Wektory wirusowe. Wykład IV i V

Transkrypt

1 Wektory wirusowe Wykład IV i V

2 Ideal vector for gene delivery: High transduction efficiency High and long-lasting transgene expression Cell-type specificity No cytotoxicity No induction of immune response High transgene capacity Easy for construction and multiplication

3 Wymagania stawiane wektorom w zależności od rodzaju choroby 1. Długotrwała lub krótkotrwała ekspresja 2. Ekspresja stała lub regulowana 3. Ekspresja systemowa lub lokalna

4 Wektory wirusowe Integrujące się do chromosomów nie integrujące się Retrowirusowe Lentiwirusowe AAV Adenowirusowe HSV Integracja zależy od: -sekwencji LTR oraz integrazy (retrowirusy) -Sekwencji ITR oraz białka rep (AAV)

5 Retroviral expression system

6 Wektory retrowirusowe Oncoretrowirusy: mamamalian and avian C-type Lentiwirusy: HIV and others Spumawirusy

7 Konstrukcja wektorów wirusowych 1. Rozdzielenie genów oraz sekwencji działających in-cis na różne wektory plazmidowe dla uniknięcie odtworzenia wirusa poprzez rekombinację - sekwencje kodujące niezbędne dla powstania cząstki infekcyjnej działają in-trans - stosowane w postaci plazmidów lub obecne w chromatynie komórek pakujących 2. Konstrukcja plazmidu zawierającego niezbędne sekwencje działające in-cis oraz gen terapeutyczny Konsekwencje takich modyfikacji 1. Zniszczenie naturalnego, dobrze funkcjonującego zestawu genów, niezbędnego do powstania cząstki infekcyjnej wirusa prowadzi do zaburzenia syntezy wektorów: -mało wydajne pakowanie wektorów w porównaniu z wirusami - powstawanie dużej liczby cząstek defektywnych: niekorzystnie wpływają na transdukcję

8 Construction of retrovirus vector 1. Construction of retrovirus vector as a recombinant plasmid in E.coli 2. Introduction of a plasmid into a packaging cell line 3. Incorporation of vector transcripts into transmissible virus particles 4. Conversion of the transcripts into double-stranded DNA by reverse transcriptase

9 Schemat wektora retrowirusowego

10 Wektory retrowirusowe Cechy retrowirusów Cechy zmodyfikowane Zachowane sekwencje LTR 5 i 3 zachowana sekwencja ψ Usunięcie genów gag, pol, env wprowadzenie markera selekcyjnego wprowadzenie genu terapeutycznego/ reporterowego cząsteczki infekcyjne wytwarzane są w komórkach pakujących

11 1. Ectotropic - infect only rodent cells (Eco-R receptor) 2. Xenotropic - infect most mammalian except rodent 3. Amphotropic - infect all mammalian (receptor Ram-1 and Glvr-1) 4. Pantropic - infect various species - VSV glicoprotein

12 Miano (titer) Stężenie cząstek wirusowych i/lub liczba wirionów zdolnych do trandukcji Liczba cząstek zdolnych do transdukcji zazwyczaj prezentuje tylko niewielką część całkowitej liczby cząstek wirusowych

13 Wektory retrowirusowe Pojemność Integracja do genomu komórki Specyficzność tkankowa Właściwości Czas trwania ekspresji Poziom ekspresji Bezpieczeństwo 8 kb Tak Tak Transfekuje tylko komórki dzielące się Długotrwała Umiarkowany ryzyko mutagenezy insercyjnej

14 Wektory lentiwirusowe Transfekują komórki nie dzielące się Zastąpienie wirusowego genu env (powinowactwo do komórek CD4) genem VSVG - szeroki zakres powinowactwa Wektory lentiwirusowe oparte są na: HIV-1, HIV-2 SIV FIV Samo-inaktywujące się wektory lentiwirusowe: delecja dolnego LTR powoduje po transdukcji transkrypcyjna inaktywację gónego LTR, ograniczając ryzyko rekombinacji i mobilizacji wektora

