ĆWICZENIE I BADANIE WRAŻLIWOŚCI BAKTERII NA ANTYBIOTYKI I CHEMIOTERAPEUTYKI

Transkrypt

1 ĆWICZENIE I BADANIE WRAŻLIWOŚCI BAKTERII NA ANTYBIOTYKI I CHEMIOTERAPEUTYKI Autor i główny prowadzący dr Dorota Korsak Wstęp Jednym z najważniejszych etapów rutynowej diagnostyki mikrobiologicznej zakażeń bakteryjnych jest oznaczenie wrażliwości patogenu na leki. Szerokie stosowanie antybiotyków pociąga za sobą ciągły wzrost oporności na leki wśród wielu klinicznie ważnych drobnoustrojów, a także pojawienie się nowych mechanizmów oporności. W chwili obecnej stosuje się wiele różnych metod identyfikacji oporności od prostych testów fenotypowych po metody wykorzystujące techniki biologii molekularnej. Współczesne laboratorium mikrobiologiczne posiada możliwość oznaczania lekowrażliwości różnymi metodami fenotypowymi: 1. metoda jakościowa metoda dyfuzyjno-krążkowa, wykorzystująca zjawisko powstawania w podłożu gradientu stężeń w trakcie dyfuzji substancji czynnej z krążka antybiogramowego. 2. metodami ilościowymi, pozwalającymi na określenie najmniejszego stężenia hamującego leku (ang. minimal inhibitory concentration, MIC) metoda rozcieńczeń w agarze antybiotyk obecny w podłożu agarowym w malejących stężeniach, na które posiewana jest zawiesina bakteryjna o określonej j gęstości 2.2. metoda rozcieńczeń w bulionie antybiotyk obecny w malejących stężeniach w bulionie; 2.3. E-testy metoda łącząca w sobie cechy metody rozcieńczeniowej i metody dyfuzyjnej, polegająca na wytwarzaniu stabilnego, ciągłego gradientu stężeń antybiotyku w podłożu agarowym. Celem ćwiczenia jest oznaczenie wrażliwości szczepów bakteryjnych na związki antybakteryjne z zastosowaniem metod fenotypowych i molekularnych. Wykonanie ćwiczenia Materiały Szczepy bakteryjne Staphylococcus aureus ATCC Enterococcus faecalis ATCC Escherichia coli ATCC Pseudomonas aeruginosa ATCC Listeria monocytogenes ATCC13932 szczepy L. monocytogenes izolowane z żywności Antybiotyki wodny roztwór tetracykliny (10 mg/ml) wodny roztwór wankomycyny (10 mg/ ml) wodny roztwór ampicyliny (10 mg/ml) roztwór cyprofloksacyny w 0.1 M HCl (10 mg/ml) Podłoża

2 (skład w przeliczeniu na 1 litr) Antybiogramowe Muellera-Hintona II ph-7,3 wyciąg wołowy 3,0 g kwaśny hydrolizat kazeiny 17,5 g skrobia 1,5 g Antybiogramowe Muellera-Hintona II agar (MHA) Bulion kazeinowo-sojowy z ekstraktem drożdżowym (TSYEB) ph-7,3 pepton K 17,0 g pepton SP 3,0 g glukoza 2,5 g chlorek sodu 5 0 g fosforan dwupotasowy 2,5 g ekstrakt drożdżowy 6,0 1. Badanie wrażliwości szczepów metodą dyfuzyjno-krążkową Przygotować odpowiednie zawiesiny (gęstość 0,5 w skali McFarlanda) następujących szczepów: S. aureus, E. faecalis, E. coli, P. aeruginosa. Na podłoże antybiogramowe Mueller-Hinton II, za pomocą jałowej wymazówki, nanieść zawiesinę bakteryjną. Po upływie 10 min nałożyć krążki bibułowe nasączone antybiotykiem/chemioterapeutykiem w ściśle określonym stężeniu (Tabela 1). Po inkubacji, prowadzonej w o C przez godz., zmierzyć średnicę strefy zahamowania wzrostu bakterii wokół krążka antybiotykowego. Określić wrażliwość badanego szczepy wykorzystując dane z Tabeli Określanie wartości minimalnego stężenia hamującego 2.1.Określanie wartości MIC metodą podwójnych rozcieńczeń antybiotyku/chemioterapeutyku w podłożu płynnym na płytkach titracyjnych Przygotować 5 ml podłoża MH II uzupełnionego odpowiednimi antybiotykami w stężeniu końcowym: wankomycyna - 16 g/ml; tetracyklina - 16 g/ml; ampicylina 16 g/ml; cyprofloksacyna - 16 g/ml. Stężenie wyjściowe każdego z antybiotyków: 1 mg/ml Przygotowanie hodowli bakteryjnej Przygotować serię 10-krotnych rozcieńczeń hodowli nocnych szczepów bakterii z rodzaju Listeria w roztworze soli fizjologicznej (RF) tak, aby uzyskać końcowe rozcieńczenie hodowli 10-5 co odpowiadało 10 4 jtk/ml Przygotowanie rozcieńczeń antybiotyku w podłożu Na 96 dołkowe płytki titracyjne o końcowej objętości 200 μl, nanieść po 100 μl podłoża MH II (począwszy od dołka B w każdej kolumnie). Następnie do dołka A w każdej kolumnie nanieść 200 μl podłoża MH II uzupełnionego badaną substancję w odpowiednim stężeniu. Począwszy od dołka A przenosić po 100 μl roztworu do kolejnych dołków, uzyskując w ten sposób serię dwukrotnych rozcieńczeń badanej substancji. Na koniec do każdego dołka dodać po 100 μl hodowli bakteryjnej z rozcieńczenia Odczyt wyników

