Zestaw do izolacji DNA z żeli agarozowych. Nr kat. EM08 Wersja zestawu:

Transkrypt

1 Zestaw do izolacji DNA z żeli agarozowych Nr kat. EM08 Wersja zestawu:

2 2

3 Nr kat. EM08 I. PRZEZNACZENIE ZESTAWU Zestaw EXTRACTME DNA GEL OUT przeznaczony jest do szybkiej i wydajnej izolacji fragmentów DNA bezpośrednio z żeli agarozowych (ze standardowej lub niskotopliwej agarozy w buforze TAE lub TBE). Podczas procesu ekstrakcji usunięte zostają agaroza, bromek etydyny oraz inne zanieczyszczenia obecne w p r ó b c e. Z e s t a w u m o ż l i w i a o c z y s z c z a n i e f r a g m e n t ó w D N A o w i e l ko ś c i a c h od 50 pz do 30 kpz, a także genomowego i plazmidowego DNA. Izolacja cząsteczek DNA mniejszych od 100 pz oraz większych od 10 kpz zachodzi jednak z obniżoną wydajnością. Protokół izolacji i składy buforów zostały zoptymalizowane w celu osiągnięcia zarówno wysokiego odzysku, jak i czystości izolowanego DNA. Produkt przeznaczony jest wyłącznie do użytku w celach badawczych. II. SKŁAD I PRZECHOWYWANIE ZESTAWU LICZBA IZOLACJI 50 IZOLACJI 150 IZOLACJI 250 IZOLACJI 3 IZOLACJE (DEMO) Nr katalogowy EM EM EM EM08 D GB Buffer (Binding Buffer) 25 ml 75 ml 125 ml 1,5 ml GW Buffer (conc.) * (Wash Buffer) 15 ml 45 ml 75 ml 4,2 ml ** Elution Buffer 10 ml 3 x 10 ml 5 x 10 ml 0,6 ml DNA Purification Columns 50 szt. 3 x 50 szt. 5 x 50 szt. 3 szt. Collection Tubes (2 ml) 50 szt. 3 x 50 szt. 5 x 50 szt. 3 szt. ** Uwaga: w zestawie DEMO (EM08 D) GW Buffer zawiera już etanol. * Przed pierwszym użyciem do roztworu GW Buffer należy dodać odpowiednią ilość % etanolu (informacja na etykietach oraz w poniższej tabeli). Po dodaniu etanolu zalecane jest oznaczenie butelki. LICZBA IZOLACJI 50 IZOLACJI 150 IZOLACJI 250 IZOLACJI Nr katalogowy EM EM EM GW Buffer 15 ml 45 ml 75 ml Etanol % 60 ml 180 ml 300 ml Całkowita objętość 75 ml 225 ml 375 ml Wszystkie składniki zestawu należy przechowywać w temp. pokojowej (15 25 C). GB Buffer należy chronić przed dostępem światła. Wszystkie roztwory z zestawu należy przechowywać szczelnie zamknięte, aby uniknąć zmiany stężeń w wyniku parowania. Odpowiednio przechowywany zestaw zachowuje stabilność przez okres minimum 12 miesięcy. 3

