(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2012/50 EP B1 (13) (51) T3 Int.Cl. A61K 39/395 ( ) A61K 31/00 ( ) A61P 35/00 ( ) (54) Tytuł wynalazku: Terapia raka opornego na platynę (30) Pierwszeństwo: US P (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2007/09 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 2013/05 (73) Uprawniony z patentu: Genentech, Inc., South San Francisco, US (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 STEPHEN M. KELSEY, Montara, US (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Iwona Płodzich-Hennig JAN WIERZCHOŃ & PARTNERZY BIURO PATENTÓW I ZNAKÓW TOWAROWYCH SP.J. ul. Żurawia 47/ Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 15679/12/P-RO/ IH EP Opis: Dziedzina Wynalazku Terapia raka opornego na platynę [0001] Wynalazek dotyczy przeciwciała skierowanego przeciw HER2, które skutecznie hamuje dimeryzację HER, jak również gemcytabiny, do stosowania w sposobie leczenia opornego na platynę raka jajnika, pierwotnego raka otrzewnej lub raka jajowodów. Tło Wynalazku Przeciwciała HER [0002] Rodzina HER receptorowych kinaz tyrozynowych stanowi ważne mediatory wzrostu, różnicowania i przeżywania komórek. Ta rodzina receptorów obejmuje czterech odrębnych przedstawicieli, obejmujących receptor naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR, ErbB1 lub HER1), HER2 (ErbB2 lub p185 neu ), HER3 (ErbB3) i HER4 (ErbB4 lub tyro2). [0003] EGFR, kodowanemu przez gen erbb1, przypisano udział w przyczynach nowotworów złośliwych u ludzi. W szczególności, zwiększoną ekspresję EGFR obserwowano w raku sutka, pęcherza, płuc, głowy, szyi i żołądka, jak również w glejakach. Zwiększonej ekspresji receptora EGFR często towarzyszy zwiększone wytwarzanie liganda EGFR przez te same komórki nowotworowe, transformującego czynnika wzrostu alfa (TGF-α), prowadząc do aktywacji receptora na autokrynnym szlaku stymulacji. Baselga i Mandelsohn, Pharmac. Ther. 64: (1994). Przeciwciała monoklonalne skierowane przeciw EGFR lub jego ligandom, TGF-α i EGF, oceniano jako środki terapeutyczne w leczeniu takich nowotworów złośliwych. Patrz np. Baselga i Mandelsohn, wyżej; Masui i współpracownicy, Cancer Research 44: (1984); i Wu i współpracownicy, J. Clin. Invest. 95: (1995). [0004] Drugiego przedstawiciela rodziny HER, p185 neu, pierwotnie zidentyfikowano jako produkt transformującego genu nerwiaka niedojrzałego chemicznie traktowanych szczurów. Zaktywowana postać protoonkogenu neu powstaje w wyniku punktowej mutacji (walina do kwasu glutaminowego) w transbłonowym regionie kodowanego białka. Amplifikację ludzkiego homologu neu obserwuje się w rakach sutka i jajników i jest ona skorelowana ze złą prognozą (Slamon i współpracownicy, Science, 235: (1987); Slamon i współpracownicy, Science 244: (1989) i opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer ). Dotychczas nie donoszono dla nowotworów ludzkich o mutacji punktowej, analogicznej do tej w protoonkogenie neu. Nadekspresję HER2 (często, ale nie zawsze z powodu amplifikacji genu) obserwowano również w innych rakach, obejmujących raka żołądka, śluzówki macicy (endometrium), gruczołu ślinowego, płuc, nerki, okrężnicy, tarczycy, trzustki i pęcherza moczowego. Patrz, między innymi, King i współpracownicy, Science, 229: 974 (1985); Yokota i współpracownicy, Lancet: 1: (1986); Fukushige i współpracownicy, Mol. Cell. Biol., 6: (1986); Geurin i współpracownicy, Oncogene Res. 3: (1988); Cohen i współpracownicy, Oncogene, 4: (1989); Yonemura i współpracownicy, Cancer Res., 51: 1034 (1991); Borst i współpracownicy, Gynecol. Oncol.

3 - 2-38: 364 (1990); Weiner i współpracownicy, Cancer Res., 50: (1990); Kern i współpracownicy, Cancer Res. 50: 5184 (1990); Park i współpracownicy, Cancer Res., 49: 6605 (1989); Zhau i współpracownicy, Mol. Carcinog., 3: (1990); Aasland i współpracownicy, Br. J. Cancer. 57: (1988); Williams i współpracownicy, Pathobiology 59: (1991) i McCann i współpracownicy, Cancer 65: (1990). HER2 może ulegać nadekspresji w raku gruczołu krokowego (Gu i współpracownicy, Cancer Lett. 99: (1996); Ross i współpracownicy, Hum. Pathol. 28: (1997); Ross i współpracownicy, Cancer 79: (1997) i Sadasivan i współpracownicy, J. Urol. 150: (1993)). [0005] Opisano przeciwciała skierowane przeciw białkowym produktom p185 neu szczura i HER2 człowieka. Drebin i współpracownicy otrzymali przeciwciała skierowane przeciw produktowi genu neu szczura, p185 neu. Patrz, na przykład, Drebin i współpracownicy, Cell 41: (1985); Myers i współpracownicy, Meth. Enzym. 198: (1991) i WO 94/ Drebin i współpracownicy, Oncogene 2: (1988) donoszą, że w wyniku stosowania mieszanin przeciwciał reaktywnych wobec dwóch odrębnych regionów p185 neu uzyskuje się synergistyczne działanie przeciwnowotworowe wobec transformowanych neu komórek NIH-3T3 wszczepionych myszom atymicznym(ang. nude). Patrz również opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer , wydany 20 października 1998 r. [0006] Hudziak i współpracownicy, Mol. Cell. Biol. 9(3): (1989) opisują tworzenie panelu przeciwciał [skierowanych przeciwko] HER2, które scharakteryzowano stosując linię komórek ludzkiego nowotworu sutka, SK-BR-3. Względną proliferację komórkową komórek SK-BR-3 po ekspozycji na przeciwciała określano przez wybarwianie fioletem krystalicznym monowarstw po 72 godzinach. Stosując to oznaczenie, maksymalne hamowanie otrzymano dla przeciwciała nazwanego 4D5, które hamowało proliferację komórkową o 56%. Inne przeciwciała w panelu obniżały proliferację komórkową w tym oznaczeniu w mniejszym stopniu. Stwierdzono ponadto, że przeciwciało 4D5 uwrażliwia linie komórkowe nowotworu sutka, w których zachodzi nadekspresja HER2, na cytotoksyczne działanie TNF-α. Patrz również opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer , wydany 14 października 1997 r. Przeciwciała skierowane przeciw HER2, omówione w Hudziak i współpracownicy, scharakteryzowano ponadto w Fendly i współpracownicy, Cancer Research 50: (1990); Kotts i współpracownicy, In Vitro 26 (3): 59A (1990); Sarup i współpracownicy, Growth Regulation 1: (1991); Shepard i współpracownicy, J. Clin. Immunol. 11(3): (1991); Kumar i współpracownicy, Mol. Cell. Biol. 11(2): (1991); Lewis i współpracownicy, Cancer Immunol. Immunother. 37: (1993); Pietras i współpracownicy, Oncogene 9: (1994); Vitetta i współpracownicy, Cancer Research 54: (1994); Sliwkowski i współpracownicy, J. Biol. Chem. 269 (20): (1994); Scott i współpracownicy, J. Biol. Chem. 266: (1991); D'souza i współpracownicy, Proc. Natl. Acad. Sci. 91: (1994); Lewis i współpracownicy, Cancer Research 56: (1996) i Schaefer i współpracownicy, Oncogene 15: (1997).

4 - 3 - [0007] Rekombinowana, humanizowana wersja mysiego przeciwciała przeciw HER2, 4D5, (humab4d5-8, rhumab HER2, Trastuzumab lub HERCEPTIN, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer ) jest klinicznie aktywna u pacjentów z przerzutowymi rakami sutka nadeksprymującymi HER2, którzy uprzednio przeszli intensywną terapię przeciwrakową (Baselga i współpracownicy, J. Clin. Oncol. 14: (1996)). Trastuzumab uzyskał zatwierdzenie do sprzedaży z Food and Drug Administration 25 września 1998 r. do leczenia pacjentów z przerzutowym rakiem sutka, w nowotworach których zachodzi nadekspresja białka HER2. [0008] Inne przeciwciała przeciw HER2 o różnych właściwościach opisano w Tagliabue i współpracownicy, Int. J. Cancer 47: (1991); McKenzie i współpracownicy, Oncogene 4: (1989); Maier i współpracownicy, Cancer Res. 51: (1991); Bacus i współpracownicy, Molecular Carcinogenesis 3: (1990); Stancovski i współpracownicy, PNAS (USA) 88: (1991); Bacus i współpracownicy, Cancer Research 52: (1992); Xu i współpracownicy, Int. J. Cancer 53: (1993); WO94/00136; Kasprzyk i współpracownicy, Cancer Research 52: (1992); Hancock i współpracownicy, Cancer Res. 51: (1991); Shawver i współpracownicy, Cancer Res. 54: (1994); Arteaga i współpracownicy, Cancer Res. 54: (1994); Harwerth i współpracownicy, J. Biol. Chem. 267: (1992); opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr i Klapper i współpracownicy, Oncogene 14: (1997). [0009] W wyniku przesiewowych poszukiwań homologii zidentyfikowano dwóch innych przedstawicieli rodziny receptorów HER, HER3 (opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach i , jak również Kraus i współpracownicy, PNAS (USA) 86: (1989)) i HER4 (europejskie zgłoszenie patentowe numer ; Plowman i współpracownicy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: (1993) i Plowman i współpracownicy, Nature 366: (1993)). Oba z tych receptorów wykazują zwiększoną ekspresję w co najmniej niektórych liniach komórkowych raka sutka. [0010] Ogólnie receptory HER występują w różnych kombinacjach w komórkach i uważa się, że heterodimeryzacja zwiększa różnorodność komórkowych odpowiedzi na szereg różnorodnych ligandów HER (Earp i współpracownicy, Breast Cancer Research and Treatment 35: (1995)). EGFR jest wiązany przez sześć różnych ligandów: naskórkowy czynnik wzrostu (EGF), transformujący czynnik wzrostu alfa (TGF-α), amfiregulinę, wiążący heparynę naskórkowy czynnik wzrostu, betacellulinę i epiregulinę (Groenen i współpracownicy, Growth Factors 11: (1994)). Rodzina białek heregulin, powstających w wyniku alternatywnego splicingu pojedynczego genu, jest ligandami dla HER3 i HER4. Rodzina heregulin obejmuje hereguliny alfa, beta i gamma (Holmes i współpracownicy, Science 256: (1992); opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer ; i Schaefer i współpracownicy, Oncogene 15: (1997)); czynniki różnicowania neu (NDF), glejowe czynniki wzrostu (GGF); aktywność indukującą receptory acetylocholinowe (ARIA) i czynnik neuronów czuciowych i ruchowych (SMDF). Prace przeglądądowe - patrz Groenen i współpracownicy, Growth Factors 11:

5 - 4 - (1994); Lemke, G. Molec. & Cell. Neurosci. 7: (1996) i Lee i współpracownicy, Pharm. Rev. 47: (1995). Ostatnio zidentyfikowano trzy dodatkowe ligandy HER: neuregulinę-2 (NRG-2), o której donoszono, że wiąże albo HER3 albo HER4 (Chang i współpracownicy, Nature 387: (1997); i Carraway i współpracownicy, Nature 387: (1997)); neuregulinę-3, która wiąże HER4 (Zhang i współpracownicy, PNAS (USA) 94 (18): (1997)); i neuregulinę-4, która wiąże HER4 (Harari i współpracownicy, Oncogene 18: (1999) HB-EGF, betacellulina i epiregulina również wiążą się z HER4. [0011] O ile EGF i TGFα nie wiążą HER2, EGF stymuluje EGFR i HER2 do tworzenia heterodimeru, co aktywuje EGFR i skutkuje transfosforylacją HER2 w heterodimerze. Dimeryzacja i/lub transfosforylacja wydaje się aktywować kinazę tyrozynową HER2. Patrz Earp i współpracownicy, wyżej. Podobnie, gdy HER3 ulega koekspresji z HER2, tworzony jest aktywny kompleks sygnałowy i przeciwciała skierowane przeciw HER2 są zdolne do niszczenia tego kompleksu (Sliwkowski i współpracownicy, J. Biol. Chem. 269 (20): (1994)). Dodatkowo, powinowactwo HER3 wobec hereguliny (HRG) zwiększa się do stanu wyższego powinowactwa, jeśli ulega koekspresji z HER2. Odnośnie kompleksu białek HER2-HER3, patrz również Levi i współpracownicy, Journal of Neuroscience 15: (1995); Morrissey i współpracownicy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: (1995); i Lewis i współpracownicy, Cancer Res. 56: (1996). HER4, podobnie jak HER3, tworzy aktywny kompleks sygnałowy z HER2 (Carraway i Cantley, Cell 78: 5-8 (1994)). Rak Jajnika [0012] Rak jajnika jest najczęstszą przyczyną zgonów wśród nowotworów złośliwych żeńskich narządów rozrodczych. Szacuje się, że jest zdiagnozowanych nowych przypadków rocznie w Stanach Zjednoczonych, z około zgonów z powodu tej choroby. Pacjentki z zaawansowanym rakiem jajnika często leczy się stosując chemioterapię opartą na platynie, często w połączeniu z taksanem. Gdy te środki zawiodły, istnieje mało opcji terapeutycznych. Pacjentki z chorobą wrażliwą na platynę są często ponownie poddawane leczeniu platyną, ale u znacznej części z nich występuje krótki czas odpowiedzi po ponownym leczeniu. Dla tych z chorobą oporną na platynę wynik jest mniej korzystny. Topotekan jest zatwierdzony przez Food and Drug Administration (FDA) dla pacjentek, u których zawiodła początkowa lub kolejna chemioterapia; liposomalna doksorubicyna jest dopuszczona tylko dla pacjentek z rakiem jajnika, który jest oporny na schematy chemioterapii opartej zarówno na platynie, jak i paklitakselu. Topotekan i liposomalna doksorubicyna wykazały stopień częściowej odpowiedzi odpowiednio 6% i 12%, u pacjentek z chorobą oporną na platynę, z medianą czasu przeżycia bez progresji tygodni. Ostatnio doniesiono o obiecujących wynikach dla zastosowania gemcytabiny w raku jajnika opornym na platynęy, z częściowymi odpowiedziami na poziomie 16%, co prowadzi do zwiększenia wykorzystania tego środka jako terapii drugiego rzutu. Jednak istnieje wyraźna potrzeba nowych i ulepszonych opcji terapeutycznych dla pacjentek z zaawansowanym rakiem jajnika, dla których dotychczasowe terapie zawiodły.

6 - 5 - [0013] Rodzinie ErbB lub receptorów ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu (HER) receptorowych kinaz tyrozynowych przypisuje się zaangażowanie w patogenezę raka jajnika. Aby działać na szlak sygnałowy HER, pertuzumab (rhumab 2C4) został opracowany jako humanizowane przeciwciało, które hamuje dimeryzację HER2 z innymi receptorami HER, w ten sposób hamując kierowaną ligandem fosforylację i aktywację, i dalszą aktywację ścieżek RAS i AKT. [0014] Gemcytabinę stosowano w różnych nowotworach i jest ona wskazana do stosowania w raku trzustki i płuc. Najczęstsze toksyczności z wykorzystaniem pojedynczego środka gemcytabiny obejmują cytopenie, z częstością występowania niedokrwistości i neutropenii odpowiednio 68% i 63%. Inną typową toksycznością są nudności i wymioty, z łączną częstością występowania 69%, z 13% częstością występowania stopnia III i 1% stopnia IV. Biegunka występuje rzadziej, u 19%. Wysypka występuje częściej, u 30%, z tylko 1% częstości występowania stopnia III. Gemcytabinę łączono z wieloma innymi środkami chemioterapeutycznymi, takimi jak taksany, antracykliny i związki platyny, bez znaczącego wzrostu lub nieoczekiwanych toksyczności. [0015] Trastuzumab łączono z gemcytabiną w kilku kombinacjach różnych chemioterapii w badaniach fazy II i również był dobrze tolerowany, nie obserwowano sercowych lub nieoczekiwanych toksyczności. Safran i współpracownicy Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 20:130 (2001), Miller i współpracownicy, Oncology 15 (2): (2001). Patrz również, Zinner i współpracownicy, Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 20:328 (2001), Nagourney i współpracownicy, Breast Cancer Res. Treat. 57:116, Abstract 475 (1999), Bun i współpracownicy, Proc. Am. Assoc. Canc. Res. 41:719, Abstract # 4571 (2000), Konecny i współpracownicy, Breast Cancer Res Treat 57: 114, Abstract 467 (1999), O'Shaugnessy i współpracownicy, Sem. Oncol 2 (suppl3):22-26 (2004), Sledge i współpracownicy, Sem. Oncol. 2 (suppl3) :19-21 (2003), Zinner i współpracownicy, Lung Cancer 44 (1) : (2004), Gatzemeier i współpracownicy, Ann Oncol. 15: (2004), dotyczące kombinacji trastuzumabu i gemcytabiny. [0016] W fazie I badań Omnitargu w monoterapii do leczenia guzów litych, 3 pacjentki z zaawansowanym rakiem jajnika leczono pertuzumabem. U jednej otrzymano trwałą częściową odpowiedź, a dodatkowa osoba miała ustabilizowaną chorobę przez 15 tygodni. Agus i współpracownicy, Proc. Am Soc Clin Oncol 22: 192, Abstract 771 (2003). Streszczenie Wynalazku [0017] Wynalazek dotyczy, w pierwszym aspekcie, przeciwciała skierowanego przeciw HER2 według zastrzeżenia 1 lub zastrzeżenia 2. [0018] W innym aspekcie, wynalazek dostarcza przeciwciała przeciw HER2 według zastrzeżenia 31. [0019] W jeszcze innym aspekcie, wynalazek dotyczy przeciwciała przeciw HER2 według zastrzeżenia 32. Krótki Opis Rysunków

7 - 6 - [0020] Figury 1A i 1B przedstawiają mapowanie epitopowe reszt w obrębie domeny zewnątrzkomórkowej (ECD) HER2 (sekwencję aminokwasową, włącznie z sekwencją sygnałową, przedstawiono na Fig. 1A; SEQ ID NO: 13), jak ustalono na drodze analizy skróconych mutantów i ukierunkowanej mutagenezy (Nakamura i współpracownicy, J. of Virology 67 (10): (1993); i Renz i współpracownicy, J. Cell Biol. 125 (6): (1994)). Różne skrócone wersje lub mutacje punktowe HER2-ECD otrzymano z cdna stosując technikę reakcji łańcuchowej polimerazy. Ekspresję mutantów HER2 prowadzono w postaci białek fuzyjnych z gd w plazmidzie ekspresyjnym ssaka. Taki plazmid ekspresyjny wykorzystuje promotor/sekwencję wzmacniającą cytomegalowirusa z sygnałami terminacji i poliadenylacji SV40 położonymi za wstawionym cdna. Plazmidowym DNA transfekowano komórki 293. Jeden dzień po transfekcji komórki znakowano metabolicznie przez noc w wolnym od metioniny i cysteiny podłożu DMEM o niskim stężeniu glukozy, zawierającym 1% dializowaną płodową surowicę bydlęcą i 25 μci każdej z 35 S-metioniny i 35 S-cysteiny. Supernatanty zbierano i do supernatantu dodawano albo przeciwciała monoklonalne skierowane przeciw HER2, albo przeciwciała kontrolne, i inkubowano przez 2-4 godziny w temperaturze 4 C. Kompleksy wytrącano, nakładano na 10-20% żel gradientowy z SDS i Tricine, i poddano elektroforezie przy napięciu 100 V. Białka z żelu przenoszono na membranę przez transfer elektryczny i analizowano za pomocą autoradiografii. Jak przedstawiono na Fig. 1B, przeciwciała HER2 7C2, 7F3, 2C4, 7D3, 3E8, 4D5, 2H11 i 3H4 wiążą różne epitopy ECD HER2. Figury 2A i 2B przedstawiają wpływ monoklonalnych przeciwciał przeciw HER2, 2C4 i 7F3, na aktywację rhrgβ1 komórek MCF7. Fig. 2A przedstawia krzywe dawka-odpowiedź dla hamowania za pomocą 2C4 lub 7F3 stymulacji przez HRG fosforylacji tyrozyny. Fig. 2B przedstawia krzywe dawka-odpowiedź dla hamowania przez 2C4 lub 7F3 wiązania rhrgβ znakowanego 125 I z komórkami MCF7. Figura 3 przedstawia hamowanie specyficznego wiązania rhrgβ znakowanego 125 I do panelu linii komórkowych ludzkich nowotworów przez skierowane przeciw HER2 przeciwciała monoklonalne 2C4 lub 7F3. Kontrolami dla przeciwciał monoklonalnych są mysie przeciwciała monoklonalne o takim samym izotypie, które nie blokują wiązania rhrg. Niespecyficzne wiązanie rhrgβ znakowanego 125 I oznaczano w równoległych inkubacjach prowadzonych w obecności 100 nm rhrgβ1. Wartości niespecyficznego wiązania rhrgβ znakowanego 125 I były niższe niż 1% całości dla wszystkich testowanych linii komórkowych. Figury 4A i 4B przedstawiają wpływ monoklonalnych przeciwciał 2C4 i 4D5 na proliferację komórek MDA-MB-175 (Fig. 4A) i SK-BR-3 (fig. 4B). Komórki MDA-MB-175 i SK-BR-3 wysiano na 96-studzienkowych płytkach i umożliwiano przyleganie przez 2 godziny. Doświadczenie prowadzono w pożywce zawierającej 1% surowicę. Dodano przeciwciała skierowane przeciw HER2 lub samą pożywkę i komórki inkubowano przez 2 godziny w temperaturze 37 C. Następnie dodano HRGβ1 (1 nm) lub samą pożywkę i komórki inkubowano przez 4 dni. Monowarstwy przemyto i wybarwiono/utrwalono 0,5% fioletem

8 - 7 - krystalicznym. W celu określenia proliferacji komórek zmierzono absorbancję przy długości fali 540 nm. Figury 5A i 5B przedstawiają wpływ monoklonalnego przeciwciała 2C4, przeciwciała Trastuzumab lub przeciwciała skierowanego przeciw EGFR na zależną od hereguliny (HRG) asocjację HER2 z HER3 w komórkach MCF7, eksprymujących HER2 na niskich/normalnych poziomach (Fig. 5A), i w komórkach SK-BR-3, eksprymujących HER2 na wysokich poziomach (Fig. 5B); patrz Przykład 2 poniżej. Figury 6A i 6B porównują aktywności nienaruszonego mysiego przeciwciała monoklonalnego 2C4 (mu 2C4) i chimerycznego fragmentu Fab 2C4. Fig. 6A przedstawia hamowanie wiązania 125 I-HRG z komórkami MCF7 przez chimeryczny Fab 2C4 lub nienaruszone mysie przeciwciało monoklonalne 2C4. Komórki MCF7 wysiewano w płytkach 24-studzienkowych (1 x 10 5 komórek / studzienkę) i hodowano do uzyskania 85% konfluencji przez dwa dni. Doświadczenia dotyczące wiązania prowadzono jak opisano w Lewis i współpracownicy, Cancer Research 56: (1996). Fig. 6B przedstawia hamowanie aktywacji przez rhrgβ1 fosforylacji tyrozyny p180 w komórkach MCF7 przeprowadzone jak opisano w Lewis i współpracownicy, Cancer Research 56: (1996). Figury 7A i 7B przedstawiają przyrównania (alignment) sekwencji aminokwasowych domeny zmiennej łańcucha lekkiego (V L ) (Fig. 7A) i domeny zmiennej łańcucha ciężkiego (V H ) (Fig. 7B) mysiego przeciwciała monoklonalnego 2C4 (SEQ ID nr 1 i 2, odpowiednio); domen V L i V H humanizowanej wersji 2C4, 574, (SEQ ID nr 3 i 4, odpowiednio) i ludzkich sekwencji konsensusowych zrębów V L i V H (hum κ1, łańcuch lekki kappa podgrupy I, humiii, łańcuch ciężki podgrupy III) (SEQ ID nr 5 i 6, odpowiednio). Gwiazdki wskazują różnice pomiędzy humanizowaną wersją 2C4, 574, a mysim przeciwciałem monoklonalnym 2C4, lub pomiędzy humanizowaną wersją 2C4, 574, a ludzką sekwencją zrębu. Regiony determinujące komplementarność (CDR) są w nawiasach. Figury 8A do 8C przedstawiają wiązanie chimerycznego Fab 2C4 (Fab.v1) i kilku humanizowanych wariantów 2C4 z zewnątrzkomórkową domeną HER2 (ECD), jak określono za pomocą testu ELISA w Przykładzie 3. Figura 9 jest wstęgowym diagramem domen V L i V H monoklonalnego przeciwciała 2C4 z oznaczonym białym szkieletem CDR (L1, L2, L3, H1, H2, H3). Pokazano również łańcuchy boczne V H ocenione przez mutagenezę podczas humanizowania (patrz Przykład 3, Tablica 2). Figura 10 przedstawia wpływ monoklonalnego przeciwciała 2C4 lub Trastuzumab na aktywację aktywowanej mitogenem kinazy białkowej (MAPK) za pośrednictwem EGF, TGFα lub HRG. Figury 11A i 11B przedstawiają sekwencje aminokwasowe łańcucha lekkiego Trastuzumabu (SEQ ID NO: 14) i łańcucha ciężkiego Trastuzumabu (SEQ ID NO: 15), odpowiednio. Figury 12A i 12B przedstawiają sekwencje aminokwasowe lekkiego łańcucha Pertuzumabu (SEQ ID NO: 16) i ciężkiego łańcucha Pertuzumabu (SEQ ID NO: 17), odpowiednio.

9 - 8 - Figura 13 przedstawia schematycznie wiązanie 2C4 w heterodimerycznym miejscu wiązania HER2, zapobiegając w ten sposób heterodimeryzacji z aktywowanym EGFR lub HER3. Figura 14 przedstawia sprzężenie HER2/HER3 ze ścieżkami MAPK i Akt. Figura 15 porównuje aktywność Trastuzumabu i Pertuzumabu. Figura 16 przedstawia schematycznie różne domeny HER2. Szczegółowy opis korzystnych przykładów wykonania I Definicje. [0021] "Receptor HER" oznacza receptorową, białkową kinazę tyrozynową, która należy do rodziny receptorów HER, i obejmuje receptory EGFR, HER2, HER3 i HER4 i innych przedstawicieli tej rodziny pozostających do zidentyfikowania w przyszłości. Receptor HER będzie generalnie zawierać domenę zewnątrzkomórkową, która może wiązać ligand HER; lipofilową domenę transbłonową; konserwowaną, wewnątrzkomórkową domenę kinazy tyrozynowej; i karboksy-końcową domenę sygnałową, niosącą kilka reszt tyrozynowych, które mogą być fosforylowane. Receptor HER może oznaczać receptor HER "o natywnej sekwencji" lub jego "wariant sekwencji aminokwasowej". Korzystnie, receptor HER jest ludzkim receptorem HER o natywnej sekwencji. [0022] Domena zewnątrzkomórkowa HER2 obejmuje cztery domeny, Domenę I (reszty aminokwasowe od około 1-195), Domenę II (reszty aminokwasowe od około ), Domenę III (reszty aminokwasowe od około ) i Domenę IV (reszty aminokwasowe od około ) (numeracja reszt bez peptydu sygnałowego). Patrz Garrett i współpracownicy, Mol. Cell. 11: (2003), Cho i współpracownicy, Nature 421: (2003), Franklin i współpracownicy, Cancer Cell 5: (2004) lub Plowman i współpracownicy, Proc. Natl. Acad. Sci. 90: (1993), i tu Fig. 16. [0023] Terminy "ErbB1", "HER1", "receptor naskórkowego czynnika wzrostu" i "EGFR" stosuje się tu wymiennie i dotyczą EGFR jak ujawniono, na przykład, w Carpenter i współpracownicy, Ann. Rev. Biochem. 56: (1987), w tym naturalnie występujących postaci zmutowanych (np. delecyjnego mutanta EGFR, jak w Humphrey i współpracownicy, PNAS (USA) 87: (1990)). erbb1 dotyczy genu kodującego białkowy produkt EGFR. [0024] Wyrażenia "ErbB2" i "HER2" stosuje się tu wymiennie i dotyczą one ludzkich białek HER2 opisanych, na przykład, w Semba i współpracownicy, PNAS (USA) 82: (1985) i Yamamoto i współpracownicy, Nature 319: (1986) (Numer dostępu Genebank X03363). Termin "erbb2" dotyczy genu kodującego ludzki ErbB2, natomiast "neu" dotyczy genu kodującego szczurzy p185 neu. Korzystnym HER2 jest ludzki HER2 o natywnej sekwencji. [0025] "ErbB3" i "HER3" dotyczą polipeptydu receptorowego jak ujawniono, na przykład, w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach i , jak również w Kraus i współpracownicy, PNAS (USA) 86: (1989).

