Inżynieria Genetyczna ćw. 1
|
|
- Weronika Kurowska
- 7 lat temu
- Przeglądów:
Transkrypt
1 Materiały do ćwiczeń z przedmiotu Genetyka z inżynierią genetyczną D - blok Inżynieria Genetyczna ćw. 1 Instytut Genetyki i Biotechnologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski, rok akad. 2015/2016 Prosimy o nierozpowszechnianie materiałów bez naszej zgody
2 Analiza funkcjonalna białka Pet127p z S. cerevisiae Instytut Genetyki i Biotechnologii UW, 2016 Pet127p to mitochondrialne białko kodowane jądrowo, odpowiedzialne za dojrzewanie transkryptów mitochondrialnych W danych literaturowych figuruje jako potencjalna egzorybonukleaza, degradująca mitochondrialne RNA w kierunku 5' 3' Brak białka Pet127 (delacja genu PET127) zaburza metabolizm RNA w mitochondriach, co objawia się upośledzeniem procesu oddychania tlenowego w komórkach drożdży w temp. 37 C Oddychanie tlenowe możliwość wzrostu na niefermentowalnym źródle węgla (np. glicerolu) Oddychanie beztlenowe fermentacja w cytoplazmie (np. glukozy) Analiza funkcjonalna poprzez ukierunkowaną mutagenezę i kontrolę fenotypów oddychania (testy wzrostowe na podłożach z fermentowalnym lub nie fermentowalnym źródle węgla)
3 Schemat mutagenezy Pet127p Instytut Genetyki i Biotechnologii UW, PCR z wykorzystaniem oligonukleotydowych starterów, zawierających zmianę nukleotydu w miejscu wprowadzanej mutacji, na matrycy plazmidowego DNA (wektora bifunkcjonalnego, bakteryjno-drożdżowego, ze sklonowanym genem PET127) 2. Usunięcie metylowanej matrycy - trawienie matrycy enzymem restrykcyjnym Dpn1 po reakcji PCR 3. Transformacja bakterii E. coli 4. Izolacja DNA plazmidowego z wielu klonów 5. Analiza sekwencji poszczególnych plazmidów poszukiwanie pozytywnych klonów 6. Transformacja drożdży plazmidami zawierającymi zmutowane sekwencje genu PET Analiza fenotypów kroplowe testy wzrostowe na podłożach z glukozą lub glicerolem w temp. 30 C lub 37 C 8. Kontrola genotypów: sekwencjonowanie plazmidów użytych do transformacji (kontrola mutagenezy) i test PCR na obecność wektora i kasety delecyjnej w otrzymanych szczepach (kontrola molekularna mutantów)
4 Ćwiczenie praktyczne 1 Mutageneza: Podmiana kodonów reszt aminokwasowych w potencjalnej domenie egzorybonukleolitycznej Pet127p Matryca do mutagenezy bifunkcjonalny wektor drożdzowobakteryjny ze sklonowanym genem PET127 (pycplac33::pet127-8,6 kb) Wg zmodyfikowanego protokołu Stratagene QuickChange Site-Directed Mutagenesis, z zastosowaniem polimerazy Phusion
5 Ćwiczenie praktyczne 1 wykonanie 1. Przygotowanie reakcji PCR. Do 45,0 µl mieszaniny reakcyjnej zawierającej 1x bufor, polimerazę Phusion, dntp oraz matrycę DNA (pycplac33::pet127) dodać po 5,0 µl każdego z 2 starterów do mutagenezy (w stężeniu 100 ng/µl). 2. Reakcję prowadzić w termocyklerze wg programu: 98 C, 30 sek (98 C, 30 sek; 55 C, 1 min; 72 C, 2 min 15 sek) x12, 4 C,. 3. Trawienie matrycy. Po skończeniu reakcji PCR dodać 2,0 µl enzymu restrykcyjnego DpnI. Inkubować w 37 C, 15 min. a następnie wstawić mieszaninę reakcyjną na lód. 4. Transformacja bakterii chemokompetentnych E. coli. Do probówki zawierającej 50 µl chemokomeptentnych komórek E. coli szczepu MH2 dodać 5 µl mieszaniny reakcyjnej. Próby inkubować 10 minut na lodzie, a następnie przenieść na dokładnie 90 sek do temp. 42 C. Natychmiast przenieść próby na lód i inkubować przez 2 min. Po inkubacji dodać 900 µl pożywki SOB i wysiać 100 µl mieszaniny na szalkę LB z dodatkiem 50 µg/ml ampicyliny. Wstawić szalki do cieplarki i inkubować przez noc w 37 C.
6 Ćwiczenie praktyczne 1 cz. 1 - PCR do mutagenezy Przygotowanie reakcji PCR. Do 45,0 µl mieszaniny reakcyjnej zawierającej 1x bufor, polimerazę Phusion, dntp oraz matrycę DNA (pycplac33::pet127) dodać po 5,0 µl każdego z 2 starterów do mutagenezy (w stężeniu 100 ng/µl) Reakcję przeprowadzić w termocyklerze wg prgramu: 98 C, 30 sek (98 C, 30 sek; 55 C, 1 min; 72 C, 2 min 15 sek) x12, 4 C,.
7 P C R (ang. Polymerase Chain Reaction) Łańcuchowa reakcja polimerazy - podstawowa technika biologii molekularnej, która umożliwia powielenie określonego fragmentu DNA
8 Kary Mullis wymyślając w połowie lat 80-tych technikę PCR (łańcuchowej reakcji polimerazy), zrewolucjonizował biologię molekularną.
9
10 Liczba powstających produktów: Cykl Liczba cząsteczek produktu Instytut Genetyki i Biotechnologii UW, 2016
11 Zmiany temperatury podczas reakcji PCR Przyłączanie starterów temperatura zależy od ich długości i sekwencji Denaturacja nici DNA rozłączają się pod wpływem temperatury Wydłużanie polimeraza dobudowuje komplementarną sekwencję
12 Startery to krótkie odcinki DNA komplementarne do powielanej sekwencji Instytut Genetyki i Biotechnologii UW, 2016
13 Składniki reakcji PCR Matryca Polimeraza DNA - syntetyzuje nić DNA tylko w jednym kierunku (5 3 ) - do rozpoczęcia syntezy potrzebuje startera Startery Mieszanina dezoksyrybonukleotydów (dntp) Bufor
14 Zalety: Zalety i wady PCR Instytut Genetyki i Biotechnologii UW, 2016 bardzo wysoka czułość specyficzność krótki czas trwania prostota Wady: bardzo wysoka czułość Dlatego konieczne są odpowiednie kontrole czystości reakcji i jej prawidłowego przebiegu. Jakie??
15 Kontrole reakcji PCR Instytut Genetyki i Biotechnologii UW, 2016 Kontrola pozytywna (+): próba, o której wiemy, że w danych warunkach reakcji da odpowiedni produkt Kontrola negatywna (-): próba, w której przy zachowaniu właściwej czystości pracy nie powstanie żaden produkt, najczęściej bez matrycy
16 Jaka jest sekwencja starterów? Poniżej przedstawiono sekwencję 700 nukleotydów mitochondrialnego DNA człowieka. Napisz sekwencję starterów o długości 20 nukleotydów, które umożliwią namnożenie DNA, które odpowiada pogrubionej sekwencji. Sekwencję starterów wpisz zgodnie z regułą 5 3. Jaką długość będzie miał produkt reakcji PCR? GATCACAGGT CTATCACCCT ATTAACCACT CACGGGAGCT CTCCATGCAT TTGGTATTTT CGTCTGGGGG GTGTGCACGC GATAGCATTG CGAGACGCTG GAGCCGGAGC ACCCTATGTC GCAGTATCTG TCTTTGATTC CTGCCTCATC CTATTATTTA TCGCACCTAC GTTCAATATT ACAGGCGAAC ATACTTACTA AAGTGTGTTA ATTAATTAAT GCTTGTAGGA CATAATAATA ACAATTGAAT GTCTGCACAG CCGCTTTCCA CACAGACATC ATAACAAAAA ATTTCCACCA AACCCCCCCC CTCCCCCCGC TTCTGGCCAC AGCACTTAAA CACATCTCTG CCAAACCCCA AAAACAAAGA ACCCTAACAC CAGCCTAACC AGATTTCAAA TTTTATCTTT TGGCGGTATG CACTTTTAAC AGTCACCCCC CAACTAACAC ATTATTTTCC CCTCCCACTC CCATACTACT AATCTCATCA ATACAACCCC CGCCCATCCT ACCCAGCACA CACACACCGC TGCTAACCCC ATACCCCGAA CCAACCAAAC CCCAAAGACA CCCCCCACAG TTTATGTAGC TTACCTCCTC AAAGCAATAC ACTGAAAATG TTTAGACGGG CTCACATCAC CCCATAAACA AATAGGTTTG GTCCTAGCCT TTCTATTAGC TCTTAGTAAG ATTACACATG
17 Długość produktu reakcji PCR: 302 pz GATCACAGGT CTATCACCCT ATTAACCACT CACGGGAGCT CTCCATGCAT TTGGTATTTT CGTCTGGGGG GTGTGCACGC GATAGCATTG CGAGACGCTG GAGCCGGAGC ACCCTATGTC GCAGTATCTG TCTTTGATTC CTGCCTCATC CTATTATTTA TCGCACCTAC GTTCAATATT ACAGGCGAAC ATACTTACTA AAGTGTGTTA ATTAATTAAT GCTTGTAGGA CATAATAATA ACAATTGAAT GTCTGCACAG CCGCTTTCCA CACAGACATC ATAACAAAAA ATTTCCACCA AACCCCCCCC CTCCCCCCGC TTCTGGCCAC AGCACTTAAA CACATCTCTG CCAAACCCCA AAAACAAAGA ACCCTAACAC CAGCCTAACC AGATTTCAAA TTTTATCTTT TGGCGGTATG CACTTTTAAC AGTCACCCCC CAACTAACAC ATTATTTTCC CCTCCCACTC CCATACTACT AATCTCATCA ATACAACCCC CGCCCATCCT ACCCAGCACA CACACACCGC TGCTAACCCC ATACCCCGAA CCAACCAAAC CCCAAAGACA CCCCCCACAG TTTATGTAGC TTACCTCCTC AAAGCAATAC ACTGAAAATG TTTAGACGGG CTCACATCAC CCCATAAACA AATAGGTTTG GTCCTAGCCT TTCTATTAGC TCTTAGTAAG ATTACACATG
18 Długość produktu reakcji PCR: 302 pz GATCACAGGT CTATCACCCT ATTAACCACT CACGGGAGCT CTCCATGCAT TTGGTATTTT CGTCTGGGGG GTGTGCACGC GATAGCATTG CGAGACGCTG GAGCCGGAGC ACCCTATGTC GCAGTATCTG TCTTTGATTC CTGCCTCATC CTATTATTTA TCGCACCTAC GTTCAATATT ACAGGCGAAC ATACTTACTA AAGTGTGTTA ATTAATTAAT GCTTGTAGGA CATAATAATA ACAATTGAAT GTCTGCACAG CCGCTTTCCA CACAGACATC ATAACAAAAA ATTTCCACCA AACCCCCCCC CTCCCCCCGC TTCTGGCCAC AGCACTTAAA CACATCTCTG CCAAACCCCA AAAACAAAGA ACCCTAACAC CAGCCTAACC AGATTTCAAA TTTTATCTTT TGGCGGTATG CACTTTTAAC AGTCACCCCC CAACTAACAC ATTATTTTCC CCTCCCACTC CCATACTACT AATCTCATCA ATACAACCCC CGCCCATCCT ACCCAGCACA CACACACCGC TGCTAACCCC ATACCCCGAA CCAACCAAAC CCCAAAGACA CCCCCCACAG TTTATGTAGC TTACCTCCTC AAAGCAATAC ACTGAAAATG TTTAGACGGG CTCACATCAC CCCATAAACA AATAGGTTTG GTCCTAGCCT TTCTATTAGC TCTTAGTAAG ATTACACATG Starter lewy: TGATTCCTGCCTCATCCTAT Starter prawy: GTGACTGTTAAAAGTGCATA
19 Schemat mutagenezy ukierunkowanej wg protokołu Stratagene QuickChange Site-Directed Mutagenesis Gen na plazmidzie zaznaczono miejsca wprowadzania mutacji Usuwanie wyjściowej, metylowanej matrycy enzymem Dpn1 Denaturacja plazmidu i przyłączenie starterów ze zmutowanymi zasadami Transformacja E. coli. W komórkach bakterii następuje naprawa przerw Polimeraza DNA (bez właściwości usuwania nici) syntetyzuje dziurawe, koliste nici DNA LEGENDA DNA wyjściowego plazmidu Startery do mutagenezy DNA zmutowanych plazmidów
20 Ćwiczenie praktyczne 1 cz. 2 - trawienie Dpn1 metylowanych matryc w produktach reakcji PCR Trawienie matrycy. Po skończeniu reakcji PCR dodać 2,0 µl enzymu restrykcyjnego DpnI. Inkubować w 37 C, 15 min. a następnie wstawić mieszaninę reakcyjną na lód.