4 III. WYMAGANE MATERIAŁY I SPRZĘT etanol % cz.d.a. czysty skalpel lub żyletka jałowe probówki wirownicze typu Eendorf (1,5 2 ml) pipety automatyczne oraz odpowiednie końcówki do pipet rękawiczki jednorazowe transiluminator mikrowirówka z rotorem na 1,5 2 ml probówki (> 11 tys. x g) termoblok lub łaźnia wodna (do 70 C) 3 M octan sodu, ph 5,2 (w nielicznych przypadkach) IV. ZASADA IZOLACJI Procedura oczyszczania DNA przeprowadzana jest z wykorzystaniem minikolumn wirowniczych, zawierających odpowiednie złoże wydajnie i selektywnie wiążące kwasy nukleinowe. W pierwszym etapie wycięty z żelu agarozowego bloczek, zawierający fragment DNA, inkubowany jest w buforze GB, który ułatwia rozpuszczanie agarozy oraz powoduje denaturację białek. Dodatkowo bufor ten zawiera barwnik, który umożliwia kontrolowanie ph roztworu odpowiedniego dla efektywnego wiązania DNA do złoża w minikolumnie. Dwuetapowe przemywanie DNA związanego do złoża ma na celu usunięcie pozostałych zanieczyszczeń i/lub inhibitorów reakcji enzymatycznych. Oczyszczone DNA eluowane jest ze złoża buforem o niskiej sile jonowej (Elution Buffer) lub wodą (ph 7,0 9,0) i gotowe jest do bezpośredniego wykorzystania w technikach biologii molekularnej (takich jak PCR, qpcr, Southern blotting, sekwencjonowanie, ligacja DNA, trawienie enzymami restrykcyjnymi itp.) lub może być przechowywane do późniejszego użycia. V. KONTROLA JAKOŚCI Każda partia produkcyjna (LOT) zestawu EXTRACTME DNA GEL OUT testowana jest według opracowanych procedur. Wydajność, czystość oraz stabilność wyizolowanego DNA analizowane są metodami spektrofotometrycznymi oraz elektroforetycznymi. Dodatkowo funkcjonalna jakość oczyszczonego DNA sprawdzana jest w reakcji PCR, qpcr oraz reakcji trawienia enzymami restrykcyjnymi. 4

5 Nr kat. EM08 VI. SPECYFIKACJA PRODUKTU MATERIAŁ WYJŚCIOWY Bloczek agarozowy o masie do 300 mg ODZYSK 70 95% w zależności od wielkości fragmentu DNA (w zakresie pz) WIELKOŚĆ IZOLOWANYCH FRAGMENTÓW DNA pz Możliwa jest również izolacja fragmentów DNA w zakresach pz i kpz, a także genomowego i plazmidowego DNA, lecz z obniżoną wydajnością. POJEMNOŚĆ ZŁOŻA ok. 25 µg DNA CZAS IZOLACJI minut CZYSTOŚĆ DNA A 260 /A 280 = 1,7 1,9 VII. ŚRODKI OSTROŻNOŚCI W przypadku, gdy do wizualizacji wyników elektroforezy używany jest bromek etydyny lub inne związki chemiczne interkalujące w DNA, należy używać ochronnej odzieży laboratoryjnej oraz jednorazowych rękawiczek nitrylowych. Podczas operacji wycinania DNA z żelu należy zachować środki ostrożności w postępowaniu z promieniowaniem UV (odzież ochronna, okulary, rękawiczki nitrylowe). Należy unikać dotykania ścianek minikolumn pipetą, aby nie przenosić śladowych ilości DNA pomiędzy kolejnymi minikolumnami. Odpady zawierające sole guanidyny mogą tworzyć wysoce reaktywne związki w połączeniu z substancjami utleniającymi. W przypadku rozlania buforu, powierzchnię zmyć wodą z detergentem. 5