10 - 9 - [0026] Terminy "ErbB4" i "HER4" dotyczą tu polipeptyduo receptorowego jak ujawniono, na przykład, w europejskim zgłoszeniu patentowym nr ; Plowman i współpracownicy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: (1993) i Plowman i współpracownicy, Nature, 366: (1993), włącznie z jego izoformami, na przykład, jak ujawniono w WO99/19488, opublikowanym 22 kwietnia [0027] Przez "ligand HER" rozumie się polipeptyd, który wiąże się z i / lub aktywuje receptor HER. Ligandem HER będącym przedmiotem szczególnego zainteresowania tutaj jest ludzki ligand HER o natywnej sekwencji, taki jak naskórkowy czynnik wzrostu (EGF) (Savage i współpracownicy, J. Biol. Chem. 247: (1972)), transformujący czynnik wzrostu alfa (TGF-α) (Marquardt i współpracownicy, Science 223: (1984)), amfiregulina, znana również jako autokrynny czynnik wzrostu nerwiaka osłonkowego lub keratynocytów (Shoyab i współpracownicy, Science 243: (1989); Kimura i współpracownicy, Nature 348: (1990) i Cook i współpracownicy, Mol. Cell. Biol. 11: (1991)); betacellulina (Shing i współpracownicy, Science 259: (1993) i Sasada i współpracownicy, Biochem. Biophys. Res. Commun. 190:1173 (1993)); wiążący heparynę naskórkowy czynnik wzrostu (HB-EGF) (Higashiyama i współpracownicy, Science 251: (1991)); epiregulina (Toyoda i współpracownicy, J. Biol. Chem. 270: (1995); i Komurasaki i współpracownicy, Oncogene 15: (1997)); heregulina (patrz poniżej); neuregulina-2 (NRG-2) (Carraway i współpracownicy, Nature 387: (1997)); neuregulina-3 (NRG-3) (Zhang i współpracownicy, Proc. Natl. Natl. Acad. Sci. 94: (1997)); neuregulina-4 (NRG-4) (Harari i współpracownicy, Oncogene 18: (1999)) lub cripto (CR-1) (Kannan i współpracownicy, J. Biol. Chem. 272 (6): (1997)). Ligandy HER, które wiążą EGFR, obejmują EGF, TGF-α, amfiregulinę, betacellulinę, HB- EGF i epiregulinę. Ligandy HER, które wiążą HER3, obejmują hereguliny. Ligandy HER zdolne do wiązania HER4 obejmują betacellulinę, epiregulinę, HB-EGF, NRG-2, NRG-3, NRG-4 i hereguliny. [0028] Termin "heregulina" (HRG), jak tu stosowany, dotyczy polipeptydu, kodowanego przez produkt genu hereguliny, jak ujawniono w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr lub Marchionni i współpracownicy, Nature, 362: (1993). Przykłady heregulin obejmują heregulinę-α, heregulinę-β1, heregulinę-β2 i heregulinę-β3 (Holmes i współpracownicy, Science, 256: (1992) i opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr ); czynnik różnicowania neu (NDF) (Peles i współpracownicy, Cell 69: (1992)); aktywność indukującą receptory acetylocholinowe (ARIA) (Falls i współpracownicy, Cell 72: (1993)); glejowe czynniki wzrostu (GGFs) (Marchionni i współpracownicy, Nature, 362: (1993)); czynnik neuronów czuciowych i ruchowych (SMDF) (Ho i współpracownicy, J. Biol. Chem. 270: (1995)); heregulinę γ (Schaefer i współpracownicy, Oncogene 15: (1997)). Termin obejmuje biologicznie aktywne fragmenty i / lub warianty sekwencji aminokwasowej polipeptydu HRG o natywnej sekwencji, takie jak jego fragment odpowiadający domenie EGF-podobnej (np. HRGβ ).

11 [0029] Termin "dimer HER" niniejszym oznacza niekowalencyjnie związany dimer, zawierający co najmniej dwa różne receptory HER. Takie kompleksy mogą się tworzyć, gdy komórka eksprymująca dwa lub więcej receptory HER eksponowana jest na ligand HER, i można je izolować przez immunoprecypitację i analizować przez SDS-PAGE, jak opisano, na przykład, w Sliwkowski i współpracownicy, J. Biol. Chem., 269 (20): (1994). Przykłady takich dimerów HER obejmują heterodimery EGFR-HER2, HER2-HER3 i HER3- HER4. Ponadto, dimer HER może zawierać dwa lub więcej receptorów HER2 połączonych z innym receptorem HER, takim jak HER3, HER4 lub EGFR. Inne białka, takie jak podjednostka receptora cytokin (np. gp130) mogą być związane z dimerem. [0030] "Heterodimeryczne miejsce wiązania" na HER2, dotyczy regionu w zewnątrzkomórkowej domenie HER2, który kontaktuje się lub graniczy z regionem w zewnątrzkomórkowej domenie EGFR, HER3 lub HER4 przy tworzenia z nim dimeru. Region ten znajduje się w Domenie II HER2. Franklin i współpracownicy, Cancer Cell 5: (2004). [0031] Termin "aktywacja HER" lub "aktywacja HER2" dotyczy aktywacji lub fosforylacji, dowolnego jednego lub więcej z receptorów HER, lub receptorów HER2. Ogólnie, aktywacja HER prowadzi do transdukcji sygnału (np. tej powodowanej przez wewnątrzkomórkową domenę kinazy receptora HER fosforylującego reszty tyrozynowe w receptorze HER lub polipeptydowym substracie). Aktywacja HER może odbywać się za pośrednictwem wiązania liganda HER z dimerem HER, zawierającym receptor HER będący przedmiotem zainteresowania. Wiązanie liganda HER z dimerem HER może aktywować domenę kinazy jednego lub więcej z receptorów HER w dimerze i tym samym powoduje fosforylację reszt tyrozynowych jednego lub więcej receptorów HER i/lub fosforylację reszt tyrozynowych w dodatkowym (dodatkowych) polipeptydowym substracie (substratach), takim jak wewnątrzkomórkowe kinazy Akt lub MAPK. [0032] Polipeptydem o natywnej sekwencji" jest polipeptyd, który posiada taką samą sekwencję aminokwasową, jak polipeptyd (np. receptor HER lub ligand HER) pochodzenia naturalnego. Takie polipeptydy o natywnej sekwencji można izolować z przyrody lub można wytwarzać stosując sposoby rekombinacyjne lub syntetyczne. Tak więc, polipeptyd o natywnej sekwencji może posiadać sekwencję aminokwasową naturalnie występującego polipeptydu ludzkiego, polipeptydu mysiego lub polipeptydu jakiegokolwiek innego gatunku ssaka. [0033] Termin "wariant sekwencji aminokwasowej" dotyczy polipeptydów posiadających sekwencje aminokwasowe, które w pewnym zakresie różnią się od polipeptydu o sekwencji natywnej. Zwykle, warianty sekwencji aminokwasowej posiadają co najmniej około 70% homologii z co najmniej jedną domeną wiążącą receptor natywnego liganda HER lub z co najmniej jedną domeną wiążącą ligand natywnego receptora HER, i korzystnie będą one w co najmniej około 80%, bardziej korzystnie w co najmniej około 90% homologiczne z takimi domenami wiążącymi receptor lub ligand. Warianty sekwencji aminokwasowych posiadają substytucje, delecje i/lub insercje w niektórych pozycjach sekwencji aminokwasowej w stosunku do natywnej sekwencji aminokwasowej.

12 [0034] "Homologię" definiuje się jako procent reszt w wariancie sekwencji aminokwasów, które są identyczne po dopasowaniu (alignment) sekwencji i wprowadzeniu przerw, jeśli to konieczne, w celu osiągnięcia maksymalnego procentu homologii. Metody i programy komputerowe do dopasowywania sekwencji są dobrze znane w tej dziedzinie. Jednym z takich programów komputerowych jest "Align 2", autorstwa Genentech, Inc, który został złożony wraz z dokumentacją dla użytkownika w United States Copyright Office, Washington, DC 20559, w dniu 10 grudnia 1991 roku. [0035] Termin "przeciwciało" stosuje się tu w najszerszym znaczeniu i w szczególności obejmuje nienaruszone przeciwciała monoklonalne, przeciwciała poliklonalne, przeciwciała multispecyficzne (np. przeciwciała bispecyficzne), utworzone z co najmniej dwóch nienaruszonych przeciwciał, i fragmenty przeciwciał, o ile wykazują one pożądaną biologiczną aktywność. [0036] Termin "przeciwciało monoklonalne" w znaczeniu tu stosowanym dotyczy przeciwciała otrzymanego z populacji zasadniczo homogennych przeciwciał, tzn., poszczególne przeciwciała wchodzące w skład populacji są identyczne i / lub wiążą ten sam epitop, z wyjątkiem możliwych wariantów, które mogą pojawić się podczas produkcji przeciwciała monoklonalnego, zwykle takie warianty są obecne w niewielkich ilościach. W przeciwieństwie do preparatów przeciwciał poliklonalnych, które zwykle zawierają różne przeciwciała skierowane przeciw różnym determinantom (epitopom), każde przeciwciało monoklonalne jest skierowane przeciw pojedynczej determinancie na antygenie. Oprócz ich specyficzności, przeciwciała monoklonalne są korzystne, ponieważ nie są one zanieczyszczone innymi immunoglobulinami. Określenie "monoklonalne" wskazuje na charakter przeciwciała, jako otrzymanego z zasadniczo homogennej populacji przeciwciał, i nie oznacza ono wymagania wytwarzania przeciwciała jakąkolwiek określoną metodą. Na przykład, przeciwciała monoklonalne, które mają być stosowane według wynalazku mogą być wytwarzane metodą hybrydomy, po raz pierwszy opisaną przez Kohler i współpracownicy, Nature, 256:495 (1975), lub mogą być wytworzone metodami rekombinacji DNA (patrz np., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer ). "Przeciwciała monoklonalne" mogą być również wyizolowane z bibliotek fagowych przeciwciał przy użyciu technik opisanych, na przykład, w Clackson i współpracownicy, Nature, 352: (1991), i Marks i współpracownicy, J. Mol. Biol., 222: (1991). [0037] Przeciwciała monoklonalne obejmują tu szczególnie przeciwciała "chimeryczne", w których część łańcucha ciężkiego i / lub lekkiego jest identyczna z lub homologiczna do odpowiadających sekwencji w przeciwciałach pochodzących z określonego gatunku lub należących do określonej klasy lub podklasy przeciwciał, podczas gdy pozostała część łańcucha (łańcuchów) jest identyczna z lub homologiczna do odpowiadających sekwencji w przeciwciałach pochodzących z innego gatunku lub należących do innej klasy lub podklasy przeciwciał, jak również fragmenty takich przeciwciał, o ile wykazują one pożądaną aktywność biologiczną (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer , i Morrison i współpracownicy, Proc. Natl. Natl. Acad. Sci. Stanów Zjednoczonych Ameryki, 81: (1984)). Przeciwciała chimeryczne będące tu przedmiotem zainteresowania

13 obejmują przeciwciała "prymatyzowane (upodobnione do przeciwciał naczelnych)", zawierające wiążące antygen sekwencje domeny zmiennej, pochodzące od naczelnych innych niż człowiek (np. małp Starego Świata, małp człekokształtnych, itp.) i ludzkie sekwencje regionów stałych. [0038] "Fragmenty przeciwciał" obejmują część nienaruszonego przeciwciała, korzystnie zawierają jego region wiążący antygen lub zmienny. Przykłady fragmentów przeciwciał obejmują fragmenty Fab, Fab', F(ab') 2 i Fv; diciała (ang. diabodies); przeciwciała liniowe; jednołańcuchowe cząsteczki przeciwciał, i wielo-specyficzne przeciwciała utworzone z fragmentu (fragmentów) przeciwciał. [0039] "Nienaruszone przeciwciało" jest przeciwciałem, które zawiera wiążący antygen region zmienny, jak również domenę stałą łańcucha lekkiego (C L ) i domeny stałe łańcucha ciężkiego, C H 1, C H 2 i C H 3. Domeny stałe mogą być domenami stałymi o natywnych sekwencjach (ludzkimi domenami stałymi o natywnych sekwencjach) lub ich wariantem sekwencji aminokwasowej. Korzystnie, nienaruszone przeciwciało posiada jedną lub więcej funkcji efektorowych. [0040] "Funkcje efektorowe" przeciwciała dotyczą tych aktywności biologicznych, które można przypisać regionowi Fc (regionowi Fc o natywnej sekwencji lub regionowi Fc o wariancie sekwencji aminokwasowej) przeciwciała. Przykłady funkcji efektorowych przeciwciał obejmują wiązanie C1q, cytotoksyczność zależną od dopełniacza, wiązanie receptora Fc, zależną od przeciwciał cytotoksyczność komórkową (ADCC), fagocytozę, regulację w dół receptorów powierzchniowych komórki (np. receptora komórki B; BCR), itp. [0041] W zależności od sekwencji aminokwasowej domeny stałej swoich łańcuchów ciężkich, nienaruszone przeciwciała można przypisać do różnych "klas". Istnieje pięć głównych klas nienaruszonych przeciwciał: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a kilka z nich można dalej podzielić na "podklasy" (izotypy), np. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA i IgA2. Domeny stałe łańcuchów ciężkich, które odpowiadają różnym klasom przeciwciał, nazwano odpowiednio α, δ, ε, γ i μ. Struktury podjednostek i przestrzenne konfiguracje różnych klas immunoglobulin są dobrze znane. [0042] "Zależna od przeciwciał cytotoksyczność komórkowa" i "ADCC" dotyczą reakcji komórkowej, w której niespecyficzne komórki cytotoksyczne, w których zachodzi ekspresja receptorów Fc (FcR) (np. komórki naturalnych zabójców (NK), neutrofile i makrofagi) rozpoznają przeciwciało związane na komórce docelowej i następnie powodują lizę komórki docelowej. W głównych komórkach zaangażowanych w ADCC, komórkach NK, zachodzi ekspresja tylko FcγRlll, podczas gdy w monocytach zachodzi ekspresja FcγRI, FcγRll i FcγRlll. Ekspresję FcR na komórkach hematopoetycznych podsumowano w Tablicy 3 na str. 464 w Ravetch i Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: (1991). W celu oszacowania aktywności ADCC cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania, można przeprowadzić oznaczenie ADCC in vitro, takie jak to opisane w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer lub Użyteczne do takich oznaczeń komórki efektorowe obejmują komórki monojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) i komórki NK (naturalnych

14 zabójców). Alternatywnie, lub dodatkowo, aktywność ADCC cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania można oceniać in vivo, np. w modelu zwierzęcym, taki jak ujawniony w Clynes i współpracownicy, PNAS (USA) 95: (1998). [0043] "Ludzkimi komórkami efektorowymi" są leukocyty, w których zachodzi ekspresja jednego lub więcej FcR i które pełnią funkcje efektorowe. Korzystnie, w komórkach zachodzi ekspresja co najmniej FcγRIII i pełnią one funkcję efektorową ADCC. Przykłady ludzkich leukocytów, które zaangażowane są w ADCC, obejmują monojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC), komórki NK (naturalnych zabójców), monocyty, cytotoksyczne komórki T i neutrofile, korzystne są PBMC i komórki NK. Komórki efektorowe można izolować z ich naturalnego źródła, np. z krwi lub PBMC, jak tu opisano. [0044] Terminy "receptor Fc" lub "FcR" stosuje się do opisania receptora, który wiąże się z regionem Fc przeciwciała. Korzystnym FcR jest ludzki FcR o sekwencji natywnej. Ponadto, korzystnym FcR jest taki, który wiąże przeciwciało IgG (receptor gamma) i posiada receptory podklas FcγRI, FcγRII i FcγRIII, w tym z wariantami allelicznymi i postaciami tych receptorów powstającymi w wyniku alternatywnego składania eksonów. Receptory FcγRII obejmują FcγRIIA ("receptor aktywujący") i FcγRIIB ("receptor hamujący"), które posiadają podobne sekwencje aminokwasowe i różnią się głównie swoimi domenami cytoplazmatycznymi. Receptor aktywujący FcγRIIA zawiera motyw opartej na tyrozynie aktywacji immunoreceptora (ITAM) w swojej domenie cytoplazmatycznej. Receptor hamujący FcγRIIB zawiera motyw opartego na tyrozynie hamowania immunoreceptora w swojej domenie cytoplazmatycznej (patrz przegląd w M. Daëron, Annu. Rev. Immunol. 15: (1997)). Przeglądu FcR dokonano w Ravetch i Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: (1991); Capel i współpracownicy, Immunomethods 4: (1994) i de Haas i współpracownicy, J. Lab. Clin. Med. 126: (1995). Termin "FcR" obejmuje inne FcR, obejmujące te, które zostaną zidentyfikowane w przyszłości. Termin obejmuje również noworodkowy receptor FcRn, który jest odpowiedzialny za przenoszenie matczynych IgG do płodu ((Guyer i współpracownicy, J. Immunol. 117: 587 (1976) i Kim i współpracownicy, J. Immunol 24: 249 (1994)). [0045] "Cytotoksyczność zależna od dopełniacza" lub "CDC" dotyczy zdolności cząsteczki do lizowania celu w obecności dopełniacza. Ścieżkę aktywacji dopełniacza inicjuje wiązanie pierwszego składnika układu dopełniacza (C1q) z cząsteczką (np. przeciwciałem) skompleksowaną z odpowiednim antygenem. W celu ocenienia aktywacji dopełniacza można przeprowadzić oznaczenie CDC, np. jak opisano w Gazzano-Santoro i współpracownicy, J. Immunol. Methods 202: 163 (1996). [0046] "Natywne przeciwciała" są zwykle terotetramerycznymi glikoproteinami o masach około daltonów, złożonymi z dwóch identycznych łańcuchów lekkich (L) i dwóch identycznych łańcuchów ciężkich (H). Każdy łańcuch lekki połączony jest z łańcuchem ciężkim jednym kowalencyjnym wiązaniem disiarczkowym, podczas gdy liczba wiązań disiarczkowych występujących pomiędzy łańcuchami ciężkimi różnych izotypów immunoglobulin jest różna. Każdy łańcuch ciężki i lekki posiada również, w regularnych odstępach, wewnątrzłańcuchowe mostki disiarczkowe. Każdy łańcuch ciężki posiada na

15 jednym końcu domenę zmienną (V H ), po której następuje szereg domen stałych. Każdy łańcuch lekki posiada na jednym końcu domenę zmienną (V L ), i na drugim końcu domenę stałą. Domena stała łańcucha lekkiego jest położona równolegle do pierwszej domeny stałej łańcucha ciężkiego, i domena zmienna łańcucha lekkiego jest położona równolegle do domeny zmiennej łańcucha ciężkiego. Uważa się, że określone reszty aminokwasowe tworzą granicę pomiędzy domenami zmiennymi łańcucha lekkiego i łańcucha ciężkiego. [0047] Termin "zmienna" dotyczy faktu, że pewne części domen zmiennych znacząco różnią się sekwencją pomiędzy przeciwciałami i są wykorzystywane w wiązaniu i specyficzności każdego określonego przeciwciała z jego określonym antygenem. Jednak, zmienność nie jest równomiernie rozłożona w domenach zmiennych przeciwciał. Koncentruje się ona w trzech odcinkach, nazywanych regionami hiperzmiennymi, zarówno w domenach zmiennych łańcuchów lekkich, jak i łańcuchów ciężkich. Bardziej konserwatywne części domen zmiennych nazywane są regionami zrębu (FR). Każda z domen zmiennych natywnych łańcuchów ciężkich i lekkich zawiera cztery FR, w większości przyjmujące konfigurację struktury β, połączone przez trzy regiony hiperzmienne, tworzące pętle łączące, i w niektórych przypadkach tworzące część struktury β. Regiony hiperzmienne w każdym łańcuchu są utrzymywane w bliskim sąsiedztwie przez FR i, z regionami hiperzmiennymi drugiego łańcucha, biorą udział w tworzeniu wiążącego antygen miejsca przeciwciał (patrz Kabat i współpracownicy, Sequences of Proteins of Immunological Interst, 5 wyd., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Domeny stałe nie są bezpośrednio zaangażowane w wiązanie przeciwciała z antygenem, ale posiadają różne funkcje efektorowe, takie jak udział przeciwciała w zależnej od przeciwciał cytotoksyczności komórkowej (ADCC). [0048] Termin "region hiperzmienny" w znaczeniu tu stosowanym dotyczy reszt aminokwasowych przeciwciała, które są odpowiedzialne za wiązanie antygenu. Region hiperzmienny generalnie obejmuje reszty aminokwasowe z "regionu determinującego komplementarność" lub "CDR" (np. reszty (L1), (L2) i (L3) w domenie zmiennej łańcucha lekkiego i (H1), (H2) i (H3) w domenie zmiennej łańcucha ciężkiego; Kabat i współpracownicy, Sequences of Proteins of Immunological Interst, wyd. 5, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) i/lub te reszty z "hiperzmiennej pętli" (np. reszty (L1), (L2) i (L3) w domenie zmiennej łańcucha lekkiego i (H1), (H2) i (H3) w domenie zmiennej łańcucha ciężkiego; Chothia i Lesk, J. Mol. Biol. 196: (1987)). Resztami "regionu zrębowego" lub "FR" są te reszty domeny zmiennej, różniące się od reszt regionu hiperzmiennego, jak tu zdefiniowano. [0049] Trawienie przeciwciał papainą daje dwa identyczne fragmenty wiążące antygen, nazwane fragmentami "Fab", z których każdy posiada pojedyncze miejsce wiążące antygen, i pozostający fragment "Fc", którego nazwa odzwierciedla jego zdolność do łatwego krystalizowania. Traktowanie pepsyną daje fragment F(ab')2, który posiada dwa miejsca wiążące antygen i jest nadal zdolny do sieciowania antygenu.

16 [0050] "Fv" jest minimalnym fragmentem przeciwciała, który zawiera pełne miejsce rozpoznawania antygenu i miejsce wiązania antygenu. Region ten składa się z dimeru domeny zmiennej jednego łańcucha ciężkiego i jednego łańcucha lekkiego, połączonych silnym, nie kowalencyjnym wiązaniem. Jest on w takiej konfiguracji, że trzy regiony hiperzmienne każdej domeny zmiennej oddziałują dla zdefiniowania miejsca wiążącego antygen na powierzchni dimeru V H -V L. Wspólnie sześć regionów hiperzmiennych nadaje przeciwciału specyficzność wiązania antygenu. Jednak, nawet pojedyncza domena zmienna (lub połowa Fv, zawierająca tylko trzy hiperzmienne regiony specyficzne wobec antygenu) posiada zdolność rozpoznawania i wiązania antygenu, chociaż z niższym powinowactwem niż całe miejsce wiążące. [0051] Fragment Fab zawiera również domenę stałą łańcucha lekkiego i pierwszą domenę stałą (CH1) łańcucha ciężkiego. Fragmenty Fab' różnią się od fragmentów Fab dodatkiem kilku reszt na karboksylowym końcu domeny CH1 łańcucha ciężkiego, obejmujących jedną lub więcej cystein z regionu zawiasowego przeciwciała. Fab'-SH jest tu oznaczeniem dla Fab', w którym reszta (reszty) cysteinowe domen stałych posiadają co najmniej jedną wolną grupę tiolową. Fragmenty F(ab')2 przeciwciał pierwotnie utworzono jako pary fragmentów Fab', pomiędzy którymi występowały cysteiny zawiasowe. Znane są również inne chemiczne sposoby sprzęgania fragmentów przeciwciał. [0052] "Łańcuchy lekkie" przeciwciał z jakiegokolwiek gatunku kręgowca można, w oparciu o sekwencje aminokwasowe ich domen stałych, zakwalifikować do jednego z dwóch wyraźnie odrębnych typów, nazwanych kappa (κ) i lambda (λ). [0053] "Jednołańcuchowe Fv" lub "scfv" fragmenty przeciwciał zawierają domeny V H i V L przeciwciała, w których domeny te występują w pojedynczym łańcuchu polipeptydowym. Korzystnie, polipeptyd Fv zawiera ponadto polipeptydowy łącznik pomiędzy domenami V H i V L, który umożliwia utworzenie przez scfv żądanej struktury do wiązania antygenu. Przegląd dotyczący scfv patrz Plückthun, w: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, tom 113, Rosenburg i Moore, wyd., Springer-Verlag, Nowy Jork, str (1994). Fragmenty scfv przeciwciał przeciw HER2 opisano w WO93/16185, opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer i opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer [0054] Termin "diciała" dotyczy małych fragmentów przeciwciał z dwoma miejscami wiążącymi antygen, które to fragmenty zawierają zmienną domenę łańcucha ciężkiego (V H ) połączoną z domeną zmienną łańcucha lekkiego (V L ) w tym samym łańcuchu polipeptydowym (V H -V L ). Przez zastosowanie łącznika, który jest zbyt krótki, aby umożliwiał parowanie pomiędzy dwiema domenami tego samego łańcucha, wymusza się parowanie z komplementarnymi domenami innego łańcucha i tworzenie dwóch miejsc wiążących antygen. Diciała opisano dokładniej w, na przykład, europejskim opisie patentowym numer , WO 93/11161 i w Hollinger i współpracownicy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: (1993).