21 Klonowanie fragmentu PCR na bakteryjnym wektorze plazmidowym 1. Reakcja PCR na matrycy całkowitego DNA drożdżowego 2. Trawienie produktu PCR i wektora (puc19) EcoRI i BamHI 3. Ligacja 4. Transformacja bakterii chemokompetentnych 5. Selekcja pojedynczego klonu (α-komplementacja)
22 Klonowanie fragmentu PCR na bakteryjnym wektorze plazmidowym 1. Reakcja PCR na matrycy całkowitego DNA drożdżowego 2. Trawienie produktu PCR i wektora (puc19) EcoRI i BamHI 3. Ligacja 4. Transformacja bakterii chemokompetentnych 5. Selekcja pojedynczego klonu (α-komplementacja)
23 ENZYMY RESTRYKCYJNE 1. W bakteriach pełnią funkcje obrony przed wirusami 2. Enzymy restrykcyjne klasy II tną dwuniciowe DNA w obrębie lub pobliżu określonej sekwencji 3. Rozpoznawane sekwencje są palindromowe, zwykle 4 lub 6 nukleotydowe Po cięciu enzymem restrykcyjnym powstaja fragmenty DNA z "lepkimi" lub "tępymi końcami.
24 Klonowanie fragmentu PCR na bakteryjnym wektorze plazmidowym 1. Reakcja PCR na matrycy całkowitego DNA drożdżowego 2. Trawienie produktu PCR i wektora (puc19) EcoRI i BamHI 3. Ligacja 4. Transformacja bakterii chemokompetentnych 5. Selekcja pojedynczego klonu (α-komplementacja)
25 LIGAZA "SKLEJA" DNA Ligazy łączą dwa fragmenty DNA Ligaza tworzy wiązania fosfodiestrowe między grupą 3' OH deoksyrybozy, a grupą fosforanową
26 LIGACJA WEKTORA ZE WSTAWKĄ Po ligacji plazmidu ze wstawką powstają 3 rodzaje cząsteczek!!!
27 WEKTORY- PODSTAWOWE NARZĘDZIE W TECHNICE KLONOWANIA 1. Najczęściej stosowanymi wektorami są plazmidy 2. Plazmidowe wektory bakteryjne powstały na bazie plazmidów naturalnie występujących w komórkach bakterii. 3. Dostępne wektory plazmidowe zawierają pewne podstawowe elementy: ORI- miejsce inicjacji replikacji. Specyficzne dla gatunku bakterii, od specyfiki tego miejsca zależy liczba kopii plazmidu w komórce, plazmid może zawierać kilka ori specyficznych dla różnych organizmów. POLILINKER- sztucznie wytworzony odcinek DNA zawierający sekwencje rozpoznawane przez wiele enzymów restrykcyjnych. MARKER I- pozwala odróżnić bakterie posiadające plazmid, od tych które go nie pobrały MARKER II- pozwala odróżnić bakterie które pobrały plazmid ze wstawką, od tych które pobrały "pusty" plazmid
28 Klonowanie fragmentu PCR na bakteryjnym wektorze plazmidowym 1. Reakcja PCR na matrycy całkowitego DNA drożdżowego 2. Trawienie produktu PCR i wektora (puc19) EcoRI i BamHI 3. Ligacja 4. Transformacja bakterii chemokompetentnych 5. Selekcja pojedynczego klonu (α-komplementacja)
29 Komórki biorcy do transformacji są odpowiednio przygotowane genetycznie W celu zwiększenia wydajności replikacji obcego DNA, szczepy bakterii wykorzystywanych do klonowań posiadają uszkodzone systemy: restrykcji i modyfikacji rekombinacji homologicznej ( reca - )
30 Transformacja bakterii chemokompetentnych Instytut Genetyki i Biotechnologii UW, 2016
31 Klonowanie fragmentu PCR na bakteryjnym wektorze plazmidowym 1. Reakcja PCR na matrycy całkowitego DNA drożdżowego 2. Trawienie produktu PCR i wektora (puc19) EcoRI i BamHI 3. Ligacja 4. Transformacja bakterii (chemokompetentne) 5. Selekcja pojedynczego klonu (α-komplementacja)
32 DZIĘKI OBECNOŚCI DRUGIEGO MARKERA WYKRYWAMY BAKTERIE NIOSĄCE ZREKOMBINOWANY PLAZMID W przypadku pbr322, bakterie niosące zrekombinowany wektor nie będą rosły na podłożu z tetracykliną W przypadku puc19 do odróżnienia bakterii ze zrekombinowanym wektorem wykorzystujemy aktywność β-galaktozydazy ( biało-niebieskie ) Plazmidy E. coli
33 SELEKCJA REKOMBINANTÓW Instytut Genetyki i Biotechnologii UW, 2016
34 Ćwiczenie praktyczne 1 cz. 3 transformacja E. coli Transformacja bakterii chemokompetentnych E. coli. Do probówki zawierającej 50 µl chemokomeptentnych komórek E. coli szczepu MH2 dodać 5 µl mieszaniny reakcyjnej. Próby inkubować 10 minut na lodzie, a następnie przenieść na dokładnie 90 sek do temp. 42 C. Natychmiast przenieść próby na lód i inkubować przez 2 min. Po inkubacji dodać 900 µl pożywki SOB i wysiać 100 µl mieszaniy na szalkę LB z dodatkiem 50 µg/ml ampicyliny. Wstawić szalki do cieplarki i inkubować przez noc w 37 C.
35 ZADANIE DOMOWE Wektory inne niż plazmidowe: pochodne faga λ kosmidy sztuczne chromosomy bakteryjne (BAC) sztuczne chromosomy drożdżowe (YAC)
36 Materiały do ćwiczeń z przedmiotu Genetyka z inżynierią genetyczną D - blok Inżynieria Genetyczna ćw. 2 Instytut Genetyki i Biotechnologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski, rok akad. 2015/2016 Prosimy o nierozpowszechnianie materiałów bez naszej zgody
37 (-) (+) ELEKTROFOREZA DNA Instytut Genetyki i Biotechnologii UW, 2016 Agaroza rozpuszczona w buforze tworzy żel. Żel zanurzony w buforze przewodzącym prąd poddajemy działaniu pola elektrycznego. DNA ma ładunek ujemny (-) i migruje w kierunku elektrody dodatniej (+) z szybkością zależną od wielkości i kształtu. Małe liniowe fragmenty poruszają się szybciej niż większe, których ruch jest silniej hamowany przez sito molekularne żelu. Szybkość migracji fragmentów DNA jest odwrotnie proporcjonalna do ich masy cząsteczkowej.
38 DETEKCJA DNA W ŻELU Proces migracji DNA obserwujemy dzięki dodaniu do próbki odpowiedniego barwnika (np. Oranż G) EtBr DNA obserwujemy w świetle UV, dzięki obecności w żelu bromku etydyny, interkalującego pomiędzy pierścienie aromatyczne w kwasie nukleinowym Bromek etydyny winterkalowany w helisę DNA "świeci" w UV znacznie mocniej niż niewbudowany bromek w tle Bromek etydyny zaburza strukturę DNA, jest silnym mutagenem!!
39 Analiza restrykcyjna DNA - podstawowa technika biologii molekularnej, która umożliwia analizę sekwencji DNA Enzym restrykcyjny należący do tzw. klasy II to nukleaza rozpoznająca i przecinająca DNA w obrębie ściśle zdefiniowanej sekwencji. Mapa restrykcyjna danego fragmentu DNA to wzajemne ułożenie miejsc (sekwencji), które są rozpoznawane i przecinane przez określony zbiór enzymów restrykcyjnych.
40 EcoRI jako homodimer
41 Izoschizomery enzymy restrykcyjne izolowane z różnych bakterii rozpoznające tę samą sekwencję w DNA i wprowadzające identyczny typ cięcia. HaeIII, BsuRI, BshFI, PhoI, BsnI GG CC CC GG Neoschizomery - enzymy restrykcyjne izolowane z różnych bakterii rozpoznające identyczną sekwencję w DNA, ale wprowadzające odmienny typ cięcia. SmaI CCC GGG GGG CCC Acc65I G GTACC CCATG G XmaI C CCGGG GGGCC C KpnI GGTAC C C CATGG
42 Analiza restrykcyjna Instytut Genetyki i Biotechnologii UW, 2016
43 Mapa restrykcyjna Instytut Genetyki i Biotechnologii UW, 2016
44 Zadanie domowe - mapa restrykcyjna Nco I (611) Eco RI (953) Nco I (611) Nco I (1956) Pst I (2312) Nco I (2691) Pst I (3956) Pst I (395 6) 5434 pz pz Eco RI (953) 5434 pz Nco I (195 6) Pst I (2312) Nco I (2691) Jakiej długości powstaną fragmenty DNA po przecięciu powyższych cząsteczek DNA za pomocą enzymu/ów: Enzym Cząsteczka liniowa Cząsteczka kolista EcoRI PstI NcoI EcoRI/PstI
45 Transformacja drożdży Saccharomyces cerevisiae metodą LiOAc/PEG Transformacja drożdży (szczepy z delecją genu PET127) wyizolowanymi z bakterii plazmidami niosącymi wprowadzoną na ćwiczeniach mutację genu PET127 (pet127-l392a lub pet127-k393a). Roztwór transformacyjny (PEG Mix): ODCZYNNIK OBJĘTOŚĆ (stężenie końcowe) PEG % [w/v] 42 μl (~40%) LiOAc 1M 6 μl (~0.1 M) Jednoniciowe nośnikowe DNA ze spermy łososia (carrier ssdna) 10 mg/ml Końcowa objętość 2 μl 50 μl Komórki kompetente zostały przygotowane wcześniej, rozporcjowane i zamrożone w -80 C. Zawieszone są w roztworze zawierającym 1xTE, 0,1 M LiOAc oraz 25% glicerol.