6 VIII. SZCZEGÓLNE ZALECENIA I UWAGI Elucja DNA ze złoża Optymalną objętość buforu elucyjnego (Elution Buffer) należy dobrać w zależności od ilości materiału użytego do izolacji oraz od wymaganego poziomu stężenia DNA w eluacie. Zaleca się stosowanie μl Elution Buffer. Jeśli pożądane jest otrzymanie DNA o wysokim stężeniu, objętość buforu elucyjnego można zmniejszyć do 20 μl. Należy mieć jednak na uwadze, że może to obniżyć wydajność odzysku DNA. Istotne w tym przypadku jest dodanie buforu elucyjnego centralnie na powierzchnię złoża. W celu uzyskania maksymalnej wydajności elucji DNA, bufor elucyjny należy podgrzać do temp. 80 C i wydłużyć czas inkubacji złoża z buforem do 10 minut. Jeśli istotne jest odzyskanie całkowitego DNA z minikolumny można przeprowadzić dodatkową elucję (200 μl). W tym przypadku należy powtórzyć pkt Protokołu izolacji DNA (sekcja XI), umieszczając minikolumnę w nowej probówce 1,5 ml typu Eendorf. Elution Buffer nie zawiera EDTA, którego obecność może niekorzystnie wpływać na niektóre reakcje enzymatyczne. Kontrolowanie poziomu ph GB Buffer zawiera wskaźnik ph, pozwalający na sprawdzenie czy ph mieszaniny j e s t m n i e j s z e n i ż 7, 5 ( k o l o r ż ó ł t y ), c o g w a r a n t u j e w y d a j n ą a d s o r p c j ę D N A d o z ł o ż a m i n i k o l u m n y. G d y p H j e s t w y ż s z e n i ż 7, 5, r o z t w ó r z m i e n i b a r w ę na różową. Może się tak zdarzyć w nielicznych przypadkach, np. gdy stosowany bufor elektroforetyczny był wielokrotnie używany lub błędnie przygotowany. Konieczne jest wtedy dodanie 10 µl 3 M octanu sodu (ph 5,2), który obniżając ph próbki zapewni wydajne wiązanie DNA do złoża. Wzrost ph powyżej wartości 7,5 powoduje diametralny spadek adsorpcji DNA do złoża w minikolumnie. IX. PRZYGOTOWANIE PRÓBKI 1. Prowadzić elektroforezę w żelu przygotowanym z agarozy niskotopliwej l u b o s t a n d a r d o w e j t e m p e r a t u r z e t o p n i e n i a, w b u f o r z e TA E l u b T B E, do momentu wystarczającego rozdzielenia fragmentów DNA. Nie zaleca się stosować zbyt wysokiego napięcia podczas rozdziału elektroforetycznego, gdyż może to spowodować wzrost temperatury buforu elektroforetycznego i doprowadzić do degradacji DNA. Należy używać świeżo przygotowanego buforu, zarówno do przeprowadzenia elektroforezy, jak i przygotowania żelu. 2. Zważyć probówkę 1,5 2 ml typu Eendorf. 6

7 Nr kat. EM08 3. Przy pomocy czystego i ostrego skalpela lub żyletki wyciąć prążek DNA w taki sposób, aby pozbyć się nadmiaru agarozy (całkowita masa wyciętego bloczka agarozy nie powinna przekraczać 300 mg). Skalpel oraz powierzchnia t r a n s i l u m i n a t o r a p o w i n n y b y ć u p r z e d n i o o c z y s z c z o n e n p. p r z y p o m o c y 5% roztworu H 2 O 2. Operację wycinania prążka DNA należy wykonać możliwie szybko, aby zminimalizować oddziaływanie promieniowania UV na izolowane DNA. Jest to szczególnie istotne, gdy wyizolowane DNA będzie bezpośrednio wykorzystywane w reakcjach sekwencjonowania i/lub klonowania. 4. Przenieść wycięty bloczek agarozowy do probówki 1,5 2 ml, a następnie zważyć. Jeśli masa bloczka agarozowego przekracza 300 mg należy podzielić bloczek na mniejsze fragmenty i przenieść do kolejnych probówek 1,5 2 ml. 5. Przed oczyszczaniem fragment agarozy zawierający DNA może być przechowywany w temp. +4 C lub -20 C nie dłużej niż tydzień, w szczelnie zamkniętej probówce, w warunkach wolnych od deoksyrybonukleaz (DNaz). X. PRZED PRZYSTĄPIENIEM DO IZOLACJI 1. Każdy z odczynników zestawu należy wymieszać. 2. Należy upewnić się czy do GW Buffer został dodany etanol. Jeśli nie, należy dodać odpowiednią ilość % etanolu (ilości podane są na etykietach oraz w tabeli w sekcji II). 3. W przypadku wytrącenia osadu w buforach GB lub GW, butelkę z roztworem należy ogrzać do temp. 37 C (GW Buffer) lub C (pozostałe bufory) i inkubować, aż do całkowitego rozpuszczenia osadu, mieszając co kilka minut, a następnie schłodzić do temp. pokojowej. 4. Nagrzać termoblok lub łaźnię wodną do temp. 50 C. 5. Ogrzać odpowiednią ilość buforu elucyjnego do temp. 70 C. 6. Należy pamiętać, aby wszystkie etapy izolacji przeprowadzać w temp. pokojowej, jeśli nie zalecono inaczej. 7. Wszystkie etapy wirowania zostały zoptymalizowane z wykorzystaniem mikrowirówki Eendorf 5417C. Prędkości wirowania podane w jednostkach rpm odnoszą się do tej mikrowirówki. 7