17 [0055] "Humanizowane" postacie przeciwciał gatunków innych niż człowiek (np. gryzoni) są chimerycznymi przeciwciałami, które zawierają minimalną sekwencję pochodzącą z immunoglobuliny gatunku innego niż człowiek. W większej części, przeciwciała humanizowane są immunoglobulinami ludzkimi (przeciwciało biorca), w których reszty z regionu hiperzmiennego biorcy zastąpiono resztami z regionu hiperzmiennego przeciwciała gatunku innego niż człowiek (przeciwciało dawca), takiego jak przeciwciała myszy, szczura, królika lub naczelnego, innego niż człowiek, posiadającego pożądaną specyficzność, powinowactwo i zdolność wiązania. W niektórych przypadkach reszty regionu zrębu immunoglobuliny ludzkiej zastępuje się odpowiadającymi resztami gatunku innego niż człowiek. Ponadto, przeciwciała humanizowane mogą zawierać reszty, które nie występują ani w przeciwciele biorcy, ani w przeciwciele dawcy. Modyfikacji tych dokonuje się w celu dalszego udoskonalenia wydajności przeciwciała. Generalnie, przeciwciało humanizowane zawierać będzie co najmniej jedną, a zwykle dwie domeny zmienne, w których wszystkie lub zasadniczo wszystkie hiperzmienne pętle odpowiadają tym z immunoglobuliny gatunku innego niż człowiek, a wszystkie lub zasadniczo wszystkie sposród FR są tymi o sekwencji immunoglobuliny ludzkiej. Humanizowane przeciwciało ewentualnie również zawiera co najmniej część regionu stałego immunoglobuliny (Fc), zwykle tego immunoglobuliny ludzkiej. Dla zapoznania się z dalszymi szczegółami patrz Jones i współpracownicy, Nature 321: (1986); Riechmann i współpracownicy, Nature 332: (1988) i Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: (1992) [0056] Humanizowane przeciwciała skierowane przeciw HER2 obejmują humab4d5-1, humab4d5-2, humab4d5-3, humab4d5-4, humab4d5-5, humab4d5-6, humab4d5-7 i humab4d5-8 lub Trastuzumab (HERCEPTIN ) jak opisano w Tablicy 3 opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki numer , humanizowane przeciwciało 520C9 (WO 93/21319) i humanizowane przeciwciała tu opisane. [0057] W tym opisie "Trastuzumab", "HERCEPTIN " i "humab4d5-8" dotyczy przeciwciała, zawierającego łańcuch lekki i ciężki sekwencji aminokwasowych w SEQ ID NO. 14 i 15, odpowiednio. [0058] W tym opisie "Pertuzumab" i "OMNITARG " dotyczy przeciwciała, zawierającego łańcuch lekki i ciężki sekwencji aminokwasowych w SEQ NR ID. 16 i 17, odpowiednio. [0059] "Nagim przeciwciałem" jest przeciwciało (jak tutaj określono), które nie jest sprzężone z cząsteczką heterologiczną, taką jak cytotoksyczna cząsteczka lub znakowana izotopowo. [0060] Przeciwciałem "wyizolowanym" jest przeciwciało, które zidentyfikowano i wydzielono i/lub odzyskano ze składnika jego naturalnego środowiska. Zanieczyszczającymi składnikami jego naturalnego środowiska są materiały, które mogłyby zakłócać diagnostyczne lub terapeutyczne stosowanie przeciwciała, i mogą obejmować enzymy, hormony i rozpuszczone inne białkowe i niebiałkowe substancje. W korzystnych przykładach wykonania, przeciwciało oczyszcza się (1) do stopnia wyższego niż 95% wagowych przeciwciała, jak określono metodą Lowry'ego, i najbardziej korzystnie wyższego niż 99%

18 wagowych, (2) do stopnia wystarczającego do otrzymania co najmniej 15 reszt N-końcowych lub wewnętrznych sekwencji aminokwasowych przy zastosowaniu sekwenatora wirowego, lub (3) do homogenności w SDS-PAGE w warunkach redukujących lub nieredukujących, stosując wybarwiania błękitem Coomassie'go lub korzystnie srebrem. Wyizolowane przeciwciało obejmuje przeciwciało in situ w zrekombinowanych komórkach, ponieważ co najmniej jeden składnik naturalnego środowiska przeciwciała nie będzie obecny. Zwykle jednak, wyizolowane przeciwciało otrzymuje się stosując co najmniej jeden etap oczyszczania. [0061] Przeciwciałem skierowanym przeciw HER2, które "hamuje dimeryzację HER bardziej skutecznie niż Trastuzumab" jest to, które zmniejsza lub eliminuje dimery HER bardziej skutecznie (na przykład co najmniej około 2 razy bardziej skutecznie) niż Trastuzumab. Korzystnie, takie przeciwciało hamuje dimeryzację HER2 co najmniej tak skutecznie, jak przeciwciała wybrane z grupy obejmującej mysie przeciwciało monoklonalne 2C4, fragment Fab z mysiego przeciwciała monoklonalnego 2C4, Pertuzumab i Fab fragment Pertuzumabu. Można ocenić hamowanie dimeryzacji HER badając dimery HER bezpośrednio lub oceniając aktywację HER lub dalsze przekazywanie sygnału, wynikające z dimeryzacji HER i / lub oceniając miejsce wiązania przeciwciało-her2, itd. Testy do przesiewowego poszukiwania przeciwciał zdolnych hamować dimeryzację HER bardziej skutecznie niż Trastuzumab opisano w Agus i współpracownicy, Cancer Cell 2: (2002) i Przykłady 1-2 i 4 w tym dokumencie. Przykładowo, można oszacować hamowanie dimeryzacji HER oceniając, na przykład, hamowanie tworzenia dimeru HER (patrz, np., Fig. 1A-B w Agus i współpracownicy, Cancer Cell 2: (2002), i tu Przykład 2); zmniejszenie aktywacji przez ligand HER komórek, w których zachodzi ekspresja dimerów HER, (przykład 1 tu, i Fig. 2A-B w Agus i współpracownicy, Cancer Cell 2: (2002), na przykład); blokowanie wiązania liganda HER do komórek, w których zachodzi ekspresja dimerów (przykład 1 tu, i Fig. 2A-B w Agus i współpracownicy, Cancer Cell 2: (2002), na przykład); hamowanie wzrostu komórek rakowych (np. komórek MCF7, MDA-MD-134, ZR- 75-1, MD-MB-175, T-47D), w których zachodzi ekspresja dimerów HER w obecności (lub nieobecności) liganda HER (Przykład 1 tu i Figs. 3A-D w Agus i współpracownicy, Cancer Cell 2: (2002), na przykład); hamowanie dalszej sygnalizacji (na przykład, hamowanie zależnej od HRG fosforylacji AKT lub hamowanie zależnej od HRG lub zależnej od TGFα fosforylacji MAPK) (patrz, Przykład 4 tu, i Fig. 2C-D Agus i współpracownicy, Cancer Cell 2: ( 2002), na przykład). Można również oszacować, czy przeciwciało hamuje dimeryzację HER badając miejsce wiązania przeciwciało-her2, na przykład, poprzez ocenę struktury lub modelu, takich jak, struktura krystaliczna, przeciwciała związanego z HER2 (patrz, na przykład, Franklin i współpracownicy, Cancer Cell 5: (2004)). [0062] Przeciwciało skierowane przeciw HER2 może "hamować zależną od HRG fosforylację AKT" i / lub "hamować zależną od HRG lub TGFα fosforylację MAPK" bardziej skutecznie (na przykład co najmniej 2-krotnie bardziej skutecznie) niż Trastuzumab (patrz Agus i współpracownicy, Cancer Cell 2: (2002) i Przykład 4 tu, przykładowo).

19 [0063] Przeciwciałem skierowanym przeciw HER2 może być to, które "nie hamuje rozszczepienia ektodomeny HER2" (Molina i współpracownicy, Cancer Res. 61: (2001). [0064] Przeciwciało skierowane przeciw HER2, które "wiąże się z heterodimerycznym miejscem wiązania" HER2, wiąże się z resztami w domenie II (i ewentualnie łączy się również z resztami w innych domenach zewnątrzkomórkowej domeny HER2, takich jak domeny I i III), i może sterycznie utrudniać, przynajmniej w pewnym stopniu, powstawanie heterodimeru HER2-EGFR, HER2-HER3 lub HER2-HER4. Franklin i współpracownicy, Cancer Cell 5: (2004) scharakteryzowali strukturę krystaliczną HER2-Pertuzumab, zdeponowaną w RCSB Protein Data Bank (ID Code IS78), ilustrując przykładowe przeciwciało, które wiąże się z heterodimerycznym miejscem wiązania HER2. [0065] Przeciwciało, które "wiąże się z domeną II" HER2 wiąże się z resztami w domenie II i ewentualnie resztami w innej domenie (domenach) HER2, takich jak domeny I i III. Korzystnie przeciwciało, które wiąże się z domeną II wiąże się z połączeniem pomiędzy domenami I, II i III HER2. [0066] "Jajnik" jest jednym z dwóch małych, w kształcie migdałów, narządów znajdujących się po obu stronach macicy u kobiet i samic zwierząt. [0067] "Jajowód (ang. fallopian tube)" lub "jajowód (ang. oviduct)" jest jednym z dwóch drobnych przewodów prowadzących z jajników samic ssaków do macicy. [0068] "Otrzewna" jest nabłonkową wyściółką jamy ciała, takiej jak brzuch. [0069] "Rak jajnika" jest ewentualnie groźnym dla życia nowotworem, który rozwija się w jednym lub obu jajnikach. Zanim pojawią się objawy raka jajnika, guz jajnika może urosnąć wystarczająco duży, aby rozsiać komórki nowotworowe w całej jamie brzusznej. Komórki nowotworowe jajników, które rozprzestrzeniły się poza jajniki są nazywane przerzutowymi rakami jajnika. Nowotwory jajnika wykazują tendencję do rozprzestrzeniania się do przepony, jelit i / lub sieci (warstwa tłuszczowa, który okrywa i wyściela narządy w jamie brzusznej). Komórki nowotworowe mogą również rozprzestrzeniać się do innych narządów poprzez kanały limfatyczne i krwiobieg. Rak jajnika, który poddaje się leczeniu w tym dokumencie obejmuje trzy podstawowe klasy złośliwych nowotworów jajników, mianowicie nowotwór nabłonkowy, nowotwór komórek płciowych i nowotwór podścieliskowy. [0070] "Pierwotny rak otrzewnowy" dotyczy raka, który pojawia się w otrzewnej. Pierwotny rak otrzewnowy może być bardzo podobny do nabłonkowego raka jajnika pod względem wyglądu mikroskopowego, objawów, schematu rozprzestrzeniania i rokowania. U kobiety, u której usunięto jajniki nadal może wystąpić pierwotny rak otrzewnowy. [0071] "Rak jajowodu" dotyczy raka jajowodu i / lub więzadła szerokiego. [0072] "Rak nabłonkowy" powstaje w warstwie komórek w kształcie sześcianu, znanych jako nabłonek rozrodczy, który otacza jajniki zewnątrz. Nowotwory nabłonkowe stanowią do 90% wszystkich raków jajnika.

20 [0073] "Nowotwór komórek rozrodczych (rak germinalny)" występuje w komórce (komórkach) dojrzewania jajeczka w jajniku. Nowotwory komórek rozrodczych, które stanowią około 3% wszystkich nowotworów jajnika, występują najczęściej u nastolatków i młodych kobiet. [0074] "Nowotwór podścieliskowy" rozwija się z komórek tkanki łącznej, które utrzymują jajnik i które produkują hormony żeńskie, estrogeny i progesteron. Nowotwory podścieliskowe stanowią 6% wszystkich nowotworów jajnika. [0075] "Próbka nowotworu" tu oznacza próbkę pochodzącą z lub zawierającą komórki nowotworowe z nowotworu pacjenta. Przykłady próbek nowotworów obejmują, ale nie są ograniczone do, biopsji nowotworu, krążących komórek nowotworowych, krążących białek osocza, płynu puchlinowego, pierwotnych hodowli komórkowych lub linii komórkowych pochodzących z nowotworów lub wykazujących właściwości podobne do nowotworu, jak również utrwalone próbki nowotworu, takie jak próbki nowotworów utrwalone w formalinie, zatopione w parafinie. [0076] "Czynnik hamujący wzrost" w znaczeniu tu stosowanym dotyczy związku lub kompozycji, które hamują wzrost komórki, zwłaszcza komórki rakowej, w której zachodzi ekspresja HER, albo in vitro albo in vivo. Tak więc, czynnikiem hamującym wzrost może być czynnik, który znacząco zmniejsza procent komórek, w których zachodzi ekspresja HER w fazie S. Przykłady środków hamujących wzrost obejmują środki, które blokują postęp cyklu komórkowego (w fazie innej niż faza S), takie jak środki, które indukują zatrzymanie w fazie G1 i zatrzymanie w fazie M. Klasyczne środki blokujące fazę M obejmują alkaloidy Vinca (winkrystyna i winblastyna), taksany i inhibitory topoizomerazy II, takie jak doksorubicyna, epirubicyna, etopozyd i bleomycyna. Te środki, które powodują zatrzymanie w fazie G1, rozszerzają się również na zatrzymywanie w fazie S, na przykład środki alkilujące DNA, takie jak tamoksyfen, prednizon, dakarbazyna, mechlormetyna, cisplatyna, metotreksat, 5- fluorouracyl i ara-c. Dalsze informacje można znaleźć w The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn i Israel, wyd., rozdział 1 zatytułowany "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs", Murakami i współpracownicy, (WB Saunders, Filadelfia, 1995), szczególnie str. 13. [0077] Przykładami przeciwciał "hamujących wzrost" są te, które wiążą się z HER2 i hamują wzrost komórek rakowych, w których zachodzi nadekspresja HER2. Korzystne hamujące wzrost przeciwciała HER hamują wzrost komórek nowotworu sutka SK-BR-3 w hodowli komórkowej o więcej niż 20%, i korzystnie więcej niż 50% (np. od około 50% do około 100%) przy stężeniu przeciwciała około od 0,5 do 30 μg/ml, jeśli hamowanie wzrostu określa się po sześciu dniach ekspozycji komórek SK-BR-3 na przeciwciało (patrz opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer , wydany 14 października 1997 r.). Oznaczenie hamowania wzrostu komórek SK-BR-3 opisano bardziej szczegółowo w tym opisie patentowym i tu poniżej. Korzystnym przeciwciałem hamującym wzrost jest humanizowany wariant mysiego monoklonalnego przeciwciała 4D5, np. Trastuzumab.

21 [0078] Przeciwciałem, które "indukuje apoptozę" jest przeciwciało, które wywołuje zaprogramowaną śmierć komórkową przez związanie aneksyny V, fragmentację DNA, obkurczenie się komórek, rozszerzenie retikulum endoplazmatycznego, fragmentację komórkową i/lub tworzenie pęcherzyków błonowych (nazywanych ciałami apoptycznymi). Komórką jest ogólnie komórka, w której zachodzi nadekspresja receptora HER2. Korzystnie, komórką jest komórka rakowa, np. komórka sutka, jajnika, żołądka, śluzówki macicy, gruczołu ślinowego, płuc, nerki, okrężnicy, tarczycy, trzustki lub pęcherza moczowego. In vitro komórką może być komórka SK-BR-3, BT474, Calu 3, MDA-MB-453, MDA-MB-361 lub SKOV3. Dostępne są różne sposoby do oszacowania zdarzeń komórkowych związanych ze śmiercią komórkową. Na przykład, można zmierzyć translokację fosfatydyloseryny (PS) przez wiązanie aneksyny; fragmentację DNA można oceniać przez obserwację fragmentów DNA w żelu elektroforetycznym, i kondensację jąder/chromatyny wraz z fragmentacją DNA można oceniać przez wzrost ilości komórek hipodiploidalnych. Korzystnie, przeciwciałem indukującym apoptozę jest przeciwciało, które powoduje indukcję wiązania aneksyny silniejszą o około od 2- do 50-krotnie, korzystnie o około od 5- do 50-krotnie, i najbardziej korzystnie o około od 10- do 50-krotnie w stosunku do komórek nietraktowanych w oznaczeniu wiązania aneksyny z zastosowaniem komórek BT474 (patrz poniżej). Przykładami przeciwciał HER2, które indukują apoptozę są 7C2 i 7F3. [0079] "Epitopem 2C4" jest region w zewnątrzkomórkowej domenie HER2, z którym wiąże się przeciwciało 2C4. W celu przeszukiwania pod kątem przeciwciał, które wiążą się z epitopem 2C4, można przeprowadzić rutynowe oznaczenie blokowania krzyżowego, takie jak to opisane w Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow i David Lane (1988). Alternatywnie, można przeprowadzić mapowanie epitopu w celu oszacowania, czy przeciwciało wiąże się z epitopem 2C4 HER2 (np. którąkolwiek lub więcej resztami w regionie od około reszty 22 do około reszty 584 HER2, włącznie; patrz Fig. 1A- B). Epitop 2C4 zawiera reszty z domeny II w zewnątrzkomórkowej domenie HER2. 2C4 i Pertuzumab wiąże się z zewnątrzkomórkową domeną HER2 w miejscu połączenia domen I, II i III. Franklin i współpracownicy, Cancer Cell 5: (2004). [0080] "Epitopem 4D5" jest region w zewnątrzkomórkowej domenie HER2, z którym wiąże się przeciwciało 4D5 (ATCC CRL 10463) i Trastuzumab. Epitop ten występuje blisko domeny transbłonowej HER2 i w domenie IV HER2. Celem przeszukiwania pod kątem przeciwciał, które wiążą się z epitopem 4D5, można przeprowadzić rutynowe oznaczenie blokowania krzyżowego, takie jak to opisane w Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow i David Lane (1988). Alternatywnie, można przeprowadzić mapowanie epitopu w celu oszacowania, czy przeciwciało wiąże się z epitopem 4D5 HER2 (np. którąkolwiek lub więcej resztami w regionie od około reszty 529 do około reszty 625, włącznie; patrz Fig. 1A-B). [0081] "Epitopem 7C2/7F3" jest region na końcu N, w domenie I, zewnątrzkomórkowej domeny HER2, z którym wiążą się przeciwciała 7C2 i/lub 7F3 (każde z nich zdeponowano w ATCC, patrz poniżej). W celu przeszukiwania pod kątem przeciwciał, które wiążą się z epitopem 7C2/7F3, można przeprowadzić rutynowe oznaczenie blokowania krzyżowego,

22 takie jak to opisane w Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow i David Lane (1988). Alternatywnie, można przeprowadzić mapowanie epitopu w celu oszacowania, czy przeciwciało wiąże się z epitopem 7C2/7F3 HER2 na HER2 (np. którąkolwiek lub więcej z reszt w regionie od około reszty 22 do około reszty 53 HER2; patrz Fig. 1A-B). [0082] "Traktowanie" dotyczy traktowania zarówno terapeutycznego, jak i profilaktycznego lub środków zapobiegawczych. Osobnicy wymagający traktowania obejmują tych, u których już występuje rak, jak również tych, u których zapobiega się rakowi. Z tego względu pacjent, który będzie poddawany traktowaniu tu opisanemu może być już zdiagnozowany jako mający raka lub może być predysponowany lub podatny na raka. [0083] Termin "ilość skuteczna terapeutycznie" dotyczy ilości leku skutecznej w leczeniu raka u pacjenta. Skuteczna ilość leku może zmniejszyć liczbę komórek rakowych; zmniejszać wielkość nowotworu; hamować (tzn. w pewnym stopniu spowalniać i korzystnie zatrzymywać) naciekanie komórek rakowych do narządów obwodowych; hamować (tzn. w pewnym stopniu spowalniać i korzystnie zatrzymywać) przerzuty nowotworu; hamować, w pewnym stopniu, wzrost nowotworu; i/lub łagodzić w pewnym stopniu jeden lub więcej z objawów związanych z rakiem. W pewnym zakresie lek może zapobiegać wzrostowi i/lub zabijać istniejące komórki rakowe, może on być cytostatyczny i/lub cytotoksyczny. Skuteczna ilość może rozszerzyć czas wolny od progresji choroby (np. jako zmierzony przez kryteria oceny odpowiedzi na zmiany guzów litych, RECIST lub zmiany CA-125), prowadzić do obiektywnych odpowiedzi (w tym odpowiedzi częściowej, PR lub odpowiedzi całkowitej, CR), zwiększyć całkowity czas przeżycia i/lub poprawić jeden lub więcej objawów raka (np. jak oceniane przez FOCI) [0084] "Całkowity czas przeżycia" dotyczy pacjenta pozostającego przy życiu przez określony okres czasu, taki jak 1 rok, 5 lat, itp., na przykład, od czasu diagnozy lub leczenia. [0085] "Czas wolny od progresji choroby" dotyczy pacjenta pozostającego przy życiu, bez pogarszania raka. [0086] "Odpowiedź obiektywna" dotyczy mierzalnej odpowiedzi, w tym całkowitej odpowiedzi (CR) lub częściowej odpowiedzi (PR). [0087] Jako "odpowiedź całkowitą" lub "remisję całkowitą" uważa się zanik wszystkich objawów raka w odpowiedzi na leczenie. To nie zawsze oznacza, że rak został wyleczony. [0088] "Odpowiedź częściowa" dotyczy zmniejszenia wymiarów jednego lub większej liczby nowotworów lub zmian, lub stopnia zaawansowania raka w organizmie, w odpowiedzi na leczenie. [0089] "Rakiem, w którym zachodzi ekspresja HER" jest rak zawierający komórki, które mają białko HER na swoich powierzchniach komórkowych. [0090] "Rakiem, w którym zachodzi ekspresja HER2" jest rak, który wytwarza wystarczające poziomy HER2 na powierzchni swoich komórek tak, że przeciwciało skierowane przeciw HER2 może się z nimi wiązać i wywierać wpływ terapeutyczny w odniesieniu do raka.

23 [0091] Rakiem, w którym "zachodzi nadekspresja" receptora HER jest rak, który posiada znacząco wyższe poziomy receptora HER, takiego jak HER2, na powierzchniach swoich komórek w porównaniu z nie rakową komórką tkanki tego samego typu. Taka nadekspresja może być spowodowana amplifikacją genu lub zwiększoną transkrypcją bądź translacją. Nadekspresję receptora HER można określić w oznaczeniu diagnostycznym lub prognostycznym przez oszacowanie zwiększonych poziomów białka HER obecnego na powierzchni komórek (np. w oznaczeniu immunohistochemicznym, IHC). Alternatywnie, lub dodatkowo, można zmierzyć poziomy kodującego HER kwasu nukleinowego w komórce, np. technikami hybrydyzacji sondy fluorescencyjnej in situ (FISH; patrz WO 98/45479, opublikowany w październiku 1998 r.), hybrydyzacji metodą Southerna lub reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), takimi jak ilościowa PCR w czasie rzeczywistym (RTPCR). Nadekspresję receptora HER można również badać przez pomiar złuszczonego antygenu (np. zewnątrzkomórkowej domeny HER) w płynie biologicznym, takim jak surowica (patrz np. opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer , wydany 12 czerwca 1990 r., WO 91/05264, opublikowany 18 kwietnia 1991 r., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer , wydany 28 marca 1995 r., i Sias i współpracownicy, J. Immunol. Methods 132: (1990)). Oprócz powyższych oznaczeń, dostępne są różne oznaczenia in vivo dla lekarzy doświadczonych w tej dziedzinie. Na przykład, komórki w organizmie pacjenta można eksponować na przeciwciało, które ewentualnie znakowano wykrywalnym znacznikiem, np. izotopem promieniotwórczym, i można oceniać wiązanie przeciwciała z komórkami pacjenta, np. przez zewnętrzne badanie promieniotwórczości lub przez analizowanie bioptatu pobranego od pacjenta, uprzednio eksponowanego na przeciwciało. [0092] Przeciwnie, rakiem, w którym "nie zachodzi nadekspresja receptora HER2" jest rak, w którym nie ma ekspresji wyższych niż normalne poziomów receptora HER2 w porównaniu z nie rakową komórką tkanki tego samego typu. [0093] Rakiem, w którym "zachodzi nadekspresja" liganda HER jest rak, który wytwarza znacząco wyższe poziomy tego liganda w porównaniu z nie rakową komórką tkanki tego samego typu. Taka nadekspresja może być spowodowana amplifikacją genu lub zwiększoną transkrypcją lub translacją. Nadekspresję liganda HER diagnostycznie można określić na podstawie oceny poziomów liganda (lub kodującego go kwasu nukleinowego) u pacjenta, np. w przypadku biopsji guza lub różnych oznaczeniach diagnostycznych, takich jak IHC, FISH, PCR lub oznaczeń in vivo, opisanych powyżej. [0094] Termin "środek cytotoksyczny" w znaczeniu tu stosowanym dotyczy substancji, która hamuje lub zapobiega funkcjom komórek i/lub powoduje zniszczenie komórek. Termin w zamierzeniu obejmuje izotopy promieniotwórcze (np At 211, I 131, I 125, Y 90, Re 186, Re 188, Sm 153, Bi 212, P 32 i radioaktywne izotopy Lu), środki chemioterapeutyczne i toksyny, takie jak toksyny niskocząsteczkowe lub toksyny aktywne enzymatycznie pochodzenia bakteryjnego, grzybowego, roślinnego lub zwierzęcego, włącznie z ich fragmentami i/lub wariantami. [0095] "Środkiem chemioterapeutycznym" jest związek chemiczny użyteczny w leczeniu raka. Przykłady środków chemioterapeutycznych obejmują środki alkilujące, takie jak tiotepa i cyklofosfamid (CYTOXAN ); sulfoniany alkilowe, takie jak busulfan, improsulfan i

24 piposulfan; azyrydyny, takie jak benzodopa, karbokwon, meturedopa i uredopa; etylenoiminy i metylomelaminy, obejmujące altretaminę, trietylenomelaminę, trietylenofosforoamid, trietylenotiofosforoamid i trimetylolomelaminę; acetogeniny (szczególnie bullatacynę i bullatacynon); delta-9-tetrahydrokannabinol (dronabinol, MARINOL ); beta-lapachon; lapachol; kolchicyny; kwas betulinowy; kamptotecynę (włączając analog syntetyczny topotekan (HYCAMTIN ), CPT-11 (irinotekan, CAMPTOSAR ), acetylokamptotecynę, skopolektynę i 9-aminokamptotecynę); briostatynę; kallistatynę; CC-1065 (włączając analogi syntetyczne adozelesynę, karzelesynę i bizelesynę); podofilotoksynę; kwas podofilinowy; tenipozyd; kryptoficyny (szczególnie kryptoficynę 1 i kryptoficynę 8); dolastatynę; duokarmycynę (włączając analogi syntetyczne, KW-2189 i CB1-TM1); eleuterobinę; pankratystatynę; sarkodyktyinę; spongistatynę; iperyty azotowe takie jak chlorambucyl, chlornafazyna, cholofosfamid, estramustyna, ifosfamid, mechloretamina, chlorowodorek tlenku mechloretaminy, melfalan, nowembichina, fenesteryna, prednimustyna, trofosfamid, iperyt uracylowy; nitrozomoczniki takie jak karmustyna, chlorozotocyna, fotemustyna, lomustyna, nimustyna i ranimnustyna; antybiotyki takie jak antybiotyki enediynowe (na przykład kalicheamycyna, szczególnie kalicheamycyna gamma1i i kalicheamycyna omega I1 (patrz np. Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: (1994)); dynemycynę, włączając dynemycynę A; bisfosfoniany, takie jak klodronat, esperamycyna; jak również chromofor neokarcynostatynowy i pokrewne chromofory enediynowych antybiotyków chromobiałkowych), aklacynomyzyny, aktynomycynę, autramycynę, azaserynę, bleomycyny, kaktynomycynę, karabicynę, karminomycynę, karcynofilinę, chromomycyny, daktynomycynę, daunorubicynę, detorubicynę, 6-diazo-5-okso-L-norleucynę, ADRIAMYCIN doksorubicynę (włączając morfolino-doksorubicynę, cyjanomorfolinodoksorubicynę, 2-pirolino-doksorubicynę i deoksydoksorubicynę), epirubicynę, ezorubicynę, idarubicynę, marcellomycynę, mitomycyny jak mitomycyna C, kwas mykofenolowy, nogalamycynę, oliwomycyny, peplomycynę, potfiromycynę, puromycynę, kwelamycynę, rodorubicynę, streptonigrynę, streptozocyny, tubercidynę, ubenimeks, zinostatyna, zorubicyna; anty-metabolity takie jak metotreksat i 5-fluorouracyl (5-FU); analogi kwasu foliowego, takie jak denopteryna, metotreksat, pteropteryna, trimetreksat; analogi purynowe takie jak fludarabina, 6-merkaptopuryna, tiamipryna, tioguanina; analogi pirymidynowe takie jak ancytabina, azacytydyna, 6- azaurydyna, karmofur, cytarabina, dideoksyurydyna, doksyflurydyna, enocytabina, floksurydyna; androgeny takie jak kalusteron, propionian dromostanolonu, epitiostanol, mepitiostan, testolakton; środki antynadnerczowe takie jak aminoglutetymid, mitotan, trilostan; środki dopełniające kwasu foliowego takie jak kwas frolinowy; aceglaton; glikozyd aldofosfamidowy; kwas aminolewulinowy; eniluracyl; amsakryna; bestrabucyl; bisantren; edatraksat; defofamina; demekolcyna; diazykwon; elfornityna; octan eliptinium; epotylon; etoglucyd; azotan galu; hydroksymocznik; lentynan; lonidamina; majtanzynoidy takie jak majtanzyna i ansamitocyny; mitogwazon, mitoksantron; mopidamol; nitrakryna; pentostatyna; fenamet; pirarubicyna; lozoksantron; 2-etylohydrazyd; prokarbazyna; kompleks polisacharydowy PSK (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoksan; ryzoksyna; sizofiran; spirogerman; kwas tenuazonowy; triazykwon; 2,2',2 - trichlorotrietyloamina; trichoteceny (zwłaszcza toksyna T-2, werakuryna A, rorydyna A i

