Obsługa pipet automatycznych. 2,0 μl 10,0 μl 20,0 μl 20 μl 100 μl 200 μl

Transkrypt

1 Obsługa pipet automatycznych Pipeta 2-2 μl Pipeta 2-2 μl , μl 1, μl 2, μl 2 μl 1 μl 2 μl

2 Obsługa pipet automatycznych Pipeta 1-1 μl μl 55 μl 1 μl

3 W probówce A i B są plazmidy: jeden jest pusty, a drugi zawiera dodatkowy gen. Oba preparaty są w objętości 12 µl.

4 1. Pobrać 3 µl roztworu do nowej probówki i podpisać ją K1. 3

5 Bufor Woda 2. Dodać do reszty preparatu (A lub B) 3 µl buforu do enzymów restrykcyjnych i 2,5 µl wody destylowanej

6 3. Po dodaniu enzymów restrykcyjnych przez T.I., probówkę (A lub B) umieścić w 37 st. C.

7 Teraz zajmiemy się izolacją DNA z człowieka.

8 4. Pobrać 5 µl roztworu do nowej probówki i podpisać ją K2. 5

9 Woda NaAc Izo. 5. Dodać do reszty (A lub B) 5 µl wody destylowanej, 7 µl NaAc i 7 µl izopropanolu. Wstawić do zamrażarki.

10 6. Zwirować i pipetą usunąć nadsącz. 5

11 7. Zwirować i pipetą DOKŁADNIE usunąć nadsącz. 5

12 8. Osad rozpuścić w 17,5 µl wody destylowanej, dodać 2 µl buforu do ligazy. T.I. doda,5 µl ligazy. Zostawić w statywie

13 9. Koniec, czyli przygotowanie do A lub B Wyjściowa elektroforezy: Trawienie Wytrącenie i rozpuszczenie Ligowanie A lub B K1 K2

14 K1 K2 A lub B Próba 3 µl 5 µl 2 µl Woda 13 µl 11 µl - Barwnik 4 µl 4 µl 5 µl Suma 2 µl 2 µl 25 µl Na żel 2 µl 2 µl 2 µl

15 1. Pobrać komórki. Pocierać przez 3 min. wnętrze jamy ustnej.

16 2. Włożyć wacik do probówki i odciąć nożyczkami.

17 3. Dodać 35 μl roztworu nr 1. Wymieszać i poczekać 3 5 na prowadzącego (będzie dodany dodatkowy roztwór).

18 4. Wstawić do 56 st. C. i mieszać co 1 min. W sumie przez 3 min.

19 Teraz przygotujemy żel agarozowy, który będzie potrzebny po PCR.

20 Dodać do kolumienki 4 μl roztworu nr 2. 4 Kolumienkę podpisać i zostawić w statywie.

21 5. Dodać 35 μl roztworu nr Wymieszać i wstawić do 7 st. C. na 1 min.

22 6. Dodać 18 μl roztworu nr Wymieszać i zwirować w ciągu 2 min.

23 7. Przenieść 6 μl roztworu po zwirowaniu do kolumienki. 6 Zwirować w ciągu 1 min.

24 8. Wyjąć kolumienkę, wylać przesącz i włożyć kolumienkę do tej samej probówki.

25 9. Dodać do kolumienki 5 μl roztworu nr 5. 5 Zwirować w ciągu 1 min.

26 1. Wyjąć kolumienkę, wylać przesącz i włożyć kolumienkę do tej samej probówki.

27 11. Dodać do kolumienki 5 μl roztworu nr 6. 5 Zwirować w ciągu 2 min.

28 12. Wyjąć kolumienkę i włożyć ją do NOWEJ probówki. Wieczko odciąć. Probówkę podpisać.

29 13. Dodać do kolumienki 5 μl roztworu nr 7. 5 Wstawić do 7 st. C. na 5 min.

30 14. Zwirować w ciągu 2 min.

31 15. JEST DNA! Przenieść 4 μl do 4 bardzo małych probówek służących do PCR.

32 16. Resztę zrobi maszyna - termocykler.

33

34 Dodać 7 ul barwnika 7 Wymieszać 2 Na żel nanieść 2 ul.

35 Czym jest PCR? ATGGACTA TACCTGAT CCGGGGAATA GGCCCCTTAT

36 Czym jest PCR? ATGGACTA TACCTGAT ATGGACTA TACCTGAT CCGGGGAATA GGCCCCTTAT CCGGGGAATA GGCCCCTTAT

37 Czym jest PCR? ATGGACTA TACCTGAT ATGGACTA TACCTGAT CCGGGGAATA GGCCCCTTAT CCGGGGAATA GGCCCCTTAT ATGGACTA ATGGACTA TACCTGAT CCGGGGAATA GGCCCCTTAT GGCCCCTTAT

38 Czym jest PCR? ATGGACTA ATGGACTA TACCTGAT CCGGGGAATA GGCCCCTTAT GGCCCCTTAT

39 Czym jest PCR? ATGGACTA ATGGACTA TACCTGAT ATGGACTA CCGGGGAATA GGCCCCTTAT GGCCCCTTAT CCGGGGAATA TACCTGAT GGCCCCTTAT

40 Czym jest PCR? ATGGACTA ATGGACTA TACCTGAT ATGGACTA ATGGACTA TACCTGAT CCGGGGAATA GGCCCCTTAT GGCCCCTTAT CCGGGGAATA GGCCCCTTAT GGCCCCTTAT

41 Czym jest PCR? ATGGACTA ATGGACTA TACCTGAT ATGGACTA ATGGACTA TACCTGAT CCGGGGAATA GGCCCCTTAT GGCCCCTTAT CCGGGGAATA GGCCCCTTAT GGCCCCTTAT