46 Transformacja drożdży Saccharomyces cerevisiae metodą LiOAc/PEG Transformacja drożdży (szczepy z delecją genu PET127) wyizolowanymi z bakterii plazmidami niosącymi wprowadzoną na ćwiczeniach mutację genu PET127. Wykonanie: 1. Z otrzymanych komórek kompetentnych (200 μl) odpipetować po 50 μl na pojedynczą transformację, krótko zwirować na niewielkich obrotach (2500 rpm przez 30 s. lub short). Supernatant usunąć pipetą nienaruszając pelletu. 2. Do probówki z drożdżami dodać 50 μl roztworu transformacyjnego, a następnie 1 μl DNA plazmidowego (w próbie kontrolnej zamiast DNA należy dodać 1 μl sterylnej wody). Całość zawiesić poprzez pipetowanie. 3. Inkubować w 42 C przez 30 min (w termobloku lub łaźni wodnej). 4. Po inkubacji zebrać komórki przez krótkie i delikatne wirowanie (2500 rpm przez 30 s. lub short), supernatant usunąć, a pellet zawiesić w 100 μl sterylnej wody lub soli fizjologicznej. 5. Całość wysiać na odpowiednią szalkę selekcyjną i inkubować przez 2-3 dni w temperaturze 30 C.
47 KLONOWANIE DNA 1. trawienie restryktazą wyizolowanego DNA, trawienie wektora. 2. ligacja wektora ze wstawką 3. transformacja bakterii - chemokompetentne - elektrokompetentne 4. selekcja (dzięki obecności na wektorze genów markerowych) 5. Wyszukanie pojedynczego klonu zawierającego zrekombinowany plazmid z interesującym nas fragmentem DNA jeżeli uzyskamy dostateczna liczbę klonów, na tyle dużą, żeby zawarte w nich wstawki reprezentowały cały genom, klony te stanowią BANK GENOMOWEGO DNA
48 WEKTORY BIFUNKCJONALNE: DWÓCH GOSPODARZY, np.: E. coli S. cerevisiae Drugi marker bakteryjny, np. LacZ Polilinker (MCS) Marker bakteryjny, np. Amp R Marker drożdżowy, zwykle pokarmowy (np. leu2, trp1, his3, ura3) Bakteryjny ori replikacji Drożdżowy ori replikacji, np. 2μ Transformacja bakterii Transformacja drożdży (np. mutantów leu -, trp -, his -, ura - ) Podłoże z antybiotykiem Selekcja transformantów Podłoże selekcyjne, (np. bez leu itp.)
49 BANK GENÓW DROŻDŻY NA WEKTORZE BIFUNKCJONALNYM YEplac181
50 RÓŻNE ENZYMY MOGĄ ZOSTAWIAĆ TAKIE SAME KOŃCE: GGATCC CCTAGG NGATCN NCTAGN BamHI Sau3A G GATCC CCTAG G N GATCN NCTAG N
51
52 KLONOWANIE DNA 1. trawienie restryktazą wyizolowanego DNA, trawienie wektora. 2. ligacja wektora ze wstawką 3. transformacja bakterii - chemokompetentne - elektrokompetentne 4. selekcja (dzięki obecności na wektorze genów markerowych) 5. Wyszukanie pojedynczego klonu zawierającego zrekombinowany plazmid z interesującym nas fragmentem DNA jeżeli uzyskamy dostateczna liczbę klonów, na tyle dużą, żeby zawarte w nich wstawki reprezentowały cały genom, klony te stanowią BANK GENOMOWEGO DNA
53 DZIĘKI OBECNOŚCI DRUGIEGO MARKERA WYKRYWAMY BAKTERIE NIOSĄCE ZREKOMBINOWANY PLAZMID W przypadku wektorów pochodnych puc19 (np. YEPLAC) do odróżnienia bakterii ze zrekombinowanym wektorem wykorzystujemy zjawisko α-komplementacji
54
55 α- komplementacja Instytut Genetyki i Biotechnologii UW, 2016
56 Reprezentatywność banku Dane konieczne do oszacowania reprezentatywności banku genomowego: Wielkośc genomu Liczba uzyskanych klonów % transformantów ze zrekombinowanym wektorem Średnia wielkość wstawki Instytut Genetyki i Biotechnologii UW, 2016 Dobry bank genów w E. coli na wektorze plazmidowym zwykle zawiera ponad 50% zrekombinowanych plazmidów, ze średnią wielkością wstawki ok. 10 kb i pokrywa kilkakrotnie genom N = ln(1-p)/ln(1-f) N- liczba klonów. P- prawdopodobieństwo znalezienia fragmentu. f frakcja genomu niesiona przez rekombinanta.
57 Bank genomowy Instytut Genetyki i Biotechnologii UW, 2016
58 Bank cdna pre-mrna
59 Drożdżowy system dwuhybrydowy: badanie interakcji pomiędzy białkami in vivo
60 System dwuhybrydowy: domenowa budowa czynników transkrypcyjnych
61 System dwuhybrydowy: konstrukcja białek fuzyjnych
62 System dwuhybrydowy: transformacja drożdży
63 System dwuhybrydowy: ekspresja genu reporterowego Instytut Genetyki i Biotechnologii UW,
64 Geny reporterowe Instytut Genetyki i Biotechnologii UW, 2016 Badanie regionów promotora odpowiedzialnych za regulację ekspresji genu Badanie zmian ekspresji w wyniku działania czynników zewnętrznych Identyfikacja oddziaływań pomiędzy białkami Określenie lokalizacji badanego białka
65 Przykładowe geny reporterowe β-galaktozydaza β-glukuronidaza (GUS) acetylotransferaza chloramfenikolu (CAT) fosfataza alkaliczna lucyferazy białko fluoryzujące na zielono (GFP)
66 Identyfikacja regionów promotora odpowiedzialnych za regulację transkrypcji aktywatory transkrypcji Ekspresja genu reporterowego gen reporterowy 100% promotor gen reporterowy 30% gen reporterowy 70% gen reporterowy 0%
67 Lokalizacja białka Instytut Genetyki i Biotechnologii UW, 2016 promotor Promotor białko X białko X Bia³ko X ORI GFP GFP amp R amp R analiza mikroskopowa białko X-GFP mitochondria nałożenie obrazu
68 Drożdżowy system dwuhybrydowy: badanie interakcji pomiędzy białkami in vivo
69 Materiały do ćwiczeń z przedmiotu Genetyka z inżynierią genetyczną D - blok Inżynieria Genetyczna ćw. 3 Instytut Genetyki i Biotechnologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski, rok akad. 2015/2016 Prosimy o nierozpowszechnianie materiałów bez naszej zgody
70 Kontrola szczepów w mutagenezie PET127 - reakcja PCR Instytut Genetyki i Biotechnologii UW, 2016
71 Wektor bifunkcjonalny, bakteryjno-drożdżowy ze sklonowanym genem PET127 Wstawka PET127 ~3,1 kb, wklonowana z użyciem BamHI i SacI
72 Kontrola szczepów w mutagenezie PET127 schemat PCR
73 Kontrola szczepów w mutagenezie PET127 nastawienie reakcji PCR MultiMix do PCR: Składniki: Bufor do polimerazy 10x (Metabion) 1-sza para starterów (Pet up i Pet down) 10 pm 2-ga para starterów ( Pet Li Pet R) 10 pm dntps (NEB) 10mM Polimeraza Taq (Metabion) 5 U/μL Woda Ilość: 2 μl 0,5 μl (0,25 μl +0,25 μl) 0,5 μl (0,25 μl +0,25 μl) 0,5 μl 0,1 μl 14,4 μl Razem na jedną próbkę: - MultiMix - 18 μl; - matryca (DNA genomowy) - 2 μl; - końcowa objętość próbki - 20 μl. Program Multiplex PCR PET127: 1. Denaturacja wstępna: 98 o C 3:00 min. 2. Denaturacja: 98 o C 0:30 min. 3. Przyłączanie starterów: 55 o C 0:30 min. 4. Elongacja: 72 o C 2:00 min. 5. Elongacja końcowa: 72 o C - 5:00 min. 6. Schładzanie: 10 o C 5 min. Liczba cykli: 30; czas trwania 2 godz. 30 min.
74 Zadanie domowe - mapa restrykcyjna Nco I (611) Eco RI (953) Nco I (611) Nco I (1956) Pst I (2312) Nco I (2691) Pst I (3956) Pst I (395 6) 5434 pz pz Eco RI (953) 5434 pz Nco I (2691) Nco I (195 6) Pst I (2312) Jakiej długości powstaną fragmenty DNA po przecięciu powyższych cząsteczek DNA za pomocą enzymu/ów: Enzym Cząsteczka liniowa Cząsteczka kolista EcoRI 4482, PstI NcoI EcoRI/PstI 2311, 1644, , , 1345, 735, , 1345, , 1479, 1359, , 1644, 1359
75 Dysrupcja genów w drożdżach U drożdży występuje bardzo wydajna rekombinacja homologiczna. Zjawisko to polega na wymianie fragmentów nici DNA o podobnej sekwencji. Mechanizm ten stanowi podstawę crossing-over. Rekombinacja homologiczna jest stosowana jako narzędzie przy tworzeniu dysrupcji i delecji genów u drożdży (tworzenie nowych szczepów).
76 Dysrupcja genu w szczepie haploidalnym
77
78
79 Technika Southern-blot: rozdział i detekcja DNA DNA Hybrydyzacja ze specyficzną, wyznakowaną sondą. DNA
80 Transfer kapilarny Transfer w polu elektrycznym
81 Znakowanie sondy (komplementarny kwas nukleinowy)
82 Kontrola dysrupcji przez hybrydyzację Southerna
83 Dysrupcja genu w szczepie diploidalnym
84 Dysrupcje w roślinach Agrobacterium tumefaciens Stanton B. Gelvin, Nature: 433,
85 Cel i kaseta dysrupcyjna Instytut Genetyki i Biotechnologii UW, 2016 EcoRI/SalI 3kb; 2kb; 1kb EcoRI 4kb SalI 5kb
86
87 Potwierdzamy dysrupcję przez hybrydyzację Southerna Instytut Genetyki i Biotechnologii UW, Jaką sondę zastosować? 2. Jakiej kontroli negatywnej użyć? 3. Jakim enzymem strawić genomowy DNA? 4. Który mutant ma wstawkę tylko w obrębie genu AtXRN2?