25 anguidyna); uretan; windezyna (ELDISINE, FILDESIN ); dakarbazyna; mannomustyna; mitobronitol; mitolaktol; pipobroman; gacytozyna; arabinozyd ( Ara-C ); cyklofosfamid; tiotepa; taksany, np. paklitaksel TAXOL (Bristol- Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.); ABRAXANE bez kremoforu, preparaty nanocząsteczkowe paklitakselu albuminy otrzymanej metodą inżynierii genetycznej (American Farmaceutyczne Partners, Schaumberg, Illinois), i TAXOTERE doksetaksel (Rhône-Poulene Rorer, Antony, France); chlorambucil; gemcytabina (GEMZAR ); 6-tioguanina; merkaptopuryna; metotreksat; analogi platyny, takie jak cisplatyna i karboplatyna; winblastyna (VELBAN ); platyna; etopozyd (VP-16); ifosfamid; mitoksantron; winkrystyna (ONCOVIN ); oksaliplatyna; leukoworyna; winorelbinw (NAVELBINE ); nowantron; edatreksat; daunomycyna; aminopteryna; kseloda; ibandronian; inhibitor topoizomerazy RFS 2000; difluorometyloornityna (DMFO); retynoidy takie jak kwas retinowy; kapecytabina; i farmaceutycznie dopuszczalne sole, kwasy i pochodne któregokolwiek z powyższych; jak również połączenia dwóch lub więcej z powyższych, takie jak CHOP, skrót dla terapii skojarzonej cyklofosfamidu, doksorubicyny, winkrystyny i prednisolonu, i FOLFOX, skrót dla schematu leczenia z oksaliplatyną (ELOXATIN ) w połączeniu z 5-FU i leukoworyną. [0096] Definicja ta obejmuje również środki antyhormonalne, które regulują lub hamują działanie hormonów na nowotwory, takie jak antyestrogeny i selektywne modulatory receptora estrogenu (SERM), w tym, na przykład, tamoksyfen (w tym NOLVADEX ; tamoksyfen), raloksyfen, droloksyfen, 4-hydroksytamoksyfen, trioksyfen, keoksyfen, LY117018, onapriston i FARESTON (toremifen); (inhibitory aromatazy hamujące enzym aromatazę, który reguluje wytwarzanie estrogenu w gruczołach nadnerczy, takie jak na przykład 4 (5)-imidazol, aminoglutetimid, MEGASE (octan megestrolu), AROMASIN eksemestan; formestan, fadrozol, RIVISOR (worozol), FEMARA (letrozol), i ARIMIDEX (anastrozol); i antyandrogeny takie jak flutamid, nilutamid, bikalutamid, leuprolid i goserelina; jak również troksacytabinę (analog nukleozydu cytozyny, 1,3- dioksolan); antysensowe oligonukleotydy, zwłaszcza te hamujące ekspresję genów w szlakach sygnałowych powiązanych z nieprawidłową proliferacją komórkową, takich jak na przykład, PKC-alfa, Raf i H-Ras i naskórkowy receptor czynnika wzrostu (EGF-R); szczepionki, takie jak szczepionki terapii genowej, na przykład, szczepionka ALLOVECTIN, szczepionka LEUVECTIN, i szczepionka VAXID ; PROLEUKIN ril-2; LURTOTECAN inhibitor topoizomerazy 1; ABARELIX rmrh; i ich farmaceutycznie dopuszczalne sole; kwasy lub pochodne któregokolwiek z powyższych. [0097] "Środek chemioterapeutyczny anty-metabolitowy" jest środkiem, który jest strukturalnie podobny do metabolitu, ale nie może być używany przez organizm w sposób produktywny. Wiele środków chemioterapeutycznych anty-metabolitowych zakłóca produkcję kwasów nukleinowych, DNA i RNA. Przykłady środków chemioterapeutycznych anty-metabolitowych obejmują gemcytabinę (GEMZAR ), 5-fluorouracyl (5-FU), kapecytabinę (Xeloda ), 6-merkaptopurynę, metotreksat, 6-tioguaninę, pemetreksed, raltitreksed, arabinozylocytozynę ARA-C cytarabinę (CYTOSAR-U ), dakarbazynę (DTIC- DOME ), azocytozynę, deoksycytozynę, pirydmiden, fludarabinę (FLUDARA ),

26 kladrabinę, 2-deoksy-D-glukozę, itd. Korzystnym środkiem chemioterapeutycznym antymetabolitowym jest gemcytabina. [0098] "Gemcytabina" lub "2 - dezoksy - 2' 2'-difluorocytydyny dwuwodzian (izomer b)" jest analogowym nukleozydem, który wykazuje aktywność przeciwnowotworową. Wzorem empirycznym dla chlorowodorku gemcytabiny jest C9H11F2N3O4 HCl. Gemcytabiny HCl jest sprzedawany przez Eli Lilly pod nazwą GEMZAR. [0099] "Środek chemioterapeutyczny oparty na związkach platyny" obejmuje związek organiczny, który zawiera platynę jako integralną część cząsteczki. Przykłady opartych na związkach platyny chemioterapeutyków obejmują karboplatynę, cisplatynę i oksaliplatynę. [0100] Termin "chemioterapia oparta na związkach platyny" w zamierzeniu dotyczy terapii z jednym lub więcej środków chemioterapeutycznych, opartych na związkach platyny, ewentualnie w połączeniu z jednym lub więcej środków chemioterapeutycznych. [0101] Termin rak "wtórnie oporny na leczenie związkami platyny" oznacza, że u pacjenta chorego na raka choroba postępuje w trakcie otrzymywania chemioterapii opartej na związkach platyny (tzn. pacjent jest "oporny na leczenie związkami platyny"), lub u pacjenta choroba postąpiła w ciągu 12 miesięcy (na przykład w ciągu 6 miesięcy), po ukończeniu schematu chemioterapii opartej na związkach platyny. [0102] Termin tu stosowany "lek ukierunkowany na EGFR" dotyczy środka terapeutycznego, który wiąże się z EGFR i ewentualnie hamuje aktywację EGFR. Przykłady takich środków obejmują przeciwciała i małe cząsteczki, które wiążą się z EGFR. Przykłady przeciwciał, które wiążą się z EGFR, obejmują MAb 579 (ATCC CRL HB 8506), MAb 455 (ATCC CRL HB8507), MAb 225 (ATCC CRL 8508), MAb 528 (ATCC CRL 8509) (patrz opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr , Mendelsohn i współpracownicy,) i jego warianty, takie jak chimeryczne 225 (C225 lub Cetuksymab; ERBUTIX ) i przekształcone ludzkie 225 (H225) (patrz WO 96/40210, Imclone Systems Inc.); przeciwciała, które wiążą mutanta typu II EGFR (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr ), humanizowane i chimeryczne przeciwciała, które wiążą EGFR, jak opisane w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr , i ludzkie przeciwciała, które wiążą EGFR, jak ABX-EGF (patrz WO98/50433, Abgenix). Przeciwciało EGFR można skoniugować ze środkiem cytotoksycznym, w ten sposób wytwarzając immunokoniugat (patrz, np., EP A2, Merck Patent GmbH). Przykłady małych cząsteczek, które wiążą się z EGFR obejmują ZD1839 lub Gefitinib (IRESSA ; AstraZeneca), CP , lub Erlotinib HCL (Tarceva ; Genentech / OSI) i AG 1478, AG1571 (SU 5271; Sugen). [0103] "Inhibitor kinazy tyrozynowej" oznacza cząsteczkę, która hamuje w pewnym stopniu aktywność kinazy tyrozynowej, takiej jak receptor HER. Przykłady takich inhibitorów obejmują leki ukierunkowane na EGFR, omówione w poprzednim akapicie, jak również inhibitor kinazy tyrozynowej o małej cząsteczce HER2, taki jak TAK165 dostępny z Takeda, dualne inhibitory HER, takie jak EKB-569 (dostępne z Wyeth), które korzystnie wiążą EGFR, ale hamują komórki ulegające nadekspresji zarówno HER2 jak i EGFR, GW (dostępne z Glaxo) doustny inhibitor kinazy tyrozynowej HER2 i EGFR, i PKI-166 (dostępne

27 z Novartis); pan-her inhibitory takie jak canertinib (CI-1033, Pharmacia); inhibitory Raf-1, takie jak antysensowny środek ISIS-5132 dostępny z ISIS Pharmaceuticals, który hamuje sygnalizację Raf-1; ukierunkowane na nie-her inhibitory TK, takie jak metanosulfonian Imatinibu (Gleevac ) dostępny z Glaxo; inhibitor MAPK zewnątrzkomórkowej regulowanej kinazy I CI-1040 (dostępny w Pharmacia); chinazoliny, takie jak PD ,4 - (3- chloroanilino) chinazolina; pirydopirymidyny; pirymidynopirymidyny; pirolopirymidyny, takie jak CGP 59326, CGP i CGP 62706; pirazolopirymidyny, 4 - (fenyloamino) - 7Hpirolo[2,3-d]pirymidyny; kurkumina (diferuloilometan, 4,5-bis (4-fluoroanilino) ftalimid); tyrfostiny zawierające ugrupowania nitrotiofenowe; PD (Warner-Lamber); cząsteczki antysensowne (np. te, które wiążą się do kwasu nukleinowego kodującego HER); chinoksaliny (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr ); tryfostiny (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr ); ZD6474 (Astra Zeneca); PTK-787 (Novartis / Schering AG); pan-her inhibitory, takie jak CI-1033 (Pfizer); Affinitac (ISIS 3521, Isis / Lilly); mesylatn Imatinibu (Gleevac, Novartis); PKI 166 (Novartis ); GW2016 (Glaxo SmithKline); CI-1033 (Pfizer), EKB-569 (Wyeth); Semaxinib (Sugen); ZD6474 (AstraZeneca); PTK-787 (Novartis / Schering AG); INC-1C11 (Imclone); lub jak opisano w jednej z następujących publikacji patentowych: opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr ; WO99/09016 (American Cyanimid); WO98/43960 (American Cyanamid); WO97/38983 (Warner Lambert); WO99/06378 (Warner Lambert); WO99 / (Warner Lambert); WO96/30347 (Pfizer, Inc), WO96/33978 (Zeneca); WO96/3397 (Zeneca) i WO96/33980 (Zeneca). [0104] "Środek antyangiogenny" dotyczy związku, który blokuje, lub zakłóca w pewnym stopniu, rozwój naczyń krwionośnych. Środkiem antyangiogennym może, na przykład, być mała cząsteczka lub przeciwciało, które wiąże się z czynnikiem wzrostu lub receptorem czynnika wzrostu zaangażowanymi w promowaniu angiogenezy. Korzystnym środkiem antyangiogennym jest tu przeciwciało, które wiąże się z naczyniowym śródbłonkowym czynnikiem wzrostu (VEGF), takim jak Bewacizumab (Avastin ). Środkiem antyangiogennym może być, na przykład, mała cząsteczka lub przeciwciało, które wiążą się z czynnikiem wzrostu lub receptorem czynnika wzrostu, uczestniczącymi w pobudzaniu angiogenezy. Korzystnym środkiem antyangiogennym według opisu jest przeciwciało, które wiąże się z naczyniowym śródbłonkowym czynnikiem wzrostu (VEGF), takim jak Bevacizumab (AVASTIN ). [0105] Termin "cytokina" jest ogólnym terminem dla białek uwalnianych przez jedną populację komórek, które działają na inną komórkę jako mediatory międzykomórkowe. Przykładami takich cytokin są limfokiny, monokiny i tradycyjne hormony polipeptydowe. Cytokiny obejmują hormon wzrostu, taki jak ludzki hormon wzrostu, N-metionylowany ludzki hormon wzrostu i bydlęcy hormon wzrostu; hormon przytarczyc; tyroksynę; insulinę; proinsulinę; relaksynę; prorelaksynę; hormony glikoproteinowe, takie jak hormon folikulotropowy (FSH), hormon tyrotropowy (TSH) i hormon luteinizujący (LH); wątrobowy czynnik wzrostu; fibroblastowy czynnik wzrostu; prolaktynę; laktogen łożyskowy; czynnik martwicy nowotworów α i β; substancję hamującę rozwój przewodów Müllera; mysi peptyd związany z gonadotropiną; inhibinę; aktywinę; naczyniowy śródbłonkowy czynnik wzrostu;

28 integrynę; trombopoetynę (TPO); czynnik wzrostu nerwów, taki jak NGF-β; płytkowy czynnik wzrostu; transformujące czynniki wzrostu (TGF), takie jak TGF-α i TGF-β; insulinopodobny czynnik wzrostu I i II; erytropoetynę (EPO); czynniki indukcyjne kości; interferony, takie jak interferon α, β i γ; czynniki stymulujące tworzenie kolonii (CSF), takie jak czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF); czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF); i czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów (G-CSF); interleukiny (IL), takie jak IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; czynnik martwicy nowotworów, taki jak TNF-α lub TNF-β, i inne środki polipeptydowe, obejmujące LIF i ligand receptora Kit (KL). W znaczeniu tu stosowanym, termin cytokina obejmuje białka ze źródeł naturalnych lub z hodowli komórek zrekombinowanych i aktywne biologicznie równoważniki cytokin o natywnych sekwencjach. II. Wytwarzanie przeciwciał HER2 [0106] Poniżej opisano przykładowe metody wytwarzania przeciwciał stosowanych według wynalazku. Antygen HER2 przeznaczony do stosowania w wytwarzaniu przeciwciał może być np. rozpuszczalną postacią zewnątrzkomórkowej domeny HER2 lub jej części, zawierającą pożądany epitop. Alternatywnie, do tworzenia przeciwciał można stosować komórki, w których zachodzi ekspresja HER2 na powierzchniach komórkowych (np. komórki NIH-3T3 transformowane dla nadekspresji HER2; lub linię komórkową raka, taką jak komórki SK-BR-3, patrz Stancovsky i współpracownicy, PNAS (USA) 88: (1991)). Inne postacie HER2 użyteczne do wytworzenia przeciwciał będą oczywiste dla specjalistów w tej dziedzinie. (i) Przeciwciała poliklonalne [0107] Wytwarzanie przeciwciał poliklonalnych u zwierząt korzystnie pobudza się przez kilkakrotne podskórne (sc) lub dootrzewnowe (ip) iniekcje odpowiedniego antygenu i adiuwanta. Użyteczne może być sprzęganie odpowiedniego antygenu z białkiem, które jest immunogenne u gatunku przeznaczonego do immunizacji, np. hemocyjaniną skałoczepu (ang. keyhole limpet hemocyanine) (KLH), albuminą surowicy, tyroglobuliną bydlęcą lub sojowym inhibitorem trypsynowym, stosując czynnik bifunkcyjny lub zmodyfikowany przez utworzenie pochodnej, na przykład ester maleimidobenzoilowy sulfosukcynimidu (sprzęganie poprzez reszty cysteiny), N-hydroksysukcynimid (poprzez reszty lizyny), glutaraldehyd, bezwodnik bursztynowy, SOCI 2 lub R 1 N=C=NR, gdzie R i R 1 są różnymi grupami alkilowymi. [0108] Zwierzęta immunizuje się antygenem, immunogennymi koniugatami lub pochodnymi przez połączenie np. 100 μg lub 5 μg białka lub koniugatu (odpowiednio dla królików lub myszy) z 3 objętościami kompletnego adiuwanta Freunda i wstrzykiwanie roztworu śródskórnie w kilku miejscach. Po jednym miesiącu stosuje się u zwierząt dawkę przypominającą od 1/5 do 1/10 początkowej ilości peptydu lub koniugatu w kompletnym adiuwancie Freunda przez podskórne iniekcje w kilku miejscach. Po upływie od 7 do 14 dni od zwierząt pobiera się krew i oznacza miano przeciwciał w surowicy. Zwierzętom podaje się

29 dawki przypominające do osiągnięcia stałego poziomu przeciwciał. Korzystnie, zwierzętom podaje się dawki przypominające koniugat tego samego antygenu, ale sprzęganego z innym białkiem i/lub poprzez inny odczynnik sieciujący. Koniugaty można sporządzać w hodowli zrekombinowanych komórek jako białka fuzyjne. Można również odpowiednio stosować środki agregujące do wzmacniania odpowiedzi immunologicznej, takie jak ałun. (ii) Przeciwciała monoklonalne [0109] Przeciwciała monoklonalne otrzymuje się z populacji zasadniczo homogennych przeciwciał, tzn. pojedyncze przeciwciała stanowiące populację są identyczne, z wyjątkiem możliwych naturalnie występujących mutacji, które mogą występować w niewielkich ilościach. Tak więc, określenie "monoklonalne" wskazuje, że przeciwciało nie jest mieszaniną odrębnych przeciwciał. [0110] Na przykład, przeciwciała monoklonalne można otrzymywać stosując metodę hybrydom, po raz pierwszy opisaną przez Kohlera i współpracownicy, Nature, 256: 495 (1975), lub można je otrzymywać metodami rekombinacji DNA (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer ). [0111] W metodzie hybrydom mysz lub inne odpowiednie, będące gospodarzem zwierzę, takie jak chomik, immunizuje się w opisany powyżej sposób w celu pobudzenia limfocytów, które wytwarzają lub są zdolne do wytwarzania przeciwciał, które będą specyficznie wiązać się z białkiem zastosowanym do immunizacji. Alternatywnie, limfocyty można immunizować in vitro. Następnie limfocyty poddaje się fuzji z komórkami szpiczaka, stosując odpowiedni czynnik indukujący fuzję, taki jak glikol polietylenowy, z utworzeniem komórki hybrydomy (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, str (Academic Press, 1986)). [0112]. Tak przygotowane komórki hybrydom wysiewa się i hoduje w odpowiednim podłożu hodowlanym, które korzystnie zawiera jedną lub więcej substancji, które hamują wzrost lub przeżywanie macierzystych komórek szpiczaka, które nie uległy fuzji. Na przykład, jeśli macierzyste komórki szpiczaka pozbawione są enzymu fosforybozylotransferazy guaninohipoksantynowej (HGPRT lub HPRT), podłoże hodowlane dla hybrydom zwykle zawiera hipoksantynę, aminopterynę i tymidynę (podłoże HAT), które to substancje zapobiegają wzrostowi komórek pozbawionych HGPPRT. [0113] Korzystnymi komórkami szpiczaka są te, które wydajnie ulegają fuzji, podtrzymują trwałe wytwarzanie przeciwciała na wysokim poziomie przez wyselekcjonowane komórki wytwarzające przeciwciała i są wrażliwe na podłoże, takie jak podłoże HAT. Wśród nich korzystnymi liniami komórek szpiczaka są linie komórek szpiczaka mysiego, takie jak te pochodzące z mysich nowotworów MOPC-21 i MPC-11, dostępne z Salk Institute Cell Distribution Center, Kalifornia, USA, i komórki SP-2 lub komórki X63-Ag8-653, dostępne z American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA. Opisano również linie komórek szpiczaka ludzkiego i linie komórek heteroszpiczaka mysio-ludzkiego do wytwarzania ludzkich przeciwciał monoklonalnych (Kozbor, J.Immunol., 133: 3001 (1984) i

30 Brodeur i współpracownicy, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, str (Marcel Dekker, Inc., Nowy Jork, 1987)) [0114] W podłożu hodowlanym, w którym hodowano komórki hybrydom, oznacza się wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciw antygenowi. Korzystnie, specyficzność wiązania przeciwciał monoklonalnych wytwarzanych przez komórki hybrydom określa się przez immunoprecypitację lub przez oznaczenie wiązania in vitro, takie jak oznaczenie radioimmunologiczne (RIA) lub enzymatyczne oznaczenie immunosorpcyjne (ELISA). [0115] Powinowactwo wiązania przeciwciała monoklonalnego można określić na przykład przez analizę Scatcharda, według Munson i współpracownicy, Anal. Blochem., 107: 220 (1980). [0116] Po zidentyfikowaniu komórek hybrydom, które wytwarzają przeciwciała o pożądanej specyficzności, powinowactwie i/lub aktywności, klony można subklonować zgodnie z procedurą kolejnych rozcieńczeń i hodować stosując standardowe metody (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, str (Academic Press, 1986)). Odpowiednie do tego celu podłoża hodowlane obejmują, na przykład, podłoże D-DMEM lub RPMI Ponadto, komórki hybrydom można hodować in vivo jako nowotwory wysiękowe w zwierzętach. [0117] Przeciwciała monoklonalne wydzielane przez subklony odpowiednio oddziela się z podłoża hodowlanego, płynu wysiękowego lub surowicy zgodnie z konwencjonalnymi procedurami oczyszczania przeciwciał, takimi jak na przykład, stosowanie białka A- Sepharose, chromatografia na hydroksyapatycie, elektroforeza żelowa, dializa lub chromatografia powinowactwa. [0118] DNA kodujące przeciwciała monoklonalne łatwo izoluje się i sekwencjonuje stosując konwencjonalne procedury (np. przez zastosowanie sond oligonukleotydowych, które są zdolne do specyficznego wiązania z genami kodującymi łańcuchy ciężki i lekki przeciwciał mysich). Komórki hybrydom służą jako korzystne źródło takiego DNA. Po wyizolowaniu, DNA można umieszczać w wektorach ekspresyjnych, które następnie poddaje się transfekcji do komórek gospodarza, takich jak komórki E. coli, małpie komórki COS, komórki jajnika chomika chińskiego (CHO) lub komórki szpiczaka, które w innym przypadku nie wytwarzają białka przeciwciał, w celu uzyskania syntezy przeciwciał monoklonalnych w zrekombinowanych komórkach gospodarza. Artykuły przeglądowe dotyczące rekombinacyjnej ekspresji DNA kodującego przeciwciało w bakteriach obejmują Skerra i współpracownicy, Curr. Opinion in Immunol., 5: (1993) i Plückthun, Immunol. Revs, 130: (1992). [0119] W kolejnym przykładzie wykonania, przeciwciała monoklonalne lub fragmenty przeciwciał można izolować z fagowych bibliotek przeciwciał, utworzonych z zastosowaniem technik opisanych w McCafferty i współpracownicy, Nature, 348: (1990). Clackson i współpracownicy, Nature, 352: (1991) i Marks i współpracownicy, J. Mol. Biol., 222: (1991) opisują izolowanie przeciwciał odpowiednio mysich i ludzkich z

31 zastosowaniem bibliotek fagowych. W kolejnych publikacjach opisano wytwarzanie ludzkich przeciwciał o wysokim powinowactwie (zakres nm) przez przetasowywanie łańcuchów (Marks i współpracownicy, Bio/Technology 10: (1992)), jak również kombinatoryczne infekowanie i rekombinację in vivo jako strategię konstruowania bardzo dużych bibliotek fagowych (Waterhouse i współpracownicy, Nuc. Acids Res. 21: (1993)). Tak więc, te techniki stanowią dobre alternatywy tradycyjnych technik przeciwciał monoklonalnych hybrydom do izolowania przeciwciał monoklonalnych. [0120] DNA można również modyfikować, na przykład, przez podstawienie sekwencji kodujących domeny stałe łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego w miejsce homologicznych sekwencji mysich (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer i Morrison i współpracownicy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851 (1984)) lub przez kowalencyjne połączenie z sekwencją kodującą immunoglobuliny całej lub części sekwencji kodującej polipeptyd, nie będący immunoglobuliną. [0121] Zwykle takie polipeptydy nie będące immunoglobulinami podstawia się za stałe domeny przeciwciała, lub podstawia się je za domeny zmienne jednego miejsca wiążącego antygen przeciwciała, tworząc chimeryczne przeciwciało biwalentne, zawierające jedno miejsce wiążące antygen, wykazujące specyficzność wobec antygenu i drugie miejsce wiążące antygen wykazujące specyficzność wobec innego antygenu. (iii) Przeciwciała humanizowane [0122] Metody humanizowania przeciwciał innych niż człowieka opisano w tej dziedzinie. Korzystnie, humanizowane przeciwciało posiada jedną lub więcej reszt aminokwasowych wprowadzonych do niego ze źródła innego niż człowiek. Te reszty aminokwasowe nie pochodzące od człowieka często określa się jako reszty "importowane", które zwykle uzyskuje się z "importowej" domeny zmiennej. Humanizację można zasadniczo prowadzić zgodnie z metodą Wintera i współpracowników (Jones i współpracownicy, Nature, 321: (1986); Riechmann i współpracownicy, Nature, 332: (1988); Verhoeyen i współpracownicy, Science, 239: (1988)), przez podstawianie sekwencjami regionów hiperzmiennych, odpowiadających sekwencji przeciwciała ludzkiego. Zgodnie z tym, takie "humanizowane" przeciwciała są przeciwciałami chimerycznymi (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer ), w których zasadniczo mniej niż nienaruszoną ludzką domenę zmienną podstawiono odpowiadającą sekwencją z gatunku innego niż człowiek. W praktyce, przeciwciałami humanizowanymi są zwykle ludzkie przeciwciała, w których niektóre reszty regionu hiperzmiennego i ewentualnie niektóre reszty FR podstawiono resztami z analogicznych miejsc w przeciwciałach gryzoni. [0123] Wybór ludzkich domen zmiennych, zarówno łańcucha lekkiego, jak i ciężkiego, przeznaczonych do otrzymywania przeciwciał humanizowanych, jest bardzo ważny dla obniżania antygenowości. Zgodnie z tak zwaną metodą "najlepszego dopasowania", sekwencję domeny zmiennej przeciwciała gryzonia przeszukuje się wobec całej biblioteki znanych ludzkich sekwencji domen zmiennych. Ludzką sekwencję, która jest najbardziej podobna do tej gryzonia akceptuje się następnie, jako ludzki region zrębowy (FR)

32 humanizowanego przeciwciała (Sims i współpracownicy, J. Immunol., 151: 2296 (1993); Chothia i współpracownicy, J. Mol. Biol., 196: 901 (1987)). W innej metodzie stosuje się określony region zrębowy pochodzący z sekwencji konsensu wszystkich ludzkich przeciwciał z określonej podgrupy łańcuchów lekkich lub łańcuchów ciężkich. Ten sam zrąb można stosować dla kilku różnych przeciwciał humanizowanych (Carter i współpracownicy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285 (1992); Presta i współpracownicy, J. Immunol.,151: 2623 (1993)). [0124] Ważne jest ponadto, aby przeciwciała poddawano humanizacji zachowując wysokie powinowactwo wiązania wobec antygenu i inne korzystne właściwości biologiczne. Dla osiągnięcia tego celu, według korzystnego sposobu, przeciwciała humanizowane otrzymuje się stosując analizę sekwencji macierzystych i różnych teoretycznych produktów humanizowanych z zastosowaniem trójwymiarowych modeli sekwencji macierzystej i sekwencji humanizowanych. Trójwymiarowe modele immunoglobulin są powszechnie dostępne i znane specjalistom w tej dziedzinie. Dostępne są programy komputerowe, które ilustrują i prezentują prawdopodobne trójwymiarowe struktury konformacyjne wybranych ewentualnych sekwencji immunoglobulin. Badanie tych struktur umożliwia analizę prawdopodobnej roli reszt w działaniu sekwencji ewentualnej immunoglobuliny, tzn. analizę reszt, które wpływają na zdolność ewentualnej immunoglobuliny do wiązania jej antygenu. W ten sposób można wyselekcjonować reszty FR i połączyć z sekwencjami biorcy i sekwencjami importowanymi tak, że uzyskuje się pożądane cechy przeciwciała, takie jak zwiększone powinowactwo do antygenu (antygenów) docelowego (docelowych). Generalnie, reszty regionu hiperzmiennego są bezpośrednio i w największym stopniu zaangażowane we wpływaniu na wiązanie antygenu. [0125] W Przykładzie 3 poniżej opisano wytwarzanie przykładowych humanizowanych przeciwciał HER2, które wiążą HER2 i blokują aktywację receptora HER przez ligand. Humanizowane przeciwciało będące tu przedmiotem szczególnego zainteresowania blokuje zachodzącą za pośrednictwem EGF, TGF-α i/lub HRG aktywację MAPK zasadniczo tak skutecznie, jak mysie przeciwciało monoklonalne 2C4 (lub jego fragment Fab) i/lub wiążą HER2 zasadniczo tak skutecznie, jak mysie przeciwciało monoklonalne 2C4 (lub jego fragment Fab). Humanizowane przeciwciało tu omawiane może, na przykład, zawierać reszty innego niż ludzki regionu hiperzmiennego wprowadzone do ludzkiej domeny zmiennej łańcucha ciężkiego i może ponadto posiadać podstawienie w regionie zrębowym (FR) w pozycji wybranej z grupy składającej się z 69H, 71H i 73H, stosując system numeracji domeny zmiennej przedstawiony w Kabat i współpracownicy, Sequences of Proteins of Immunological Interest, wyd. 5, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). W jednym przykładzie wykonania, humanizowane przeciwciało zawiera podstawienia w FR w dwóch lub wszystkich spośród pozycji 69H, 71H i 73H. [0126] Przykładowe przeciwciało humanizowane będące tu przedmiotem zainteresowania zawiera reszty determinujące komplementarność domeny zmiennej łańcucha ciężkiego GFTFTDYTMX, gdzie X korzystnie jest D lub S (SEQ ID NO: 7);

