Mgr Dorota Przybylska

Wielkość: px

Rozpocząć pokaz od strony:

Download "Mgr Dorota Przybylska"

Ludwika Baran
7 lat temu
Przeglądów:

1 Mgr Dorota Przybylska Dziedzina: nauki biologiczne Dyscyplina: biochemia Wszczęcie: Temat: Rola oksydazy NADPH 4 oraz szlaku odpowiedzi na uszkodzenia DNA w starzeniu ludzkich komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych Promotor: prof. dr hab. Ewa Sikora Promotor pomocniczy: dr Grażyna Mosieniak Recenzenci: prof. dr hab. Grzegorz Bartosz, prof. dr hab. Janusz Błasiak

2 Rola oksydazy NADPH 4 oraz szlaku odpowiedzi na uszkodzenia DNA w starzeniu ludzkich komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych Dorota Przybylska Promotor: prof. dr hab. Ewa Sikora Promotor pomocniczy: dr Grażyna Mosieniak Streszczenie Starzenie komórkowe to proces prowadzący do nieodwracalnego zatrzymania podziałów. Wyróżnia się starzenie replikacyjne, związane ze skracaniem telomerów, oraz przyspieszone, zachodzące pod wpływem stresu oksydacyjnego lub czynników, które mogą uszkadzać DNA. Źródłem reaktywnych form tlenu (RFT) w komórkach są mitochondria oraz wyspecjalizowane enzymy, takie jak na przykład oksydazy NADPH, których główną funkcją jest produkcja RFT. Wiele badań wskazuje również, że starzeniu komórkowemu niektórych typów komórek towarzyszy poliploidyzacja. Wykazano, że w czasie starzenia organizmu dochodzi do akumulacji komórek starych oraz postuluje się, że komórki te mogą brać udział w patogenezie wielu chorób związanych z wiekiem. Jedną z nich jest miażdżyca, w przebiegu której dowiedziono udziału starych komórek śródbłonka oraz komórek mięśni gładkich (VSMC). Wiadomo, że w czasie starzenia VSMC dochodzi do nagromadzenia oksydacyjnych uszkodzeń DNA. Badania prowadzone na zwierzętach wykazały, że ich źródłem może być jedna z izoform oksydaz NADPH NOX4, a jej nadekspresję powiązano również z poliploidyzacją tych komórek. Jednakże rola, jaką pełni NOX4 oraz szlak odpowiedzi na uszkodzenia DNA w starzeniu ludzkich VSMC nie jest jednoznaczna. Celem niniejszej pracy było więc zbadanie roli tego szlaku, ze szczególnym uwzględnieniem kinazy ATM w starzeniu komórek mięśni gładkich oraz określenie roli NOX4 w tym procesie, jak również zweryfikowanie wyników, które uzyskano w badaniach in vitro, na komórkach mięśni gładkich izolowanych z blaszek miażdżycowych, które uległy starzeniu w organizmie. Przeprowadzone doświadczenia pozwoliły na opracowanie i opisanie modelu starzenia replikacyjnego ludzkich VSMC oraz przyspieszonego ludzkich i szczurzych VSMC. Stwierdzono, że znaczniki starzenia tych komórek były takie same w obydwu modelach. Zaobserwowana różnica dotyczyła zatrzymania w cyklu komórkowym. Komórki ludzkie akumulowały się w fazie G1, jednakże 40% komórek traktowanych związkiem uszkadzającym DNA (doksorubicyną; dox) posiadało 4C DNA, czemu towarzyszyła

3 ekspresja białek charakterystycznych dla fazy G1. Natomiast wśród komórek szczurzych traktowanych tym związkiem pojawiały się komórki posiadające więcej niż 4C DNA. W przypadku starzenia przyspieszonego ludzkich komórek, obserwowano aktywację szlaku odpowiedzi na uszkodzenia DNA. Aby zbadać rolę tego szlaku w indukcji starzenia, wyciszono ekspresję ATM, będącej głównym przekaźnikiem tej kaskady sygnałowej. Zahamowano również jej aktywność za pomocą specyficznego inhibitora, a następnie traktowano komórki związkiem uszkadzającym DNA. Pomimo znacząco obniżonego poziomu ATM, nadal obserwowano niezmienioną liczbę komórek starych. Co ciekawe, obniżeniu uległ jedynie poziom wydzielania cytokin prozapalnych oraz aktywacja białekefektorów szlaku odpowiedzi na uszkodzenia DNA. Wykazano, że oprócz fosforylacji ATM, w procesie starzenia indukowanego dox aktywacji ulegała również kinaza DNA-PKcs, która mogła być odpowiedzialna za indukcję starzenia w komórkach pozbawionych ATM. Ponadto wykazano, że pomimo wzrostu poziomu RFT, w czasie starzenia replikacyjnego oraz przyspieszonego ludzkich komórek mięśni gładkich dochodziło do obniżenia poziomu NOX4, natomiast w komórkach szczurzych poziom Nox4 rósł. Co więcej, zahamowanie aktywności oksydaz NADPH lub wyciszenie ekspresji NOX4 skutkowało indukcją starzenia ludzkich komórek mięśni gładkich. Nie było ono jednak zależne od aktywacji szlaku odpowiedzi na uszkodzenia DNA. Obserwowano natomiast ekspresję HIF1α, spadek cykliny D1, wzrost poziomu p27 KIP1 oraz akumulację hipofosforylowanego białka Rb, co może świadczyć o odpowiedzi komórki na hipoksję, wystąpieniu stresu i trwałego zahamowania proliferacji. Otrzymane wyniki wskazują, że NOX4 odgrywa ważną rolę w proliferacji ludzkich komórek mięśni gładkich aorty, a spadek jej ekspresji prowadzi do zahamowania istotnych dla funkcjonowania komórki ścieżek przesyłania sygnału regulowanych przez RFT, produkowanych specyficznie przez tę oksydazę. Prowadzi to do nieodwracalnej utraty potencjału proliferacyjnego i starzenia komórkowego. Badania na komórkach izolowanych z blaszek miażdżycowych pacjentów nie dały jednoznacznych wyników co do roli NOX4 w starzeniu tych komórek in vivo poziom jej ekspresji był zróżnicowany. Wykazano jednak, że komórki pobrane z blaszek miażdżycowych miały cechy komórek starych. Podsumowując, po raz pierwszy wykazano, że nie tylko kinaza ATM, lecz również DNA-PK odgrywają zasadniczą rolę w szlaku odpowiedzi na uszkodzenia DNA. Po raz pierwszy pokazano również, że obniżenie RFT, których źródłem jest NOX4, może być odpowiedzialne za starzenie komórkowe.