88 Wynik Southerna Instytut Genetyki i Biotechnologii UW, 2016 Autoradiogram hybrydyzacji z sondą do genu oporności na kanamycynę
89 Hybrydyzacja kolonijna Instytut Genetyki i Biotechnologii UW, 2016
90 Technika northern-blot: rozdział i detekcja RNA RNA Hybrydyzacja ze specyficzną, wyznakowaną sondą. RNA
91 Elektroforeza białek: SDS-PAGE SDS nadaje białkom jednolity ładunek ujemny białka migrują w żelu poliakrylamidowym z prędkością zależną od wielkości
92 Coomassie Brilliant Blue Instytut Genetyki i Biotechnologii UW, 2016
93 Technika western-blot
94 SDS-PAGE Western blot
95 Southern, northern i western Instytut Genetyki i Biotechnologii UW, 2016
96 Testy kroplowe mutantów w PET127 kontrola fenotypów oddechowych sprawdzenie zdolności transformantów drożdżowych do oddychania tlenowego 30 ⁰ C 37 ⁰ C Δpet127 PET127 (WT) PET127 (D A) PET127 (E A) PET127 (K A) PET127 (L A) GLUKOZA Glicerol niefermentowalne źródło węgla, na którym wydajnie rosną tylko drożdże posiadające zdolność do oddychania tlenowego. GLICEROL Δ +wt Δ +wt
97 Testy kroplowe mutantów w PET127 kontrola fenotypów oddechowych wykonanie 1. Przygotowanie odpowiednich rozcieńczeń drożdży do testu wzrostowego. 30 µl 30 µl 30 µl 30 µl Hodowla nocna (OD 600 =1,0) Seryjne rozcieńczenia 2. Oznaczenie szalek w zależności od temperatury inkubacji (30 i 37 C) i źródła węgla (glukoza i glicerol) = 4 szalki na parę. 3. Nakropić na szalki po 6 µl rozcieńczeń od 10-1 do 10-4 zgodnie ze wzorem. 4. Szalki inkubować w cieplarce w odpowiedniej temperaturze przez 3 dni. 270 µl sterylnej wody (lub soli fizjologicznej) + 30 µl poprzedniego rozcieńczenia Δ +wt Dwa wybrane mutanty białka pet127 (z czterech badanych na ćwiczeniach)
98 Materiały do ćwiczeń z przedmiotu Genetyka z inżynierią genetyczną D - blok Inżynieria Genetyczna ćw. 4 Instytut Genetyki i Biotechnologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski, rok akad. 2015/2016 Prosimy o nierozpowszechnianie materiałów bez naszej zgody
99 Kontrola szczepów w mutagenezie PET127 rozdział produktów PCR w żelu agarozowym Przygotowanie i nakładanie prób: Do reakcji PCR (20µl) dodać 4µl 6x stężonego buforu obciążającego z barwnikiem Orange G. Do 1-szej kieszonki nałożyć 4µl wzorca masy cząsteczkowej (gotowy, z buforem do nakładania). Na żel nałożyć 12µl mieszaniny. Elektroforezę prowadzić w 1% żelu agarozowym + EtBr, 1x buforze TEA, 70-90V do 1h.
100 Sekwencjonowanie DNA Instytut Genetyki i Biotechnologii UW, 2016
101 Sekwencjonowanie DNA: metoda Sangera Instytut Genetyki i Biotechnologii UW, 2016 Dideoksynukleotydy (analogi nukleotydów bez grupy OH w pozycji 3 ) powodują przedwczesną terminację syntezy DNA
102 Sekwencjonowanie DNA: metoda Sangera Instytut Genetyki i Biotechnologii UW, 2016
103 Sekwencjonowanie DNA: metoda Sangera Instytut Genetyki i Biotechnologii UW, 2016
104 Współczesna modyfikacja metody Sangera
105 Współczesna modyfikacja metody Sangera
106 Współczesna modyfikacja metody Sangera
107 Współczesna modyfikacja metody Sangera
108 Współczesna modyfikacja metody Sangera
109 Komputerowa analiza sekwencji Wyszukiwanie sekwencji w bazie danych: program BLAST (odczyt sekwencjonowania z wydruku z ćwiczeniem + plik z sekwencją z ćwiczenia komputerowego) Pokaz chromatogramów in silico (w katalogu cw kilka przykładowych wyników sekwencjonowań klonów otrzymanych po mutagenezie PET127 do obejrzenia w programie Finch TV) Porównywanie dwóch sekwencji (bl2seq) (plik do blast2seq w katalogu cw zawiera przykładowe 2 sekwencje do porównania)
110 Sekwencjonowanie nowej generacji, wysokoprzepustowe (NGS Next Generation Sequencing) Pirosekwencjonowanie, przez syntezę z kaskadą 4 reakcji enzymatycznych (454; Roche) historycznie pierwsza metoda NGS obecnie platforma zombie Sekwencjonowanie mostkowe, przez syntezę z odwracalną terminacją (Ilumina) obecnie najczęściej stosowana i najbardziej wydajna technologia (do 2 Terra par zasad / 8 dni pracy urządzenia) Sekwencjonowanie typu Ion Torrent, przez syntezę z detekcją protonów na układzie scalonym (Life Tech.) Sekwencjonowanie przez ligację fluorescencyjnie znakowanych krótkich oligonukleotydów (SOLID; Life Tech.) obecnie platforma zombie I wiele innych
111 Sekwencjonowanie nowej generacji, wysokoprzepustowe podstawowe różnice względem metody Sangera W metodzie Sangera sekwencjonujemy jednocześnie tylko różnych matryc, przy czym każda matryca jest mieszanina wielu cząsteczek, które nie powinny ale mogą się różnić! Problem: przy sekwencjonowaniu produktu PCR pochodzącego od homozygoty mamy czysty odczyt. Gdy pochodzi on od heterozygoty w pozycji gdzie występuje różnica między allelami, polegająca na zamianie zasad, odczyt jest wątpliwy a w przypadku delecji lub insercji wręcz nie możliwy dla całej dalszej części cząsteczki. Rozwiązanie: klonowanie produktów PCR i dopiero ich sekwencjonowanie. Metody NGS opierają się o równoległe, masowe sekwencjonowanie od kilku tysięcy do kilkuset milionów różnych matryc tzw. bibliotek. Najpierw sekwencjonowany materiał jest losowo fragmentowany, ligowany z uniwersalnymi adaptorami i odpowiednio rozcieńczany. Każda z finalnych matryc powstaje po amplifikacji klonalnej od pojedynczej cząsteczki poprzez PCR na matrycy 1 cząsteczki a nie mieszaninie różnych wiec jest zawsze homogenna! Każdy wariant allelu ma swoją homogenną reprezentacje!
112 Sekewncjonowanie w technologii Illumina: mostkowe, przez syntezę z odwracalną terminacją (za Illumina) Instytut Genetyki i Biotechnologii UW, 2016
113 Metoda Sangera Sekwencjonowanie nowej generacji: wady i zalety względem metody Sangera Proste i szybkie przygotowanie 1 próby. Niski koszt jednokrotnego uruchomienia urządzenia. Długość pojedynczego odczytu do ok pz. Wysoki koszt odczytu na 1 zasadę. Niska przepustowość, nie możliwe są doświadczenia ilościowe. Metody NGS Instytut Genetyki i Biotechnologii UW, 2016 Trudne, kosztowne i pracochłonne przygotowanie bibliotek, w zasadzie nie opłacalne dla pojedynczych prób. Pojedyncze odczyty bardzo krótkie, w przedziale pz. Skomplikowana analiza bioinformatyczna. Więcej błędów sekwencjonowania. Bardzo duża ilość odczytów: do 2 Terra par zasad (dla 4 mld. różnych odczytów), co umożliwia dla 1 urządzenia (Illumina HiSeq 2500) odczyt 10 ludzkich genomów z ok. 100x pokryciem (powtórzeniem) dla jednego kierunku każdej z 2 nici DNA! Duża ilość odczytów pozwala na prowadzenie doświadczeń ilościowych np. transkryptomicznych typu RNA-seq. Wielokrotnie niższy koszt odczytu na 1 zasadę.
114 Wydajności oraz koszt użycia różnych platform NGS (2014) Instrument Amplification Run time Millions of Reads/run Bases / read Reagent Cost/run Reagent Cost/Gb Reagent Cost/Mread bp/run Gbp/run cost/gb Applied Biosystems 3730 (capillary) sensors Libraries PCR Chips Seq reagents Sum PCR, cloning 2 hrs $144 $2,307, $1,500, , $2,307, Illumina MiSeq v3 bridgepcr 20 hrs $824 $ $ ,300,000, $ Illumina MiSeq v3 Illumina NextSeq 500 bridgepcr 55 hrs $1,442 $ $ ,200,000, $ BridgePCR 30 hrs $4,000 $33.33 $ ,000,000, $33.33 Illumina HiSeq high output v4 Illumina HiSeq X (2 flow cells) BridgePCR 6 days $14,950 $29.90 $ ,000,000, $29.90 BridgePCR 3 days $12,750 $7.08 $2.13 1,800,000,000,000 1, $7.08 Ion Torrent PGM 314 chip empcr 2.3 hrs $349 $3, $ ,000, $3, Ion Torrent PGM 314 chip empcr 3.7 hrs $474 $2, $ ,000, $2, Ion Torrent PGM 318 chip empcr 4.4 hrs $749 $ $ ,000, $ Ion Torrent PGM 318 chip Ion Torrent - Proton I empcr 7.3 hrs $874 $ $ ,900,000, $ empcr 4 hrs $1,000 $81.63 $ ,250,000, $81.63 Life Technologies SOLiD 5500xl empcr 8 days $10,503 $67.72 $ ,100,000, $67.72 Pacific Biosciences RS II None - SMS 2 hrs $100 $1, $3, ,000, $1, Glenn, TC (2011) Field Guide to Next Generation DNA Sequencers. Molecular Ecology Resources Update.