33 DVNPNSGGSIYNQRFKG (SEQ ID NO: 8) i/lub NLGPSFYFDY (SEQ ID NO: 9), ewentualnie zawierające modyfikacje aminokwasowe tych reszt CDR, np. jeśli modyfikacje zasadniczo utrzymują lub poprawiają powinowactwo przeciwciała. Na przykład, będący przedmiotem zainteresowania wariant przeciwciała może posiadać od około jednego do około siedmiu lub około pięciu podstawień aminokwasowych w powyższych sekwencjach CDR łańcuchów ciężkich. Takie warianty przeciwciał można otrzymać poprzez dojrzewanie powinowactwa, np. jak opisano poniżej. Najbardziej korzystne przeciwciało humanizowane zawiera sekwencję aminokwasową domeny zmiennej łańcucha ciężkiego w SEQ ID NO:4. [0127] Przeciwciało humanizowane może zawierać reszty determinujące komplementarność domeny zmiennej łańcucha lekkiego KASQDVSIGVA (SEQ ID NO: 10); SASYX 1 X 2 X 3, gdzie X 1 korzystnie jest R lub L, X 2 korzystnie jest Y lub E, i X 3 korzystnie jest T lub S (SEQ ID NO: 11) i/lub QQYYIYPYT (SEQ ID NO: 12), np. oprócz tych reszt CDR domeny zmiennej łańcucha ciężkiego, które podano w poprzednim akapicie. Takie przeciwciała humanizowane ewentualnie zawierają modyfikacje aminokwasowe powyższych reszt CDR, np. jeśli modyfikacje zasadniczo utrzymują lub poprawiają powinowactwo przeciwciała. Na przykład, wariant przeciwciała będący przedmiotem zainteresowania może posiadać od około jednego do około siedmiu lub około pięciu podstawień aminokwasowych w powyższych sekwencjach CDR łańcuchów lekkich. Takie warianty przeciwciał można otrzymać poprzez dojrzewanie powinowactwa, np. jak opisano poniżej. Najbardziej korzystne przeciwciało humanizowane zawiera sekwencję aminokwasową domeny zmiennej łańcucha lekkiego w SEQ ID NO: 3. [0128] Niniejsze zgłoszenie rozważa również otrzymane poprzez dojrzewanie powinowactwa przeciwciała, które wiążą HER2 i blokują aktywację receptora HER przez ligand. Przeciwciałem macierzystym może być przeciwciało ludzkie lub przeciwciało humanizowane, np. przeciwciało zawierające sekwencje zmienne łańcucha lekkiego i/lub ciężkiego odpowiednio SEQ ID Nos: 3 i 4 (tzn. wariant 574). Otrzymane poprzez dojrzewanie powinowactwa przeciwciało korzystnie wiąże się z receptorem HER2 z powinowactwem wyższym od tego mysiego 2C4 lub wariantu 574 (np. powinowactwem poprawionym od około dwukrotnie lub około czterokrotnie, do około stukrotnie lub około tysiąckrotnie, np. jak ocenione przez zastosowanie ELISA z wykorzystaniem domeny zewnątrzkomórkowej HER2 (ECD). Przykładowe reszty CDR domeny zmiennej łańcucha ciężkiego do podstawiania obejmują H28, H30, H34, H35, H64, H96, H99 lub połączenia dwóch lub więcej (np. dwie, trzy, cztery, pięć, sześć lub siedem z tych reszt). Przykładowe reszty CDR domeny zmiennej łańcucha lekkiego do podstawiania obejmują L28, L50, L53, L56, L91, L92, L93, L94, L96, L97 lub połączenia dwóch lub więcej (np. od dwóch do trzech, czterech, pięciu lub do około dziesięciu z tych reszt). [0129] Rozważa się różne postacie przeciwciała humanizowanego lub przeciwciała otrzymanego poprzez dojrzewanie powinowactwa. Na przykład, przeciwciałem humanizowanym lub przeciwciałem otrzymanym poprzez dojrzewanie powinowactwa może być fragment przeciwciała, taki jak Fab, który ewentualnie sprzęgnięto z jednym czynnikiem lub więcej czynnikami cytotoksycznymi w celu utworzenia immunokoniugatu. Alternatywnie,

34 przeciwciałem humanizowanym lub przeciwciałem otrzymanym poprzez dojrzewanie powinowactwa może być nienaruszone przeciwciało, takie jak nienaruszone przeciwciało IgG1. (iv) Przeciwciała ludzkie [0130] Jako alternatywę dla humanizacji, można wytworzyć przeciwciała ludzkie. Na przykład, obecnie jest możliwe otrzymanie zwierząt transgenicznych (np. myszy), które są zdolne, po immunizacji, do wytwarzania pełnego repertuaru przeciwciał ludzkich, przy braku wytwarzania immunoglobulin endogennych. Na przykład, opisano, że wynikiem homozygotycznej delecji genu regionu łączącego łańcucha ciężkiego (J H ) przeciwciała u chimerycznych myszy ze zmutowaną linią płciową jest całkowite zahamowanie wytwarzania przeciwciał endogennych. Wynikiem przeniesienia ludzkiego układu genów immunoglobulin linii płciowej do takich myszy o zmutowanej linii płciowej będzie wytwarzanie przeciwciał ludzkich po stymulacji antygenem. Patrz np. Jakobovits i współpracownicy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits i współpracownicy, Nature, 362: (1993); Bruggemann i współpracownicy, Year in Immuno., 7: 33 (1993) i opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach , i [0131] Alternatywnie, można stosować technikę prezentacji fagowej (McCafferty i współpracownicy, Nature 348: (1990)) do tworzenia ludzkich przeciwciał lub fragmentów przeciwciał in vitro, z zestawu genów domeny zmiennej (V) immunoglobulin od nieimmunizowanych dawców Zgodnie z tą techniką, geny domen V przeciwciał klonuje się w jednej ramce odczytu z genem lub głównego, lub drugorzędnego białka otoczki bakteriofaga włókienkowatego, takiego jak M13 lub fd, i prezentuje jako funkcjonalne fragmenty przeciwciał na powierzchni cząstki fagowej. Ze względu na to, że włókienkowata cząstka zawiera jednoniciową kopię DNA genomu faga, wynikiem selekcji opartej na funkcjonalnych właściwościach przeciwciała również prowadzi do selekcji genu kodującego przeciwciało wykazujące te właściwości. Tak więc, fag naśladuje pewne właściwości komórki B. Prezentację przez fagi można prowadzić w różnych formatach: przegląd patrz np. Johnson, Kevin S. i Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3: (1993). Można stosować kilka źródeł odcinków genów V do prezentacji fagowej. Clackson i współpracownicy, Nature, 352: (1991) wyizolowali szereg różnorodnych przeciwciał skierowanych przeciw oksazolonowi z małej losowej kombinatorycznej biblioteki genów V otrzymanych ze śledziony immunizowanych myszy. Można skonstruować zestaw genów V od nieimmunizowanych dawców ludzkich i przeciwciała skierowane wobec szeregu rozmaitych antygenów (włącznie z autoantygenami) można wyizolować zasadniczo zgodnie z metodami opisanymi w Marks i współpracownicy, J. Mol. Biol. 222: (1991) lub Griffith i współpracownicy, EMBO J. 12: (1993). Patrz również opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach i [0132] Jak omówiono powyżej, przeciwciała ludzkie mogą być również wytwarzane przez aktywowane in vitro komórki B (patrz opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach i ).

35 [0133] Ludzkie przeciwciała HER2 opisano w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer , wydanym 30 czerwca 1998 r., i WO 97/00271, opublikowanym 3 stycznia (v) Fragmenty przeciwciał [0134] Opracowano różne metody wytwarzania fragmentów przeciwciał. Tradycyjnie fragmenty te uzyskiwano przez proteolityczne trawienie nienaruszonych przeciwciał (patrz np. Morimoto i współpracownicy, Journal of Biochemical and Biophyslcal Methods 24: (1992) i Brennan i współpracownicy, Science, 229: 81 (1985)). Jednak, fragmenty te mogą być obecnie bezpośrednio wytwarzane przez zrekombinowane komórki gospodarza. Na przykład, fragmenty przeciwciał można izolować z omawianych powyżej fagowych bibliotek przeciwciał. Alternatywnie, fragmenty Fab'-SH można bezpośrednio odzyskiwać z E. coli i chemicznie sprzęgać z utworzeniem fragmentów F(ab')2 (Carter i współpracownicy, Bio/Technology 10: (1992)). Zgodnie z innym podejściem, fragmenty F(ab)2 można izolować bezpośrednio z hodowli zrekombinowanych komórek gospodarza. Dla osób pracujących w tej dziedzinie oczywiste będą inne techniki wytwarzania fragmentów przeciwciał. W innych przykład wykonaniach, przeciwciałem z wyboru jest jednołańcuchowy fragment Fv (scfv). Patrz WO 93/16185 i opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach i Fragmentem przeciwciała może być również "przeciwciało liniowe", na przykład jak opisano w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer Takie fragmenty liniowych przeciwciał mogą być monospecyficzne lub bispecyficzne. (vi) Przeciwciała bispecyficzne [0135] Przeciwciałami bispecyficznymi są przeciwciała, które posiadają specyficzności wiązania dla co najmniej dwóch różnych epitopów. Przykładowe przeciwciała bispecyficzne mogą wiązać się z dwoma różnymi epitopami białka HER2. Inne takie przeciwciała mogą łączyć miejsce wiązania HER2 z miejscem (miejscami) wiązania EGFR, HER3 i/lub HER4. Alternatywnie, ramię HER2 może być połączone z ramieniem, które wiąże się z pobudzającą cząsteczką na leukocycie, taką jak cząsteczka receptora komórek T (np. CD2 lub CD3) lub Fc receptorami dla IgG (FcγR), takimi jak FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) i FcγRIII (CD16) tak, aby skupić mechanizmy obrony komórkowej na komórkach, w których zachodzi ekspresja HER2. Przeciwciała bispecyficzne można również stosować do lokalizowania środków cytotoksycznych w komórkach, w których zachodzi ekspresja HER2. Przeciwciała te posiadają ramię wiążące HER2 i ramię, które wiąże środek cytotoksyczny (np. saporynę, antyinterferon-α, alkaloid vinca, łańcuch A rycyny, metotreksat lub hapten z izotopem promieniotwórczym. Przeciwciała bispecyficzne można otrzymać jako przeciwciała o pełnej długości lub fragmenty przeciwciał (np. bispecyficzne przeciwciała F(ab')2). [0136] W WO 96/16673 opisano bispecyficzne przeciwciało skierowane przeciw HER2/FcγRIII, i opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer ujawnia IDM1 (Osidem) bispecyficzne przeciwciało HER2/FcγRI. Bispecyficzne przeciwciało HER2/Fcα przedstawiono w WO 98/ Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki

36 numer omawia bispecyficzne przeciwciało HER2/CD3. MDX-210 jest bispecyficznym HER2-FcγRIII Ab. [0137] Sposoby wytwarzania przeciwciał bispecyficznych wytwarzania przeciwciał bispecyficznych są znane specjalistom w danej dziedzinie. Tradycyjnie, rekombinowana produkcja przeciwciał bispecyficznych o pełnej długości jest oparta o koekspresję dwóch par łańcuch ciężki-łańcuch lekki immunoglobulin, gdzie dwa łańcuchy mają różne specyficzności (Milstein i współpracownicy, Nature, 305: 537 (1983)). Ze względu na losowy wybór łańcuchów ciężkich i lekkich immunoglobulin, te hybrydomy (kwadromy) wytwarzają ewentualną mieszaninę 10 różnych cząsteczek przeciwciał, spośród których tylko jedna posiada prawidłową strukturę bispecyficzną. Oczyszczanie właściwej cząsteczki, zwykle wykonywane za pomocą stosowania etapów chromatografii powinowactwa, jest raczej niewygodne i wydajności produktu są niskie. Podobne procedury ujawniono w WO 93/08829 i w Traunecker wi współpracownicy, EMBO J., 10: 3655 (1991). [0138] Według innego podejścia, domeny zmienne przeciwciał o pożądanych specyficznościach (miejscach wiązania przeciwciało-antygen) poddaje się fuzji z sekwencjami domen stałych immunoglobulin. Fuzja korzystnie zachodzi z domeną stałą łańcucha ciężkiego immunoglobuliny, zawierającą co najmniej część regionów zawiasowego, CH2 i CH3. Korzystne jest, aby pierwszy region stały łańcucha ciężkiego (CH1) zawierający miejsce konieczne do wiązania łańcucha lekkiego, był obecny w co najmniej jednej z fuzji. DNA kodujące fuzje łańcuchów ciężkich immunoglobulin i, jeśli jest to pożądane, łańcuchów lekkich, wstawia się do oddzielnych wektorów i ulega kotransfekcji do odpowiedniego organizmu gospodarza. Zapewnia to dużą elastyczność pod względem dostosowania wzajemnych proporcji trzech fragmentów polipeptydowych w przykładach wykonania, kiedy nierówne proporcje trzech łańcuchów polipeptydowych użytych w konstrukcji, zapewniają optymalną wydajność. Jest jednak możliwe wstawienie sekwencji kodujących dla dwóch lub wszystkich trzech łańcuchów polipeptydowych do jednego wektora ekspresyjnego, jeśli ekspresja co najmniej dwóch łańcuchów polipeptydowych w równych proporcjach prowadzi do wysokich wydajności lub kiedy proporcje nie mają szczególnego znaczenia. [0139] W korzystnym przykładzie wykonania tego podejścia, przeciwciała bispecyficzne są zbudowane z hybryd łańcucha ciężkiego immunoglobuliny, z pierwszą specyficznością wiązania na jednym ramieniu i hybrydową parą łańcuchów ciężkiego i lekkiego immunoglobuliny (zapewniających drugą specyficzność wiązania) na drugim ramieniu. Stwierdzono, że ta asymetryczna struktura ułatwia oddzielanie pożądanego związku bispecyficznego od niepożądanych połączeń łańcuchów immunoglobulin, ponieważ obecność lekkiego łańcucha immunoglobuliny tylko w jednej połowie bispecyficznej cząsteczki zapewnia łatwy sposób oddzielania. Podejście to ujawniono w WO 94/ W celu zapoznania się z dalszymi szczegółami dotyczącymi wytwarzania przeciwciał bispecyficznych patrz, np., Suresh i współpracownicy, Methods in Enzymology, 121: 210 (1986). [0140] Według innego podejścia, opisanego w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer , interfejs (region kontaktu) pary cząsteczek przeciwciał można tak

37 konstruować, aby zapewnić maksymalizację procentu heterodimerów, które odzyskuje się z hodowli zrekombinowanych komórek. Korzystny region kontaktu zawiera co najmniej część domeny C H 3 domeny stałej przeciwciała. W sposobie tym jeden lub więcej małych łańcuchów bocznych aminokwasów z interfejsu cząsteczki pierwszego przeciwciała zastępuje się większymi łańcuchami bocznymi (np. tyrozyny czy tryptofanu). Na interfejsie cząsteczki drugiego przeciwciała tworzy się odpowiadające "wgłębienia" o identycznej lub podobnej wielkości co duży łańcuch ( łańcuchy) boczny (boczne), poprzez zastąpienie aminokwasów o dużych łańcuchach bocznych aminokwasami o mniejszych łańcuchach bocznych (np. treoniny alaniną). Zapewnia to mechanizm zwiększania wydajności heterodimeru w stosunku do niepożądanych produktów końcowych, takich jak homodimery. [0141] Przeciwciała bispecyficzne obejmują przeciwciała sieciowane lub "heterokoniugaty". Na przykład, jedno z przeciwciał heterokoniugatu można sprzęgać z awidyną, a drugie z biotyną. Takie przeciwciała zaproponowano, na przykład, do nakierowania komórek układu opornościowego do niepożądanych komórek (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer ) i do leczenia infekcji HIV (WO 91/00360 i WO 92/ i europejski opis patentowy numer 03089). Heterokoniugaty przeciwciał mogą być wytwarzane za pomocą jakichkolwiek dogodnych sposobów sieciowania. Odpowiednie środki sieciujące są dobrze znane w dziedzinie i są ujawnione w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer , wraz z licznymi metodami sieciowania. [0142] Metody wytwarzania przeciwciał bispecyficznych z fragmentów przeciwciał również opisano w literaturze. Na przykład, przeciwciała bispecyficzne można otrzymać stosując wiązanie chemiczne. Brennan i współpracownicy, Science, 229: 81 (1985) opisują procedurę, w której nienaruszone przeciwciała rozszczepia się proteolitycznie z utworzeniem fragmentów F(ab')2. Fragmenty te redukuje się w obecności środka kompleksującego ditiole, arseninu sodowego, w celu stabilizacji sąsiednich ditioli i zapobiegania tworzenia międzycząsteczkowych wiązań disiarczkowych. Utworzone fragmenty Fab' przekształca się następnie w pochodne tionitrobenzoesanu (TNB). Jedną z pochodnych Fab'-TNB następnie ponownie przekształca się w Fab'-tiol przez redukcję merkaptoetyloaminą i miesza z równomolową ilością drugiej pochodnej Fab'-TNB z utworzeniem przeciwciała bispecyficznego. Wytworzone przeciwciała bispecyficzne można stosować jako środki do selektywnej immobilizacji enzymów. [0143] Ostatnie postępy ułatwiły bezpośrednie odzyskiwanie fragmentów Fab'-SH z E. coli, które można chemicznie sprzęgać z utworzeniem przeciwciał bispecyficznych. Shalaby i współpracownicy, J. Exp. Med., 175: (1992) opisują wytwarzanie w pełni humanizowanej cząsteczki F(ab') przeciwciała bispecyficznego. Każdy z fragmentów Fab' jest oddzielnie wydzielany z E. coli i poddawany bezpośredniemu sprzęganiu chemicznemu in vitro z utworzeniem przeciwciała bispecyficznego. Tak utworzone przeciwciało bispecyficzne było zdolne do wiązania z komórkami, w których zachodziła nadekspresja receptora HER2 i normalnymi ludzkimi komórkami T, jak również wyzwalania aktywności litycznej ludzkich limfocytów cytotoksycznych wobec stanowiących cel ludzkich nowotworów sutka.

38 [0144] Opisano również różne metody otrzymywania i izolowania fragmentów przeciwciał bispecyficznych bezpośrednio z hodowli zrekombinowanych komórek. Na przykład, przeciwciała bispecyficzne wytwarzano stosując leucynowe zamki (suwaki). Kostelny i współpracownicy, J. Immunol., 148 (5): (1992). Peptydy leucynowego zamka z białek Fos i Jun połączono z częściami Fab' dwóch różnych przeciwciał przez fuzję genów. Homodimery przeciwciał zredukowano w regionie zawiasowym z utworzeniem monomerów, a następnie ponownie utleniano tworząc heterodimery przeciwciał. Sposób ten można również wykorzystywać do tworzenia homodimerów przeciwciał. Technologia "diaciał", opisana przez Hollinger i współpracownicy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: (1993), zapewniła alternatywny mechanizm otrzymywania fragmentów przeciwciał bispecyficznych. Fragmenty zawierają domenę zmienną łańcucha ciężkiego (V H ) połączoną z domeną zmienną łańcucha lekkiego (V L ) poprzez łącznik, który jest zbyt krótki, aby umożliwić parowanie pomiędzy dwiema domenami tego samego łańcucha. Zgodnie z tym, domeny V H i V L jednego fragmentu zmuszone są do parowania z komplementarnymi domenami V L i V H drugiego fragmentu, w ten sposób tworząc dwa miejsca wiążące antygeny. Doniesiono również o innej strategii otrzymywania fragmentów przeciwciał bispecyficznych dzięki zastosowaniu dimerów o pojedynczym łańcuchu Fv (sfv). Patrz Gruber i współpracownicy, J. Immunol., 152: 5368 (1994) [0145] Bierze się również pod uwagę przeciwciała o więcej niż dwóch wartościowościach. Na przykład, można otrzymywać przeciwciała trispecyficzne. Tutt i współpracownicy, J. Immunol. 147: 60 (1991). (vii) Inne modyfikacje sekwencji aminokwasowej [0146] Rozważa się modyfikację (modyfikacje) sekwencji aminokwasowej opisanych tu przeciwciał skierowanych przeciw HER2. Na przykład, może być pożądana poprawa powinowactwa wiązania i/lub innych właściwości biologicznych przeciwciała. Warianty sekwencji aminokwasowej przeciwciała skierowanego przeciw HER2 otrzymuje się przez wprowadzanie odpowiednich zmian nukleotydowych do kwasu nukleinowego przeciwciała przeciwko HER2, lub przez syntezę peptydów. Takie modyfikacje obejmują, na przykład, delecje i/lub insercje i/lub podstawienia reszt w sekwencji aminokwasowej przeciwciała skierowanego przeciw HER2. Celem uzyskania produktu końcowego można stosować jakąkolwiek kombinację delecji, insercji i podstawień, pod warunkiem, że konstrukt końcowy posiada pożądane właściwości. Zmiany aminokwasów mogą również zmieniać potranslacyjne procesy przeciwciała skierowanego przeciw HER2, takie jak zmiany liczby lub pozycji miejsc glikozylacji. [0147] Użytecznym sposobem identyfikowania pewnych reszt lub regionów przeciwciała skierowanego przeciw HER2, które są korzystnymi miejscami dla mutagenezy, nazwano "mutagenezą przeszukiwaną alaninami", jak opisano w Cunningham i Wells, Science, 244: (1989). W tym sposobie identyfikuje się resztę lub grupę reszt docelowych (np. reszty naładowane, takie jak arg, asp, his, lys i glu) i zastępuje aminokwasami obojętnymi lub naładowanymi ujemnie (najbardziej korzystnie alaniną lub fenyloalaniną) w celu uzyskania oddziaływań aminokwasów z antygenem HER2. Te pozycje aminokwasowe, które wykazują

39 funkcjonalną wrażliwość na podstawienia, analizuje się następnie bardziej szczegółowo przez wprowadzanie dalszych lub innych wariantów w, lub dla miejsc podstawienia. Tak więc, o ile wstępnie określa się miejsce wprowadzania różnicy w sekwencji aminokwasowej, charakter mutacji per se nie musi zostać wstępnie określony. Na przykład, dla analizy roli mutacji w danym miejscu, przeprowadza się przeszukiwanie alaninami lub mutagenezę losową docelowego kodonu lub regionu i ulegające ekspresji warianty przeciwciała przeciw HER2 przeszukuje się pod kątem pożądanej aktywności. [0148] Insercje w sekwencjach aminokwasowych obejmują fuzje amino- i/lub karboksylokońcowe, o długości pozostającej w zakresie od jednej reszty do polipeptydów zawierających sto lub więcej reszt, jak również insercje wewnątrzsekwencyjne pojedynczych lub licznych reszt aminokwasowych. Przykłady insercji na końcach obejmują przeciwciało skierowane przeciw HER2 z N-końcową resztą metionylową lub przeciwciało poddane fuzji z polipeptydem cytotoksycznym. Inne insercyjne warianty cząsteczki przeciwciała skierowanego przeciw HER2 obejmują fuzję z końcem N lub C przeciwciała przeciw HER2 enzymu (np. dla ADEPT) lub polipeptydu, który zwiększa okres półtrwania przeciwciała w surowicy. [0149] Innym rodzajem wariantu jest wariant substytucji aminokwasowej. Warianty te posiadają co najmniej jedną resztę aminokwasową w cząsteczce przeciwciała skierowanego przeciw HER2 zastąpioną inną resztą. Miejsca najbardziej pożądane dla mutagenezy przez substytucję obejmują regiony hiperzmienne, lecz zmiany w FR bierze się również pod uwagę. Konserwatywne substytucje przedstawiono w Tablicy 1 pod nagłówkiem "korzystne substytucje". Jeśli takie substytucje prowadzą do zmiany aktywności biologicznej, to następnie można wprowadzać bardziej zasadnicze zmiany, określone w Tablicy 1 "Przykładowe substytucje", lub jak opisano poniżej w odniesieniu do klas aminokwasów, mogą być wprowadzone i produkty przeszukiwane. Tablica 1 Reszta oryginalna Przykładowe Substytucje Korzystne Substytucje Ala (A) Val; Leu; Ile Val Arg (R) Lys; Gln; Asn Lys Asn (N) Gln; His; Asp, Lys; Arg Gln Asp (D) Glu; Asn Glu Cys (C) Ser; Ala Ser Gln (Q) Asn; Glu Asn Glu (E) Asp; Gln Asp Gly (G) Ala Ala

40 His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg Ile (I) Leu (L) Leu; Val; Met; Ala; Phe; Norleucyna Leu Norleucyna; Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg Met (M) Leu; Phe; Ile Leu Phe (F) Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr Pro (P) Ala Ala Ser (S) Thr Thr Thr (T) Val; Ser Ser Trp (W) Tyr; Phe Tyr Tyr(Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe Val (V), Ile; Leu; Met; Phe; Ala; Norleucyna Leu [0150] Istotne modyfikacje właściwości biologicznych przeciwciał prowadzi się przez wybór substytucji, które różnią się znacząco swoim wpływem na utrzymywanie (a) struktury szkieletu polipeptydowego w obszarze substytucji, na przykład konformacji struktury β lub helikalnej, (b) ładunku lub hydrofobowości cząsteczki w miejscu docelowym lub (c) wielkości łańcucha bocznego. Aminokwasy mogą być zgrupowane według podobieństwa własności ich łańcuchów bocznych (w A. L. Lehninger, w Biochemistry, wydanie drugie, str , Worth Publishers, Nowy Jork (1975)): (1) niepolarne: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M) (2) polarne bez ładunku: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q) (3) kwasowe: Asp (D), Glu (E) (4) zasadowe: Lys (K), Arg (R), His (H) [0151] Alternatywnie, naturalnie występujące reszty podzielono na grupy w oparciu o typowe właściwości łańcuchów bocznych: (1) hydrofobowe: norleucyna, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) obojętne hydrofilowe: Cys, Ser, Thr; Asn, Gln; (3) kwasowe: Asp, Glu; (4) zasadowe: His, Lys, Arg; (5) reszty, które wpływają na orientację łańcucha: Gly, Pro;

41 (6) aromatyczne: Trp, Tyr, Phe. [0152] Substytucje nie konserwatywne wymagają wymiany przedstawiciela jednej z tych klas na przedstawiciela innej klasy. [0153] Każda reszta cysteiny nie biorącą udziału w utrzymywaniu właściwej konformacji przeciwciała skierowanego przeciw HER2 również może ulec substytucji, na ogół seryną, dla poprawy oksydacyjnej stabilności cząsteczki i zapobiegania niewłaściwemu sieciowaniu. Przeciwnie, mostek (mostki) cysteinowe można dodatkowo wprowadzać do przeciwciała dla poprawy jego stabilności (szczególnie jeśli przeciwciałem jest fragment przeciwciała, taki jak fragment Fv) [0154] Szczególnie korzystny rodzaj wariantu substytucyjnego obejmuje substytucję jednej lub więcej reszt regionu hiperzmiennego przeciwciała macierzystego (np. przeciwciała humanizowanego lub ludzkiego). Generalnie, otrzymany (otrzymane) wariant (warianty) wybrany (wybrane) do dalszego opracowywania będzie miał poprawione właściwości biologiczne w porównaniu z przeciwciałem macierzystym, z którego go wytworzono. Dogodny sposób wytwarzania takich wariantów substytucyjnych obejmuje dojrzewanie powinowactwa z zastosowaniem prezentacji fagowej. W skrócie, kilka miejsc regionu hiperzmiennego (np. 6-7 miejsc) poddaje się mutacjom w celu utworzenia wszystkich możliwych substytucji aminokwasowych w każdym z miejsc. Tak wytworzone warianty przeciwciała prezentowane są w sposób monowalentny na cząstkach fagów włókienkowatych w postaci białek fuzyjnych z produktem genu III M13, upakowanych w każdej cząstce. Warianty po prezentacji fagowej następnie poddaje się przeszukiwaniu pod kątem ich właściwości biologicznych (np. powinowactwa wiązania) jak tu ujawniono. W celu zidentyfikowania ewentualnych miejsc regionu hiperzmiennego do modyfikacji, można przeprowadzić mutagenezę przeszukiwania alanin dla identyfikacji reszt regionu hiperzmiennego uczestniczących w znaczącym stopniu w wiązaniu antygenu. Alternatywnie, lub dodatkowo, korzystne może być zanalizowanie struktury krystalicznej kompleksu antygen-przeciwciało dla identyfikacji punktów kontaktu pomiędzy przeciwciałem i ludzkim HER2. Takie reszty kontaktowe i reszty sąsiadujące są ewentualnymi resztami do substytucji zgodnie z metodami tu opracowanymi. Po utworzeniu takich wariantów, panel wariantów poddaje się przeszukiwaniu w sposób tu opisany i przeciwciała o ulepszonych właściwościach w jednym lub więcej odpowiednich oznaczeń można wybrać do dalszego opracowywania. [0155] Inny rodzaj wariantu aminokwasowego przeciwciała zmienia pierwotny schemat glikozylacji przeciwciała. Przez zmianę rozumie się delecję jednej lub więcej grup węglowodanowych występujących w przeciwciele, i/lub dodanie jednego lub więcej miejsc glikozylacji, które nie są obecne w przeciwciele. [0156] Glikozylacja przeciwciał jest zwykle lub N-połączeniem lub O-połączeniem. N- połączenie dotyczy przyłączenia grupy węglowodanowej do łańcucha bocznego reszty asparaginy. Tripeptydowe sekwencje asparagina-x-seryna i asparagina-x-treonina, gdzie X jest jakimkolwiek aminokwasem poza proliną, stanowią sekwencje rozpoznania do

