słowa kluczowe: BCL-2, oligonukleotydy antysensowe (ASO), apoptoza, proliferacja komórek, lipofekcja.

Transkrypt

1 Wyciszanie ekspresji genu BCL-2 oligonukleotydami antysensowymi w komórkach nowotworowych linii Hela, a zmiany w proliferacji komórek i aktywacja apoptozy BCL-2 gene expression silencing with antisense oligonucleotides in HeLa cancer cell line, and changes in cells proliferation and activation of apoptosis Elektrogastrografia jako narzêdzie do bezinwazyjnej oceny wp³ywu Nr leków 2/ Ilona Bednarek*, Daniel Sypniewski, Sabina Ga³ka, Tomasz Loch, Grzegorz Machnik, Zak³ad Biotechnologii i In ynierii Genetycznej; Wydzia³ z Oddzia³em Medycyny Laboratoryjnej Œl¹skiego Uniwersytetu Medycznego ul. Narcyzów 1; Sosnowiec Streszczenie Celem pracy jest ocena wpływu oligonukleotydów antysensowych (ASO) komplementarnych do różnych odcinków transkryptu genu BCL-2 na poziom jego ekspresji, oraz na stopień proliferacji i indukcję apoptozy komórek nowotworowych HeLa. ASO do komórek HeLa wprowadzano stosując metodę lipofekcji. Jako kontrolny oligonukleotyd zastosowano sekwencję nukleotydową niewykazującą homologii do żadnego odcinka genomu człowieka. Wpływ transfekcji z ASO na poziom ekspresji genu BCL-2 wyznaczano metodą ilościowej reakcji amplifikacji RealTime QRT-PCR. Proliferację komórek wyznaczano testem MTT, (Sigma-Aldrich) zaś indukcję apoptozy oceniano na podstawie morfologii komórek uprzednio wyznakowanych fluoroforem Hoechst i techniką elektroforetycznego rozdziału genomowego DNA in situ w transferowanych komórkach testem kometowym. Wybrane antysensowe sekwencje oligonukleotydowe komplementarne do mrna BCL-2 w obrębie regionów niekodujących: 5 NC i 3 NC, w obrębie kodonu START i STOP, oraz w obrębie pierwszego egzonu, wywierają wpływ na komórki Hela, powodując w nich spadek poziomu ekspresji genu BCL-2, zahamowanie proliferacji i indukcje apoptozy. Obserwowane efekty były najsilniejsze dla ASO komplementarnych względem egzonu pierwszego mrna BCL-2. Abstract The aim of the study is an evaluation of the influence of antisense oligonucleotides (ASOs) complementary to the particular parts of BCL-2 gene transcript on the BCL-2 gene expression and on the level of proliferation and apoptosis induction in HeLa cancer cell line. ASOs were introduced into the cells using lipofection method. As a control ASO we used oligonucleotide performing no complementarity to any part of the human genome sequence. Influence of transfection with ASOs on the BCL-2 expression was analyzed by quantitative RealTime QRT-PCR method. Cell proliferation was measured by MTT assay (Sigma-Aldrich) and induction of the cell apoptosis was estimated by pre-stained with Hoechst cell morphology and by in situ electrophoresis of genomic DNA comet assay. The selected sequences of ASOs complementary to the non-coding regions 5 NC and 3 NC, and complementary to the START and STOP codons, and to the first exon of mrna BCL-2 showed an influence on the loss of the level of BCL-2 gene expression and on the transfected cells proliferation, as well, as on the apoptosis induction. Those observed effects were the strongest for ASO complementary to the first exon of BCL-2 mrna. słowa kluczowe: BCL-2, oligonukleotydy antysensowe (ASO), apoptoza, proliferacja komórek, lipofekcja. key words: BCL-2, antisense oligonucleotides, (ASOs), apoptosis, cell proliferation, lipofection. 38