15 Wykorzystanie wektorów retrowirusowych 1. Terapia niedoborów odporności transfer limofocytów (niedobór ADA) lub komórek macierzystych (X-SCID) 2. Transfer genu samobojczego kinazy tymidynowej zapobieganie reakcji GvH (przeszczep przeciw gospodarzowi) u pacjentów z po przeszczepie allogenicznym szpiku kostnego

16 Serotypy adenowirusów i schorzenia przez nie wywoływane

17 The simplest of adenoviral life cycle Entry into the cell Uncoating of DNA transcription translation RNA DNA replication Assembly of progeny virus particles and exit from cell

18 Funkcje genów adenowirusowych E1A reguluje ekspresję genów niezbędnych do replikacji genomu Ad -wyłącza nadzór białka Rb nad genami kontrolującymi metabolizm nukleotydów i replikację DNA - interakcja z modulatorami transkrypcji: deacetylazami histonowymi, acetylotransferazą histonową - w konsekwencji dochodzi do stabilizacji i akumulacji p53 -ponieważ nadekspresje p53 prowadzi do apoptozy komórek, wirusy uruchamiaja mechanizmy temu zapbiegające zależne od genow E1B oraz E40rf6 E2 koduje trzy białka zaangazowane w replikacji DNA polimeraza DNA, białko wiążące jednoniciowe DNA oraz białko preterminalne E3 funkcje immunosupresyjne: gp19 hamuje prezentację antygenów w kontekście antygenów MHC klasy II 14,7 oraz 10,4 kda hamuje apoptoze komórek inicjowana przez fas/fas ligand oraz TNFa Promotor białek E3 wymaga białek kodowanych przez E1 E4 białka niezbędne do selektywnej ekspresji białek wirusowych kosztem genów komórkowych np.. zahamowanie przenoszenia do cytoplazmy transkryptów genów komórkowych na rzecz genów wirusowych

19 Transcription factor E2F Quiescence cdk Cyclin A E2F TTTCGCGC Rb E1A Ad protein silent c-myc c-myb cdc2 kinase PCNA Proliferation cdk Cyclin A Rb P E2F TTTCGCGC Mann MJ, Mol Med. Today 2000 transactivate c-myc c-myb cdc2 kinase PCNA

20 Schemat dzialania adenowirusa w komórce Wejscie do komorki DNA wirusowe Produkcja bialek wirusowych Namnazanie DNA Receptor dla adenovirusów: CAR Powstawnie wirusow potomnych Wejscie do komorki DNA wektora Produkcja leczniczego bialka Namnazanie DNA Schemat dzialania wektora adenowirusowego pierwszej generacji

21 Adenoviruses ~40 serotypes of adenoviruses (for gene therapy type 2 and 5 were used), causing usually mild illness in humans Genome consists a 36 kb double-stranded linear DNA with ITR sequences at each end, with: Early genes (responsible for viral gene transcription,, DNA replication, host immune suppression and host cell apoptosis Late genes (coding proteins required for virus assembly) E1 early gene is essential for the subsequent adenoviral gene expression region E1 leczniczy gen DNA adenowirusa DNA wektora adenowirusowego pierwszej generacji

22 Adenoviral E1 E3 vectors E2 E4 Deletions Vector Production Capacity Features E1 E1 (and E3) E1 complementing cells 7.5 kb Viral protein neosynthesis, viral replication despite lack of E1 E1E4 E1,E4 (and E3) E1 and E4 complementing cells 10 kb Reduced viral protein neosynthesis, E1E2 E1,E2A or E2B (and E3) E1 and E2 complementing cells 9 kb Block of viral replication sever inhibition of viral protein synthesis Benihoud K. et al Current Opinion in Biotechnology 10: 440.