42 enzymatycznego przyłączania grupy węglowodanowej do łańcucha bocznego asparaginy. Tak więc, obecność którejkolwiek z tych sekwencji tripeptydowych w polipeptydzie tworzy ewentualne miejsce glikozylacji. O-glikozylacja dotyczy połączenia jednego z cukrów N- acetylogalaktozoaminy, galaktozy lub ksylozy z hydroksyaminokwasem, najczęściej seryną lub treoniną, chociaż może również być wykorzystywana 5-hydroksyprolina lub 5- hydroksylizyna. [0157] Wprowadzanie dodatkowych miejsc glikozylacji do przeciwciała dogodnie przeprowadza się przez zmianę sekwencji aminokwasowej tak, że zawiera ona jedną lub więcej z opisanych powyżej sekwencji tripeptydowych (miejsc N-glikozylacji). Zmiany można również dokonać przez dodanie lub podstawienie, jednej lub więcej reszt seryny lub treoniny do sekwencji oryginalnego przeciwciała (dla miejsc O-glikozylacji). [0158] Cząsteczki kwasów nukleinowych kodujące warianty sekwencji aminokwasowej przeciwciała skierowanego przeciw HER2 otrzymuje się różnymi metodami znanymi w tej dziedzinie. Metody te obejmują, ale bez ograniczania, izolowanie ze źródła naturalnego (w przypadku naturalnie występujących wariantów sekwencji aminokwasowych) lub otrzymywania przez mutagenezę za pośrednictwem oligonukleotydów (czyli ukierunkowaną), mutagenezę przez PCR i mutagenezę za pomocą kaset wcześniej przygotowanej wariantowej lub niewariantowej wersji przeciwciała skierowanego przeciw HER2. [0159] Może być pożądane modyfikowanie przeciwciała według wynalazku w odniesieniu do funkcji efektorowej, np. tak aby wzmocnić zależną od antygenu cytotoksyczność komórkową (ADCC) i/lub cytotoksyczność zależną od dopełniacza (CDC) przeciwciała. Można to uzyskać przez wprowadzenie jednego lub więcej podstawień aminokwasowych w regionie Fc przeciwciała. Alternatywnie, lub dodatkowo, można wprowadzić resztę (reszty) cysteiny do regionu Fc, w ten sposób umożliwiając utworzenie między łańcuchowego wiązania disiarczkowego w tym regionie. Tak utworzone przeciwciało homodimeryczne może wykazywać poprawioną zdolność do ulegania internalizacji i/lub zwiększone zależne od dopełniacza zabijanie komórek i zależną od przeciwciała cytotoksyczność komórkową (ADCC). Patrz Caron i współpracownicy, J. Exp. Med. 176: (1992) i Shopes, B., J. Immunol. 148: (1992). Homodimeryczne przeciwciała o wzmocnionej aktywności przeciwnowotworowej można również otrzymać stosując heterobifunkcyjne środki sieciujące, jak opisano w Wolff i współpracownicy, Cancer Research 53: (1993). Alternatywnie, można skonstruować metodą inżynierii genetycznej przeciwciało, które posiada podwójne regiony Fc i dlatego może posiadać wzmocnione możliwości zależnej od dopełniacza lizy i ADCC. Patrz Stevanson i współpracownicy, Anti-Cancer Drug Design, 3: (1989). [0160] W celu zwiększenia okresu półtrwania przeciwciała w surowicy, do przeciwciała (a zwłaszcza fragmentu przeciwciała) można wprowadzić epitop wiążący receptor ratunkowy, jak opisano na przykład w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer W znaczeniu tu stosowanym, termin "epitop wiążący receptor ratunkowy" dotyczy epitopu regionu Fc cząsteczki IgG (np. IgG 1, IgG 2, IgG 3 lub IgG 4 ), który jest odpowiedzialny za zwiększanie okresu półtrwania cząsteczki IgG w surowicy in vivo.

43 (viii) Przeszukanie pod kątem przeciwciał o pożądanych właściwościach [0161] Metody wytwarzania przeciwciał opisano powyżej. Przeciwciała można dalej selekcjonować pod kątem pewnych pożądanych właściwości biologicznych. [0162] W celu identyfikacji przeciwciała, które blokuje aktywację receptora HER2 przez ligand, można określić zdolność przeciwciała do blokowania wiązania liganda HER z komórkami, w których zachodzi ekspresja receptora HER (np. w połączeniu z innym receptorem HER, z którym receptor HER będący przedmiotem zainteresowania tworzy heterooligomer HER). Na przykład, komórki, w których zachodzi naturalna ekspresja, lub poddane transfekcji tak, aby zachodziła w nich ekspresja, receptory HER heterooligomeru HER, można inkubować z przeciwciałem, a następnie eksponować na znakowany ligand HER. Zdolność przeciwciała skierowanego przeciw HER2 do blokowania wiązania liganda z receptorem HER w heterooligomerze HER można następnie ocenić. [0163] Na przykład, hamowanie wiązania HRG z linią komórek nowotworu sutka MCF7 przez przeciwciała HER2 można przeprowadzić stosując monowarstwowe hodowle MCF7 w lodzie w 24-studzienkowej płytce, zasadniczo jak opisano w Przykładzie 1 poniżej. Przeciwciała monoklonalne HER2 można dodawać do każdej studzienki i inkubować w ciągu 30 minut. Następne można dodawać 125 I znakowaną rhrgβ (25 pm) i inkubację można kontynuować w ciągu od 4 do 16 godzin. Można otrzymać krzywe dawka-odpowiedź i obliczać wartość IC 50 dla przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania. W jednym przykładzie wykonania, przeciwciało, które blokuje aktywację receptora HER przez ligand, ma w tym oznaczeniu IC 50 dla hamowania wiązania HRG z komórkami MCF7 wynoszące około 50 nm lub mniej, bardziej korzystnie 10 nm lub mniej. Jeśli przeciwciałem jest fragment przeciwciała, taki jak fragment Fab, IC 50 dla hamowania wiązania HRG z komórkami MCF7 w tym oznaczeniu może, na przykład, wynosić około 100 nm lub mniej, bardziej korzystnie 50 nm lub mniej. [0164] Alternatywnie, lub dodatkowo, można oceniać zdolność przeciwciała skierowanego przeciw HER2 do blokowania stymulowanej ligandem HER fosforylacji tyrozyny receptora HER obecnego w heterooligomerze HER. Na przykład, komórki, w których zachodzi endogenna ekspresja receptorów HER lub poddane transfekcji tak, aby zachodziła w nich taka ekspresja, można inkubować z przeciwciałem, a następnie oznaczyć zależną od liganda HER aktywność fosforylacji tyrozyny stosując monoklonalne przeciwciało skierowane przeciw fosfotyrozynie (które ewentualnie sprzęgano z wykrywalnym znacznikiem). Do określania aktywacji receptora HER i blokowania tej aktywności przez przeciwciało dostępne jest również oznaczenie aktywacji receptora o aktywności kinazy opisane w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer [0165] W jednym przykładzie wykonania, można dokonywać przeszukiwania pod kątem przeciwciała, które hamuje stymulację fosforylacji tyrozyny p180 przez HRG w komórkach MCF7, zasadniczo jak opisano w Przykładzie 1 poniżej. Na przykład, komórki MCF7 można wysiewać w 24-studzienkowych płytkach i do każdej studzienki dodawać Przeciwciała HER2 monoklonalne i inkubować w temperaturze pokojowej w ciągu 30 minut; następnie do każdej

44 studzienki można dodawać rhrgβ1 177=244 do stężenia końcowego 0,2 nm i inkubację można kontynuować przez 8 minut. Z każdej studzienki można odciągnąć podłoże i reakcje można zatrzymywać przez dodanie 100 μl buforu do próbek z SDS (5% SDS, 25 mm DTT i 25 mm Tris-HCl, ph 6,8). Każdą próbkę (25 μl) można poddawać elektroforezie na żelach o gradiencie 4-12% poliakryloamidu (Novex), a następnie przenosić elektroforetycznie na membranę z polifluorku winylidenu. Można wywoływać immunobloty stosując przeciwciało skierowane przeciw fosfotyrozynie (o stężeniu 1 μg/ml) i intensywność głównego reaktywnego prążka o M r ~ można ilościowo oceniać przez densytometrię w świetle odbitym. Wyselekcjonowane przeciwciało korzystnie hamuje w tym oznaczeniu stymulację fosforylacji tyrozyny p180 przez HRG do około 0-35% wartości kontrolnej. Można wytwarzać krzywą dawka-odpowiedź dla hamowania stymulacji fosforylacji tyrozyny p180 przez HRG, określanej przez densytometrię w świetle odbitym i można obliczyć IC 50 dla przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania. W jednym przykładzie wykonania, przeciwciało, które blokuje aktywację receptora HER przez ligand ma w tym oznaczeniu IC 50 dla hamowania stymulacji tyrozyny p180 przez HRG wynoszące około 50 nm lub mniej, bardziej korzystnie 10 nm lub mniej. Jeśli przeciwciałem jest fragment przeciwciała, taki jak fragment Fab, IC 50 dla hamowania stymulacji fosforylacji tyrozyny p180 przez HRG w tym oznaczeniu może wynosić na przykład około 100 nm lub mniej, bardziej korzystnie 50 nm lub mniej. [0166] Można również oceniać wpływ hamowania wzrostu przez przeciwciało wobec komórek MDA--MB-175, np. zasadniczo jak opisano w Schaefer i współpracownicy, Oncogene 15: (1997). Według tego oznaczenia, komórki MDA-MB-175 można traktować monoklonalnym przeciwciałem skierowanym przeciw HER2 (10 μg/ml) przez 4 dni i wybarwiać fioletem krystalicznym. Inkubacja z przeciwciałem HER2 może wykazać wpływ hamowania wzrostu na tę linię komórkową, podobny do tego wykazywanego przez monoklonalne przeciwciało 2C4. W dalszym przykładzie wykonania, egzogenne HRG nie będzie znacząco odwracało tego hamowania. Korzystnie, przeciwciało jest zdolne do hamowania proliferacji komórkowej komórek MDA-MB-175 w większym zakresie niż monoklonalne przeciwciało 4D5 (i ewentualnie w większym zakresieu niż monoklonalne przeciwciało 7F3), zarówno w obecności, jak i nieobecności egzogennego HRG. [0167] W jednym przykładzie wykonania, będące przedmiotem zainteresowania przeciwciało skierowane przeciw HER2 może blokować zależną od hereguliny asocjację HER2 z HER3 zarówno w komórkach MCF7, jak i SK-BR-3, określaną w doświadczeniu koimmunoprecypitacji, takim jak to opisane w Przykładzie 2, znacznie bardziej skutecznie niż monoklonalne przeciwciało 4D5, i korzystnie znacznie bardziej skutecznie niż monoklonalne przeciwciało 7F3. [0168] W celu identyfikacji przeciwciał HER2 hamujących wzrost, przeciwciała można przeszukiwać pod kątem tych, które hamują wzrost komórek rakowych, w których zachodzi nadekspresja HER2. W jednym przykładzie wykonania, wybrane przeciwciało hamujące wzrost jest zdolne do hamowania wzrostu komórek SK-BR-3 w hodowli komórkowej o około %, i korzystnie o około %, przy stężeniu przeciwciała wynoszącym około od

45 - 44-0,5 do 30 μg/ml. W celu identyfikacji takich przeciwciał można przeprowadzić oznaczenie na komórkach SK-BR-3, opisane w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer Według tego oznaczenia, komórki SK-BR-3 hoduje się w mieszaninie 1:1 podłoża F12 i DMEM, wzbogaconej w 10% płodową surowicę bydlęcą, glutaminę i penicylinę/streptomycynę. Komórki SK-BR-3 wysiewa się w ilości komórek w szalkach do hodowli komórek o średnicy 35 mm (2 ml/szalkę o średnicy 35 mm). Dodaje się 0,5 do 30 μg/ml przeciwciała skierowanego przeciw HER2 na szalkę. Po sześciu dniach zlicza się liczbę komórek, w porównaniu z komórkami nietraktowanymi, stosując elektroniczne urządzenie do zliczania komórek COULTER TM. Te przeciwciała, które hamują wzrost komórek SK-BR-3 o około % lub o około %, można wybierać jako przeciwciała hamujące wzrost, patrz opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer dla oznaczeń do przeszukiwania pod kątem przeciwciał hamujących wzrost, takich jak 4D5 i 3E8. [0169] Do selekcji pod kątem przeciwciał, które indukują apoptozę, dostępne jest oznaczenie wiązania aneksyny z zastosowaniem komórek BT474. Komórki BT474 hoduje się i wysiewa w szalkach, jak omówiono w poprzednim akapicie. Następnie podłoże usuwa się i zastępuje samym świeżym podłożem lub podłożem zawierającym 10 μg/ml przeciwciała monoklonalnego. Komórki inkubuje się w ciągu okresu 3 dni, monowarstwy przemywa się PBS i odłącza stosującę trypsynę. Następnie komórki wiruje się, ponownie zawiesza w buforze do wiązania z Ca2+ i rozmieszcza do probówek, jak omówiono powyżej dla oznaczenia śmierci komórkowej. Do probówek dodaje się następnie znakowaną aneksynę (np. aneksynę V-FITC) (1 μg/ml). Próbki można analizować stosując cytometr przepływowy FACSCAN i oprogramowanie FACSCONVERT Cell Quest (Becton Dickinson). Te przeciwciała, które indukują istotne statystycznie poziomy wiązania aneksyny w stosunku do kontroli wybiera się jako przeciwciała indukujące apoptozę. Oprócz oznaczenia wiązania aneksyny, dostępne jest oznaczenie wybarwiania DNA z zastosowaniem komórek BT474. W celu przeprowadzenia tego oznaczenia, komórki BT474, które traktowano przeciwciałem będącym przedmiotem zainteresowania jak opisano w poprzednich dwóch akapitach, inkubuje się z 9 μg/ml HOECHST w ciągu dwóch godzin w temperaturze 37 C, a następnie analizuje w cytometrze przepływowym EPICS ELITE (Coulter Corporation) stosując oprogramowanie MODFIT LT (Verity Software House). Stosując to oznaczenie, przeciwciała, które indukują zmianę procentu komórek apoptycznych, który jest 2-krotny lub wyższy (i korzystnie 3-krotny lub wyższy) niż w przypadku komórek nietraktowanych (do 100% komórek apoptycznych), można wybrać jako przeciwciała pro-apoptyczne. Zobacz WO98/17797 dla oznaczeń do przeszukiwania pod kątem przeciwciał, które indukują apoptozę, takie jak 7C2 and 7F3. [0170] Do przeszukiwania pod kątem przeciwciał, które wiążą się z epitopem związanym przez przeciwciało będące przedmiotem zainteresowania, można przeprowadzić rutynowe oznaczenie blokowania krzyżowego, takie jak to opisane w Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow i David Lane (1988). Alternatywnie lub dodatkowo, można prowadzić mapowanie epitopowe metodami znanymi w tej dziedzinie (patrz np. Fig. 1A i 1B tu). Przeciwciała, takie jak 2C4 lub Pertuzumab, do HER2.

46 Alternatywnie lub dodatkowo, można prowadzić mapowanie epitopowe metodami znanymi w tej dziedzinie (patrz np. Fig. 1A i 1B tu). i/lub można zbadać strukturę przeciwciała-her2 (Franklin i współpracownicy, Cancer Cell 5: (2004)), celem sprawdzenia którą domeną (domanami) HER2 jest/są związane przez przeciwciała. (ix) Immunokoniugaty [0171] Wynalazek dotyczy również immunokoniugatów zawierających przeciwciało sprzężone ze środkiem cytotoksycznym, takim jak środek chemioterapeutyczny, toksyna (np. toksyna niskocząsteczkowa lub toksyna aktywna enzymatycznie pochodzenia bakteryjnego, grzybowego, roślinnego lub zwierzęcego, włącznie z ich fragmentami i/lub wariantami) lub izotopem promieniotwórczym (tzn. radiokoniugat). [0172] Środki chemioterapeutyczne użyteczne w tworzeniu takich immunokoniugatów opisano powyżej. Rozważa się tu również koniugaty przeciwciała z jedną lub więcej toksynami niskocząsteczkowymi, takimi jak kalicheamicyna, majtanzyna (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer ), trichoten i CC1065. [0173] W jednym korzystnym przykładzie wykonania wynalazku, przeciwciało poddaje się sprzęganiu z jedną lub więcej cząsteczkami majtanzyny (np. od około 1 do około 10 cząsteczkami majtanzyny na cząsteczkę przeciwciała). Majtanzynę można, na przykład, przekształcić w May-SS-Me, którą można zredukować do May-SH3 i poddać reakcji ze zmodyfikowanym przeciwciałem (Chari i współpracownicy, Cancer Research 52: (1992)) z utworzeniem immunokoniugatu majtanzynoid-przeciwciało. [0174] Inny immunokoniugat będący przedmiotem zainteresowania zawiera przeciwciało skierowane przeciw HER2 sprzężone z jedną lub więcej cząsteczkami kalicheamicyny. Rodzina antybiotyków kalicheamicynowych charakteryzuje się zdolnością do rozrywania dwuniciowego DNA przy stężeniach subpikomolowych. Strukturalne analogi kalicheamicyny, które można stosować, obejmują, ale bez ograniczania γ 1 I, α 2 I, α 3 I, N-acetyloγ1 I, PSAG i θ I 1 (Hinman i współpracownicy, Cancer Research 53: (1993) i Lode i współpracownicy, Cancer Research 58: 2928 (1998)). Patrz również opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach , , i [0175] Enzymatycznie aktywne toksyny i ich fragmenty, które można stosować, obejmują łańcuch A toksyny błoniczej, niewiążące aktywne fragmenty toksyny błoniczej, łańcuch A egzotoksyny (z Pseudomonas aeruginosa), łańcuch A rycyny, łańcuch A abryny, łańcuch A modecyny, alfa-sarcynę, białka Aleurites fordii, białka diantyny, białka Phytolaca americana (PAPI, PAPII i PAP-S), inhibitor momordica charantia, kurcynę, krotynę, inhibitor Saponaria officinalis, geloninę, mitogelinę, restryktocynę, fenomycynę, enomycynę i trikoteceny. Patrz, na przykład, WO 93/21232, opublikowany 28 października 1993 r. [0176] Wynalazek rozważa ponadto immunokoniugat utworzony pomiędzy przeciwciałem i związkiem o aktywności nukleolitycznej (np. rybonukleazą lub endonukleazą DNA, taką jak deoksyrybonukleaza; DNaza).

47 [0177] Do wytwarzania HER2 przeciwciał skoniugowanych z izotopami promieniotwórczymi dostępnych jest szereg izotopów. Przykłady obejmują At 211, I 131, I 125, Y 90, Re 186, Re 188, Sm 153, Bi 212, P 32 i promieniotwórcze izotopy Lu. [0178] Koniugaty przeciwciała i środka cytotoksycznego można wytwarzać stosując szereg bifunkcyjnych środków sprzęgających białka, takich jak N-sukcynimidylo-3-(2- pirydylotiolo)propionian (SPDP), sukcynimidylo-4-(n-maleimidometylo)cykloheksano-1- karboksylan, iminotiolan (IT), bifunkcyjne pochodne imidoestrów (takie jak chlorowodorek adypimidynianu dimetylowego), aktywne estry (takie jak suberynian disukcynimidylowy), aldehydy (takie jak glutaraldehyd), związki bis-azydowe (takie jak bis (pazydobenzoilo)heksanodiamina), pochodne bis-diazoniowe (takie jak bis-(p-diazonio benzoilo)-etylenodiamina), diizocyjaniany (takie jak 2,6-diizocyjanian toluenu) i bis-aktywne związki fluorowe (takie jak 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen). Na przykład, immunotoksynę rycynową można otrzymać jak opisano w Vitetta i współpracownicy, Science 238: 1098 (1987). Znakowany węglem C14 kwas 1-izotiocyjanianobenzylo-3-metylodietylenotriaminopentaoctowy (MX-DPTA) jest przykładowym środkiem chelatującym do koniugacji radionukleotydu z przeciwciałem. Patrz WO 94/ Łącznikiem może być "łącznik rozszczepialny", ułatwiający uwalnianie leku cytotoksycznego w komórce. Na przykład można stosować łącznik labilny w kwasach, łącznik wrażliwy na peptydazy, łącznik dimetylowy lub łącznik zawierający wiązanie disiarczkowe (Chari i współpracownicy, Cancer Research 52: (1992)). [0179] Alternatywnie, można wytwarzać białko fuzyjne, zawierające przeciwciało skierowane przeciwko HER2 i środek cytotoksyczny, np. technikami rekombinacji lub syntezy peptydów. [0180] W jeszcze innym przykładzie wykonania, przeciwciało można skoniugować z "receptorem" (takim jak streptawidyna) do wykorzystywania we wstępnym kierowaniu do nowotworu, podczas którego pacjentowi podaje się koniugat przeciwciało-receptor, a następnie usuwa się niezwiązany koniugat z krążenia stosując środek usuwający, i kolejno podaje się "ligand" (np. awidynę), który skoniugowano ze środkiem cytotoksycznym (np. radionukleotydem). (x) Zależna od przeciwciał terapia prolekiem z udziałem enzymu (ADEPT) [0181] Przeciwciała według wynalazku można również stosować w ADEPT, na drodze koniugowania przeciwciała z enzymem aktywującym prolek, który przekształca prolek (np. peptydylowy środek chemioterapeutyczny, patrz WO 81/01145) w aktywny lek przeciwrakowy. Patrz, na przykład, WO 88/07378 i opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer [0182] Enzymatyczna składowa immunokoniugatu użytecznego w ADEPT obejmuje dowolny enzym zdolny do działania na prolek w taki sposób, że przekształca go w bardziej aktywną, cytotoksyczną postać. [0183] Enzymy, które są użyteczne w sposobie według wynalazku obejmują, ale bez ograniczania, alkaliczną fosfatazę użyteczną do przekształcania proleków zawierających grupę fosforanową w wolne leki; arylosulfatazę użyteczną do przekształcania leków

48 zawierających grupę siarczanową w wolne leki, deamianzę cytozynową użyteczną do przekształcania nietoksycznej 5-fluorocytozyny w lek przeciwrakowy, 5-fluorouracyl, proteazy, takie jak proteaza Serratia, termolizyna, subtylizyna, karboksypeptydazy i katepsyny (takie jak katepsyny B i L), które są użyteczne w przekształcaniu proleków zawierających peptydy w wolne leki; D-alanylokarboksypeptydazy użyteczne w przekształcaniu proleków, które zawierają podstawniki D-aminokwasowe; enzymy rozszczepiające węglowodany, takie jak β-galaktozydaza i neuraminidaza, użyteczne do przekształcania proleków glikozylowanych w wolne leki; β-laktamazy użyteczne do przekształcania leków zmodyfikowanych β-laktamami w wolne leki i amidazy penicylinowe, takie jak amidaza penicyliny V lub amidaza penicyliny G, użyteczne do przekształcania leków zmodyfikowanych przy atomach azotu grup aminowych, odpowiednio grupami fenoksyacetylowymi lub fenyloacetylowymi w wolne leki. Alternatywnie, do przekształcania proleków według wynalazku w wolne aktywne leki można stosować przeciwciała o aktywności enzymatycznej, znane również w dziedzinie jako "abzymy" (patrz np. Massey, Nature, 328: (1987)). Koniugaty przeciwciało-abzym można otrzymać jak opisano tu w celu dostarczania abzymu do populacji komórek nowotworowych. [0184] Enzymy według wynalazku mogą być kowalencyjnie związane z przeciwciałami HER2 stosując metody dobrze znane w tej dziedzinie, takie jak stosowanie dyskutowanych powyżej heterobifunkcyjnych odczynników sieciujących. Alternatywnie, można konstruować białka fuzyjne, zawierające co najmniej wiążący antygen region przeciwciała według wynalazku połączony z co najmniej funkcjonalnie aktywną częścią enzymu według wynalazku, stosując dobrze znane w tej dziedzinie rekombinacji DNA, (patrz np. Neuberger i współpracownicy, Nature, 312: (1984). (xi) Inne modyfikacje przeciwciał [0185] Rozważa się tu inne modyfikacje przeciwciał. Na przykład, przeciwciało można połączyć z jednym z wielu różnorodnych polimerów niebiałkowych, np. glikolem polietylenowym, glikolem polipropylenowym, polioksyalkilenami lub kopolimerami glikolu polietylenowego i glikolu polipropylenowego. Przeciwciało można również zamykać w mikrokapsułkach otrzymanych, na przykład, metodami koacerwacji lub przez polimeryzację międzyfazową (na przykład odpowiednio w mikrokapsułkach hydroksymetylocelulozowych lub żelatynowych i mikrokapsułkach poli-(metylometacylanowych)), w koloidalnych układach dostarczania leków (na przykład liposomach, mikrosferach albuminowych, mikroemulsjach, nanocząstkach i nanokapsułkach) lub w makroemulsjach. Takie metody ujawniono w Remington's Pharmaceutical Sciences, wydanie 16, Oslo, A. wyd. (1980). [0186] Ujawnione tu przeciwciała HER2 można również otrzymać w postaci immunoliposomów. Liposomy zawierające przeciwciało otrzymuje się metodami znanymi w tej dziedzinie, takimi jak opisane w Epstein i współpracownicy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang i współpracownicy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach i i WO 97/38731, opublikowanym 23 października 1997 r. Liposomy o wydłużonym czasie