2 Nr 2/2008 WSTÊP Protoonkogen BCL-2 zaliczany jest do białek o podstawowej funkcji, jaką jest aktywność anty-apoptotyczna. Białko BCL-2 jest zlokalizowane w błonach: jądrowej, mitochondrialnej oraz retikulum endoplazmatycznego. Hamowanie apoptozy przez białko BCL- 2 wynika z blokowania uwalniania przez miotochondrium cytochromu C, a przez to hamowania aktywacji kaspaz przez niezwiązane z cytochromem C białko Apaf-1 (ang.: apoptosis activating factor-1). [1] Problematycznym staje się fakt nieprzewidzianej i niepotrzebnej nadekspresji genu BCL-2. Istnieje szereg doniesień naukowych, które wskazują na wyraźną, tak zwaną ekotopową, nadekspresję genu BCL-2 pojawiającą się tylko w obrębie komórek zmienionych nowotworowo. Nadekspresja ta może być pierwotna lub też może być indukowana przez chemio- lub radioterapię stosowaną w trakcie leczenia pacjentów. Protoonkogen BCL-2 ulega nadekspresji w przypadku złośliwych nowotworów hematologicznych oraz nowotworów piersi, płuc, prostaty, jajników, nerek, w przypadku czerniaka i szeregu innych jednostek chorobowych. [2]. Wynalezienie strategii wyciszania ekspresji wybranych genów w komórkach przynosi wiele możliwości, między innymi pozwala regulować przebieg cykli metabolicznych w komórkach, jak również umożliwia modulowanie przebiegu cyklu komórkowego, czy wreszcie pozwala manipulować procesem programowanej śmierci komórek - apoptozą. Zahamowanie ekspresji anty-apoptotycznego genu BCL-2 powinno w efekcie doprowadzić do zmian w równowadze: proliferacja komórkowa śmierć komórki, na korzyść tej ostatniej. W wypadku nadekspresji genu BCL-2 w komórkach nowotworowych odpowiednie zablokowanie aktywności tego genu winno skutkować wzrostem umieralności niechcianych w organizmie komórek nowotworowych, a w efekcie poprawić skuteczność terapii przeciwnowotworowej. Jednym z narzędzi molekularnych umożliwiających regulację ekspresji genów ich wyciszanie, są oligonukleotydy antysensowe. Są one niemodyfikowanymi, bądź chemicznie modyfikowanymi, krótkimi fragmentami zbudowanymi z około nukleotydów. Mogą to być zarówno rybo-, jak i deoksyrybonukleotydy, a ich sekwencja jest komplementarna do mrna lub też do sekwencji DNA genu. Oligonukleotydy antysensowe hybrydyzując z mrna tworzą przestrzenną przeszkodę, uniemożliwiając przyłączenie się mrna do rybosomów, blokując tym samym syntezę białka na matrycy danego mrna. Hamowanie ekspresji genu za pomocą antysensu, swoiście utworzonej hybrydy składającej się z mrna i antysensowego oligonu- WYCISZANIE EKSPRESJI GENU BCL-2 kleotydu, aktywuje enzym RNazę H, która z kolei prowadzi aktywną degradację mrna w tak stworzonym dupleksie. Właśnie ten efekt zasługuje na podkreślenie. O ile samo przyłączenie oligonukleotydu antysensowego do mrna i związane z tym blokowanie dostępu do mrna cząsteczkom rybosomów jest czasowo zmienne (oligonukleotydy mają tendencje do dysocjacji od komplementarnej nici), o tyle aktywacja Razy H czyni proces wyciszania matrycy do translacji mrna procesem nieodwracalnym (degradacja