Application of antisense oligomers as therapeutic tools

Transkrypt

1 Application of antisense oligomers as therapeutic tools Krzysztof Sobczak Department of Gene Expression, Institute of Molecular Biology and Biotechnology. Collegium Biologicum, Room 1.122; phone

2 Two categories of nucleic acid-binding oligomers - antisense reagents (i) modifier oligos which bond to and then modify their targeted sequences, either directly (ribozymes) or indirectly via RNase-H or RISC-mediated degradation (ODN, sirna) (i) blocker oligos which bond to, but not modify their complementary sequences (LNA, PNA, morpholino) ODN oligodeoxynucleotide sirna short interfering RNA LNA locked nucleic acids PNA peptide nucleic acids

3

4 Analogi kwasów nukleinowych są znacznie stabilniejsze Tm duplex DNA/DNA Tm duplex DNA/PNA

5

6 Dystrofia mięśniowa Duchenne'a ang. Duchenne muscular Dystrophy (DMD) dziedziczy się w sposób recesywny wywołana mutacjami w genie DMD (chrom. X) kodującym dystrofinę mutacje powodują przesunięcie ramki odczytu i całkowity brak dystrofiny najczęściej spotykana forma dystrofii mięśniowej 1/3,500 urodzeń chłopców Objawy: nekroza włókien mięśniowych, kardiomiopatia w wieku 12 lat większość chorych nie jest już w stanie samodzielnie chodzić średni okres życia pacjentów wynosi lat

7 deletions of exons 72% nonsense mutations -10% Patomechanism of DMD

8 deletions of exons 72% nonsense mutations -10% Patomechanism of DMD

9 Local and systemic delivery of 2 -O-metylo oligomers Goyenvalle et al. Mol Ther. 2009

10 Clinical trial with 2 -O-metylo oligos in DMD patients van Deutekom et al. N Engl J Med. 2007

11 Triplet Repeat Expansion Diseases (TREDs) DM Myotonic Dystrophy

12 Three main pathomechanisms of TREDs Kozlowski, Sobczak & Krzyzosiak, Med. Genet. 2010

13 Myotonic Dystrophy (DM) Curshmann-Steinert disease Autosomal dominant disease Expansion of CTG triplets in 3 UTR of DMPK (chrom 19) Expansion of CCTG repeats in intron 1 of ZNF9 (chrom. 3) Occurrence 1 per 6-10,000 people

14 Pathomechanism of myotonic dystrophy (DM) - dominant effect of toxic RNA

15 Splicing defect and nuclear sequestration of MBNL1 protein in human DM1 and DM2. Lin X et al. Hum. Mol. Genet. 2006;15:

16 Is the CAG-25 morpholino an efective tool to inhibit MBNL1/CUG exp interaction in vitro? Non-disease control Myotonic dystrophy

17 heteroduplex CUG hairpin CAG-25 oligomers disrupt (CUG)109 hairpin [mm] C C CAG-25-morpholino * CAG-25-DNA *

18 Very short CAG-repeat LNA oligomers invade stable CUG repeat hairpin structure Wojtkowiak-Szlachcic et al. Manuscript in preparation

19 heteroduplex CUG hairpin heteroduplex CUG hairpin CAG morpholino: (i) prevents the CUG/MBNL1 complex formation (ii) disrupts preformed complex (i) ( RNA + Oligo ) + MBNL C um CAG CAG -25-morpholino CAG-25-DNA (ii) ( RNA + MBNL1 ) + Oligo C um CAG CAG -25-morpholino CAG-25-DNA

20 Is CAG-25 morpholino an efective tool to restore normal function of MBNL1 in vivo? Non-disease control Myotonic dystrophy

21 CAG25 dispersed CUGexp nuclear RNA foci

22 Reversal of misregulated alternative splicing by CAG25

23 ClC-1 protein expression and function are rescued by CAG25 Three phenotypes monitored for the same splicing events!!! 1. RNA splicing RT-PCR 3. physiological measurement myography 2. Protein localization immunostaining

24 Long effect of CAG25 on splicing process - at least 14 weeks

25 Alternative splicing is not affected by CAG25 in the absence of CUG exp RNA

26 CAG25 increases translation of CUG exp -containing mrna

27 Wheeler et al. J Clin Invest. 2007

28 Choroba Huntingtona ang. Huntington Disease (HD) dziedziczona jest w sposób autosomalny dominujący mutacja genu HTT (chrom. 4) kodującego huntingtynę ekspansja powtórzeń trójnukleotydowych CAG występuje u 1 na 15,000 osób neurotoksyczność zmutowanej huntingtyny zawierającej reszt glutaminy Objawy: niekontrolowane ruchy (ruchy pląsawicze) pojawienie się drżenia rąk i nóg zaburzenia umysłowe, postępujące zaburzenia pamięci zachłystowe zapalenie płuc jest przyczyną śmierci pacjentów

29

30 Zastosowanie antysensowych oligomerów LNA i PNA selektywnie obniża ekspresję zmutowanej huntingtyny PNA peptide nucleic acids LNA lacked nucleic acids Hu et al. Nat Biotech. 2009

31 Selektywność zależny od różnicy długości powtórzeń CAG zmutowanego i normalnego wariantu genu HTT Hu et al. Nat Biotech. 2009

32

33 Application of chemically modified antisense oligomers 1. Splicing correcion 2. Inhibition of RNA/protein interactions 3. Inhibition of mutant mrna translation Oligomer s chemistry: 2 -O-Met-RNA morfolino LNA PNA

34 Morpholino oligomers can be used also to knock-down gene expression in vivo Edema (American English) or oedema (British English) is an abnormal accumulation of fluid Huang H, et al.; J Biol Chem. 2012

35 mirna biogenesis and inhibition of mirna function by antago-mir oligonucleotides

36 Inhibition of mirna function by antisense oligomers (antagomirs). Oligomers used for mirna blocking: morfolino LNA PNA

37 Design of chemically modified antagomir oligonucleotides

38 Anti-122pS Anti-122fS Antagomir-122

39

40

41

42

43

44 Antisense oligodeoxynucleotides (AONs) activate cellular RNAse H and induce cleavege of target RNA - gapmers Application of AONs in cancer

45 Gapmers are antisense oligonucleotides which activate RNaseH containing at both ends different types of nucleic acids analogs

46 Unique graduate student = possibilities