49 trwania w krążeniu ujawniono w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer [0187] Szczególnie użyteczne liposomy można wytworzyć metodą odparowywania o odwróconych fazach z kompozycji lipidów zawierającej fosfatydylocholinę, cholesterol i zmodyfikowaną PEG fosfatydyloetanoloaminę (PEG-PE). Liposomy wytłacza się przez filtry o określonej wielkości porów dla uzyskania liposomów o pożądanej średnicy. Fragmenty Fab' przeciwciał według wynalazku można sprzęgać (koniugować) z liposomami, jak opisano w Martin i współpracownicy, J. Biol. Chem. 257: (1982) w reakcji wymiany disiarczkowej. Liposomy ewentualnie zawierają środek chemioterapeutyczny. Patrz, Gabizon i współpracownicy, J. National Cancer Inst.81(19)1484 (1989). III. Preparaty farmaceutyczne [0188] Terapeutyczne preparaty przeciwciał stosowanych zgodnie z wynalazkiem przygotowane do celów przechowywania poprzez zmieszanie przeciwciała o pożądanym stopniu czystości z ewentualnymi, farmaceutycznie dopuszczalnymi nośnikami, zaróbkami lub środkami stabilizującymi (Remington s Pharmaceutical Sciences, wyd. 16, Osol, A., wyd. (1980)) w postaci liofilizowanych preparatów lub roztworów wodnych. Dopuszczalne nośniki, zaróbki lub środki stabilizujące są nietoksyczne dla biorców w stosowanych dawkach i stężeniach, i obejmują bufory, takie jak fosforan, cytrynian i inne kwasy organiczne; przeciwutleniacze obejmujące kwas askorbinowy i metioninę; tionina; środki konserwujące (takie jak chlorek oktadecylodimetylobenzyloamonowy, chlorek heksametoniowy, chlorek benzalkoniowy, chlorek benzotoniowy; fenol, alkohol butylowy lub benzylowy; parabeny alkilowe, takie jak paraben metylowy lub paraben propylowy; katechol; rezorcinol; cykloheksanol; 3-pentanol; i m-krezol); niskocząsteczkowe (mniej niż około 10 reszt) polipeptydy; białka, takie jak albumina surowicy, żelatyna lub immunoglobuliny; polimery hydrofilowe, takie jak poliwinylopirolidon; aminokwasy, takie jak glicyna, glutamina, asparagina, histydyna, arginina lub lizyna; monosacharydy, disacharydy i inne węglowodany, obejmujące glukozę, mannozę i dekstryny; środki chelatujące, takie jak EDTA, cukry, takie jak sacharoza, mannitol, trehaloza lub sorbitol; przeciwjony tworzące sole, takie jak sodowy; kompleksy metali (np. kompleksy Zn-białko); i/lub niejonowe środki powierzchniowo czynne, takie jak TWEEN, PLURONICS lub glikol polietylenowy (PEG). Korzystne liofilizowane preparaty przeciwciała przeciwko HER2 opisano w WO 97/ [0189] Preparat według wynalazku może również zawierać więcej niż jeden związek aktywny, w zależności od określonych wskazań dotyczących leczenia, korzystnie są to związki o aktywnościach uzupełniających, a nie wzajemnie niekorzystnych. Cząsteczki takie powinny występować w połączeniach w takich ilościach, które są skuteczne dla danego celu. Na przykład, może być pożądane dalsze dostarczenie przeciwciał, które wiążą się z EGFR, HER2 (np. przeciwciała, które wiąże się z innym epitopem na HER2), HER3, HER4 lub naczyniowym czynnikiem śródbłonkowym (VEGF) w jednym preparacie. Alternatywnie, lub dodatkowo, kompozycja może ponadto zawierać czynnik chemioterapeutyczny, środek cytotoksyczny, cytokinę, czynnik hamujący wzrost, środek antyhormonalny, lek ukierunkowany na EGFR, środek przeciwangiogenny i/lub środek chroniący serce. Takie

50 cząsteczki są odpowiednio obecne w kombinacji w ilościach, które są skuteczne pod względem zamierzonego celu. [0190] Składniki aktywne mogą być również umieszczone w mikrokapsułkach otrzymanych, na przykład, za pomocą techniki koacerwacji lub na drodze polimeryzacji międzyfazowej, na przykład, odpowiednio hydroksymetylocelulozowych lub żelatynowych mikrokapsułkach i kapsułkach z poli(metakrylanu metylu), w koloidalnych układach dostarczania leków (na przykład liposomy, mikrosfery albuminowe, mikroemulsje, nanocząsteczki i nanokapsułki) lub w postaci makroemulsji. Techniki zostały ujawnione w Remington s Pharmaceutical Sciences wyd. 16, Osol, A. Ed. (1980). [0191] Można otrzymać preparaty o przedłużonym uwalnianiu. Odpowiednie przykłady preparatów o przedłużonym uwalnianiu obejmują zawierające przeciwciało półprzepuszczalne macierze stałych polimerów hydrofobowych, mające postać ukształtowanych artykułów, np. błon lub mikrokapsułek. Przykłady macierzy o przedłużonym uwalnianiu obejmują poliestry, hydrożele (na przykład poli(2-hydroksyetylo-metakrylan) lub polialkohol winylowy, polilaktydy (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer ), kopolimery kwasu L-glutaminowego i γ-etylo-l-glutaminy, nie ulegający degradacji octan etyleno-winylowy, degradowalne kopolimery kwas mlekowy-kwas glikolowy, takie jak LUPRON DEPOT (mikrokuleczki do iniekcji złożone z kopolimeru kwas mlekowy-kwas glikolowy i octanu leuprolidu) i kwas poli-d-(-)-3-hydroksymasłowy. [0192] Preparaty przeznaczone do podawania in vivo muszą być sterylne. Osiąga się to w prosty sposób na drodze filtracji przez sterylne błony filtrujące. IV. Badanie przesiewowe pacjentów do terapii [0193] W korzystnym przykładzie wykonania wynalazku, pacjentki wybrane do leczenia miały nowotwór wykazujący aktywację HER (i korzystnie HER2). W jednym przykładzie wykonania, stopień aktywacji HER (lub HER2) w komórkach nowotworowych znacząco przewyższał poziom aktywacji tego receptora w komórkach nie-rakowych z tkanki tego samego typu. Taka nadmierna aktywacja może być wynikiem nadekspresji receptora HER i / lub wyższych niż prawidłowe poziomów liganda HER, dostępnego do aktywacji receptora HER w komórkach rakowych. Taka nadmierna aktywacja może powodować i / lub być spowodowana przez złośliwy stan komórek rakowych. W niektórych przykładach wykonania, raka poddaje się oznaczeniu diagnostycznemu lub prognostycznemu w celu określenia, czy występuje amplifikacja i / lub nadekspresja liganda HER, co powoduje taką nadmierną aktywację receptora HER. Alternatywnie, lub dodatkowo, raka można poddać oznaczeniu diagnostycznemu lub prognostycznemu w celu określenia, czy występujące amplifikacja i / lub nadekspresja liganda HER w raku, która przypisuje nadmiernej aktywacji receptora. W podgrupie takich raków, nadmierna aktywacja receptora może być wynikiem autokrynnego szlaku stymulacji. Różne oznaczenia do określania aktywacji HER będa opisane bardziej szczegółowo poniżej. (i) Dimery HER

51 [0194] Próbki nowotworów mogą być oceniane pod kątem obecności dimerów HER, jako wskazującej na aktywację HER lub HER2. Dowolna metoda znana w tej dziedzinie może być zastosowany do wykrycia dimerów HER2, takich jak EGFR-HER2, HER2-HER3, w nowotworach. Niektóre korzystne metody opisano poniżej. Te metody wykrywają niekowalencyjne oddziaływania białko-białko lub w inny sposób wykazują bliskość pomiędzy białkami będącymi przedmiotem zainteresowania. [0195] Metody oparte na immunopowinowactwie, takie jak immunoprecypitacja lub ELISA, mogą być stosowane do wykrywania dimerów HER. W jednym z przykładów wykonania, przeciwciała skierowane przeciw HER2 stosuje się do immunoprecypitacji kompleksów zawierających HER2 z komórek nowotworowych, a następnie otrzymany immunoprecipitat poddaje badaniu na obecność EGFR lub HER3 metodą immunoblottingu. W innym przykładzie wykonania, przeciwciała przeciwko HER3 lub EGFR mogą być stosowane w etapie immunoprecypitacji, a następnie immunoprecipitat poddany badaniu za pomocą przeciwciał przeciw HER2. W kolejnym przykładzie wykonania, ligandy HER specyficzne dla EGFR, HER3, kompleksów EGFR/HER2 lub kompleksów HER2/HER3 mogą być wykorzystane do wytrącenia (precypitacji) kompleksów, które są następnie badane na obecność HER2: Na przykład, ligandy mogą być sprzężone z awidyną i kompleksy oczyszczane na kolumnie z biotyną. [0196] W innych przykładach wykonania, takich jak testy ELISA lub testy immunologiczne typu,,kanapkowego, przeciwciała przeciw HER2 są unieruchomione na stałym podłożu, kontaktowane z komórkami nowotworowymi lub lizatem komórek nowotworowych, przemyte, a następnie eksponowane na przeciwciało przeciw EGFR lub HER3. Wiązanie z tym ostatnim przeciwciałem, które można wykryć bezpośrednio lub przez drugorzędowe przeciwciało sprzężone z wykrywalnym znacznikiem, wskazuje na obecność heterodimerów. W niektórych przykładach wykonania, przeciwciało przeciwko EGFR lub HER3 jest unieruchomione, a przeciwciało przeciwko HER2 stosowane do etapu wykrywania. W innych przykładach wykonania ligandy HER mogą być stosowane zamiast lub w połączeniu z przeciwciałami przeciwko HER. [0197] Sieciowanie chemiczne lub UV może być również wykorzystane do kowalencyjnego połączenia dimerów na powierzchni żywych komórek. Hunter i współpracownicy, Biochem J., 320: Przykłady chemicznych środków sieciujących obejmują ditiobis(sukcynoimidylo)propionian (DSP) i 3,3'ditiobis(sulfosukcynoimidylo)propionian (DTSSP). W jednym przykładzie wykonania, ekstrakty komórkowe z usieciowanych chemicznie komórek nowotworowych są analizowane za pomocą SDS-PAGE, i poddane immunoblottingowi z przeciwciałami przeciw EGFR i / lub HER3. Przesunięty w górę prążek odpowiedniej masy cząsteczkowej najprawdopodobniej reprezentuje dimery EGFR-HER2 lub HER2-HER3, ponieważ HER2 jest preferowanym partnerem dimeryzacji dla EGFR i HER3. Wynik ten może być potwierdzony przez kolejny immunoblotting z przeciwciałami przeciw HER2. [0198] Fluorescencyjne rezonansowe przeniesienie energii (FRET) może również być stosowane do wykrywania dimerów EGFR-HER2, lub HER2-HER3. FRET wykrywa zmiany

52 konformacyjne białka i oddziaływania białko-białko w warunkach in vivo i in vitro w oparciu o transfer energii od fluoroforu dawcy do fluoroforu biorcy. Selvin, Nat. Struct. Biol., 7: (2000). Przekazywanie energii odbywa się tylko wtedy, jeśli fluorofor dawca znajduje się w wystarczającej bliskości fluoroforu biorcy. W typowym eksperymencie FRET, dwa białka lub dwa miejsca na jednym białku są znakowane różnymi sondami fluorescencyjnymi. Jedna z sond, sonda dawca, jest wzbudzana do wyższego stanu energetycznego poprzez padające światło o określonej długości fali. Sonda dawca następnie przekazuje swoją energię do drugiej sondy, sondy biorcy, dając w wyniku zmniejszenie intensywności fluorescencji dawcy i wzrost emisji fluorescencji biorcy. Do pomiaru stopnia transferu energii, intensywność dawcy w próbce wyznakowanej sondami dawcą i biorcą jest porównywana z jego intensywnością w próbce wyznakowanej tylko sondą dawcą. Ewentualnie, intensywność biorcy jest porównywana w próbkach dawca / biorca i tylko biorca. Odpowiednie sondy są znane w dziedzinie i obejmują, na przykład, barwniki przechodzące przez błony, takie jak fluoresceina i rodamina, barwniki organiczne, takie jak barwniki cyjaninowe, i atomy lantanowców. Selvin, powyżej. Metody i urządzenia do wykrywania i pomiaru transferu energii są również znane w tej dziedzinie. Selvin, powyżej. [0199] Techniki oparte na FRET odpowiednie do wykrywania i pomiaru oddziaływań białkobiałko w poszczególnych komórkach są również znane w tej dziedzinie. Na przykład, mikroskopia FRET z fotowybielaniem dawcy (pbfret) i mikroskopia obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM) może być stosowana do wykrywania dimeryzacji receptorów na powierzchni komórki. Selvin, powyżej;. Gadella & Jovin, J. Cell Biol, 129: (1995). W jednym przykładzie wykonania, stosuje się pbfret na komórkach albo "w zawiesinie" albo "in situ" do wykrywania i pomiaru dimerów EGFR-HER2 lub HER2-HER3, jak opisano w Nagy i współpracownicy, Cytometry, 32: (1998). Te techniki umożliwiają pomiar zmniejszenia czasu życia fluorescencji donora w wyniku przeniesienia energii. W szczególnym przykładzie wykonania, techniki FRET cytometrii przepływowej typu Foerster (FCET) mogą być stosowane do badania dimeryzacji EGFR-HER2 i HER2-HER3, jak opisano w Nagy i i współpracownicy, powyżej, i Brockhoff i współpracownicy, Cytometry, 44: (2001). [0200] FRET korzystnie stosuje się w połączeniu ze standardowymi technikami znakowania immunohistochemicznego. Kenworthy, Methods, 24: (2001). Na przykład, przeciwciała sprzężone z odpowiednimi barwnikami fluorescencyjnymi można stosować jako sondy do oznaczania dwóch różnych białek. Jeżeli białka są niedaleko od siebie, barwniki fluorescencyjne działają jako dawcy i akceptory dla FRET. Przeniesienie energii jest wykrywane za pomocą standardowych środków. Transfer energii może być wykrywany przy pomocy cytometrii przepływowej lub cyfrowych systemów mikroskopowych, takich jak mikroskopia konfokalna lub szerokopolowa mikroskopia fluorescencyjna połączona z kamerą z matrycą CCD. [0201] W jednym z przykładów wykonania wynalazku, przeciwciała skierowane przeciw HER2 i przeciwciała przeciw EGFR albo HER3 są znakowane bezpośrednio dwoma różnymi fluoroforami, na przykład jak opisano w Nagy i współpracownicy, powyżej. Komórki

53 nowotworowe lub lizaty komórek nowotworowych kontaktuje się z różnie wyznakowanymi przeciwciałami, które działają jak dawcy i biorcy dla FRET w obecności dimerów EGFR- HER2 lub HER2-HER3. Alternatywnie, nieznakowane przeciwciała przeciwko HER2 i EGFR albo HER3 są używane wraz z różnie wyznakowanymi drugorzędowymi przeciwciałami, które służą jako dawcy i biorcy. Patrz, na przykład, Brockhoff i współpracownicy, wyżej. Transfer energii jest wykrywany i obecność dimerów stwierdzana, jeśli znaczniki znajdują się w bliskim sąsiedztwie. [0202] W innych przykładach wykonania ligandy receptora HER, które są specyficzne dla HER2 i albo HER1 albo HER3 są znakowane fluorescencyjnie i używane do badań FRET. [0203] W jeszcze innych przykładach wykonania według wynalazku, obecność dimerów na powierzchni komórek nowotworowych wykazuje się przez ko-lokalizację HER2 z EGFR albo HER3 za pomocą standardowych technik immunofluorescencji bezpośredniej lub pośredniej i konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej. Alternatywnie, obrazowanie za pomocą skanowania laserowego (LSI) jest stosowane do wykrywania wiązania przeciwciała i kolokalizacji HER2 z EGFR albo HER3 w formacie wysokoprzepustowym, np. płytki z mikrostudzienkami, jak opisano w Zuck i współpracownicy, Proc. Natl. Natl. Acad. Sci. USA 96: (1999). [0204] W kolejnych przykładach wykonania, obecność dimerów EGFR - HER2 i / lub HER2 - HER3 określa się przez identyfikację aktywności enzymatycznej, która jest zależna od odległości składników dimeru. Przeciwciało skierowane przeciwko HER2 jest sprzężone z jednym enzymem, a przeciwciało przeciwko EGFR lub HER3 jest sprzężone z drugim enzymem. Dodaje się pierwszy substrat dla pierwszego enzymu i reakcja wytwarza drugi substrat dla drugiego enzymu. Prowadzi to do reakcji z inną cząsteczką, aby wytworzyć wykrywalny związek, taki jak barwnik. Obecność innego odczynnika chemicznego niszczy drugi substrat tak, że zapobiega się reakcji z drugim enzymem, chyba, że enzymy pierwszy i drugi, i w ten sposób oba przeciwciała, znajdują się blisko siebie. W szczególnym przykładzie wykonania komórki nowotworowe lub lizaty komórek kontaktuje się z przeciwciałem przeciw HER2, które jest sprzężone z oksydazą glukozową i przeciwciałem przeciw HER3 lub HER1, które jest sprzężone z peroksydazą chrzanową. Do reakcji dodaje się glukozę, wraz z prekursorem barwnika, takim jak DAB, i katalazę. Obecność dimerów określa się dzięki pojawieniu się koloru po barwieniu na DAB. [0205] Dimery mogą być wykrywane przy użyciu metod opartych na układzie testowym etag (Aclara Bio Sciences, Mountain View, CA), jak opisano, na przykład, w zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 2001/ , opublikowanym 06 grudnia etag lub "znacznik elektroforetyczny" zawiera ugrupowanie wykrywalnego reportera, takiego jak grupa fluorescencyjna. Może również zawierać "modyfikator mobilności", który składa się zasadniczo z ugrupowania posiadającego wyjątkową ruchliwość elektroforetyczną. Ugrupowania te pozwalają na wyodrębnienie i wykrywanie etag ze złożonej mieszaniny w określonych warunkach elektroforetycznych, takich jak elektroforeza kapilarna (CE). Część etag, zawierająca ugrupowanie reporterowe i ewentualnie modyfikator mobilności jest połączona z ugrupowaniem wiążącym pierwszy celprzez

54 rozcinalną grupę łączącą, tworząc pierwszy związek wiążący. Ugrupowanie wiążące pierwszy cel specyficznie rozpoznaje określony pierwszy cel, na przykład kwas nukleinowy lub białko. Ugrupowanie wiążące pierwszy cel nie jest ograniczone w żaden sposób, i może być na przykład, polinukleotydem lub polipeptydem. Korzystnie, ugrupowanie wiążące pierwszy cel jest fragmentem przeciwciała, lub przeciwciałem. Alternatywnie, ugrupowanie wiążące pierwszy cel może być ligandem receptora HER lub jego fragmentem zdolnym do wiązania. [0206] Grupa łącząca korzystnie zawiera ugrupowanie rozcinalne, takie jak substrat enzymu lub dowolne wiązanie chemiczne, które może być rozcięte w określonych warunkach. Kiedy ugrupowanie wiążące pierwszy cel wiąże się ze swoim celem, środek rozcinający jest wprowadzany i / lub aktywowany, i grupa łącząca jest rozcinana, uwalniając w ten sposób część etag zawierającą ugrupowanie reportera i modyfikator mobilności. Tak więc, obecność "wolnego" etag oznacza wiązanie ugrupowania wiążącego cel z celem. [0207] Korzystnie, drugi związek wiążący obejmuje środek rozcinający i ugrupowanie wiążące drugi cel, które specyficznie rozpoznaje drugi cel. Ugrupowanie wiążące drugi cel, również nie jest ograniczone w żaden sposób i może być, na przykład, przeciwciałem lub fragmentem przeciwciała lub ligandem receptora HER lub fragmentem wiążącym liganda. Środek rozcinający jest taki, że rozetnie grupę łączącą w pierwszym związku wiążącym, tylko jeśli pierwszy związek wiążący i drugi związek wiążący będą w bliskiej odległości. [0208] W przykładzie wykonania według wynalazku, pierwszy związek wiążący zawiera etag, w których przeciwciało przeciw HER2 służy jako ugrupowanie wiążące pierwszy cel. Drugi związek wiążący obejmuje przeciwciało przeciwko EGFR lub HER3 połączone ze środkiem rozcinającym, zdolnym do rozcięcia grupy łączącej etag. Korzystnie środek rozcinający musi być aktywowany w celu umożliwienia przecięcia grupy łączącej. Komórki nowotworowe lub lizaty komórek nowotworowych kontaktuje się z etag, który wiąże się z HER2, i ze zmodyfikowanym przeciwciałem przeciwko EGFR lub HER3, które wiąże się z EGFR lub HER3 na powierzchni komórki. Niezwiązany związek wiążący korzystnie usuwa się, a środek rozcinający aktywuje, jeśli to konieczne. Jeśli są obecne dimery EGFR-HER2 lub HER2-HER3, środek rozcinający będzie przecinać grupę łączącą i uwalniać etag ze względu na bliskość środka rozcinającego do grupy łączącej. Wolne etag może być wykryte za pomocą dowolnej metody znanej w tej dziedzinie, takiej jak elektroforeza kapilarna. [0209] W jednym przykładzie wykonania, środek rozcinający stanowią aktywowane substancje chemiczne, które działają na grupę łączącą. Na przykład, środek rozcinajacy może być aktywowany przez wystawienie próbki na działanie światła. [0210] W innym przykładzie wykonania, etag jest zbudowane z zastosowaniem przeciwciała przeciwko EGFR lub HER3 jako ugrupowania wiążącego pierwszy cel, a drugi związek wiążący jest wykonany z przeciwciała przeciw HER2. [0211] W jeszcze innym przykładzie wykonania, dimer HER jest wykrywany przy użyciu przeciwciała lub innego odczynnika, który specyficznie lub korzystnie wiąże się z dimerem, w porównaniu do jego wiązania z którymkolwiek receptorem HER w dimerze.

55 (ii) Fosforylacja HER2 [0212] Po immunoprecypitacji z przeciwciałem skierowanym przeciw EGFR, HER2 lub HER3, jak to omówiono w poprzedniej sekcji, może ewentualnie następować funkcyjne oznaczenie dla dimerów, jako alternatywa lub uzupełnienie do immunoblottingu. W jednym przykładzie wykonania po immunoprecypitacji z przeciwciałem przeciwko HER3 następuje test na aktywność kinazy tyrozynowej receptorów w immunoprecypitacie. Ponieważ HER3 nie ma wewnętrznej aktywności kinazy tyrozynowej, obecność aktywności kinazy tyrozynowej w immunoprecypitacie wskazuje, że HER3 jest najprawdopodobniej związane z HER2. Graus Porta i współpracownicy, EMBO J., 16: (1997); Klapper i współpracownicy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96: (1999). Ten wynik może być potwierdzony przez immunoblotting z przeciwciałami przeciw HER2. W innym wykonaniu po immunoprecypitacji z przeciwciałem przeciw HER2 następuje test na aktywność kinazy tyrozynowej receptora EGFR. W tym teście immunoprecypitat jest skontaktowany z radioaktywnym ATP i substratem peptydowym, który naśladuje występujące in vivo miejsce transfosforylacji HER2 przez EGFR. Fosforylacja peptydu wskazuje na koimmunoprecypitację, a tym samym dimeryzację EGFR z HER2. Testy aktywności kinazy tyrozynowej receptorów są dobrze znane w dziedzinie i obejmują testy, które wykrywają fosforylację docelowych substratów, na przykład za pomocą przeciwciała skierowanego przeciw fosfotyrozynie i aktywacji pokrewnych ścieżek transdukcji sygnału, takich jak ścieżka MAPK. [0213] Fosforylację receptora HER można ocenić za pomocą immunoprecypitacji jednego lub więcej receptorów HER, takich jak receptor HER2 (HER2) i analizy Western blot. Na przykład, wynik dodatni jest określany przez obecność prążka fosfo-her2 na żelu, przy użyciu przeciwciała przeciw fosfotyrozynie do wykrywania fosforylowanej (fosforylowanych) reszty (reszt) tyrozyny w immunoprecypitowanym receptorze (receptorach) HER. Przeciwciała przeciw fosfotyrozynie są dostępne na rynku z PanVera (Madison, WI), filii Invitrogenu, Chemicon International Inc. (Temecula, Kalifornia), lub Upstate Biotechnology (Lake Placid, Nowy Jork). Wynik negatywny jest określany przez brak prążka. [0214] W innym przykładzie wykonania, fosforylacja receptora HER2 (HER2) jest oceniana przez immunohistochemię przy użyciu fosfo- specyficznego przeciwciała przeciw HER2 (klon PN2A; Thor i współpracownicy, J. Clin. Oncol., 18 (18): (2000)). [0215] Inne metody wykrywania fosforylacji receptora (receptorów) HER obejmują, ale bez ograniczania, KIRA ELISA (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer ; ; ; ; i ), spektrometrię masową (porównanie wielkości fosforylowanego i nie fosforylowanego HER2) i test bliskości e-tag, zarówno z przeciwciałem przeciw HER (np. HER2) jak i przeciwciałem fosfo- specyficznym lub fosfotyrozyno specyficznym (np. za pomocą zestawu testowego etag dostępnego z Aclara BioSciences (Mountain View, CA). Szczegóły dotyczące oznaczenia z etag są opisane powyżej.

56 [0216] Można również użyć przeciwciał fosfo-specyficznych w macierzy komórkowej do wykrywania stanu fosforylacji w próbce komórkowej białka transdukcji sygnału, (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 2003/ ). (iii) Ligandy HER2 [0217] Poziomy liganda HER, takiego jak TGF-α, w nowotworze lub związanego z nowotworem można określić na podstawie znanych procedur. Takie testy mogą wykrywać białko i/lub kwas nukleinowy je kodujący w badanej próbce. W jednym przykładzie wykonania poziom liganda HER w nowotworze może być ustalony za pomocą immunohistochemii (IHC); patrz, na przykład, Scher i współpracownicy, Clin. Cancer Research 1: (1995). Alternatywnie, lub dodatkowo, można oceniać poziomy kwasu nukleinowego kodującego ligand HER w badanej próbce; np. za pomocą FISH, southern blottingu lub technik PCR. (iv) Rak, w którym nie zachodzi nadekspresja HER2 [0218] O ile rak może charakteryzować się nadekspresją receptora HER2, niniejsze zgłoszenie dotyczy ponadto leczenia raka, którego nie uważa się za raka, w którym zachodzi nadekspresja HER2. [0219] Do określania ekspresji HER2 w raku dostępne są różne oznaczenia diagnostyczne/prognostyczne. W jednym przykładzie wykonania nadekspresję HER2 można analizować dzięki IHC, np. stosując HERCEPTEST (Dako). Zatopione w parafinie skrawki tkankowe z bioptatu nowotworu można poddawać oznaczeniu IHC i przyjąć następujące kryteria intensywności wybarwiania białka HER2: Ocena 0 nie obserwuje się wybarwiania lub obserwuje się wybarwianie błon w mniej niż 10% komórek nowotworowych. Ocena 1+ wykrywa się nikłe/ledwo dostrzegalne wybarwianie błon w więcej niż 10% komórek nowotworowych. Wybarwiana jest tylko część błony komórek. Ocena 2+ obserwuje się słabe do umiarkowanego całkowite wybarwianie błon w więcej niż 10% komórek nowotworowych. Ocena 3+ obserwuje się umiarkowane do silnego całkowite wybarwianie błon w więcej niż 10% komórek nowotworowych [0220] Nowotwory z oceną od 0 do 1+ dla nadekspresji HER2 można scharakteryzować jako nie wykazujące nadekspresji HER2, podczas gdy nowotwory z oceną od 2+ do 3 + można scharakteryzować jako wykazujące nadekspresję HER2. [0221] Nowotwory z nadekspresją HER2 mogą być oceniane za pomocą immunohistochemicznych ocen, odpowiadających liczbie kopii cząsteczek HER2 ulegających ekspresji na komórkę, i mogą być określone biochemicznie: 0 = kopii/komórkę, 1 + = co najmniej około kopii/komórkę,

57 = co najmniej około kopii/komórkę, 3 + = co najmniej około kopii/komórkę. [0222] Nadekspresja HER2 na poziomie 3+, która prowadzi do niezależnej od liganda aktywacji kinazy tyrozynowej (Hudziak i współpracownicy, Proc. Natl. Acad Sci. USA, 84: (1987)), występuje w około 30% przypadków raka piersi, i u tych pacjentów są zmniejszone: przeżycie wolne od nawrotu choroby i przeżycie ogólne (Slamon i współpracownicy, 244: (1989); Slamon i współpracownicy, Science, 235: (1987)). [0223] Alternatywnie, lub dodatkowo, można przeprowadzić oznaczenia FISH, takie jak INFORM (sprzedawane przez Ventana, Arizona) lub PATHVISION (Vysis, Illinois) na utrwalonej formaliną, zatopionej w parafinie tkance nowotworu w celu określenia stopnia (jeśli w ogóle jest) nadekspresji HER2 w nowotworze. [0224] W jednym przykładzie wykonania, rakiem będzie rak, który eksprymuje (a może zachodzić nadekspresja) EGFR, taką ekspresję można ocenić jak dla sposobów oceny ekspresji HER2, jak omówiono powyżej. [0225] Nadekspresję lub amplifikację receptora HER lub liganda HER można oceniać stosując oznaczenie diagnostyczne in vivo, np. przez podawanie cząsteczki (takiej jak przeciwciało), która wiąże się z wykrywaną cząsteczką i jest wyznakowana wykrywalnym znacznikiem (np. izotopem promieniotwórczym), i zewnętrzne badanie (skanowanie) pacjenta w poszukiwaniu lokalizacji znacznika. V. Leczenie z przeciwciałami skierowanymi przeciw HER2 [0226] Rozważa się, że według wynalazku przeciwciała przeciwko HER2 mogą być stosowane w leczeniu raka opornego na chemioterapię lub raka opornego na platynę, takiego jak raka opornego na platynę w sposobie przedstawionym w zastrzeżeniach. Rak na ogół zawiera komórki eksprymujące HBR2 tak, że przeciwciało przeciw HER2 w niniejszym opisie jest w stanie związać się z komórkami nowotworowymi. [0227] Pacjent jest leczony kombinacją przeciwciała przeciw HER2, najlepiej Pertuzumabu, i chemioterapeutycznego środka anty-metabolicznego, korzystnie gemcytabiny. Połączone podawanie obejmuje jednoczesne podawanie lub równoczesne podawanie, przy użyciu preparatów oddzielnych lub jednego preparatu farmaceutycznego, i kolejne podawanie, w dowolnym porządku, w którym korzystnie jest okres czasu, gdy obydwa (lub wszystkie) środki czynne wywierają jednocześnie ich działanie biologiczne. Tak więc, chemioterapeutyczny środek anty-metaboliczny może być podawany przed lub po podaniu przeciwciała skierowanego przeciw HER2. W tym przykładzie wykonania, czas między co najmniej jednym podawaniem chemioterapeutycznego środka anty-metabolicznego i co najmniej jednym podawaniem przeciwciała przeciwko HER2 wynosi korzystnie około 1 miesiąc lub krócej, i najkorzystniej około 2 tygodni lub krócej. Alternatywnie chemioterapeutyczny środek anty-metaboliczny i przeciwciało przeciwko HER2 są jednocześnie podawane pacjentom, w jednym preparacie lub oddzielnych preparatach.