8 XI. PROTOKÓŁ IZOLACJI 1. Wyciąć z żelu bloczek agarozowy zawierający DNA, a następnie umieścić w probówce 1,5 2 ml typu Eendorf. M a s a b l o c z k a a g a r o z o w e g o n i e p o w i n n a p r z e k r a c z a ć m g. Więcej wskazówek znajduje się w sekcji IX. Przygotowanie próbki. 2. Dodać 500 µl GB Buffer i wymieszać poprzez kilkukrotne odwracanie probówki. 3. Inkubować mieszaninę w temp. 50 C przez 5 10 min lub do momentu całkowitego rozpuszczenia agarozy. Podczas inkubacji kilka razy mieszać próbkę poprzez kilkukrotne odwracanie probówki. Przed przystąpieniem do dalszych czynności należy upewnić się, że agaroza została całkowicie rozpuszczona. Kolor mieszaniny powinien być żółty. Jeżeli po rozpuszczeniu agarozy roztwór zmienił barwę na różową, należy dodać 10 µl 3 M roztworu octanu sodu o ph 5,2 i wymieszać (patrz sekcja VIII. Szczególne zalecenia i uwagi). 4. Krótko odwirować próbkę w celu odzyskania resztek roztworu z wieczka probówki, a następnie przenieść maksymalnie 800 µl mieszaniny na złoże minikolumny umieszczonej w probówce odbierającej i wirować 1 min przy tys. rpm (11 15 tys. x g). Jeżeli mieszanina ma większą objętość niż 800 µl, po odwirowaniu wylać przesącz z probówki odbierającej, umieścić w niej z powrotem minikolumnę i nanieść pozostałą część mieszaniny na złoże. 5. Przenieść minikolumnę do nowej probówki odbierającej (2 ml). 8

9 Nr kat. EM08 6. Dodać do minikolumny 700 μl GW Buffer i wirować 30 s przy tys. rpm (11 15 tys. x g). 7. Wylać przesącz z probówki odbierającej i umieścić w niej z powrotem minikolumnę. 8. Powtórzyć etapy Wirować 1-2 min przy tys. rpm (15 21 tys. x g). Bufor płuczący zawiera alkohol, który może powodować inhibicję niektórych reakcji enzymatycznych, a także obniżenie wydajności elucji, dlatego istotne jest jego całkowite usunięcie przed etapem elucji. 10. Ostrożnie wyjąć suchą minikolumnę z probówki odbierającej i umieścić ją w jałowej probówce 1,5 ml typu Eendorf. 11. Nanieść μl Elution Buffer uprzednio ogrzanego do temp. 70 C centralnie na złoże w minikolumnie. Możliwa jest zmiana objętości buforu elucyjnego w zakresie µl. Więcej wskazówek do tego etapu znajduje się w sekcji VIII. Szczególne zalecenia i uwagi. 12. Inkubować minikolumnę z buforem elucyjnym przez 2 min. 13. Wirować 1 min przy tys. rpm (11 15 tys. x g). 14. Minikolumnę usunąć, a wyizolowane DNA przechowywać w temp. +4 C lub -20 C do czasu dalszych analiz. 9

