Nowe oblicze RNA. Józef Dulak. Zakład Biotechnologii Medycznej Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii Uniwersytet Jagielloński

Transkrypt

1 Nowe oblicze RNA Józef Dulak DMB Zakład Biotechnologii Medycznej Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii Uniwersytet Jagielloński biotka.mol.uj.edu.pl/~hemeoxygenase 9 grudnia 2006

2 Regulacja ekspresji genów

3 RNA komórek eukariotycznych

4 Indukcja ekspresji genów w eukariotycznych

5 Wiele poziomów regulacji ekspresji

6 Regulacja ekspresji genów w związanych zanych z pobieraniem i magazynowaniem żelaza

7 Sposoby hamowania ekspresji genów - Pułapki oligonukleotydowe - Nukleotydy antysensowe - Rybozymy

8 Pułapki oligonukleotydowe (decoys)

9 Hybrydyzacja kwasów naukleinowych jako sposób hamowania ekspresji genów DNA hybrydyzuje z DNA DNA hybrydyzuje z RNA RNA hybrydyzuje z RNA U U U U U U U U

10 Rybozymy katalityczne cząsteczki RNA H- A, C lub U

11 Oligonukleotydy antysensowe

12 Wszystkie wyżej wymienione sposoby sąs jednak mało o wydajne i w znacznym stopniu sztuczne, czyli wymyślone przez człowieka

13 Zastosowanie jednoniciowego, antysensowego RNA do hamowania ekspresji genów 1991 Fire et al. C. elegans

14 Dwuniciowe RNA bardziej efektywne aniżeli jednoniciowe... - Interferencja RNA była a przekazywana potomstwu -Do hamowania ekspresji genów w potrzebne było o niewiele cząsteczek RNA, co sugerowało o mechanizm katalityczny (amplifikację)

15 Fire at al., 1998 Dwuniciowe RNA hamuje ekspresję genów w bardziej efektywnie niż jednoniciowe Zarodek kontrolny Zarodek z uwidocznionym mrna genu mex-3 Zarodek nastrzyknięty ty jednoniciowym antysensowym RNA Zarodek nastrzyknięty ty dwuniciowym RNA Nicień po podaniu niespecyficznego dsrna Nicień po podaniu specyficznego dsrna Dwuniciowe RNA o długod ugości kilkuset nukleotydów

16 Nobel 2007 w dziedzinie fizjologii lub medycyny Andrew Fire Craig Mello

17 Patent na interferencję RNA Genetic inhibition by double-stranded RNA Abstract A process is provided of introducing an RNA into a living cell to inhibit gene expression of a target gene in that cell. The process may be practiced ex vivo or in vivo. The RNA has a region with doublestranded structure. Inhibition is sequence-specific in that the nucleotide sequences of the duplex region of the RNA and of a portion of the target gene are identical. The present invention is distinguished from prior art interference in gene expression by antisense or triple-strand methods Inventors: Fire; Andrew (Baltimore, MD), Kostas; Stephen (Chicago, IL), Montgomery; Mary (St. Paul, MN), Timmons; Lisa (Lawrence, KS), Xu; SiQun (Ballwin, MO), Tabara; Hiroaki (Shizuoka, JP), Driver; Samuel E. (Providence, RI), Mello; Craig C. (Shrewsbury, MA) Assignee: Carnegie Institute of Washington (Washington, DC) Appl. No. 09/215,257 Filed: December 18, 1998 This application claims the benefit of U.S. Provisional Appln. No. 60/068,562, filed Dec. 23, 1997.

18 Interferencja RNA Specyficzne hamowanie ekspresji genów w przez dwuniciowe RNA na drodze: 1. indukcji specyficznej degradacji komplementarnego mrna 2. hamowania translacji 3. modyfikacji chromatyny

19 Wyjaśnienie mechanizmu działania ania interferencyjnego RNA Enzym Dicer tnie dsrna na krótkie, nukleotydowe fragmenty

20 Mechanizm działania ania sirna

21 Zastosowanie sirna u ssaków

22 Zastosowanie sirna u ssaków

23 Wprowadzenie sirna kodowanego w wektorze

24 Sposoby dostarczania sirna do komórek Chemicznie syntetyzowane sirna krótkotrwałe wyłączenie sirna kodowane w wektorze długotrwałe wyłączenie

25 Ekspresja sirna wprowadzonego w wektorze

26 Rózne rodzaje regulatorowych cząsteczek RNA Figure Genomes 3 ( Garland Science 2007)

27 Celem mirna jest często niekodujący fragment 3 3 mrna Figure Genomes 3 ( Garland Science 2007)

28 Biogeneza i mechanizm działania ania mirna Esquela-Kerscher & Slack, Nature Rev Cancer 2006

29 Interferencja RNA u różnych r organizmów drożdże rzodkiewnik muszka owocowa C. elegans/ssaki Meister & Tuschl, Nature 2004