115 Pokaz NGS LAB W IGiB UW (pok. VII)
116 Technika northern-blot: rozdział i detekcja RNA RNA Hybrydyzacja ze specyficzną, wyznakowaną sondą. RNA
117 Indukcja transkrypcji genu kodującego arginazę u A. nidulans
118 Katabolizm argininy Gen agaa koduje arginazę, rozkładającą argininę do ornityny, a gen otaa koduje transaminazę ornitynową Transkrypcja obu genów jest indukowana argininą Za indukcję odpowiada czynnik transkrypcyjny ARCA arca d 47 mutacja dominująca arca r 3 mutacja recesywna
119 1. standard masy cząsteczkowej RNA (RNA Lader High Range, MBI Fermentas) warunki hodowli aktywność arginazy 2. wt MM 0,2 3. wt MM + arginina 1,8 4. arca d 47 MM 1,9 5. arca d 47 MM + arginina 2,1 6. arca r 3 MM 0,1 7. arca r 3 MM + arginina 0,1 8. RNA totalne z ludzkich komórek białaczkowych Jurkat 1u aktywności arginazy = aktywność enzymu dająca 1 μmol mocznika na minutę w warunkach standardowych mrna (geny) referencyjne northern-blot jakościowy alternatywny splicing
120 Technika western-blot
121 Detekcja białka w western-blot Instytut Genetyki i Biotechnologii UW, 2016
122 Southern, northern i western Instytut Genetyki i Biotechnologii UW, 2016
123 Badanie lokalizacji w komórce czynnika transkrypcyjnego AREB u Aspergillus nidulans pokaz mikroskopii fluorescencyjnej AREB czynnik transkrypcyjny z rodziny GATA, rozpoznaje konkretne sekwencje w promotorach wielu genów Pełni rolę negatywnego regulatora transkrypcji (represor) w represji azotowej Lokalizacja wewnątrzkomórkowa zależy od statusu pokarmowego: zwykle jest w jądrze, częściowo w cytoplazmie. W przypadku głodzenia azotowego zwiększa się jeszcze jego obecność w jądrze Obserwacja lokalizacji możliwa jest dzięki fuzji AREB z białkiem T- Sappaphire ( szafirowej fluorescencji ) Kontrolą w doświadczeniu jest histon H1 (białko jądrowe) w fuzji z RFP (białkiem czerwonej fluorescencji )
124 Schemat integracji do genomu A. nidulans konstruktu kodującego AREB w fuzji białkiem fluorescencyjnym T-Sapphire pyrg A. fu gen z Aspergillus fumigatus, wykorzystywany do rekombinacji homologicznej. Pozwala to uniknąć rekombinacji z dzikim losuc pyrg A. nidulans (niska homologia obu genów) gpd promotor zapewniający wysoką, konstututywną ekspresję konstruktu. ribob A. fu selekcyjny marker pokarmowy, gen z A. fumigatus (też zabezpieczenie przed nieporządaną rekombinacją z genem A. nidulans) Za A. Dzikowska i M. Macios
125 Obecność AREB w jądrze wzrasta przy głodzeniu azotowym NH4 + NO3 - -N (5 hours) Za A. Dzikowska i M. Macios
126 Lokalizacja AREB zależy od statusu pokarmowego G glukoza; F- fruktoza; -N głodzenie azotowe; -C głodzenie węglowe G/NH4 G/NO3 F/NH4 F/NO3 -N -C Za A. Dzikowska i M. Macios
127 Lokalizacja AREB::T-Sappaphire potwierdzona odczynnikiem DAPI (barwiącym specyficznie jądra) DAPI Zanim spenetruje do jądra niespecyficznie barwi inne struktury np. ściany komórkowe AREB::T-Sappaphire Za A. Dzikowska i M. Macios
128 Kontrola szczepów w mutagenezie PET127 schemat PCR
129 Kontrola szczepów w mutagenezie PET127 wzorcowy wynik PCR Instytut Genetyki i Biotechnologii UW, 2016
130 Odczyt testów wzrostowych dla mutantów w PET127 Sprawdzenie fenotypów oddechowych dla mutantów D378A i E346A
131 Model struktury PET127 z S. cerevisiae Instytut Genetyki i Biotechnologii UW, 2016 Na model PET127 zaznaczono: struktury typu kartka kolorem czerwonym, helisy ciemnoniebieskim, łańcuchy słabo ustrukturyzowane - jasnoniebieskim lub zielonym. Zaznaczono mutowane podstawniki z okolic centrum aktywnego: kolor biały podstawniki E346 i D378, kolor żółty podstawniki L392 i K393. Model atomowy czaszowy: cząsteczka kw. nukleinowego (tu DNA) Model otrzymano w oprogramowaniu I- TASSER (Yang Zhang's Lab) poprzez modelowanie na podstawie sekwencji homologicznych o znanej strukturze i zwizualizowano programem YASSARA (YASARA Biosciences GmbH):
132 Model struktury centrum aktywnego PET127 z S. cerevisiae Na model PET127 zaznaczono: struktury typu kartka kolorem czerwonym, helisy ciemnoniebieskim, łańcuchy słabo ustrukturyzowane - jasnoniebieskim lub zielonym. Zaznaczono mutowane podstawniki z okolic centrum aktywnego: kolor biały podstawniki E346 i D378, kolor żółty podstawniki L392 i K393. MG skoordynowany jon Mg 2+ Model otrzymano w oprogramowaniu I- TASSER (Yang Zhang's Lab) poprzez modelowanie na podstawie sekwencji homologicznych o znanej strukturze i zwizualizowano programem YASSARA (YASARA Biosciences GmbH):
133 Kilka słów o ekspresji heterologicznej
134 Przykład wektora bifunkcjonalnego do ekspresji białek w komórkach ssaczych Za: OriGene
135 Plazmid do heterologicznej ekspresji i oczyszczania białek w bakteriach pbad - promotor arabinozowy YFG - your favourite gene polyhistidine tag - znacznik heksahistydynowy (6xHIS) do oczyszczania przez chromatografię powinowactwa
136 Chromatografia powinowactwa na przykładzie złoża niklowego i heksahistydyny
137
138 Konstrukcja zdegenerowanej sondy
139 SYNTETYCZNY OLIGONUKLEOTYD, PRODUKT PCR LUB RT-PCR w oparciu o znaną sekwencję KLON cdna (np. do przeszukiwania banku genomowego) RNA łatwy do izolacji np. rrna DNA konserwowany ewolucyjnie lub z organizmu spokrewnionego izolacja i fragmentacja DNA DNA BADANY ORGANIZM WEKTOR ligacja transformacja biorcy (Escherichia coli) izolacja RNA i odwrotna transkrypcja cdna RNA (cdna) izolowany z różnych tkanek do hybrydyzacji różnicowej BANK GENOMOWY BANK cdna BIAŁKO łatwe do oczyszczenia, występujące w dużych ilościach Ustalenie N-końcowej sekwencji aminokwasowej białka, projektowanie i synteza zestawu zdegenerowanych sond Immunizacja ssaka (np. królika) SONDA PRZECIWCIAŁA W Y S Z U K I W A N I E K L O N Ó W KOMPLEMENTACJA MUTACJI (na ogół dla banku genowego np. klonowanie genów drożdży wg schematu z ćwiczeń) METODY HYBRYDYZACYJNE (hybrydyzacja kolonijna, łysinkowa albo różnicowa) METODY IMMUNOLOGICZNE (biblioteka na wektorze ekspresyjnym)
Inżynieria Genetyczna ćw. 1
Materiały do ćwiczeń z przedmiotu Genetyka z inżynierią genetyczną D - blok Inżynieria Genetyczna ćw. 1 Instytut Genetyki i Biotechnologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski, rok akad. 2018/2019
Bardziej szczegółowoInżynieria Genetyczna ćw. 3
Materiały do ćwiczeń z przedmiotu Genetyka z inżynierią genetyczną D - blok Inżynieria Genetyczna ćw. 3 Instytut Genetyki i Biotechnologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski, rok akad. 2018/2019
Bardziej szczegółowoInżynieria Genetyczna ćw. 2
Materiały do ćwiczeń z przedmiotu Genetyka z inżynierią genetyczną D - blok Inżynieria Genetyczna ćw. 2 Instytut Genetyki i Biotechnologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski, rok akad. 2018/2019
Bardziej szczegółowoBiologia molekularna z genetyką
Biologia molekularna z genetyką P. Golik i M. Koper Konwersatorium 3: Analiza genetyczna eukariontów Saccharomyces cerevisiae Makrokierunek: Bioinformatyka i Biologia Systemów; 2016 Opracowano na podstawie
Bardziej szczegółowoInżynieria Genetyczna ćw. 4
Materiały do ćwiczeń z przedmiotu Genetyka z inżynierią genetyczną D - blok Inżynieria Genetyczna ćw. 4 Instytut Genetyki i Biotechnologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski, rok akad. 2018/2019
Bardziej szczegółowoKlonowanie molekularne Kurs doskonalący. Zakład Geriatrii i Gerontologii CMKP
Klonowanie molekularne Kurs doskonalący Zakład Geriatrii i Gerontologii CMKP Etapy klonowania molekularnego 1. Wybór wektora i organizmu gospodarza Po co klonuję (do namnożenia DNA [czy ma być metylowane
Bardziej szczegółowoĆwiczenia 1 Wirtualne Klonowanie Prowadzący: mgr inż. Joanna Tymeck-Mulik i mgr Lidia Gaffke. Część teoretyczna:
Uniwersytet Gdański, Wydział Biologii Katedra Biologii Molekularnej Przedmiot: Biologia Molekularna z Biotechnologią Biologia II rok ===============================================================================================
Bardziej szczegółowoKLONOWANIE DNA REKOMBINACJA DNA WEKTORY
KLONOWANIE DNA Klonowanie DNA jest techniką powielania fragmentów DNA DNA można powielać w komórkach (replikacja in vivo) W probówce (PCR) Do przeniesienia fragmentu DNA do komórek gospodarza potrzebny
Bardziej szczegółowoBiologia Molekularna z Biotechnologią ===============================================================================================
Uniwersytet Gdański, Wydział Biologii Biologia i Biologia Medyczna II rok Katedra Genetyki Molekularnej Bakterii Katedra Biologii i Genetyki Medycznej Przedmiot: Katedra Biologii Molekularnej Biologia
Bardziej szczegółowoĆwiczenie 5 Klonowanie DNA w wektorach plazmidowych
Ćwiczenie 5 Klonowanie DNA w wektorach plazmidowych Celem ćwiczenia jest sklonowanie fragmentu DNA (powielonego techniką PCR i wyizolowanego z żelu agarozowego na poprzednich zajęciach) do wektora plazmidowego
Bardziej szczegółowoZakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: BIOLOGIA MOLEKULARNA
Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: BIOLOGIA MOLEKULARNA Zakład Biologii Molekularnej Wydział Farmaceutyczny, WUM ul. Banacha 1, 02-097 Warszawa IZOLACJA DNA Z HODOWLI KOMÓRKOWEJ.