matrycy). Oligonukleotydy antysensowe mogą także wiązać się z sekwencjami DNA, tworząc wówczas charakterystyczne struktury tripleksów. Gdy struktura taka powstanie na przykład w obrębie promotora genu uniemożliwia wówczas wiązanie się czynników transkrypcyjnych i samej polimerazy RNA do promotora i tym samym hamuje transkrypcję odpowiedniego genu. [1, 3]. Sama struktura tripleksu utworzonego w obrębie dowolnego regionu genu jest natomiast martwym odcinkiem w odniesieniu do procesu transkrypcji, gdyż nie ma pełnej możliwości denaturacji matrycowego DNA do struktur jednoniciowych niezbędnych w procesie transkrypcji. Aby oligonukleotydy antysensowe mogły modulować ekspresję genu, muszą dostać się do wnętrza komórki. Mechanizm penetracji tych związków do komórek nie jest w pełni jasny. Wiadomo, że zależy on od temperatury, struktury i stężenia oligonukleotydów oraz od rodzaju badanych komórek. [3] Obecnie uważa się, że endocytoza i pinocytoza są głównymi mechanizmami dokomórkowej internalizacji oligonukleotydów. Przy niskich stężeniach oligonukleotydu internalizacja zachodzi przez interakcję z błonowym receptorem, natomiast odpowiednio przy stężeniach wysokich receptory te są rozpuszczone i przeważa proces pinocytozy. [3] Obok szeroko omówionych w literaturze problemów związanych z odpowiednim przygotowaniem oligonuklotydów antysensowych w celu uzyskania maksymalnego efektu terapeutycznego poprzez zastosowanie odpowiedniego doboru modyfikacji chemicznych samych oligonukleotydów, niesłychanie ważnym problemem jest odpowiedni dobór odcinka genu / mrna, względem którego komplementarnie mają być syntetyzowane oligonukleotydy antysensowe. Prace naukowe omawiające wpływ oligonkleotydów antysensowych na poziom wyciszenia ekspresji genów przedstawiają wyniki, w których najwyższy efekt wyciszenia obserwowany był w przypadku wiązania się oligonukleotydów do miejsca inicjacji translacji, bądź też w obrębie wiązania oligonukleotydów do regionów niekodujących, czyli 5 NC (szczególnie w pobliżu 39

3 WYCISZANIE EKSPRESJI GENU BCL-2 metyloguanozyny tworzącej tak zwana czapeczkę na końcu 5 ; 5 cap) oraz 3 UTR. W przypadkach wyciszania genów c-myc i c-ha-ras, region 5 NC okazał się być szczególnie podatnym na regulację poprzez hybrydyzacje z oligonukleotydami antysensowymi, zaś dla genu c-raf regionem takim był region 3 UTR. [4]. Wagner R.W. (1995) [4] proponuje przetestowanie aż 50 różnych sekwencji oligonukleotydów dla danego genu w celu doboru najbardziej optymalnego układu wyciszającego ekspresję. Sugeruje się także, aby tak dobierać sekwencje docelowe dla oligonukleotydów antysensowych, aby znajdowały się one poza obszarem tworzenia struktur pseudodwuniciowych w cząsteczkach RNA. [4] W przedstawionej pracy podjęto się oceny wpływu czterech różnych sekwencji oligonukleotydowych na ekspresję genu BCL-2 w linii nowotworowej komórek HeLa. Nr 2/2008 MATERIA Y I METODY Materiałem do badań były komórki epitelialne ludzkiej linii nowotworowej HeLa (ATCC: CCL-2), wywodzącej się z nowotworu gruczolakoraka szyjki macicy. Komórki tej linii traktowane były układem oligonukleotydów antysensowych (ASO), komplementarnych do wybranych rejonów genu BCL-2. W badaniach zastosowano