3 Hodowle bakteryjne na płytkach titracyjnych należy inkubować w temperaturze o C przez godz. Odczyt będzie polegał na obserwacji zmętnienia podłoża. Za wartość MIC należy przyjąć najmniejsze stężenie antybiotyku, przy którym nie zaobserwowano wzrostu bakterii Określanie wartości MIC metodą E-testów Na podłoże antybiogramowe MH II z krwią owczą, za pomocą jałowej wymazówki, nanieść zawiesinę bakteryjną szczepów Listeria monocytogenes (rozcieńczenie 10-1 ). Po upływie 10 min nałożyć paski testowe (E-testy) ze stopniowo zmieniającymi się stężeniami antybiotyku. Po inkubacji przez godz. w temp. 37 o C na skali testu odczytać wartość MIC. Za MIC przyjąć wartość w punkcie przecięcia eliptycznej strefy zahamowania wzrostu utworzonej wokół paska z jego brzegiem. 3. Wykorzystanie metod molekularnych w wyrywaniu oporności bakterii 3.1 Molekularne mechanizmy oporności szczepów Campylobacter jejuni/coli na fluorochinolony i tetracykliny Mechanizm oporności bakterii z rodzaju Campylobacter (C. jejuni i C. coli) na fluorochinolony związany jest głównie pojawieniem się mutacji chromosomowych w genie gyra kodującym podjednostkę A topoizomerazy II gyrazy. Mutacje punktowe w genie gyra zmieniają sekwencję nukleotydową, co prowadzi do modyfikacji miejsca, które są celem działania dla fluorochinolonów. Prowadzi to zmniejszenia powinowactwa enzymu do tych chemioterapeutyków. Najczęstszą mutacją punktową w genie gyra spotykaną wśród szczepów Campyloabcter opornych na fluorochinolony jest zamiana kodonu ACA (kodującego treoninę) na ATA (kodującego izoleucynę ) w pozycji 86. Techniką stosowaną do identyfikacji tej mutacji jest metoda MAMA PCR (ang. mismatch amplification mutation assay PCR). Jest to reakcja amplifikacji ze starterami o zmodyfikowanej sekwencji. Startery są komplementarne do zmienionej sekwencji w DNA. Oporność na tetracykliny szczepów Campylobacter związana jest z obecnością genu tet(o). Gen ten koduje białko chroniące rybosom przed działaniem antybiotyku. Materiały DNA genomowy szczepów C. coli i C. jejuni Startery Mutacja Thr 86 w genie gyr A dla C. jejuni; gyra1 5- TTT TTA GCA AAG ATT CTG AT-3 gyra2 5- CAA AGC ATC ATA AAC TGC AA-3 Mutacja Thr 86 w genie gyr A dla C. coli gyra3 5- TAT GAG CGT TAT TAT CGG TC -3 gyra4 5-TAA GGC ATC GTA AAC AGC CA-3 Obecność genu tet(o) TET1 5- GGC GTT TTG TTT ATG TGC G-3 TET2 5-ATG GAC AAC CCG ACA GAA GC Wykrywanie oporności na fluorochinolony Wykrywanie mutacji w genie kodującym podjednostkę A gyrazy Skład mieszaniny reakcyjnej (25 µl)

4 H 2 O 19 µl bufor do PCR (10 x) 2,5 µl starter A1 (lub A3) (stężenie wyjściowe 10 µm) 1 µl starter A2 (lub A4) (stężenie wyjściowe 10 µm) 1 µl deoksyrybonukleotydy (10 mm) 1 µl polimeraza Taq (1U/µl) 1 µl DNA 2 µl Warunki reakcji - 35 cykli 94 o C 5 min 94 o C 1 min 48 o C 1 min 72 o C 1 min 72 o C 7 min 4 o C Wykrywanie oporności na tetracykliny Wykrywanie obecności genu tet(o) Startery: TET1 itet2 Warunki reakcji jak wyżej jedyna zmiana to temperatura przyłączania starterów (T m ) 57 o C Probówki umieścić w termocyklerze 4. Przeprowadzić reakcję PCR. 5. Po zakończeniu reakcji próbki (po dodaniu buforu obciążającego) rozdzielić w 1% żelu agarozowym. 6. Sporządzić dokumentację fotograficzną rozdziału DNA. 7. Określić, czy badany szczep jest oporny na fluorochinolony i/lub tetracykliny.

5 Tabela 1. Badanie wrażliwości szczepów bakteryjnych na antybiotyki i chemioterapeutyki* Pseudomonas aeruginosa imipenem ceftriakson minocyklina ciprofloksacyna Enterococcus feacalis krążek ( g) strefa zahamowania wzrostu (mm) Wartość MIC ( g/ml) antybiotyk tetracyklina ampicylina wankomycyna linezolid Escherichia coli ampicylina tikarcylina / 75/ /2 16/2 kwas klawulanowy cefoksytyna aztreonam Staphylococcus aureus norfloksacyna cefoksytyna (oksacylina) wankomycyna gentamicyna * kryteria interpretacyjne wg. CLSI Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; sixteenth informational supplement. Vol 26 no. 3. M100-S16