30 Mechanizm działania ania różnych r cząsteczek interferującego RNA jest podobny

31 Fizjologiczne znaczenie mirna C. elegans geny lin-4 4 & let-7 kodują mirna Mutacja w tych genach zaburzenia w rozwoju C. elegans Udział w: programowanej śmierci komórki (apoptoza( apoptoza) specyfikacji charakteru neuronów kontroli gromadzenia tłuszczu t zapobieganiu proliferacji genetycznych pasożyt ytów

32 Transpozony (skaczące ce geny) Fragmenty DNA kodujące enzymy umożliwiaj liwiające transpozycję (przeniesienie z jednego miejsca genomu do innego miejsca skaczące ce geny ). Mogą prowadzić do poziomego przekazywania genów, czyli przenoszenia się genu z genomu jednego gatunku na inny. Czerwony kolor nasion spowodowany jest transpozonami

33 Funkcje mirna Większo kszość zwierząt t ma od różnych r mirna (ocenia się, że e u ludzi ok.1000 i mogą stanowić 1-4% wszystkich genów w ulegających ekspresji) Lokalizacja w genomie: większo kszość w obrębie bie intronów w genów w kodujących białka Ocenia się, że mirna kontrolują około o 30% ludzkich genów! Ok. 30% genów mirna wykazuje homologię między C. elegans, Drosophila i człowiekiem

34 mirna a choroby człowieka owieka -Zaburzenia w ekspresji mirna w nowotworach (rak nerki, piersi, chłoniaki oniaki,, inne) -mirna mogą zarówno odgrywać rolę hamująca jak i stymulująca powstawnie nowotworów w (czyli mogą być supresorami jak i onkogenami) oncomirs

35 Rola mirna w rozwoju nowotworów Esquela-Kerscher & Slack, Nature Rev Cancer 2006

36 Zastosowanie interferencji RNA - odwrotna genetyka ( (reverse genetics) Praktycznie wszystkie genów C. elegans zostało wyłą łączonych za pomoca sirna!

37 Terapia genowa wykorzystanie kwasów nukleinowych w charakterze leków Gen terapeutyczny Wektor Pacjent Ekspresja genu terapeutycznego Efekt leczniczy Białko lecznicze

38 Terapia genowa Wzmacniająca Substytucyjna Hamująca wzmocnienie wprowadzenie hamowanie ekspresji ekspresji genów brakującego genu genów Nowotwory Choroby układu krążenia np. Nowotwory choroby układu krążenia Choroby dziedziczne (wrodzone błędy metaboliczne, mukowiscydoza, dystrofia mięśniowa )

39 Terapeutyczne kwasy nukleinowe DNA RNA Geny Wektory DNA) Sekwencje niekodujące Geny (wektory RNA) Sekwencje niekodujące Oligonukleotydy Antysensowe Pułapki oligonukleotydwe rybozymy sirna

40 Rózne sposoby hamowania ekspresji genów

41 Próby kliniczne terapii z zastosowaniem sirna w zapobieganiu degeneracji plamki żółtej

42 DMB Degeneracja plamki

43 sirna przeciw mrna VEGF Acuity Pharmaceuticals Normal Macula Dry AMD:Drusen formation under the Macula Wet AMD:Macula with abnormal blood vessels + sirna

44 sirna-027 hamuje patologiczną angiogenezę Kontrola sirna-027

45 Możliwe zastosowania sirna - leczenie zakażeń wirusowych (HCV, HIV) - hamowanie angiogenezy AMD, łuszczyca, reumatoidalne zapalenie stawów, nowotwory - choroby neurodegeneracyjne pląsawica Huntingtona - Astma hamowanie produkcji cytokin prozapalnych

46 sirna w terapii

47 Różnorodny świat RNA

48 Wnioski -Zrozumienie mechanizmów w ekspresji genów w jest równie ważne jak próby wykorzystania tych zjawisk -Skuteczne zastosowanie biotechnologii wymaga dogłę łębnej wiedzy nt.. mechanizmów w regulacji ekspresji genów -Badania o charakterze bardzo podstawowym stworzyły mozliwości pracy dla wielu osób

49 Nobel Prize Award Ceremony The Nobel Prize Award Ceremony at the Stockholm Concert Hall, Sweden. December 10, 4:30 p.m. - 6:00 p.m. (CET).

50