oligonukleotydy odpowiednio komplementarne względem wyciszanego genu w obrębie: regionu 5 NC (oligonukleotyd bcl-nc); kodonu START (oligonukleotyd bcl-atg); kodonu STOP (oligonukleotyd bcl-taa); oraz w obrębie sekwencji kodującej pierwszego egzonu (oligonukleotyd bcl-egz I): aminokwas kodowanego białka BCL-2. Do badań włączono także sekwencję oligonukleotydową kontrolną, (ASO kontrolny), niewykazującą komplementarności względem żadnej znanej sekwencji genomu człowieka. Sekwencje nukleotydowe stosowanych ASO przedstawiono w tabeli nr I. Wszystkie ze stosowanych ASO były fosfotiopochodnymi oligonukleotydów syntetyzowanymi w Instytucie Biochemii i Biofizyki PAN w Warszawie. Hodowle komórkowe prowadzone były w standardowych warunkach (37 C, 5% wysycenie atmosfery CO 2 ), w medium hodowlanym RPMI-1640 (PAA) z dodatkiem 10% bydlęcej surowicy płodowej (FBS) (PAA) oraz gentamycyny (Sigma-Aldrich). Kolejne pasaże prowadzono stosując odtrawianie konfluentnych hodowli roztworem trypsyny i EDTA (PAA) i ponowny posiew na nowe naczynia hodowlane w stosunku 1:4. W dniu poprzedzającym transfer ASO komórki wysiano na płytki hodowlane 96-dołkowe w ilości 5x10 3 komórek na dołek. Transfer ASO do komórek przeprowadzono metodą lipofekcji z wykorzystaniem komercjalnego układu liposomów: Lipofectamine Reagent (Invitrogen) postępując zgodnie z protokołem producenta. Do lipotransferu zastosowano ASO w stężeniach: 400, 200, 100 i 50nM. Uwzględniono odpowiednie próby kontrolne, w tym: czyste hodowle komórkowe nie traktowane żadnym z czynników (ASO, liposomy), hodowle traktowane samym odczynnikiem Lipofectamine Reagent (ocena cytotoksyczności liposomów), oraz hodowle traktowane oligonukleotydem kontrolnym zarówno metodą wspomaganą liposomami (ocena niespecyficznej toksyczności ASO), jak i bezpośrednio bez użycia lipidów (ocena ogólnej toksyczności niespecyficznej DNA). Eksperyment dla każdego z zastosowanych wariantów prowadzono w triplikatach. Przeprowadzono trzy niezależne serie eksperymentów, których wyniki poddano szczegółowej analizie. Dla transfekowanych komórek wyznaczono: zmiany w proliferacji, wykorzystując w tym celu test MTT (Sigma-Aldrich), fluorescencyjną mikroskopową ocenę morfologii komórek po uprzednim ich wybarwieniu barwnikiem Hoechst 33258, ilościową ocenę poziomu transkryptu genu BCL-2 techniką RealTime RT-QPCR z aplikacją metody DDC T do obliczeń ilości mrna badanego genu, a także poszukiwano obrazu indukcji apoptozy na poziomie degradacji genomowego DNA pojedynczych komórek po- TABELA I. Sekwencje badanych oligonukleotydów antygenowych (ASO) stosowanych w badaniach na linii komórkowej HeLa. Stosowany oligonukleotyd antysensowy (ASO) Sekwencja nukleotydowa ASO 40 bcl-nc bcl-atg bcl-taa bcl-egz I ASO kontrolny 5 -TCCCAGAGGAAAAGCAACGG-3 5 -CGCCATCCTTCCCAGAGGAA-3 5 -GGCAGGCATGT GACTTCAC-3 5 -AATCCTCCCCCAGTTCACCC-3 5 -TCC CGC GCA CTT GAT GCA TT-3

