Modyfikacje systemu ekspresji zależnej od doksycykliny -gen tta lub rtta znajduje się pod kontrolą promotora tkankowospecyficznego

12 Wykorzystanie systemu ekspresji regulowanej przez doksycyklinę w innych wektorach -Retrowirusowe -Adenowirusowe -AAV

13 Hypoxia inducible factor a crucial mediator of hypoxia-induced induced gene expression Erythropoiesis & iron metabolism Erythropoietin Transferrin Transferrin receptor Ceruloplasmin Heme oxygenase-1 O 2 HIF Angiogenesis VEGF VEGFR-1 Vasomotor control NOS II Cell proliferation & viability IGF-1 IGFBP-1&3 TGFβ3 NOS II Energy metabolism GLUT1,2 & 3 PEPCK LDH A PGK3 Aldolase A & C PFK L & C Pyruvate kinase Enolase

14 Hypoxia-dependent promoters

15 Hamowanie ekspresji genów za pomocą kwasów nukleinowych

16 Terapia genowa Wzmacniająca Substytucyjna Hamująca wzmocnienie wprowadzenie hamowanie ekspresji ekspresji genów brakującego genu genów 1. Nowotwory 2. Miażdżyca

17 Strategies aimed at block of gene expression Block of transcription -sense strategy binding of regulatory proteins, e.g. transcription factors, by oligonucleotides decoy strategy) - antigene strategy triple helix formation between oligonucleotides and double-stranded DNA Block of translation - ribozymes specifically targeted degradation of mrna - antisense strategy binding of oligonucleotides to mrna - RNA interference Functional inactivation of proteins -interfering peptides or protein

18 Oligonukleotydy antysensowe Krótkie fragmenty syntetycznych, chemicznie zmodyfikowanych kwasów nukleinowych, zaprojektowanych tak, by hybrydyzowały z komplementarnymi sekwencjami mrna i blokowały syntezę białek kodowanych przez takie docelowe transkrypty

19 Antisense oligonucleotides nucleotides long - hybridize to corresponding RNA - act by: a) modulation of splicing b) inhibition of protein translation by disruption of protein assembly c) utilise RNAse H enzymes

20

21 Losy oligonukletydów in vivo 1.Degradacja przez nukleazy surowicy 2. Pobieranie przez komórki wątroby (pobieranie niespecyficzne) 3. Pobieranie przez komórki nerki i wydzielanie z moczem

22 Antisense strategy - problems 1. Stability vs binding affinity 2. Delivery to target cells 3. Non-antisense effect a) immune stimulation - CpG motifs - phosphporotiate backbone 4. Well tolerated, side effects are dose dependent 5. Side effects: thrombocytopenia hypotension fever asthenia increase liver enzymes complement activation

23 Clinical application of antisense oligonucleotides Vitravene - CMV-induced retinitis Bcl2 antisense - melanoma

24 Clinical trials with antisense oligonucleotides

25 Ribozymes Small RNA molecules which allow sequence-specific endoribonucleolytic cleavage in a catalytic manner Processing of rrna in Tetrahymena Self-cleaving RNAs from: - bacteriophages - plant satellite virusoids - satellite tobacco ringspot virus - human delta hepatitis virus RNA components of a polysaccharide branching enzyme and RNAse P Discovered in the begining of 80 s by Thomas Cech and Sydney Altman

26 Rybozymy typu hammerhead hammerhead -występują w genomach wiroidów i wirusoidów, małych, jednoniciowych RNA patogenów roślin -zbudowane są z trzech helis połączonych pętlami - w zmodyfikowanych rybozymach występuje tylko jedna pętla - konieczna jest obecność sekwencji UH

27 Rybozymy typu hammerhead hammerhead H- A, C lub U

28 Delivery of ribozymes to target cells - exogenous - ribozymes must be chemically modified - endogenous - coding sequences for ribozymes are delivered with viral vectors Degradation of ribozymes in the serum Prevention by modification removal of 2 hydroxyl group, which is required for the RNAses to cleave

29 Ribozymes - application 1. Inhibition of gene expression HIV HBV HCV CML - chronic myelogenous leukemia tumors - ANGIOZYME 2. Correction of mutations

30 Ribozyme Pharmaceuticals Inc. Sirna Therapeutics, Inc. (NASDAQ: RNAI), formerly Ribozyme Pharmaceuticals, Inc.

31 Interferencja RNA RNA interference PSTG post-transciptional gene silencing Specific inhibition of gene expression by double-stranded RNA, which stimulates the degradation of a target mrna

32 RNA interference specialized type of RNA degradation evolutionary ancient defence mechanism Functions: plants protection from viruses -Other organisms protection from transposons replicating via RNA intermediates

33 Several ways to obtain sirna 1. Chemical synthesis of RNA 2. Synthesis of DNA oligos, annealing, adding T7 polymerase promoter, transcription in vitro 3. Additing T7 polymerase promoter, transcription in vivo 4. Cloning of sequence coding antisense RNA into plasmid, transfection and expression in cells 5. Cloning into adenoviral/aav/retroviral vectors

34 Designing the RNAi oligos

35 Silencer sirna construction kit (Ambion)

36

37 Application of RNAi in gene therapy Inhibition of the expression of: a) oncogenes b) viral genes c) apoptotic genes d) Other genes eg anti-angiogenic therapy in cancer

38 Different ways of inhibition of gene expression

39 DNA decoys Pułapki oligonukleotydowe

40 DNA decoys

41 DNA decoys