Bardziej szczegółowoĆwiczenia 1 Wirtualne Klonowanie. Prowadzący: mgr Anna Pawlik i mgr Maciej Dylewski. Część teoretyczna:
Uniwersytet Gdański, Wydział Biologii Biologia i Biologia Medyczna II rok Katedra Biologii Molekularnej Przedmiot: Biologia Molekularna z Biotechnologią ===============================================================================================
Bardziej szczegółowoDefinicje. Białka rekombinowane (ang. recombinant proteins, r-proteins) Ukierunkowana mutageneza (ang. site-directed/site-specific mutagenesis)
Definicje Białka rekombinowane (ang. recombinant proteins, r-proteins) Białka, które powstały w żywych organizmach (lub liniach komórkowych) w wyniku ekspresji rekombinowanego DNA. Rekombinowany DNA jest
Bardziej szczegółowoMetody odczytu kolejności nukleotydów - sekwencjonowania DNA
Metody odczytu kolejności nukleotydów - sekwencjonowania DNA 1. Metoda chemicznej degradacji DNA (metoda Maxama i Gilberta 1977) 2. Metoda terminacji syntezy łańcucha DNA - klasyczna metoda Sangera (Sanger
Bardziej szczegółowo2. Enzymy pozwalające na manipulację DNA a. Polimerazy DNA b. Nukleazy c. Ligazy
Metody analizy DNA 1. Budowa DNA. 2. Enzymy pozwalające na manipulację DNA a. Polimerazy DNA b. Nukleazy c. Ligazy 3. Klonowanie in vivo a. w bakteriach, wektory plazmidowe b. w fagach, kosmidy c. w drożdżach,
Bardziej szczegółowoPolimeraza Taq (1U/ l) 1-2 U 1 polimeraza Taq jako ostatni składniki mieszaniny końcowa objętość
Ćwiczenie 6 Technika PCR Celem ćwiczenia jest zastosowanie techniki PCR do amplifikacji fragmentu DNA z bakterii R. leguminosarum bv. trifolii TA1 (RtTA1). Studenci przygotowują reakcję PCR wykorzystując
Bardziej szczegółowoPowodzenie reakcji PCR wymaga właściwego doboru szeregu parametrów:
Powodzenie reakcji PCR wymaga właściwego doboru szeregu parametrów: dobór warunków samej reakcji PCR (temperatury, czas trwania cykli, ilości cykli itp.) dobór odpowiednich starterów do reakcji amplifikacji
Bardziej szczegółowoĆwiczenie 7 Klonowanie DNA w wektorach plazmidowych
Ćwiczenie 7 Klonowanie DNA w wektorach plazmidowych Celem ćwiczenia jest sklonowanie fragmentu DNA (powielonego techniką PCR i wyizolowanego z żelu agarozowego na poprzednich zajęciach) do wektora plazmidowego
Bardziej szczegółowoHybrydyzacja kwasów nukleinowych
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych Jaka jest lokalizacja genu na chromosomie? Jakie jest jego sąsiedztwo? Hybrydyzacja - powstawanie stabilnych struktur dwuniciowych z cząsteczek jednoniciowych o komplementarnych
Bardziej szczegółowoTaqNova-RED. Polimeraza DNA RP20R, RP100R
TaqNova-RED Polimeraza DNA RP20R, RP100R RP20R, RP100R TaqNova-RED Polimeraza DNA Rekombinowana termostabilna polimeraza DNA Taq zawierająca czerwony barwnik, izolowana z Thermus aquaticus, o przybliżonej
Bardziej szczegółowoWybrane techniki badania białek -proteomika funkcjonalna
Wybrane techniki badania białek -proteomika funkcjonalna Proteomika: umożliwia badanie zestawu wszystkich (lub prawie wszystkich) białek komórkowych Zalety analizy proteomu np. w porównaniu z analizą trankryptomu:
Bardziej szczegółowoZakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: BIOLOGIA MOLEKULARNA
Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: BIOLOGIA MOLEKULARNA Zakład Biologii Molekularnej Wydział Farmaceutyczny, WUM ul. Banacha 1, 02-097 Warszawa tel. 22 572 0735, 606448502
Bardziej szczegółowoGenetyczne modyfikowanie organizmów Kierunek OCHRONA ŚRODOWISKA, II rok semestr letni 2015/16
Genetyczne modyfikowanie organizmów Kierunek OCHRONA ŚRODOWISKA, II rok semestr letni 2015/16 Ćwiczenie 3 Identyfikacja genetycznie modyfikowanych roślin w produktach spożywczych - jakościowe badanie obecności
Bardziej szczegółowoBiologia medyczna, materiały dla studentów
Zasada reakcji PCR Reakcja PCR (replikacja in vitro) obejmuje denaturację DNA, przyłączanie starterów (annealing) i syntezę nowych nici DNA (elongacja). 1. Denaturacja: rozplecenie nici DNA, temp. 94 o
Bardziej szczegółowoPCR - ang. polymerase chain reaction
PCR - ang. polymerase chain reaction łańcuchowa (cykliczna) reakcja polimerazy Technika PCR umożliwia otrzymywanie dużej liczby kopii specyficznych fragmentów DNA (czyli amplifikację zwielokrotnienie fragmentu
Bardziej szczegółowoTECHNIKI ANALIZY RNA TECHNIKI ANALIZY RNA TECHNIKI ANALIZY RNA
DNA 28SRNA 18/16S RNA 5SRNA mrna Ilościowa analiza mrna aktywność genów w zależności od wybranych czynników: o rodzaju tkanki o rodzaju czynnika zewnętrznego o rodzaju upośledzenia szlaku metabolicznego
Bardziej szczegółowoHybrydyzacja kwasów nukleinowych
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych Jaka jest lokalizacja tego genu na chromosomie? Jakie jest jego sąsiedztwo? Hybrydyzacja - powstawanie stabilnych struktur dwuniciowych z cząsteczek jednoniciowych o komplementarnych
Bardziej szczegółowoSYLABUS. Wydział Biologiczno-Rolniczy. Katedra Biochemii i Biologii Komórki
SYLABUS 1.1. PODSTAWOWE INFORMACJE O PRZEDMIOCIE/MODULE Nazwa przedmiotu/ modułu Biologia molekularna Kod przedmiotu/ modułu* Wydział (nazwa jednostki prowadzącej kierunek) Nazwa jednostki realizującej
Bardziej szczegółowoTaqNovaHS. Polimeraza DNA RP902A, RP905A, RP910A, RP925A RP902, RP905, RP910, RP925
TaqNovaHS RP902A, RP905A, RP910A, RP925A RP902, RP905, RP910, RP925 RP902A, RP905A, RP910A, RP925A RP902, RP905, RP910, RP925 TaqNovaHS Polimeraza TaqNovaHS jest mieszaniną termostabilnej polimerazy DNA
Bardziej szczegółowoAnalizy wielkoskalowe w badaniach chromatyny
Analizy wielkoskalowe w badaniach chromatyny Analizy wielkoskalowe wykorzystujące mikromacierze DNA Genotypowanie: zróżnicowane wewnątrz genów RNA Komórka eukariotyczna Ekspresja genów: Które geny? Poziom
Bardziej szczegółowoDr. habil. Anna Salek International Bio-Consulting 1 Germany
1 2 3 Drożdże są najprostszymi Eukariontami 4 Eucaryota Procaryota 5 6 Informacja genetyczna dla każdej komórki drożdży jest identyczna A zatem każda komórka koduje w DNA wszystkie swoje substancje 7 Przy
Bardziej szczegółowoProteomika: umożliwia badanie zestawu wszystkich lub prawie wszystkich białek komórkowych
Proteomika: umożliwia badanie zestawu wszystkich lub prawie wszystkich białek komórkowych Zalety w porównaniu z analizą trankryptomu: analiza transkryptomu komórki identyfikacja mrna nie musi jeszcze oznaczać
Bardziej szczegółowoNowoczesne systemy ekspresji genów
Nowoczesne systemy ekspresji genów Ekspresja genów w organizmach żywych GEN - pojęcia podstawowe promotor sekwencja kodująca RNA terminator gen Gen - odcinek DNA zawierający zakodowaną informację wystarczającą
Bardziej szczegółowoGENOMIKA FUNKCJONALNA. Jak działają geny i genomy? Poziom I: Analizy transkryptomu
GENOMIKA FUNKCJONALNA Jak działają geny i genomy? Poziom I: Analizy transkryptomu Adnotacja (ang. annotation) pierwszy etap po uzyskaniu kompletnej sekwencji nukleotydyowej genomu analiza bioinformatyczna
Bardziej szczegółowoKLONOWANIE DNA REKOMBINACJA DNA WEKTORY
KLONOWANIE DNA Klonowanie DNA jest techniką powielania fragmentów DNA DNA można powielać w komórkach (replikacja in vivo) W probówce (PCR) Do przeniesienia fragmentu DNA do komórek gospodarza potrzebny
Bardziej szczegółowoMATERIAŁY DO BLOKU INŻYNIERIA GENETYCZNA
MATERIAŁY DO BLOKU INŻYNIERIA GENETYCZNA 1. AMPLIFIKACJA FRAGMENTU DNA METODĄ PCR Otrzymywanie dużej liczby kopii określonego fragmentu DNA możliwe jest przy zastosowaniu procedur klonowania lub znacznie
Bardziej szczegółowoAmpliTest Babesia spp. (PCR)
AmpliTest Babesia spp. (PCR) Zestaw do wykrywania sekwencji DNA specyficznych dla pierwotniaków z rodzaju Babesia techniką PCR Nr kat.: BAC21-100 Wielkość zestawu: 100 oznaczeń Objętość pojedynczej reakcji:
Bardziej szczegółowoInżynieria genetyczna
Inżynieria genetyczna i technologia rekombinowanego DNA Dr n. biol. Urszula Wasik Zakład Biologii Medycznej Inżynieria genetyczna świadoma, celowa, kontrolowana ingerencja w materiał genetyczny organizmów
Bardziej szczegółowoGENOMIKA FUNKCJONALNA. Jak działają geny i genomy? Poziom I: Analizy transkryptomu
GENOMIKA FUNKCJONALNA Jak działają geny i genomy? Poziom I: Analizy transkryptomu Adnotacja (ang. annotation) pierwszy etap po uzyskaniu kompletnej sekwencji nukleotydyowej genomu analiza bioinformatyczna
Bardziej szczegółowoMetody badania ekspresji genów
Metody badania ekspresji genów dr Katarzyna Knapczyk-Stwora Warunki wstępne: Proszę zapoznać się z tematem Metody badania ekspresji genów zamieszczonym w skrypcie pod reakcją A. Lityńskiej i M. Lewandowskiego
Bardziej szczegółowoZestaw do wykrywania Chlamydia trachomatis w moczu lub w kulturach komórkowych
Nr kat. PK15 Wersja zestawu: 1.2016 Zestaw do wykrywania w moczu lub w kulturach komórkowych na 50 reakcji PCR (50µl), włączając w to kontrole Detekcja oparta jest na amplifikacji fragmentu genu crp (cysteine
Bardziej szczegółowoJaka jest lokalizacja genu na chromosomie? Jakie jest jego sąsiedztwo?