4 Nr 2/2008 sługując się zmodyfikowaną w Zakładzie Biotechnologii i Inżynierii Genetycznej SUM metodą elektroforezy in situ pojedynczych komórek, czyli tzw. testem kometowym (comet assay). [ 5] Analizę statystyczną wyników przeprowadzono wykorzystując pakiet obliczeniowy STATISTICA v Rys. 1. Obraz mikroskopii fluorescencyjnej komórek HeLa poddanych działaniu ASO bcl-egz I wybarwionych fluoroforem Hoechst Strzałką zaznaczoną komórki apoptotyczne o wyraźnej fragmentacji genomowego DNA. WYCISZANIE EKSPRESJI GENU BCL-2 WYNIKI BADAÑ I ICH OMÓWIENIE Linię komórek nowotworowych reprezentujących gruczolakoraka macicy, (linia HeLa), podano działaniu modulatora ekspresji genów w postaci oligonukleotydów antysensowych. W przedstawionej pracy oceniono wpływ na proliferację i indukcję apoptozy czterech różnych sekwencji oligonukleotydowych potencjalnie blokujących ekspresję genu BCL-2 w badanej linii komórkowej. Najszersze spektrum hamowania proliferacji badanych komórek nowotworowych linii HeLa zaobserwowano w przypadku zastosowania oligonukleotydów antysensowych bcl-egz I, komplementarnych do sekwencji kodującej pierwszego egzonu (od 915 nt do 934 nt w RNA i od 141 do 147 aa w kodowanym białku). Wymieniony oligonukleotyd zmniejszał proliferację komórek linii HeLa w sposób istotny statystycznie w porównaniu do proliferacji komórek kontrolnych HeLa niepoddanych działaniu antysensów. Efekt ten obserwowano dla zastosowanych stężeń badanego oligonukleotydu: 400 nm, 200nM oraz 100nM. Spadek proliferacji komórek nowotworowych traktowanych oligonukleotydem bcl-egz I był obserwowany również dla najniższego ze stosowanych stężeń oligonukleotydów: 50nM, jednak różnice w zmianie proliferacji komórek względem komórek kontrolnych nie miały wartości wskazujących na różnice statystycznie istotne. W przypadku pozostałych stosowanych ASO statystycznie istotne różnice w zmianach proliferacji komórek nowotworowych badanych i kontrolnych (nie traktowanych oligonukleotydami antysensowymi) zaobserwowano dla oligoukleotydu bcl-taa, komplementarnego w obrębie kodonu STOP oraz dla oligonukleotydu bcl-nc (region 5 NC), nie mniej jednak w obu przypadkach stwierdzono niższą siłę oddziaływania oligonukleotydów oraz mniejszy zakres działania w odniesieniu do dawki (stężenia) ASO. O ile dla oligonkleotydu antysensowego bcl-egz I wartości istotne statystycznie dotyczyły stężeń: 400, 200 i 100nM, przy odpowiednim p równym: 0,000305; 0, i 0,000443, o tyle dla oligonukleotydu bcl-taa wartości te dotyczyły już tylko stężeń: 200 i 100 nm (przy niższym p = 0, i 0, ), a dla oligonukleotydu bcl-nc dotyczyły jedynie stężenia 100 nm ( p =0,033722). Siłę oddziaływania oligonukleotydu antysensowego bcl-egz I na poziom proliferacji komórek nowotworowych odzwierciedliły również dane statystyczne przedstawiające różnice w hamowaniu proliferacji pod wpływem różnych stężeń tego samego oligonukleotydu. W omawianym przypadku istotne statystycznie różnice znaleziono dla porównywanych par stężeń: 400 a 200 nm; 400 a 100 nm; 200 a 100 nm oraz 100 a 50 nm oligonukleotydu bcl-egz I. Był to najliczniejszy przypadek stwierdzonej zależności pomiędzy zastosowaną dawką ASO, a zahamowaniem proliferacji komórek pod wpływem danej sekwencji oligonukleotydu antysensowego. W przypadku oligonukleotydu komplementarnego do regionu w obrębie kodonu START stwierdzono zahamowanie proliferacji komórek nowotworowych, jednak żadna z uzyskanych wartości nie była istotna statystycznie. W odniesieniu do różnic wpływu dawek ASO na proliferację komórek