23 Wykorzystanie wektorów adenowirusowych w terapii genowej 1. Terapia błędów metabolicznych niedobór OCT 2. Terapia chorób monogenowych mukowiscydoza brak efektów 3. Terapia chorób układu krążenia transfer genów czynników angiogennych 4. Terapia nowotworów możliwe, że toksyczność i nasilenie immunogenności przyniesie dodatkowy efekt terapeutyczny

24 Adenoviral vectors of the first generation Great: Very high transduction efficiency Broad host and cell type ranges Can be prepared in high titers Can transduce mitotic and post-mitotic cells Do not integrate with genome Can harbor ~ 7 kb of transgene But: Strong immune response to viral proteins eliminate virally transduced cells within 30 days Neutralizing antibody response prevents readministration of adenovirus vector of the same serotype Thus: Adenoviral vectors provide the high but transient (<4 weeks) transgene expression

25 Helper-dependent adenoviral vectors Very high transduction efficiency Broad host species and cell type range Can transduce mitotic and post-mitotic cells Can harbor ~ 35 kb (!) of transgene Do not integrate with genome Do not produce any viral proteins Show significantly reduced immunogenicity in vivo Drawback: Difficult for producing in high titers

26 Sekwencja ITR (konieczna do powielenia DNA) Wypelniacz (intron) moze byc zastępowany leczniczym genem leczniczy gen ITR Sekwencja Ψ (konieczna zapakowania DNA do kapsydu)

27 Konstrukcja wektorów helper-dependent Sygnal pakowania DNA do kapsydu Wirus pomocniczy Sygnal pakowania DNA do kapsydu Wektor gutless loxp loxp molekularne nozyczki Komorki Leczniczy gen Powielanie DNA w komorkach Sygnal pakowania DNA do kapsydu zostal wyciety NIE pakuje sie do kapsydow Produkuje bialka kapsydow, Pakuje sie do gotowych kapsydow

28 Adenoviral vectors E1 E3 E2 E4 Vector Deletions Production Capacity Features E1 E1 (and E3) E1 complementing cells 7.5 kb Viral protein neosynthesis, viral replication despite lack of E1 E1E4 E1,E4 (and E3) E1 and E4 complementing cells 10 kb Reduced viral protein neosynthesis, E1E2 E1,E2A or E2B (and E3) E1 and E2 complementing cells 9 kb Block of viral replication sever inhibition of viral protein synthesis Gutless All viral genes E1 complementing cells, helper virus 36 kb No viral protein neosynthesis, No viral replication, Helper virus contaminants (<0.1%) Benihoud K. et al Current Opinion in Biotechnology 10: 440.

29 Wektory AAV

30 Wirusy związane z adenowirusami (AAV) Małe, niepatogenne wirusy DNA jednoniciowe Do replikacji wymagają dodatkowych genów dostarczanych przez inne wirusy (adenowirusy lub wirusa opryszczki) Integrują do DNA w chromosomie 19 Infekują wiele typów komórek: Wiązanie AAV-2 do komórek odbywa się poprzez siarczan heparanu. Wejście do komórek poprzez integrynę α V β 5 oraz receptor dla FGF-2

31 Wirusy związane z adenowirusami (AAV) Małe, niepatogenne wirusy DNA jednoniciowe Do replikacji wymagają dodatkowych genów dostarczanych przez inne wirusy (adenowirusy lub wirusa opryszczki) Genom AAV 4681 nukleotydów, na końcach 145 nukleotydowe ITR (inverted terminal repeats) ITR niezbędne in cis miejsce inicjacji replikacji - sygnał pakowania do kapsydu - integracja do genomu komórki - uwolnienie z chromosomu (w przypadku wektorów z rekombinantowego plazmidu)

32 Site-specific integration AAV integrates usually stably into a specific site on chromosome 19q13.3 (AAVS1) Integration region- AAVS1 (RBS,TRS) Rep78 and Rep68 bind to a 109 bp DNA fragment near AAVS1 and can mediate complex formation (DNA of chromosome 19 and AAV harpin DNA) Viral DNA replication within AAVS1 are likely involved in sitespecific integration;

33 Wektory AAV usunięcie genów rep i cap wprowadzenie genu terapeutycznego ITR ITR

34 Wektory AAV - utrata zdolności do specyficznej integracji w chromosomie 19 spowodowane brakiem białek Rep68 oraz Rep78 - integracja niespecyficzna (z niską, około 5-10 % wydajnośćia) - wystepują w postaci episomalnej