10 XII. MOŻLIWE PROBLEMY I ICH ROZWIĄZYWANIE Problem Niska wydajność izolacji DNA. Zatkane złoże kolumny. Inhibicja enzymatycznej obróbki wyizolowanego DNA. Prawdopodobna przyczyna Niecałkowicie rozpuszczony bloczek agarozowy. Nieefektywne wiązanie DNA do złoża. Niedodany etanol do buforu płuczącego. Niecałkowita elucja DNA. Niewłaściwe ph buforu elucyjnego lub wody (ph <7,0). Niecałkowicie rozpuszczony bloczek agarozowy. Obecność soli w próbce. Obecność agarozy w próbce. Obecność etanolu w próbce. Rozwiązanie Wydłużyć czas inkubacji w temp. 50 C do momentu rozpuszczenia agarozy. Po rozpuszczeniu agarozy, dla pewności przedłużyć inkubację o dodatkowe 5 minut. Upewnić się, że po rozpuszczeniu agarozy mieszanina posiada żółte zabarwienie. W przypadku zmiany barwy na różową, należy dodać 10 µl 3 M octanu sodu o ph 5,2. Upewnić się, że % etanol został dodany w odpowiedniej ilości do GW Buffer. Przed naniesieniem na złoże podgrzać Elution Buffer do temp. 80 C. Nanieść Elution Buffer centralnie na powierzchnię złoża. Wydłużyć czas inkubacji z Elution Buffer do 10 minut. Przeprowadzić powtórną elucję. Zwiększyć objętość Elution Buffer do 200 μl. Do elucji użyć Elution Buffer. Wydłużyć czas inkubacji w temp. 50 C do momentu rozpuszczenia agarozy. Po rozpuszczeniu agarozy, dla pewności przedłużyć inkubację próbki o dodatkowe 5 minut. Wszystkie etapy wirowania przeprowadzać w temp. pokojowej. Upewnić się, że w GW Buffer nie wytrącił się osad. Wydłużyć czas inkubacji w temp. 50 C do momentu rozpuszczenia agarozy. Dla pewności przedłużyć inkubację próbki o dodatkowe 5 minut. Po każdym etapie płukania usuwać przesącz z probówki odbierającej. Upewnić się, że po etapie wirowania (pkt. 9 Protokołu izolacji) nie pozostały w minikolumnie resztki buforu płuczącego, w przeciwnym wypadku należy powtórzyć wirowanie. Błędne wyniki sekwencjonowania DNA. Zbyt długa ekspozycja próbki na promienie UV. Zanieczyszczony bufor do elektroforezy. Zanieczyszczony sprzęt. Skrócić czas operacji związanych z wycinaniem DNA z żelu. Używać świeżo przygotowanego buforu, zarówno do prowadzenia elektroforezy, jak i przygotowania żelu. Oczyścić skalpel i powierzchnię transiluminatora przed wycinaniem bloczka agarozowego. 10

11 Nr kat. EM08 Nieostre prążki w obrazie elektroforetycznym. DNA wypływa ze studzienek w żelu agarozowym. Obecność nukleaz w buforze do elektroforezy. Obecność nukleaz w buforze elucyjnym. Obecność etanolu w próbce. Używać świeżego, wolnego od DNaz buforu do prowadzenia elektroforezy oraz przygotowania żelu agarozowego. Przechowywać żel agarozowy w temp. +4 C w warunkach wolnych od DNaz nie dłużej niż kilka dni. Wymienić zanieczyszczony bufor elucyjny na nowy. Gdy do elucji zamiast Elution Buffer używa się wody, upewnić się, że jest ona wolna od DNaz. Po każdym etapie płukania usuwać przesącz z probówki odbierającej. Upewnić się, że po etapie wirowania (pkt. 9 Protokołu izolacji) nie pozostały w minikolumnie resztki buforu płuczącego, w przeciwnym wypadku należy powtórzyć wirowanie. XIII. BEZPIECZEŃSTWO I POSTĘPOWANIE Z PRODUKTEM GB BUFFER Niebezpieczeństwo H302, H312, H315, H319, H331, H335, P261, P273, P280, P405, P305+P351+P338, P302+P352 H302 Działa szkodliwie po połknięciu. H312 Działa szkodliwie w kontakcie ze skórą. H315 Działa drażniąco na skórę. H319 Działa drażniąco na oczy. H331 Działa toksycznie w następstwie wdychania. H335 Może powodować podrażnienie dróg oddechowych. P261 Unikać wdychania pyłu/ dymu/ gazu/ mgły/ par/ rozpylonej cieczy. P273 Unikać uwolnienia do środowiska. P280 Stosować rękawice ochronne/ odzież ochronną. P405 Przechowywać pod zamknięciem. P305 + P351 + P338 W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ DO OCZU: Ostrożnie płukać wodą przez kilka minut. Wyjąć soczewki kontaktowe, jeżeli są i można je łatwo usunąć. Nadal płukać. P302 + P352 W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ NA SKÓRĘ: Umyć dużą ilością wody z mydłem. 11

12