HeLa dla tego oligonkleotydu (bcl-atg) istotną statystycznie różnicę znaleziono jedynie pomiędzy stopniem hamowania proliferacji komórek nowotworowych traktowanych wymienionym oligonukleotydem w stężeniach: 200 i 100 nm. W wyniku przeprowadzonych badań stwierdzono brak istotnych statystycznie różnic pomiędzy proliferacją komórek nie transfekowanych (kontrolnych) a proliferacją komórek transfekowanych pustymi liposomami. Analogicznie nie stwierdzono istotnych statystycznie różnic pomiędzy proliferacją komórek kontrolnych, a proliferacją komórek traktowanych zarówno kontrolnym oligonukleotydem zamkniętym w liposomach, jak i oligonukleotydem nagim, bezpośrednio dodawanym do medium hodowlanego. Również nie stwierdzono istotnych statystycznie różnic pomiędzy proliferacją komórek traktowanych poszczególnymi oligonukleotydami badanymi, a proliferacją komórek z oligonukleotydem kontrolnym podawa- 41

5 WYCISZANIE EKSPRESJI GENU BCL-2 Nr 2/2008 nych w obu postaciach: bez i z nośnikiem liposomowym. Uzyskane wyniki mogą świadczyć o tym, iż zarówno sam oligonukleotyd kontrolny, podany w formie wolnej i w formie zamkniętej w liposomach, jak i sam nośnik liposomowy wpływają na proliferację komórek, nie mniej jednak wpływ ten nie jest istotny z punktu widzenia statystycznego i nie powinien mieć wpływu na efekt końcowy swoistego działania oligonukleotydów na badane komórki. Istotne znaczenie może mieć jednak stężenie zastosowanego oligonukleotydu. Potwierdzają to wyniki statystyczne dla prób komórek traktowanych oligonukleotydami kontrolnymi. W przypadku oligonukleotydów kontrolnych zawartych w liposomach istotne statystycznie różnice występują pomiędzy wszystkimi zastosowanymi stężeniami. W przypadku nagich ODN zależność ta dotyczy najwyższego z zastosowanych stężeń, tj. 400nM. Wyniki te mogą świadczyć o rosnącej wraz ze stężeniem niespecyficznej toksyczności oligonukleotydów dla badanych komórek. Efekt ten należy uwzględnić przy całościowej interpretacji wyników, zwłaszcza tych uzyskiwanych dla badanych oligonukleotydów anty BCL-2 stosowanych w stężeniu najwyższym 400nM. Warto w tym miejscu wspomnieć, iż w szczególności dla fosforotiopochodnych oligonukleotydów, a takie zastosowano w przedstawionej pracy, ważne jest określenie niespecyficznego hamownia proliferacji komórek. Fosfotiopochodne ASO są stabilniejsze w komórkach, lecz mogą przy wyższych stężeniach wykazywać podwyższoną toksyczność względem komórek z powodu zwiększonego wiązania się do białek komórkowych i ich następczej inaktywacji. W wyniku przeprowadzonych eksperymentów stwierdzoną najwydajniejszą aktywność względem hamowania proliferacji komórek nowotworowych oligonukleotydu antysensowego wiążącego się z mrna genu BCL-2 w obrębie pierwszego egzonu: ASO bclegz I. Dla tego ASO znaleziono również największy indeks apoptotyczny wyliczany jako procent komórek apoptotycznych w poszczególnych polach widzenia analizowanych obrazów mikroskopowych. Indeks ten wynosił 51 %, przy odpowiednim: 27% dla bcl-taa, i zaledwie 5-7% dla pozostałych ASO. Również ilość identyfikowanych komet apoptotycznych pojedynczych komórek była najwyższa dla ASO bcl-egz I. Przykładowe obrazy wyznaczanych indeksów apoptotycznych i