Jaka jest lokalizacja genu na chromosomie? Jakie jest jego sąsiedztwo? Hybrydyzacja - powstawanie stabilnych struktur dwuniciowych z cząsteczek jednoniciowych o komplementarnych sekwencjach nukleotydów
Bardziej szczegółowoMapowanie fizyczne genomów -konstrukcja map wyskalowanych w jednostkach fizycznych -najdokładniejszą mapą fizyczną genomu, o największej
Mapowanie fizyczne genomów -konstrukcja map wyskalowanych w jednostkach fizycznych -najdokładniejszą mapą fizyczną genomu, o największej rozdzielczości jest sekwencja nukleotydowa -mapowanie fizyczne genomu
Bardziej szczegółowoWybrane techniki badania białek -proteomika funkcjonalna
Wybrane techniki badania białek -proteomika funkcjonalna Proteomika: umożliwia badanie zestawu wszystkich (lub prawie wszystkich) białek komórkowych Zalety analizy proteomu w porównaniu z analizą trankryptomu:
Bardziej szczegółowoProgram ćwiczeń z inżynierii genetycznej KP-III rok Biologii
Program ćwiczeń z inżynierii genetycznej KP-III rok Biologii Ćwiczenie 1 i 2: Metody izolacji, oczyszczania DNA kolokwium wstępne: sprawdzenie podstawowych wiadomości z zakresu genetyki, i biologii molekularnej
Bardziej szczegółowoPCR - ang. polymerase chain reaction
PCR - ang. polymerase chain reaction łańcuchowa (cykliczna) reakcja polimerazy Technika PCR umożliwia otrzymywanie dużej liczby kopii specyficznych fragmentów DNA (czyli amplifikację zwielokrotnienie fragmentu
Bardziej szczegółowoPCR - ang. polymerase chain reaction
PCR - ang. polymerase chain reaction łańcuchowa (cykliczna) reakcja polimerazy Technika PCR umożliwia otrzymywanie dużej liczby kopii specyficznych fragmentów DNA (czyli amplifikację zwielokrotnienie fragmentu
Bardziej szczegółowoOznaczenie polimorfizmu genetycznego cytochromu CYP2D6: wykrywanie liczby kopii genu
Ćwiczenie 4 Oznaczenie polimorfizmu genetycznego cytochromu CYP2D6: wykrywanie liczby kopii genu Wstęp CYP2D6 kodowany przez gen występujący w co najmniej w 78 allelicznych formach związanych ze zmniejszoną
Bardziej szczegółowoMetody analizy genomu
Metody analizy genomu 1. Mapowanie restrykcyjne. 2. Sondy do rozpoznawania DNA 3. FISH 4. Odczytanie sekwencji DNA 5. Interpretacja sekwencji DNA genomu 6. Transkryptom 7. Proteom 1. Mapy restrykcyjne
Bardziej szczegółowoMieszanina trójfosforanów deoksyrybonukleotydów (dntp: datp, dgtp, dctp, dttp) Bufor reakcyjny zapewniający odpowiednie warunki reakcji
Uniwersytet Gdański, Wydział Biologii Biologia i Biologia medyczna II rok Katedra Biologii Molekularnej Przedmiot: Biologia Molekularna z Biotechnologią =================================================================
Bardziej szczegółowoPCR łańcuchowa reakcja polimerazy
PCR łańcuchowa reakcja polimerazy PCR - ang. polymerase chain reaction Technika PCR umożliwia otrzymywanie dużej liczby kopii specyficznych fragmentów DNA (czyli amplifikację zwielokrotnienie fragmentu
Bardziej szczegółowoEkspresja genów heterogenicznych w drożdżach Pichia pastoris
Ekspresja genów heterogenicznych w drożdżach Pichia pastoris Ekspresja genów heterogenicznych w drożdżach Pichia pastoris Drożdże Pichia pastoris należą do drożdży metanolotroficznych tj. zdolnych do wykorzystywania
Bardziej szczegółowoPrzeglądanie bibliotek
Przeglądanie bibliotek Czyli jak złapać (i sklonować) ciekawy gen? Klonowanie genów w oparciu o identyczność lub podobieństwo ich sekwencji do znanego już DNA Sonda homologiczna (komplementarna w 100%)
Bardziej szczegółowoTransformacja pośrednia składa się z trzech etapów:
Transformacja pośrednia składa się z trzech etapów: 1. Otrzymanie pożądanego odcinka DNA z materiału genetycznego dawcy 2. Wprowadzenie obcego DNA do wektora 3. Wprowadzenie wektora, niosącego w sobie
Bardziej szczegółowoBiologia Molekularna Podstawy
Biologia Molekularna Podstawy Budowa DNA Budowa DNA Zasady: Purynowe: adenina i guanina Pirymidynowe: cytozyna i tymina 2 -deoksyryboza Grupy fosforanowe Budowa RNA Budowa RNA Zasady: purynowe: adenina
Bardziej szczegółowoDrożdżowe systemy ekspresyjne
Drożdże Drożdżowe systemy ekspresyjne Zalety: możliwość uzyskania dużej biomasy modyfikacje postranslacyjne eksprymowanych białek transport eksprymowanych białek do pożywki Duża biomasa W przypadku hodowli
Bardziej szczegółowoOznaczenie polimorfizmu genetycznego cytochromu CYP2D6: wykrywanie liczby kopii genu
Ćwiczenie 4 Oznaczenie polimorfizmu genetycznego cytochromu CYP2D6: wykrywanie liczby kopii genu Wstęp CYP2D6 kodowany przez gen występujący w co najmniej w 78 allelicznych formach związanych ze zmniejszoną
Bardziej szczegółowowykład dla studentów II roku biotechnologii Andrzej Wierzbicki
Genetyka ogólna wykład dla studentów II roku biotechnologii Andrzej Wierzbicki Uniwersytet Warszawski Wydział Biologii andw@ibb.waw.pl http://arete.ibb.waw.pl/private/genetyka/ Ekspresja genów jest regulowana
Bardziej szczegółowoZestaw do wykrywania Anaplasma phagocytophilum w kleszczach, krwi i hodowlach komórkowych
Nr kat. PK24N Wersja zestawu: 1.2016 Zestaw do wykrywania phagocytophilum w kleszczach, krwi i hodowlach komórkowych dwie oddzielne reakcje PCR 2x50 reakcji PCR (50 µl), włączając w to kontrole Detekcja
Bardziej szczegółowowykład dla studentów II roku biotechnologii Andrzej Wierzbicki
Genetyka ogólna wykład dla studentów II roku biotechnologii Andrzej Wierzbicki Uniwersytet Warszawski Wydział Biologii andw@ibb.waw.pl http://arete.ibb.waw.pl/private/genetyka/ 1. Gen to odcinek DNA odpowiedzialny
Bardziej szczegółowoĆwiczenie 3. Amplifikacja genu ccr5 Homo sapiens wykrywanie delecji Δ32pz warunkującej oporność na wirusa HIV
Ćwiczenie 3. Amplifikacja genu ccr5 Homo sapiens wykrywanie delecji Δ32pz warunkującej oporność na wirusa HIV Cel ćwiczenia Określenie podatności na zakażenie wirusem HIV poprzez detekcję homo lub heterozygotyczności
Bardziej szczegółowoĆwiczenie 3 PCR i trawienie DNA enzymami restrykcyjnymi
Uniwersytet Gdański, Wydział Biologii Katedra Genetyki Molekularnej Bakterii Katedra Biologii i Genetyki Medycznej Katedra Biologii Molekularnej Biologia i Biologia Medyczna II rok Przedmiot: Biologia
Bardziej szczegółowoNajważniejsze z nich to: enzymy restrykcyjne wektory DNA inne enzymy np. ligazy, fosfatazy, polimerazy, nukleazy
Aby manipulować genami niezbędne są odpowiednie narzędzia molekularne, które pozwalają uzyskać tzw. zrekombinowane DNA (umożliwiają rekombinację materiału genetycznego in vitro czyli w próbówce) Najważniejsze
Bardziej szczegółowoNajważniejsze z nich to: enzymy restrykcyjne wektory DNA inne enzymy np. ligazy, fosfatazy, polimerazy, nukleazy
Aby manipulować genami niezbędne są odpowiednie narzędzia molekularne, które pozwalają uzyskać tzw. zrekombinowane DNA (umożliwiają rekombinację materiału genetycznego in vitro czyli w próbówce) Najważniejsze
Bardziej szczegółowoMETODY MOLEKULARNE STOSOWANE W TAKSONOMII
METODY MOLEKULARNE STOSOWANE W TAKSONOMII AUTOR: MAGDALENA DUDEK Taksonomia jest nauką, której głównym celem jest badanie, opisywanie oraz klasyfikacja organizmów. W oparciu o różnice i podobieństwa łączy
Bardziej szczegółowoGENOMIKA FUNKCJONALNA. Jak działają geny i genomy? Poziom I: Analizy transkryptomu
GENOMIKA FUNKCJONALNA Jak działają geny i genomy? Poziom I: Analizy transkryptomu Adnotacja (ang. annotation) pierwszy etap po uzyskaniu kompletnej sekwencji nukleotydyowej genomu analiza bioinformatyczna
Bardziej szczegółowoSYLABUS. Wydział Biologiczno-Rolniczy. Katedra Biochemii i Biologii Komórki
SYLABUS 1.1. PODSTAWOWE INFORMACJE O PRZEDMIOCIE/MODULE Nazwa przedmiotu/ modułu Biologia molekularna z elementami inżynierii genetycznej Kod przedmiotu/ modułu* Wydział (nazwa jednostki prowadzącej kierunek)
Bardziej szczegółowoZestaw do wykrywania Babesia spp. i Theileria spp. w kleszczach, krwi i hodowlach komórkowych
Nr kat. PK25N Wersja zestawu: 1.2012 Zestaw do wykrywania spp. i Theileria spp. w kleszczach, krwi i hodowlach komórkowych dwie oddzielne reakcje PCR 2x50 reakcji PCR (50 µl), włączając w to kontrole Zestaw
Bardziej szczegółowoWektory DNA - klonowanie molekularne
Wektory DNA - klonowanie molekularne Fragment DNA (np. pojedynczy gen) można trwale wprowadzić do komórek gospodarza (tzn. zmusić go do powielania w tym gospodarzu) tylko wtedy, gdy zostanie on wbudowany
Bardziej szczegółowoĆwiczenie 2. Identyfikacja płci z wykorzystaniem genu amelogeniny (AMGXY)
Ćwiczenie 2. Identyfikacja płci z wykorzystaniem genu amelogeniny (AMGXY) Cel ćwiczenia Amplifikacja fragmentu genu amelogeniny, znajdującego się na chromosomach X i Y, jako celu molekularnego przydatnego
Bardziej szczegółowoSubstancje stosowane do osadzania enzymu na stałym podłożu Biotyna (witamina H, witamina B 7 ) Tworzenie aktywnej powierzchni biosensorów