35 Serotypy AAV 5 serotypów (ostatnio doniesienia o szóstym) Wystepują przeciwciała neutralizujące, ale nie zapobiegają ponownej infekcji istotne dla Wykorzystania AAV w terapii genowej - receptorem dla serotypu AAV-5 - PDGFR

36 AAV Helper-Free System Do powstania AAV potrzebne sa tylko następujące geny adenowirusa: E1, E2A, E4 oraz VA

37 AAV Helper-Free System - Safe, no adenovirus required - Stable expression in dividing and non-dividing cells - Broad host range - Infects both dividing and non-dividing cells - High titer virus - Up to 100% transduction efficiency, even on difficult-to-transfect cell lines - Lower toxicity vs. non-viral methods of gene delivery

38 Vectors in AAV helper- free system

39 Helper-free production of AAV vectors (2)

40 Cechy wektorów AAV Zalety 1. Długotrwała ekspresja integracja do genomu, także postać episomalna 2. Slutecznie transdukują wiele typów komórek, także w stanie spoczynku; 3. Wirusy niepatogenne, prawdopodobnie niskie ryzyko komórkowej odpowiedzi immunologicznej, ograniczone ponadto przez usunięcie sekwencji wirusowych Ograniczenia 1. Niespecyficzna integracja (po usunięciu sekwencji rep) 2. Mała pojemność maks. 4 kb 3. Problemy z transdukcją niektórych typów komórek próby ukierunkowania 4. Trudność uzyskania odpowiednio dużej ilości cząstek wirusa 5. Możliwość odpowiedzi humoralnej przeciwciała rozpoznające białka otoczki

41 AAV- konkatameryzacja

42 Zastosowanie wektorów AAV w terapii genowej 1. Choroby układu nerwowego np. choroba Canvana 2. Mukowiscydoza 3. Hemofilia transfer genu czynnika IX do mięśni nóg

43 Wirus opryszczki (HSV-1) Zalety bardzo duży genom 152 kbp liniowy, dwuniciowy DNA, zawiera przynajmniej 84 geny (ciągłe) około połowa tych genów jest zbędna dla replikacji wirusa. Możliwość wprowadzania transgenów o długości przynajmniej 30 kb Możliwość uzyskiwania dużej liczby kopii cząstek wirusa Nieotksyczne, mogą przebywać w stanie latencji przez długi okres czasu w komórkach Transdukują liczne typy komórek Ograniczenia Brak doświadczenia z zastosowaniem rekombinowanych herpeswirusów u pacjentów Problemy z nacelowaniem transdukcji na określony typ komórek

44 Zastosowanie wektorów HSV-1 Badania eksperymentalne: 1. Nowotwory, w tym nowotwory układu nerwowego 2. Choroby obwodowegi układu nerwowego 3. Chorby centralnego układu nerwowego 4. Uszkodzenie rdzenia kręgowego 5. Leczenie bólu transfer do nerwów czuciowych wydaje się być najbardziej obiecujący

45 Inne wektory wirusowe 1.Retro-adenowirusy 2. Wirus opryszczki 3. Wirus polio, zapalenia wątroby typu A 4. Wirus Ebola... wektor lentiwirusowy zawierający białka osłonki wirusa Ebola transdukuje komórki nabłonka oddechowego

46 Wektory mieszane 1. AAV - HSV - gen Rep AAV umożliwia integrację wektora w określone miejsce na chromosomie Retrovirus-HSV 3. Retro-adeno - wprowadzenie sekwencji LTR pozwala na integrację wektora do chromosomów komórki - wektor taki może transfekować komórki nie dzielące się (jak adenowirus) a zarazem umożliwia trwałą ekspresję

47 Problemy wirusowej strategii dostarczania genów 1. Toksyczność 2. Ograniczona specyficzność komórkowa 3. Ograniczona pojemność wektora 4. Problemy z syntezą i przechowywaniem 5. Ryzyko rekombinacji 6. Ryzyko transferu do komórek linii płciowej 6. Wysoki koszt

48