42

43

44 Tandemowe powtórzenia GATC GATC GATC GATC GATC GATC GATC GATC GATC GATC GATC GATC GATC GATC GATC GATC GATC GATC

45 (GATC) x 6 (GATC) x 4 (GATC) x 6 (GATC) x 5

46 (GATC) x 6 (GATC) x 4 (GATC) x 6 (GATC) x 5? (GATC) x 6 (GATC) x 6 (GATC) x 6 (GATC) x 5 (GATC) x 4 5? (GATC) x 6 (GATC) x 4 (GATC) x

47 Tandemowe powtórzenia GATC GATC GATC GATC GATC GATC GATC GATC GATC GATC GATC GATC GATC GATC GATC GATC GATC GATC

48 Przypadek autentyczny Indianapolis, USA - lato 1998 r. W nocy kobieta została brutalnie pobita Broniąc się podrapała napastnika Niedaleko miejsca zbrodni znaleziono pijanego mężczyznę w zakrwawionych spodniach Mężczyzna został podejrzanym w sprawie pobicia

49 Tkanka spod paznokci O., czyli tkanka P. Tkanka O. Spodnie P. Krew O. P. O=Ofiara; P=Podejrzany

50 ATGGACTA TACCTGAT CCGGGGAATA GGCCCCTTAT ATGGACTA CCGGGGAATA TACCTGAT GGCCCCTTAT ATGGACTA ATGGACTA TACCTGAT CCGGGGAATA GGCCCCTTAT GGCCCCTTAT

51 Fwd i Rev Starter Fwd ma sekwencję w takiej samej orientacji, jak w bazie danych (lub sekwencja kodująca białko) Starter Rev ma sekwencję odwrotnie komplementarną Trzeba sobie napisać sekwencję komplementarną, która będzie w orientacji 3 -> 5 Potem odwrócić kolejność nukleotydów tak, żeby była zapisana w orientacji 5 -> 3

52 Spróbujmy!

53 Startery, które pozwolą namnożyć fragment od 1. do 759. nukleotydu 1: ATGTCGGATT CAAACCAAGG CAACAATCAG CAAAACTACC :4 731: AAGAAGTGGA TGACGAAGTT GTTAACGATA TGTTTGGTGG :77 Temperatura topnienia powinna wynosić ok. 5 Oblicza się wg wzoru: Temp.=2 (A+T)+4 (C+G)-4

54 Startery, które pozwolą namnożyć fragment od 1. do 759. nukleotydu 1: ATGTCGGATT CAAACCAAGG CAACAATCAG CAAAACTACC :4 Fwd, 19 nukleotydów: 5 ATGTCGGATTCAAACCAAG 3 731: AAGAAGTGGA TGACGAAGTT GTTAACGATA TGTTTGGTGG :77 Rev, 22 nukleotydów: 5 ATCGTTAACAACTTCGTCATC 3 Temperatura topnienia powinna wynosić ok. 5 Oblicza się wg wzoru: Temp.=2 (A+T)+4 (C+G)-4

55 Gadżet, który można dodać do startera

56 Gadżet, który można dodać do startera Overhang

57 T7 promoter primer # pet upstream primer # Bgl II T7 promoter lac operator Xba I rbs Nco I His Tag Nde I Nhe I T7 Tag Eag I BamH I EcoR I Sac I Sal I Hind III Not I Xho I thrombin His Tag Bpu112 I T7 terminator T7 terminator primer # pet-28a-c(+) cloning/expression region BamHI: GGATCC XhoI: CTCGAG Fwd, 5 GGATCCATGTCGGATTCAAACCAAG 3 Rev, 5 CTCGAGATCGTTAACAACTTCGTCATC 3

58 Dra III(5127) f1 origin ( ) Bpu112 I(8) Xho I(158) Not I(166) Eag I(166) Hind III(173) Sal I(179) Sac I(19) EcoR I(192) BamH I(198) Nhe I(231) Nde I(238) Nco I(296) Xba I(335) Bgl II(41) SgrA I(442) Sph I(598) Pvu I(4426) Sgf I(4426) Sma I(43) Cla I(4117) Nru I(483) Eco57 I(3772) Kan ( ) pet-28a(+) (5369bp) laci ( ) Mlu I(1123) Bcl I(1137) BstE II(134) Apa I(1334) BssH II(1534) EcoR V(1573) Hpa I(1629) AlwN I(364) BssS I(3397) ori (3286) PshA I(1968) BspLU11 I(3224) Sap I(318) Bst117 I(2995) Tth111 I(2969) Bgl I(2187) Fsp I(225) Psp5 II(223)

59 zbm bm.uw

60 Wyniki uczestników (gr.1)

61 Wyniki uczestników (gr.2)

62

63 1 razy!

64 PARTNERZY PROJEKTU 1.Zalać rozdrobnione truskawki roztworem (2% SDS, 5% NaCl), aby kawałki truskawek trochę wystawały ponad powierzchnię. 1 ml płynu do zmywania naczyń, 9 ml wody, 4 g NaCl 2.Wstawić do 6 na 1 min. IBSE - nauczanie przez badanie w przedmiotach przyrodniczych, Warszawa, 215

65 PARTNERZY PROJEKTU do 1 ml IBSE - nauczanie przez badanie w przedmiotach przyrodniczych, Warszawa, 215

66 PARTNERZY PROJEKTU Delikatnie po ściance!!! Cebula Alkohol co najmniej tyle samo IBSE - nauczanie przez badanie w przedmiotach przyrodniczych, Warszawa, 215

67 PARTNERZY PROJEKTU IBSE - nauczanie przez badanie w przedmiotach przyrodniczych, Warszawa, 215