analizy kometowej dla komórek HeLa traktowanych ASO przedstawiono na rys. 1 i 2. Wśród danych literaturowych za równie skuteczny w wyciszaniu ekspresji genu BCL-2 jak w naszych badaniach rejon mrna BCL-2 i przekładający się na zmianę w proliferacji komórek wykazali między inny- A B C D Rys 2 Obraz mikroskopowy analizy kometowej rozdziału in situ genomowego DNA w komórkach HeLa transfekowanych ASO bcl-egz I (A i C) oraz ASO bcl-taa (B i D). Różną siłę działania oligonukleotydów antysensowych w indukcji apoptozy odzwierciedlają odmienne obrazy komet apoptotycznych: (wg skali Collinsa 0-4) z maksymalnym skupiskiem pofragmentowanego DNA genomowego w ogonie komety 4pkt., (rys2 C), lub z maksymalnym skupiskiem pofragmentowanego DNA genomowego w jądrze komety 1pkt., (rys. 2D). [6]. 42

6 Nr 2/2008 mi: Lopes de Menezes i wsp. (2000) oraz Refik I. Pakunlu i wsp. (2003). Pracowali oni z oligonukleotydami antysensowymi komplementarnymi także do egzonu 1, ale odpowiednio dla badaczy były to pozycje: od 212 do 229 kodonu, oraz od 205 do 224 kodonu mrna BCL-2. [7, 8] Należy zaznaczyć, iż obie grupy badaczy pracowały z wyższymi stężeniami oligonukleotydów antysensowych, rzędu nm, nie mniej jednak prowadzili oni badania na specyficznej grupie komórek z wyidukowanym mechanizmem oporności wielolekowej związanej ze zwiększonym wyrzutem leków z komórek przez błony plazmatyczne. Stosowany w badaniach klinicznych Oblimersen wykazuje natomiast komplementarność w obrębie pierwszych sześciu kodonów egzonu pierwszego. [9] Można przyjąć, że dla genu BCL-2 początkowy odcinek kodujący stanowi optymalne miejsce docelowe do projektowania wyciszających sekwencji oligonukleotydowych. Analiza struktury przestrzennej mrna BCL-2 (GenBank # M_14745.) w dostępnym serwisie internetowym do analizy struktury II-rzędowej RNA: GeneBee service, [10], wskazała na korzystne pod względem konformacji lokalizowanie projektowanych ASO w obrębie egzonu I. Wybrany obszar charakteryzował się zmniejszonym zagęszczeniem naturalnie tworzących się w obrębie całej cząsteczki mrna BCL-2 pseudodwuniciowych struktur, takich jak na przykład struktury szpilki do włosów (hair-pin structures). Wynik fragmentu analizy struktury przestrzennej mrna BCL-2 przedstawiono na rys. 3. WYCISZANIE EKSPRESJI GENU BCL-2 Na uwagę zasługuje fakt, iż oligonukleotyd antysensowy bcl-egz I jest komplementarny do regionu mrna leżącego w obszarze domeny BH1 syntetyzowanego białka BCL-2. Tejże domenie przypisuje się tworzenie charakterystycznych połączeń z obszarami kolejnej domeny BH3 i utworzenie wraz z nią struktury przestrzennej wchodzącej w interakcję z promotorami śmierci [11]. Badania Kawatani i Imoto [11] nad zmutowanymi formami białka BCL-2, pozbawionymi kolejno domen: BH1, 2, 3 i 4, wykazały, iż usunięcie domeny BH1 z białka BCL-2 doprowadziło do aktywacji apoptozy w komórkach nowotworowych, co było szczególnie widoczne po zastosowaniu cytostatyków, w tym kampotecyny. Samą domenę BH1 określa się również jako strukturę pore forming, która stanowiąc element strukturalny białek rodziny BCL- 2, zakotwiczając się w błonach, decyduje o ilościowych interakcjach pomiędzy homo- i hetero-dimerami białek pro- i anty-apoptotycznych, a