4 Summary Cellular senescence is a process leading to irreversible cell cycle arrest. There are two types of senescence replicative, which is telomere shortening dependent and premature senescence which can be induced with DNA damaging agents and oxidative stress. The major source of reactive oxygen species (ROS) are mitochondria but there are also specialized enzymes such as NADPH oxidases (NOX) the only function of which is the production of ROS. Many studies have also shown a link between polyploidy and cellular senescence. It is known that during aging senescent cells accumulate in the organism and participate in the pathogenesis of age-related disorders. One of such diseases is atherosclerosis in the course of which senescent vascular smooth muscle cells (VSMCs) and endothelial cells can be observed. It was shown that senescent VSMCs possess oxidative DNA damage. Studies using animals have shown that such DNA damage could be induced by ROS produced by one of the NOX isoforms NOX4. What is more, researchers have linked overexpression of NOX4 with polyploidization of cells. However, the role of NOX4 and the DNA damage response pathway in the process of senescence of VSMC derived from human aorta remains unclear. Thus, the aim of this study was to specify the role of this pathway and ATM kinase in senescence of this type of the cells and explain the role of NOX4 in this process. Another goal was to verify the results obtained during in vitro experiments, using VSMCs derived from human atherosclerotic plaques which underwent cellular senescence in vivo. Our experiments led to the development of a model of replicative and stress-induced premature senescence of VSMCs derived from human and rat aortas. The expression of the majority of markers of senescence was similar in both models but the difference concerned the cell cycle arrest. Human cells which underwent replicative and H 2 O 2 -induced senescence accumulated in the G1 phase of the cell cycle. After treatment with a DNA damaging agent (doxorubicin; dox) the cells expressed proteins characteristic for the G1 phase, however 40% of them had 4C DNA. In contrary, some of VSMCs which were obtained from rats and treated with dox had more than 4C DNA. Stress-induced premature senescence was related to the activation of the DNA damage response pathway (DDR). To investigate its role in the induction of senescence of human VSMCs, we either downregulated the expression or inhibited the activity of ATM and treated the cells with a DNA damaging agent. This kinase is considered to be the main protein in this type of signal transduction. Surprisingly, neither inhibition of ATM nor its downregulation affected the number of senescent cells. It diminished

5 the secretion of cytokines and slightly decreased the activation of effectors of the DDR pathway. It was also shown that DNA-PKcs is activated in response to dox treatment so it could play a role in the induction of senescence in the cells with decreased ATM level. It was shown that during replicative as well as stress-induced premature senescence of human VSMCs the level of NOX4 decreased but in rat VSMCs the effect was opposite. What is more, inhibition or silencing of NOX4 in human cells resulted in the induction of senescence. This process was independent from the activation of the DDR. However, the expression of HIF1α, downregulation of cyclin D1, upregulation of p27 KIP1 and activation of Rb were observed. It suggests that these cells responded to hypoxia, underwent stress and stopped proliferating. The obtained results suggest that NOX4 plays a crucial role in the proliferation of human vascular smooth muscle cells. Downregulation of its expression probably leads to the inhibition of signalling pathways which are important for cell functioning. It leads to irreversible loss of the proliferative potential, namely cellular senescence. Unfortunately, studies using VSMCs isolated from human atherosclerotic plaques did not give unequivocal results concerning the role of NOX4 in the senescence of these cells its expression was diverse. However, it was shown that these cells possessed the markers of senescence. To sum up, it was shown for the first time that not only ATM but also DNA-PK plays an important role in the DNA damage response pathway. It was also presented for the first time that downregulation of NOX4-derived ROS could be responsible for the induction of cellular senescence.

Podobne dokumenty

Prof. dr hab. Grzegorz Bartosz Katedra Biofizyki Molekularnej Uniwersytetu Łódzkiego

Prof. dr hab. Grzegorz Bartosz Katedra Biofizyki Molekularnej Uniwersytetu Łódzkiego Recenzja rozprawy doktorskiej mgr Doroty Przybylskiej pt. Rola oksydazy NADPH4 oraz szlaku odpowiedzi na uszkodzenia