SEKWECJWAIE ASTĘPEJ GEERACJI- GS Losowa fragmentacja nici DA Dołączanie odpowiednich linkerów (konstrukcja biblioteki) Amplifikacja biblioteki na podłożu szklanym lub plastikowym biosensory Wielokrotnie
Bardziej szczegółowoBiotechnologia i inżynieria genetyczna
Wersja A Test podsumowujący rozdział II i inżynieria genetyczna..................................... Imię i nazwisko.............................. Data Klasa oniższy test składa się z 16 zadań. rzy każdym
Bardziej szczegółowoPodstawy inżynierii genetycznej
Metody bioinformatyki Podstawy inżynierii genetycznej prof. dr hab. Jan Mulawka Czym jest inżynieria genetyczna Zbiór technik rekombinowania i klonowania DNA Wydzielanie i charakteryzowanie pojedyńczych
Bardziej szczegółowoMetody: PCR, MLPA, Sekwencjonowanie, PCR-RLFP, PCR-Multiplex, PCR-ASO
Diagnostyka molekularna Dr n.biol. Anna Wawrocka Strategia diagnostyki genetycznej: Aberracje chromosomowe: Metody:Analiza kariotypu, FISH, acgh, MLPA, QF-PCR Gen(y) znany Metody: PCR, MLPA, Sekwencjonowanie,
Bardziej szczegółowoTRANSKRYPCJA - I etap ekspresji genów
Eksparesja genów TRANSKRYPCJA - I etap ekspresji genów Przepisywanie informacji genetycznej z makrocząsteczki DNA na mniejsze i bardziej funkcjonalne cząsteczki pre-mrna Polimeraza RNA ETAP I Inicjacja
Bardziej szczegółowoMetody badania polimorfizmu/mutacji DNA. Aleksandra Sałagacka Pracownia Diagnostyki Molekularnej i Farmakogenomiki Uniwersytet Medyczny w Łodzi
Metody badania polimorfizmu/mutacji DNA Aleksandra Sałagacka Pracownia Diagnostyki Molekularnej i Farmakogenomiki Uniwersytet Medyczny w Łodzi Mutacja Mutacja (łac. mutatio zmiana) - zmiana materialnego
Bardziej szczegółowoĆWICZENIE 1 i 2 Modyfikacja geu wołowej beta-laktoglobuliny przy użyciu metody Overlap Extension PCR (wydłużania nakładających się odcinków)
ĆWICZENIE 1 i 2 Modyfikacja geu wołowej beta-laktoglobuliny przy użyciu metody Overlap Extension PCR (wydłużania nakładających się odcinków) Celem ćwiczenia jest wprowadzenie mutacji punktowej do genu
Bardziej szczegółowo7. Metody molekularne jako źródło informacji botanicznej i lichenologicznej
7. Metody molekularne jako źródło informacji botanicznej i lichenologicznej 7.2. Metody biologii molekularnej (technika PCR, sekwencjonowanie DNA) wykorzystywane w taksonomii roślin Autor: Magdalena Dudek
Bardziej szczegółowoFarmakogenetyka Biotechnologia Medyczna I o
ĆWICZENIE 2 Oznaczanie polimorfizmu cytochromu CYP2D6 za pomocą tradycyjnych metod biologii molekularnej: PCR-RFLP I. Łańcuchowa reakcja polimerazy PCR (polymerase chain reaction) Technika PCR rozwinęła
Bardziej szczegółowoProwadzący: dr Lidia Boss znacznik fluorescencyjny (np. SYBR Green II)
Uniwersytet Gdański, Wydział Biologii Biologia i Biologia Medyczna II rok Katedra Biologii Molekularnej Przedmiot: Biologia Molekularna z Biotechnologią ============================================================================
Bardziej szczegółowoWektory DNA - klonowanie molekularne
Wektory DNA - klonowanie molekularne Fragment DNA (np. pojedynczy gen) można trwale wprowadzić do komórek gospodarza (tzn. zmusić go do powielania w tym gospodarzu) tylko wtedy, gdy zostanie on wbudowany
Bardziej szczegółowoĆwiczenia 2-4 KLONOWANIE DNA
Ćwiczenia 2-4 KLONOWANIE DNA Klonowanie DNA jest podstawową techniką biologii molekularnej umożliwiającą powielenie określonego fragmentu DNA (najczęściej genu) w komórkach gospodarza np. bakteriach Escherichia
Bardziej szczegółowoENZYMY RESTRYKCYJNE ENZYMY RESTRYKCYJNE CZYM RÓŻNIĄ SIĘ POSZCZEGÓLNE ENZYMY? nazewnictwo: EcoRV
ENZYMY RESTRYKCYJNE Enzymy z klasy endonukleaz (hydrolaz), wykazujące powinowactwo do specyficznych fragmentów dwuniciowych cząsteczek DNA i hydrolizujące wiązania fosfodiestrowe w obu niciach Naturalnie
Bardziej szczegółowoInżynieria genetyczna- 6 ECTS. Inżynieria genetyczna. Podstawowe pojęcia Część II Klonowanie ekspresyjne Od genu do białka
Inżynieria genetyczna- 6 ECTS Część I Badanie ekspresji genów Podstawy klonowania i różnicowania transformantów Kolokwium (14pkt) Część II Klonowanie ekspresyjne Od genu do białka Kolokwium (26pkt) EGZAMIN
Bardziej szczegółowoTATA box. Enhancery. CGCG ekson intron ekson intron ekson CZĘŚĆ KODUJĄCA GENU TERMINATOR. Elementy regulatorowe
Promotory genu Promotor bliski leży w odległości do 40 pz od miejsca startu transkrypcji, zawiera kasetę TATA. Kaseta TATA to silnie konserwowana sekwencja TATAAAA, występująca w większości promotorów
Bardziej szczegółowoWykład 14 Biosynteza białek
BIOCHEMIA Kierunek: Technologia Żywności i Żywienie Człowieka semestr III Wykład 14 Biosynteza białek WYDZIAŁ NAUK O ŻYWNOŚCI I RYBACTWA CENTRUM BIOIMMOBILIZACJI I INNOWACYJNYCH MATERIAŁÓW OPAKOWANIOWYCH
Bardziej szczegółowoTematyka zajęć z biologii
Tematyka zajęć z biologii klasy: I Lp. Temat zajęć Zakres treści 1 Zapoznanie z przedmiotowym systemem oceniania, wymaganiami edukacyjnymi i podstawą programową Podstawowe zagadnienia materiału nauczania
Bardziej szczegółowoInstrukcje do ćwiczeń oraz zakres materiału realizowanego na wykładach z przedmiotu Inżynieria bioprocesowa na kierunku biotechnologia
1 Zakład Mikrobiologii UJK Instrukcje do ćwiczeń oraz zakres materiału realizowanego na wykładach z przedmiotu Inżynieria bioprocesowa na kierunku biotechnologia 2 Zakład Mikrobiologii UJK Zakres materiału
Bardziej szczegółowoPOLIMERAZY DNA- PROCARYOTA
Enzymy DNA-zależne, katalizujące syntezę DNA wykazują aktywność polimerazy zawsze w kierunku 5 3 wykazują aktywność polimerazy zawsze wobec jednoniciowej cząsteczki DNA do utworzenia kompleksu z ssdna
Bardziej szczegółowoĆwiczenie 3 Oznaczenie polimorfizmu genetycznego cytochromu CYP2D6 metodą PCR w czasie rzeczywistym (rtpcr) przy użyciu sond typu TaqMan
Ćwiczenie 3 Oznaczenie polimorfizmu genetycznego cytochromu CYP2D6 metodą PCR w czasie rzeczywistym (rtpcr) przy użyciu sond typu TaqMan Klasyczna metoda PCR jest metodą jakościową, nie ilościową co np.
Bardziej szczegółowoWPROWADZENIE DO GENETYKI MOLEKULARNEJ
WPROWADZENIE DO GENETYKI MOLEKULARNEJ Replikacja organizacja widełek replikacyjnych Transkrypcja i biosynteza białek Operon regulacja ekspresji genów Prowadzący wykład: prof. dr hab. Jarosław Burczyk REPLIKACJA
Bardziej szczegółowoRT31-020, RT , MgCl 2. , random heksamerów X 6
RT31-020, RT31-100 RT31-020, RT31-100 Zestaw TRANSCRIPTME RNA zawiera wszystkie niezbędne składniki do przeprowadzenia syntezy pierwszej nici cdna na matrycy mrna lub całkowitego RNA. Uzyskany jednoniciowy
Bardziej szczegółowoSaccharomyces Transformer Kit zestaw do przygotowywania i transformacji komórek kompetentnych Saccharomyces cerevisiae. Metoda chemiczna.
Saccharomyces Transformer Kit zestaw do przygotowywania i transformacji komórek kompetentnych Saccharomyces cerevisiae. Metoda chemiczna. wersja 0916 6 x 20 transformacji Nr kat. 4010-120 Zestaw zawiera
Bardziej szczegółowoAmpliTest Salmonella spp. (Real Time PCR)
AmpliTest Salmonella spp. (Real Time PCR) Zestaw do wykrywania sekwencji DNA specyficznych dla bakterii z rodzaju Salmonella techniką Real Time PCR Nr kat.: BAC01-50 Wielkość zestawu: 50 oznaczeń Objętość
Bardziej szczegółowoWPROWADZENIE DO GENETYKI MOLEKULARNEJ
WPROWADZENIE DO GENETYKI MOLEKULARNEJ Replikacja organizacja widełek replikacyjnych Transkrypcja i biosynteza białek Operon regulacja ekspresji genów Prowadzący wykład: prof. dr hab. Jarosław Burczyk REPLIKACJA
Bardziej szczegółowoPL B1. UNIWERSYTET PRZYRODNICZY W LUBLINIE, Lublin, PL BUP 26/11
PL 214501 B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 214501 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 391458 (51) Int.Cl. C12Q 1/68 (2006.01) C12N 15/29 (2006.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej
Bardziej szczegółowoAmpliTest GMO screening-nos (Real Time PCR)
AmpliTest GMO screening-nos (Real Time PCR) Zestaw do wykrywania sekwencji DNA terminatora NOS techniką Real Time PCR Nr kat.: GMO03-50 GMO03-100 Wielkość zestawu: 50 reakcji 100 reakcji Objętość pojedynczej
Bardziej szczegółowoE.coli Transformer Kit
E.coli Transformer Kit zestaw do przygotowywania i transformacji komórek kompetentnych Escherichia coli. Metoda chemiczna. wersja 1117 6 x 40 transformacji Nr kat. 4020-240 Zestaw zawiera komplet odczynników
Bardziej szczegółowoTechniki molekularne w mikrobiologii SYLABUS A. Informacje ogólne
Techniki molekularne w mikrobiologii A. Informacje ogólne Elementy sylabusu Nazwa jednostki prowadzącej kierunek Nazwa kierunku studiów Poziom kształcenia Profil studiów Forma studiów Rodzaj Rok studiów
Bardziej szczegółowoOlimpiada Biologiczna
Olimpiada Biologiczna Informator narzędzia bioinformatyczne Katarzyna Grudziąż, Takao Ishikawa Warszawa, luty 2019 r. Bioinformatyka to dziedzina nauki łącząca w sobie wiedzę z dziedziny biologii z wykorzystaniem
Bardziej szczegółowo