tym samym decyduje o aktywacji apoptozy komórek. [12]. Biorąc pod uwagę wykazaną w naszych badaniach możliwość skutecznego hamowania proliferacji komórek nowotworowych przez interakcję z zastosowaną sekwencją oligonukleotydową bcl-egz I, celowym jest prowadzenie dalszych badań, szczególnie in vivo, nad możliwością wykorzystania wskazanego w niniejszej pracy narzędzia molekularnego, jakim jest sekwencja ASO bcl-egz I w regulacji przeżywalności komórek w różnych typach schorzeń związanych z nadekspresją genu BCL-2. Rys. 3. Fragment zaprojektowanej struktury przestrzennej mrna BCL-2; strzałką zaznaczono region, w obrębie którego przyłącza się sekwencja ASO bcl-egz I (pozycje nukleotydowe od 915 do 934). 43

7 WYCISZANIE EKSPRESJI GENU BCL-2 WNIOSKI W ustalonej linii nowotworowej HeLa wykazano zahamowanie proliferacji i indukcję apoptozy po wprowadzeniu do komórek metodą lipofekcji sekwencji oligonukleotydów antysensowych. Najsilniejszy opisany efekt pojawił się w przypadku podaży do komórek ASO komplementarnych względem egzonu I mrna BCL-2, tym samym ustalono ten odcinek badanego genu za optymalne miejsce do projektowania sekwencji wyciszających ekspresję oligonukleotydów antysensowych. 44 Nr 2/2008 PIŒMIENNICTWO: 1. Nahta R, Esteva FJ. Bcl-2 antisense oligonucleotides: a potential novel strategy for the treatment of breast cancer. Semin. Oncol. 2003; 30(5): Gutierrez-Puente Y, Zapata-Benavides P, Tari AM, Lopez-Berestein G. Bcl-2 Related Antisense Therapy. Semin. Oncol. 2002; 29(3): Dias N, Stein CA. Antisense oligonucleotides: basics and mechanisms. Mol Cancer Ther 2002; 1: Ziegler A., Luedke GH., Fabbro D., Altmann K- H., Stahel RA and Wittke ZU. Induction of apptosis In small-cell lung kancer Wells by an antisense oligodeoxynucleotide targeting the BCL-2 coding sequence. J. Natl. Cancer Inst. 1997; 89 (14): Bednarek I., Sypniewski D., Klama-Baryła A., Gałka S., Machnik G.: Single-cell gel electrophoresis (comet assay) as a tool for apoptosis determination in tumor cell lines HL-60 and Jukart cultures treated with anisomycin. Ann. Acad. Med. Siles. 2006; 60 (4): Colins A.R.: The comet assay for DNA amage and repair. Principles, applications, and limitations. Mol. Biotechnol. 2004; 26: Lopes de Menezes DE, Hudon N, McIntosh N, Mayer LD. Molecular and Pharmacokinetic Properties Associated with the Therapeutics of Bcl-2 Antisense Oligonucleotide G3139 Combined with Free and Liposomal Doxorubicin. Clin Cancer Res 2000; 6: Pakunlu RI, Cook TJ, Minko T. Simultaneous Modulation of Multidrug Resistance and Antiapoptotic Cellular Defense by MDR1 and BCL-2 Targeted Antisense Oligonucleotides Enhances the Anticancer Efficacy of Doxorubicin. Pharm Res, 2003, 20: Herbst RS. and Frankel SR. Oblimersen Sodium (Genasense bcl-2 Antisense Oligonucleotide): A Rational Therapeutic to Enhance Apoptosis in Therapy of Lung Cancer. Clin Cancer Res 2004; (Suppl.): Kawatani M., Imoto M.: Deletion of the BH1 domain of BCL-2 accelerates apoptosis by acting in a dominant negative fashion. J. Biol. Chem. 2003; George N.M., Evans J.D., Luo X.: A three-helix homo-oligomerization domain containing BH3 and BH1 is responsible for the apoptotic activity of Bax. Genes Dev. 2007; 21: