Zestaw do oczyszczania DNA po reakcjach enzymatycznych

Transkrypt

1 Nr kat. EM07 Wersja zestawu: Zestaw do oczyszczania DNA po reakcjach enzymatycznych EXTRACTME jest zastrzeżonym znakiem towarowym firmy BLIRT S.A.

2

3 Nr kat. EM07 I. PRZEZNACZENIE ZESTAWU Zestaw EXTRACTME DNA CLEAN-UP przeznaczony jest do szybkiego i wydajnego oczyszczania fragmentów DNA po reakcjach enzymatycznych. Oczyszczone DNA wolne jest od nukleaz, inhibitorów enzymów, detergentów, polimeraz, enzymów restrykcyjnych, kationów dwuwartościowych, soli itp., gwarantując wysoką użyteczność w technikach biologii molekularnej. Zestaw umożliwia oczyszczanie fragmentów DNA o wielkościach od 50 pz do pz, a także g enomoweg o i pl a zmidoweg o D N A. Ek s t rakc ja c z ąs tec zek D N A mniejsz ych od 10 0 pz oraz większych od pz zachodzi jednak z obniżoną wydajnością. Protokół izolacji i składy buforów zostały zoptymalizowane w celu osiągnięcia zarówno wysokiego odzysku, jak i czystości oczyszczanego DNA. Produkt przeznaczony jest wyłącznie do użytku w celach badawczych. II. SKŁAD I PRZECHOWYWANIE ZESTAWU LICZBA IZOLACJI 50 IZOLACJI 150 IZOLACJI 250 IZOLACJI 3 IZOLACJE (DEMO) Nr katalogowy EM EM EM EM07-D CB Buffer (Binding Buffer) 25 ml 75 ml 125 ml 1,5 ml CW Buffer (conc.)* (Wash Buffer) 11 ml 33 ml 55 ml 3 ml** Elution Buffer 10 ml 3 x 10 ml 5 x 10 ml 0,6 ml DNA Purification Columns 50 szt. 3 x 50 szt. 5 x 50 szt. 3 szt. Collection Tubes (2 ml) 50 szt. 3 x 50 szt. 5 x 50 szt. 3 szt. **Uwaga: w zestawie DEMO (EM07-D) CW Buffer zawiera już etanol. * Przed pierwszym użyciem do roztworu CW Buffer n a l e ż y d o d a ć o d p o w i e d n i ą i l o ś ć % etanolu (informacja na etykietach oraz w poniższej tabeli). Po dodaniu etanolu zalecane jest oznaczenie butelki. LICZBA IZOLACJI 50 IZOLACJI 150 IZOLACJI 250 IZOLACJI Nr katalogowy EM EM EM CW Buffer 11 ml 33 ml 55 ml Etanol % 44 ml 132 ml 220 ml Całkowita objętość 55 ml 165 ml 275 ml 3

4 Wszystkie składniki zestawu należy przechowywać w temp. pokojowej (15 25 C). Wszystkie roztwory z zestawu należy przechowywać szczelnie zamknięte, aby uniknąć zmiany stężeń w wyniku parowania. Odpowiednio przechowywany zestaw zachowuje stabilność przez okres minimum 12 miesięcy. III. WYMAGANE MATERIAŁY I SPRZĘT etanol % cz.d.a. jałowe próbówki wirownicze typu Eendorf (1,5 2 ml) pipety automatyczne oraz odpowiednie końcówki do pipet rękawiczki jednorazowe mikrowirówka z rotorem na probówki o poj. 1,5 2 ml (> 11 tys. x g) termoblok lub łaźnia wodna (do 70 C) 3 M octan sodu, ph 5,2 (w nielicznych przypadkach) IV. ZASADA IZOLACJI Procedura oczyszczania DNA przeprowadzana jest z wykorzystaniem minikolumn wirowniczych, zawierających odpowiednie złoże krzemionkowe wydajnie i selektywnie wiążące kwasy nukleinowe. W pierwszym etapie do p r ó b k i D N A d o d a w a n y j e s t C B B u ff e r, k t ó r y p o w o d u j e d e n a t u r a c j ę b i a ł e k oraz umożliwia efektywne wiązanie DNA do złoża w minikolumnie. Dodatkowo bufor ten zawiera barwnik, który pozwala na kontrolowanie ph roztworu odpowiedniego dla efektywnego wiązania DNA do złoża. Dwuetapowe przemywanie DNA związanego do złoża ma na celu usunięcie pozostałych zanieczyszczeń i/lub inhibitorów reakcji enzymatycznych. Oczyszczone DNA eluowane jest ze złoża buforem o niskiej sile jonowej (Elution Buffer) lub wodą (ph 7,0 9,0) i gotowe jest do bezpośredniego wykorzystania w technikach biologii molekularnej (takich jak PCR, qpcr, Southern blotting, sekwencjonowanie, ligacja DNA, trawienie enzymami restrykcyjnymi itp.) lub może być przechowywane do późniejszego użycia. V. KONTROLA JAKOŚCI Każda partia produkcyjna (LOT) zestawu EXTRACTME DNA CLEAN-UP testowana jest według opracowanych procedur. Wydajność, czystość oraz stabilność wyizolowanego DNA analizowane są metodami spektrofotometrycznymi 4

5 Nr kat. EM07 oraz elektroforetycznymi. Dodatkowo funkcjonalna jakość oczyszczonego DNA sprawdzana jest w reakcji PCR, qpcr oraz reakcji trawienia enzymami restrykcyjnymi. VI. SPECYFIKACJA PRODUKTU MATERIAŁ WYJŚCIOWY Próbka DNA o objętości do 100 µl ODZYSK 90 99% w zależności od wielkości fragmentu DNA (w zakresie pz) WIELKOŚĆ IZOLOWANYCH FRAGMENTÓW DNA pz Możliwe jest również oczyszczanie fragmentów DNA w zakresach pz i kpz, a także genomowego i plazmidowego DNA, lecz z obniżoną wydajnością. POJEMNOŚĆ ZŁOŻA ok. 25 µg DNA CZAS IZOLACJI 5 10 minut CZYSTOŚĆ DNA A 260/A280 = 1,7 1,9 VII. ŚRODKI OSTROŻNOŚCI Należy unikać dotykania ścianek minikolumn pipetą, aby nie przenosić śladowych ilości DNA pomiędzy kolejnymi minikolumnami. Zalecane jest używanie jałowych końcówek z filtrami do pipet. Odpady zawierające sole guanidyny mogą tworzyć wysoce reaktywne związki w połączeniu z substancjami utleniającymi. W przypadku rozlania buforu, powierzchnię zmyć wodą z detergentem. 5

6 VIII. SZCZEGÓLNE ZALECENIA I UWAGI Elucja DNA ze złoża Optymalną objętość buforu elucyjnego (Elution Buffer) należy dobrać w zależności od ilości DNA zawartego w próbce oraz od wymaganego poziomu stężenia DNA w eluacie. Zaleca się stosowanie μl Elution Buffer. Jeśli pożądane jest otrzymanie DNA o wysokim stężeniu, objętość buforu elucyjnego można zmniejszyć do 20 μl. Należy mieć jednak na uwadze, że może to obniżyć wydajność odzysku DNA. Istotne w tym przypadku jest dodanie buforu elucyjnego centralnie na powierzchnię złoża. W celu uzyskania maksymalnej wydajności elucji DNA, bufor elucyjny należy podgrzać do temp. 80 C i wydłużyć czas inkubacji złoża z buforem do 10 minut. Jeśli istotne jest odzyskanie całkowitego DNA z minikolumny można przeprowadzić dodatkową elucję (200 μl). W tym przypadku należy powtórzyć pkt Protokołu izolacji DNA (sekcja XI), umieszczając minikolumnę w nowej probówce 1,5 ml typu Eendorf. Elution Buffer nie zawiera EDTA, którego obecność może przeszkadzać w niektórych reakcjach enzymatycznych. Kontrolowanie poziomu ph CB Buffer zawiera wskaźnik ph, pozwalający na sprawdzenie, czy ph mieszaniny j e s t m n i e j s z e n i ż 7, 5 ( k o l o r ż ó ł t y ), c o g w a r a n t u j e w y d a j n ą a d s o r p c j ę D N A d o z ł o ż a m i n i k o l u m n y. G d y p H j e s t w y ż s z e n i ż 7, 5, r o z t w ó r z m i e n i b a r w ę na różową. Może się tak zdarzyć w nielicznych przypadkach, np. gdy wartość ph próbki DNA bardzo odbiega od standardowych warunków wykorzystywanych przy operacjach z DNA (ph >9,0). Konieczne jest wtedy dodanie 10 µl 3 M octanu sodu (ph 5,2), który obniżając ph próbki zapewni wydajne wiązanie DNA do złoża. Wzrost ph CB Buffer powyżej wartości 7,5 powoduje diametralny spadek adsorpcji DNA do złoża w minikolumnie. 6

7 Nr kat. EM07 IX. PRZYGOTOWANIE PRÓBKI Przenieść odpowiednią objętość próbki DNA (nie więcej niż 100 µl) do jałowej probówki 1,5 2ml typu Eendorf. Próbki DNA przed oczyszczaniem można przechowywać w warunkach wolnych od deoksyrybonukleaz (DNaz) w temp. +4 C przez krótki okres czasu, lub w postaci zamrożonej (preferowana temp. -80 C) przez dłuższy okres czasu. Należy unikać częstego rozmrażania i zamrażania próbek DNA. X. PRZED PRZYSTĄPIENIEM DO IZOLACJI 1. Każdy z odczynników zestawu należy wymieszać. 2. Należy upewnić się, czy do CW Buffer został dodany etanol. Jeśli nie, należy dodać odpowiednią ilość % etanolu (ilości podane są na etykietach oraz w tabeli w sekcji II). 3. W przypadku wytrącenia osadu w buforach, butelkę z roztworem należy ogrzać do temp. 37 C (CW Buffer) lub temp C (pozostałe bufory) i inkubować, aż do całkowitego rozpuszczenia osadu, mieszając co kilka minut, a następnie schłodzić do temp. pokojowej. 4. Ogrzać odpowiednią ilość buforu elucyjnego do temp. 70 C. 5. Należy pamiętać, aby wszystkie etapy izolacji przeprowadzać w temp. pokojowej. 6. Wszystkie etapy wirowania zostały zoptymalizowane z wykorzystaniem mikrowirówki Eendorf 5417C. Prędkości wirowania podane w jednostkach rpm odnoszą się do tej mikrowirówki. 7

8 1. XI. PROTOKÓŁ IZOLACJI 1. Do 1 obj. próbki DNA dodać 5 obj. CB Buffer (n p. d o 5 0 µ l mieszaniny po reakcji PCR dodać 250 µl CB Buffer), worteksować 3 s. Sposób przygotowania próbki opisano w sekcji IX. Przygotowanie próbki. Kolor mieszaniny powinien być żółty. Jeżeli roztwór zmienił barwę na purpurową, należy dodać 10 µl 3 M roztworu octanu sodu o ph 5,2 i wymieszać (patrz sekcja VIII. Szczególne zalecenia i uwagi). 2. Krótko odwirować próbkę w celu odzyskania resztek roztworu z wieczka probówki, a następnie przenieść całą objętość mieszaniny na złoże minikolumny umieszczonej w probówce odbierającej i wirować 1 min przy tys. rpm (11 15 tys. x g). 3. Przenieść minikolumnę do nowej probówki odbierającej (2 ml). 4. Dodać do minikolumny 600 μl CW Buffer i wirować 30 s przy tys. rpm (11 15 tys. x g). 5. Wylać przesącz z probówki odbierającej i umieścić w niej z powrotem minikolumnę. 6. Dodać do minikolumny 400 μl CW Buffer i wirować 30 s przy tys. rpm (11 15 tys. x g). 7. Wylać przesącz z probówki odbierającej i umieścić w niej z powrotem minikolumnę. 8

9 Nr kat. EM07 8. Wirować 1-2 min przy tys. rpm (15 21 tys. x g). Bufor płuczący zawiera alkohol, który może powodować inhibicję niektórych reakcji enzymatycznych, a także obniżenie wydajności elucji, dlatego istotne jest jego całkowite usunięcie przed etapem elucji. 9. Ostrożnie wyjąć suchą minikolumnę z probówki odbierającej i umieścić ją w jałowej probówce 1,5 ml typu Eendorf. 10. Nanieść μl Elution Buffer uprzednio ogrzanego do temp. 70 C centralnie na złoże w minikolumnie. Możliwa jest zmiana objętości buforu elucyjnego w zakresie µl. Więcej wskazówek do tego etapu znajduje się w sekcji VIII. Szczególne zalecenia i uwagi. 11. Inkubować minikolumnę z buforem elucyjnym przez 2 min. 12. Wirować 1 min przy tys. rpm (11 15 tys. x g). 13. Minikolumnę usunąć, a wyizolowane DNA przechowywać w temp. +4 C lub -20 C do czasu dalszych analiz. 9

10 XII. MOŻLIWE PROBLEMY I ICH ROZWIĄZYWANIE Problem Niska wydajność izolacji DNA. Inhibicja enzymatycznej obróbki wyizolowanego DNA. Nieostre prążki w obrazie elektroforetycznym. DNA wypływa ze studzienek w żelu agarozowym. Prawdopodobna przyczyna Nieefektywne wiązanie DNA do złoża. Niedodany etanol do buforu płuczącego. Niecałkowita elucja DNA. Niewłaściwe ph buforu elucyjnego lub wody (ph <7,0). Obecność etanolu w próbce. Obecność soli w próbce. Obecność nukleaz w buforze elucyjnym. Obecność etanolu w próbce. Rozwiązanie Upewnić się, że po dodaniu CB Buffer mieszanina posiada żółte zabarwienie. W przypadku zmiany barwy na różową, należy dodać 10 µl 3 M octanu sodu o ph 5,2. Upewnić się, że % etanol został dodany w odpowiedniej ilości do CW Buffer. Przed naniesieniem na złoże podgrzać Elution Buffer do temp. 80 C. Nanieść Elution Buffer centralnie na powierzchnię złoża. Wydłużyć czas inkubacji z Elution Buffer do 10 minut. Przeprowadzić powtórną elucję. Zwiększyć objętość Elution Buffer do 200 μl. Do elucji użyć Elution Buffer. Po każdym etapie płukania usuwać przesącz z probówki odbierającej. Upewnić się, że po etapie wirowania (pkt. 9 Protokołu izolacji) nie pozostały w minikolumnie resztki buforu płuczącego, w przeciwnym wypadku należy powtórzyć wirowanie. Wszystkie etapy wirowania przeprowadzać w temp. pokojowej. Upewnić się, że w CW Buffer nie wytrącił się osad. Wymienić zanieczyszczony bufor elucyjny na nowy. Gdy do elucji zamiast Elution Buffer używa się wody, upewnić się, że jest ona wolna od DNaz. Po każdym etapie płukania usuwać przesącz z probówki odbierającej. Upewnić się, że po etapie wirowania (pkt. 9 Protokołu izolacji) nie pozostały w minikolumnie resztki buforu płuczącego, w przeciwnym wypadku należy powtórzyć wirowanie. 10

11 Nr kat. EM07 XIII. BEZPIECZEŃSTWO I POSTĘPOWANIE Z PRODUKTEM CB BUFFER Niebezpieczeństwo H225, H302, H315, H319, H335, H336, P210, P261, P305+P351+P338 H225 Wysoce łatwopalna ciecz i pary. H302 Działa szkodliwie po połknięciu. H315 Działa drażniąco na skórę. H319 Działa drażniąco na oczy. H335 Może powodować podrażnienie dróg oddechowych. H336 Może wywoływać uczucie senności lub zawroty głowy. P210 Przechowywać z dala od źródeł ciepła/ iskrzenia/otwartego ognia/gorących powierzchni. Palenie wzbronione. P261 Unikać wdychania pyłu/ dymu/ gazu/ mgły/ par/ rozpylonej cieczy.. P305 + P351 + P338 W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ DO OCZU: Ostrożnie płukać wodą przez kilka minut. Wyjąć soczewki kontaktowe, jeżeli są i można je łatwo usunąć. Nadal płukać. 11

12