58 [0228] Leczenie skojarzone powoduje poprawę oznak lub objawów raka. Na przykład, taka terapia może spowodować poprawę przeżycia (przeżycia ogólnego i/lub przeżycia wolnego od progresji choroby) w stosunku do pacjentów leczonych tylko chemioterapeutycznym środkiem anty-metabolicznym, lub może spowodować obiektywną odpowiedź kliniczną (częściową lub całkowitą). Ponadto leczenie kombinacją chemioterapeutycznego środka antymetabolicznego (np. gemcytabiny) i przeciwciała skierowanego przeciw HER2 (np. Pertuzumab) może spowodować synergistyczną, lub większą niż sumaryczną, korzyść dla pacjenta. [0229] Korzystnie, przeciwciało skierowane przeciw HER2 jest podawane jako nagie przeciwciało. Jednak, podawane przeciwciało przeciw HER2 może być sprzężone ze środkiem cytotoksycznym. Korzystnie, immunokoniugat i/lub białko HER2, z którym się on wiążę, ulega/ulegają internalizacji do komórki, czego wynikiem jest zwiększona skuteczność terapeutyczna immunokoniugatu pod względem zabijania komórek rakowych, z którymi się on wiąże. W korzystnym przykładzie wykonania, środek cytotoksyczny ukierunkowany jest wobec kwasu nukleinowego w komórce rakowej lub interferuje z nim. Przykłady takich środków cytotoksycznych obejmują majtanzynoidy, kalicheamycyny, rybonukleazy i endonukleazy DNA. [0230] Przeciwciało skierowane przeciw HER2 (lub immunokoniugat przeciwciała przeciw HER2) i chemioterapeutyczny środek anty-metaboliczny podaje się człowiekowi pacjentowi zgodnie ze znanymi metodami, takimi jak podawanie dożylne, np. jako szybkie wstrzyknięcie lub przez ciągłą infuzję w ciągu dłuższego czasu, drogą domięśniową, dootrzewnową, domózgowo-rdzeniową, podskórną, dostawową, domaziówkową, doosłonkową, doustną, miejscową lub inhalacyjną. Przeciwciało przeciw HER2 i chemioterapeutyczny środek antymetaboliczny mogą, ale nie muszą być podawane tą samą drogą podawania. Korzystne jest podawanie dożylne lub podskórne, zarówno przeciwciał, jak i chemioterapeutycznego środka anty-metabolicznego. [0231] Odpowiednie dawkowanie przeciwciała skierowanego przeciw HER2 do zapobiegania lub leczenia choroby zależeć będzie od rodzaju leczonej choroby, jak zdefiniowano powyżej, ciężkości i przebiegu choroby, tego, czy przeciwciało przeciw HER2 podaje się w celach zapobiegawczych, czy leczniczych, wcześniejszego leczenia, historii klinicznej pacjenta i odpowiedzi na przeciwciało przeciw HER2 i od uznania lekarza prowadzącego. Przeciwciało skierowane przeciw HER2 odpowiednio podaje się pacjentowi w toku leczenia raz lub w seriach. W zależności od rodzaju i ciężkości choroby, początkową proponowaną dawką do podawania pacjentowi jest około od 1 μg/kg do 50 mg/kg (np. 0,1 mg/kg-20 mg/kg) przeciwciała skierowanego przeciw HER 2, zależnie od tego, na przykład, czy będzie to jedno czy więcej oddzielnych podań, czy też podawanie przez ciągłą infuzję. W jednym przykładzie wykonania czas początkowy infuzji dla przeciwciała przeciw HER2 może być dłuższy niż kolejne czasy infuzji, na przykład około 90 minut dla początkowej infuzji i około 30 minut dla kolejnych infuzji (jeśli początkowa infuzja jest dobrze tolerowana). Korzystne dawkowanie przeciwciał przeciw HER2 będzie się mieściło w zakresie od około 0,05 mg/kg do około 10 mg/kg. Tak więc, jedna lub więcej dawek około 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg

59 lub 10 mg/kg (lub dowolnej ich kombinacji) może być podawana pacjentom. Takie dawki mogą być podawane okresowo, np. co tydzień lub co trzy tygodnie (np. takie, że pacjent otrzymuje od około dwóch do około dwudziestu, np. około sześciu dawek przeciwciał skierowanych przeciw HER2). Początkowa wyższa dawka nasycająca, następnie jedna lub więcej małych dawek mogą być podawane. W jednym przykładzie wykonania przeciwciało przeciw HER2 jest podawane jako dawka nasycająca około 840 mg, a następnie około 420 mg około co 3 tygodnie. W innym przykładzie wykonania przeciwciało przeciw HER2 jest podawane w dawce około 1050 mg podawane około co 3 tygodnie. [0232] Chemioterapeutyczny środek anty-metaboliczny jest zazwyczaj podawany w dawkach dla nich znanych lub ewentualnie obniżonych z powodu połączonego działania leków lub negatywnych skutków ubocznych, przypisywanych podawaniu chemioterapeutycznego środka anty-metabolicznego. Przygotowania i dozowania harmonogramy dla takich chemioterapeutyki może służyć zgodnie z instrukcjami wytwórcy lub wyznaczony empirycznie przez wykwalifikowanych lekarza. Preparaty i schematy dawkowania takiej chemioterapii opisano również w Chemotherapy Service, red. M. C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992). Jeśli chemioterapeutycznym środkiem anty-metabolicznym jest gemcytabina, korzystnie, jest podawana w dawce między około 600 mg/ m2 do 1250 mg/m 2 (na przykład około 1000 mg/m 2 ) na przykład, w dniach 1 i 8 w 3 tygodniowym cyklu. [0233] Oprócz przeciwciała skierowanego przeciw HER2 i chemioterapeutycznego środka anty-metabolicznego, mogą być łączone z nimi inne schematy terapeutyczne. Na przykład, może być podawany drugi (trzeci, czwarty itd.) środek (środki) chemioterapeutyczny (chemioterapeutyczne), w którym drugi środek chemioterapeutyczny jest innym chemioterapeutycznym środkiem anty-metabolicznym lub chemioterapeutycznym środkiem, który nie jest anty-metabolityczny. Na przykład drugim środkiem chemioterapeutycznym może być taksan (np Paklitaksel lub Docetaksel), kapecytabina lub środek chemioterapeutyczny opraty na platynie (np. karboplatyna, cisplatyna lub oksaliplatyna), antracyklina (taka jak doksorubicyna, łącznie z liposomalną doksorubicyną), topotekan, pemetreksed, vinca alkaloidy (np. winorelbina) i TLK 286. Mogą być podawane "koktajle" różnych środków chemioterapeutycznych. [0234] Inne środki lecznicze, które mogą być połączone z przeciwciałem skierowanym przeciw HER2 i chemioterapeutycznym środkiem anty-metabolicznym obejmują jeden lub więcej z: drugiego, innego przeciwciała przeciw HER2 (na przykład przeciwciała przeciw HER2 hamującego wzrost, jak Trastuzumab lub przeciwciała przeciw HER2, które indukuje apoptozę komórki, w której zachodzi ekspresja HER2, takiego jak 7C2, 7F3 lub ich humanizowanych wariantów); drugiego przeciwciała skierowanego przeciwko innemu antygenowi związanemu z nowotworem, takiemu jak EGFR, HER3, HER4; związków antyhormonalnych, np. związek anty-estrogenowy, taki jak tamoksyfen, lub inhibitor aromatazy; środków chroniących serce (w celu zapobieżenia lub zmniejszenia jakichkolwiek dysfunkcji mięśnia sercowego związanych z terapią); cytokin; leków nakierowanych na EGFR (takich jak TARCEVA, IRESSA lub cetuksymab); środków antyangiogennych

60 (zwłaszcza bewacizumab, sprzedawany przez Genentech pod nazwą AVASTIN ); inhibitorów kinazy tyrozynowej; inhibitorów COX (na przykład inhibitor COX-1 i COX-2); niesteroidowych leków przeciwzapalnych, Celekoksyb (CELEBREX ); inhibitorów transferazy farnesylowej (np. Tipifarnib/ZARNESTRA R z Johnson i Johnson lub Lonafarnib SCH66336 z Schering-Plough); przeciwciał, które wiążą białko nowotworowopłodowe CA 125, takich jak Oregovomab (MoAb B43.13); szczepionek HER2 (np. HER2 AutoVac szczepionki z Pharmexia, lub APC8024 szczepionka białkowa z Dendreon lub HER2 szczepionka peptydowa z GSK/Corixa); innej terapii nakierowanej na HER (np. trastuzumab, cetuksymab, gefitinib, erlotynib, CI1033, GW2016 itp); inhibitorów Raf i/lub ras (patrz, na przykład, WO 2003/86467); Doxil; Topetecan; taksol; GW572016; TLK286; EMD-7200; leków na nudności, takich jak antagoniści serotoniny, sterydy lub benzodiazepiny; leków, które zapobiegają lub leczą wysypkę lub standardowych terapii trądziku, w tym miejscowych lub doustnych antybiotyków; leków obniżających temperaturę ciała, takich jak acetaminofen, difenhydramina lub meperidyna; hematopoetycznych czynników wzrostu, itp. [0235] Odpowiednie dawki dla każdego z powyższych środków współ-podawanych są te obecnie używane i mogą być obniżone z powodu połączonego działania (synergia) środka i przeciwciała skierowanego przeciw HER2. [0236] Oprócz powyższych schematów leczenia, pacjent może podlegać chirurgicznemu usunięciu komórek nowotworowych i/lub radioterapii. [0237] Poza podawaniem białka przeciwciała pacjentowi, w niniejszym zgłoszeniu rozważa się podawanie przeciwciała przez terapię genową. Takie podawanie kwasu nukleinowego kodującego przeciwciało jest objęte wyrażeniem "podawanie skutecznej terapeutycznie ilości przeciwciała". Patrz, na przykład, WO 96/07321, opublikowany 14 marca 1996 r., dotyczący stosowania terapii genowej do tworzenia wewnątrzkomórkowych przeciwciał. [0238] Istnieją dwa główne podejścia do podawania kwasu nukleinowego (ewentualnie zawartego w wektorze) do komórek pacjenta: in vivo i ex vivo. Dla dostarczenia in vivo, kwas nukleinowy wstrzykuje się bezpośrednio pacjentowi, zazwyczaj w miejscu, w którym wymagane jest przeciwciało. Dla traktowania ex vivo, pobiera się komórki pacjenta, do tych wyizolowanych komórek wprowadza się kwas nukleinowy i zmodyfikowane komórki podaje się pacjentowi albo bezpośrednio, albo, na przykład, zakapsułkowane w porowatych membranach, które wszczepia się pacjentowi (patrz np. opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach i ). Istnieją różne dostępne techniki wprowadzania kwasów nukleinowych do zdolnych do życia komórek. Techniki różnią się zależnie od tego, czy kwas nukleinowy przenosi się do komórek hodowanych in vitro, czy in vivo w komórkach zamierzonego gospodarza. Techniki odpowiednie do przenoszenia kwasu nukleinowego do komórek ssaków in vitro obejmują stosowanie liposomów, elektroporacji, mikroiniekcji, fuzji komórkowej, DEAE-dekstranu, metody wytrącania fosforanem wapniowym itd. Wektorem powszechnie stosowanym do dostarczania genów ex vivo jest retrowirus.

61 [0239] Obecnie korzystne techniki przenoszenia kwasów nukleinowych in vivo obejmują transfekcję wektorami wirusowymi (takimi jak adenowirus, wirus opryszczki I lub wirus towarzyszący adenowirusom) i układy oparte na lipidach (użytecznymi lipidami do przenoszenia genu za pośrednictwem lipidów są na przykład DOTMA, DOPE i DC-Chol). W niektórych sytuacjach pożądane jest dostarczenie źródła kwasu nukleinowego z czynnikiem, który kieruje do komórek docelowych, takim jak przeciwciało specyficzne wobec białka błonowego na powierzchni komórkowej lub komórek docelowych, ligand receptora na komórkach docelowych itd.. Jeśli wykorzystuje się liposomy, do kierowania i/lub ułatwiania pobierania można stosować białka, które wiążą się z białkiem błonowym na powierzchni komórkowej związanym z endocytozą, np. białka kapsydu lub ich fragmenty wykazujące tropizm wobec określonego rodzaju komórek, przeciwciała skierowane przeciw białkom, które ulegają internalizacji w cyklu i białka, które kierują do położenia wewnątrzkomórkowego i wydłużają wewnątrzkomórkowy okres półtrwania. Technikę endocytozy zależnej od receptora opisali, na przykład, Wu i współpracownicy, J. Biol. Chem. 262: (1987) i Wagner i współpracownicy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: (1990). Dla zapoznania się z przeglądem znanych obecnie protokołów znakowania genów i terapii genowej patrz Anderson i współpracownicy, Science 256: (1992). Patrz również WO 93/25673 i cytowane w nim odnośniki. VI. Deponowanie materiałów [0240] Poniższe linie komórek hybrydom zdeponowano w bazie American Type Culture Collection, University Blvd., Manassas, VA , USA (ATCC): Oznaczenie przeciwciała Nr ATCC Data zdeponowania 7C2 ATCC HB października F3 ATCC HB października D5 ATCC CRL maja C4 ATCC HB kwietnia 1999 [0241] Dalsze szczegóły wynalazku zilustrowano poniższymi nieograniczającymi Przykładami. Przykład 1 Wytwarzanie i charakteryzowanie monoklonalnego przeciwciała 2C4 [0242] Mysie przeciwciała monoklonalne 2C4, 7F3 i 4D5, które specyficznie wiążą się z zewnątrzkomórkową domeną HER2, utworzono jak opisano w Fendly i współpracownicy, Cancer Research, 50: (1990). Krótko, komórki NIH 3T3/HER (w których zachodzi ekspresja około 1 x 10 5 cząsteczek HER2/komórkę) otrzymane jak opisano w Hudziak i współpracownicy, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 84: (1987) zebrano stosując sól fizjologiczną zbuforowaną fosforanami (PBS) zawierającą 25 mm EDTA i zastosowano do immunizacji myszy BALB/c. Myszy otrzymywały dootrzewnowe iniekcje

62 komórek w 0,5 ml PBS w tygodniach 0, 2, 5 i 7. Myszy o antysurowicach, które immunoprecypitowały znakowane 32 P HER2, otrzymywały dootrzewnowe iniekcje ekstraktu błonowego HER2 oczyszczanego na Sepharose z immobiliozowaną aglutyniną kiełków pszenicy (WGA) w tygodniach 9 i 13. Następnie stosowano dożylne iniekcje 0,1 ml preparatu HER2 i limfocyty śledzionowe poddawano fuzji z linią X63-Ag8.633 szpiczaka mysiego. [0243] Supernatanty hybrydom przeszukiwano pod kątem wiązania HER2 przez ELISA i radioimmunoprecypitację. [0244] Epitopy HER2 związane przez monoklonalne przeciwciała 4D5, 7F3 i 2C4 określono przez analizę współzawodniczego wiązania (Fendly i współpracownicy, Cancer Research 50: (1990)). Badania krzyżowego blokowania przeprowadzono na przeciwciałach przez bezpośrednią fluorescencję nienaruszonych komórek stosując PANDEX Screen Machine do ilościowej oceny fluorescencji. Każde z przeciwciał monoklonalnych skoniugowano z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) stosując ustalone procedury (Wofsy i współpracownicy, Selected Methods in Cellular Immunology, str. 287, Mishel i Schiigi (wyd.) San Francisco: W.J. Freeman Co. (1980)). Zlewające się monowarstwy komórek NIH 3T3/HER traktowano trypsyną, przemywano raz i ponownie zawieszano z gęstością 1,75 x 10 6 komórek/ml w zimnymj PBS zawierającym 0,5% albuminę surowicy bydlęcej (BSA) i 0,1% NaN 3. Dodawano cząstki lateksowe (IDC, Portland, OR) do 1% stężenia końcowego celem zmniejszenia się zatykania membran płytek PANDEX. Komórki w zawiesinie, 20 μl i 20 μl oczyszczonych przeciwciał monoklonalnych (100 μg/ml do 0,1 μg/ml) dodawano do studzienek płytki PANDEX i inkubowano na lodzie w ciągu 30 minut. Do każdej studzienki dodawano wstępnie określone rozcieńczenie znakowanych FITC przeciwciał monoklonalnych o objętości 20 μl, inkubowano w ciągu 30 minut, przemywano i określano ilościowo fluorescencję stosując PANDEX. Przeciwciała monoklonalne uważano za dzielące wspólny epitop, jeśli blokowały swoje wzajemne wiązanie o 50% lub więcej w porównaniu z monoklonalnym przeciwciałem kontrolnym. W tym doświadczeniu monoklonalne przeciwciała 4D5, 7F3 i 2C4 przypisano odpowiednio epitopom I, G/F i F. [0245] Hamujące wzrost właściwości monoklonalnych przeciwciał 2C4, 7F3 i 4D5 oceniano stosując linię komórek nowotworu sutka, SK-BR-3 (patrz Hudziak i współpracownicy, Molec. Cell. Biol. 9(3): (1989)). Krótko, komórki SK-BR-3 oddzielono od podłoża stosując 0,25% (obj./obj.) trypsynę i zawieszano w kompletnym podłożu z gęstością 4 x 10 5 komórek na ml. Objętości 100 μl (4 x 10 4 komórek) wysiewano w 96-studzienkowych płytkach do mikrorozcieńczeń, umożliwiano adhezję komórek, i następnie dodawano 100 μl samego podłoża lub podłoża zawierającego przeciwciało monoklonalne (stężenie końcowe 5 μg/ml). Po 72 godzinach płytki dwukrotnie przemywano PBS (ph 7,5), wybarwiono fioletem krystalicznym (0,5% w metanolu) i analizowano pod względem względnej proliferacji komórek jak opisano w Sugarman i współpracownicy, Science, 230: (1985). Przeciwciała monoklonalne 2C4 i 7F3 hamowały względną proliferację komórek SK- BR-3 o odpowiednio około 20% i około 38% w porównaniu z około 56% hamowaniem uzyskanym dla monoklonalnego przeciwciała 4D5.

63 [0246] Monoklonalne przeciwciała 2C4, 4D5 i 7F3 oceniano pod kątem ich zdolności do hamowania stymulowanej HRG fosforylacji tyrozyny białek o M r w zakresie z pełnokomórkowych lizatów komórek MCF7 (Lewis i współpracownicy, Cancer Research 56: (1996)). Donoszono, że w komórkach MCF7 zachodzi ekspresja wszystkich znanych receptorów HER, ale na stosunkowo niskich poziomach Ze względu na to, że HER2, HER3 i HER4 posiadają prawie identyczne wielkości cząsteczkowe, nie jest możliwe rozróżnienie, którego białka tyrozyny ulegały fosforylacji, jeśli pełnokomórkowe lizaty oceniano stosując analizę Western blotting. [0247] Jednak, komórki te są idealne do oznaczeń stymulowanej HRG fosforylacji tyrozyn, ponieważ w stosowanych warunkach oznaczenia, w nieobecności egzogennie dodawanej HRG, wykazują one tylko niskie lub niewykrywalne poziomy fosforylacji tyrozyn białek o M r w zakresie [0248] Komórki MCF7 wysiewano w 24-studzienkowych płytkach, do każdej studzienki dodawano monoklonalne przeciwciała przeciw HER2 i inkubowano w ciągu 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie do każdej studzienki dodawano rhrgβ do stężenia końcowego 0,2 nm i inkubację kontynuowano w ciągu 8 minut. Z każdej studzienki ostrożnie odessano podłoże i reakcję zatrzymywano przez dodanie 100 μl buforu do próbek z SDS (5% SDS, 25 mm DTT i 25 mm Tris- HCl, ph 6,8). Każdą próbkę (25 μl) poddawano elektroforezie w żelu o gradiencie 4-12% (Novex), a następnie elektroforetycznie przenoszono na membranę z polifluorku winylidenu. Immunobloty wywoływano stosując przeciwciało skierowane przeciw fosfotyrozynie (4G10, z UBI, stosowane w stężeniu 1 μg/ml) i intensywność głównego reaktywnego prążka o M r ~ ilościowo oceniano przez densytometrię w świetle odbitym, jak opisano uprzednio (Holmes i współpracownicy, Science, 256: (1992); Sliwkowski i współpracownicy, J. Biol. Chem., 269: (1994)). [0249] Monoklonalne przeciwciała 2C4, 7F3 i 4D5 znacząco hamowały tworzenie sygnału indukowanej HRG fosforylacji tyrozyny przy M r W nieobecności HRG żadne z tych przeciwciał nie było zdolne do stymulacji fosforylacji tyrozyn białek o M r w zakresie Przeciwciała te również nie reagowały krzyżowo z EGFR (Fendly i współpracownicy, Cancer Research 50: (1990)), HER3 lub HER4. Przeciwciała 2C4 i 7F3 znacząco hamowały stymulację przez HRG fosforylację tyrozyn p180 do <25% kontroli. Monoklonalne przeciwciało 4D5 było zdolne do blokowania stymulacji fosforylacji tyrozyn przez HRG o około 50%. Fig. 2A przedstawia krzywe dawka-odpowiedź dla hamowania przez 2C4 i 7F3 stymulowanej HRG fosforylacji tyrozyn p180, określone przez densytometrię w świetle odbitym. Analiza tych krzywych hamowania z zastosowaniem 4-parametrycznego fitowania dała IC50 wynoszące 2,8 ± 0,7 nm i 29,0 ± 4,1 dla odpowiednio 2C4 i 7F3. [0250] Hamowanie przez przeciwciała HER2 wiązania HRG z liniami komórek nowotworu sutka MCF7 przeprowadzono z monowarstwowymi hodowlami na lodzie w 24-studzienkowej płytce (Lewis i współpracownicy, Cancer Research, 56: (1996)). Do każdej studzienki dodawano monoklonalne przeciwciała HER2 i inkubowano w ciągu 30 minut. Dodawano znakowaną 125 I rhrgβ (25 pm) i inkubację kontynuowano w ciągu od 4 do

64 godzin. Fig. 2B przedstawia krzywe dawka-odpowiedź dla hamowania przez 2C4 lub 7F3 wiązania HRG z komórkami MCF7. Różne stężenia 2C4 lub 7F3 inkubowano z komórkami MCF7 w obecności znakowanej 125 I rhrgβ1 i krzywe hamowania przedstawiono na Fig. 2B. Analiza tych danych dała IC 50 wynoszące 2,4 ± 0,3 nm i 19,0 ± 7,3 nm odpowiednio dla 2C4 i 7F3. Maksymalne hamowanie wynoszące około 74% dla 2C4 i 7F3 było zgodne z danymi dla hamowania fosforylacji tyrozyn. [0251] W celu określenia, czy obserwowany wpływ przeciwciał HER2 na komórki MCF7 był zjawiskiem ogólnym, linie komórek nowotworów ludzkich inkubowano z 2C4 i 7F3 i określano stopień specyficznego wiązania znakowanej 125 I rhrgβ1 (Lewis i współpracownicy, Cancer Research 56: (1996)). Wyniki tych badań przedstawiono na Fig. 3. Wiązanie znakowanej 125 I rhrgβ1 może być znacząco hamowane przez lub 2C4, lub 7F3 we wszystkich liniach komórkowych, z wyjątkiem linii komórek raka sutka MDA-MB-468, o której donoszono, że zachodzi w niej ekspresja niewielka HER2 lub nie zachodzi ona w ogóle. Dla pozostałych linii komórkowych donoszono o ekspresji HER2, z poziomem ekspresji szeroko zróżnicowanym. Rzeczywiście, zakres ekspresji HER2 w badanych liniach komórkowych różni się o ponad dwa rzędy wielkości. Na przykład, w liniach BT-20, MCF7 i Caov3 zachodzi ekspresja około 10 4 receptorów HER2/komórkę, podczas gdy w BT-474 i SK-BR-3 około 10 6 receptorów HER2/komórkę. Ze względu na szeroki zakres ekspresji HER2 w tych komórkach i powyższe dane wywnioskowano, że oddziaływanie pomiędzy HER2 i HER3 lub HER4 samo było oddziaływaniem o wysokim powinowactwie, które zachodzi na powierzchni błony plazmatycznej. [0252] Wpływ hamowania wzrostu monoklonalnych przeciwciał 2C4 i 4D5 na komórki MDA-MB-175 i SK-BR-3 w obecności lub nieobecności egzogennej rhrgβ1 (Schaefer i współpracownicy, Oncogene 15: (19997)) oszacowano. Poziomy HER2 w komórkach MDA-MB-175 są 4-6 razy wyższe niż poziom stwierdzony w prawidłowych komórkach nabłonkowych sutka, i tyrozyny receptora HER2-HER4 są konstytutywnie fosforylowane w komórkach MDA-MB-175. Komórki MDA-MB-175 traktowano z HER2 przeciwciałami monoklonalnymi 2C4 i 4D5 (10 μg/ml) w ciągu 4 dni. W oznaczaniu wybarwiania fioletem krystalicznym inkubacja z 2C4 wykazywała silny wpływ hamujący wzrost na tę linię komórkową (Fig. 4A). Egzogenne HRG nie odwracało znacząco tego hamowania. Z drugiej strony, 2C4 nie wykazało hamującego wpływu na linię komórkową SK-BR-3, w której zachodzi nadekspresja HER2 (Fig. 4B). Monoklonalne przeciwciało 2C4 było zdolne do hamowania proliferacji komórek MDA-MB-175 w większym zakresie niż monoklonalne przeciwciało 4D5, zarówno w obecności, jak i nieobecności egzogennej HRG. Hamowanie proliferacji komórek przez 4D5 jest zależne od poziomu ekspresji HER2 (Lewis i współpracownicy, Cancer Immunol. Immunother. 37: (1993)). Można było wykryć maksymalne 66% hamowanie w komórkach SK-BR-3 (Fig. 4B) Jednak, wpływ ten może zostać przezwyciężony przez egzogenną HRG. Przykład 2 Monoklonalne przeciwciało 2C4 blokuje zależne od HRG łączenie się HER2 z HER3

65 [0253] Zdolność HER3 do łączenia się z HER2 zbadano w doświadczeniu koimmunoprecypitacji. 1,0 x 10 6 komórek MCF7 lub SK-BR-3 wysiano w sześciostudzienkowych płytkach do hodowli komórkowych w DMEM/Ham's F12 podłożu w stosunku 50:50, zawierającym 10% płodową surowicę bydlęcą (FBS) i 10 mm HEPES, ph 7,2 (podłoże wzrostowe) i umożliwiano przyłączanie do podłoża w ciągu nocy. Komórki głodzono w ciągu dwóch godzin w podłożu wzrostu bez surowicy przed rozpoczęciem doświadczenia. [0254] Komórki krótko przemywano solą fizjologiczną zbuforowaną fosforanami (PBS), i następnie inkubowano z lub 100 nm wskazanym przeciwciałem rozcieńczonym w 0,2% wag./obj. albuminie surowicy bydlęcej (BSA) w podłożu RPMI z 10 mm HEPES, ph 7,2 (bufor do wiązania), lub z samym buforem do wiązania (kontrola). Po jednej godzinie w temperaturze pokojowej do połowy studzienek (+) dodawano HRG do 5 nm stężenia końcowego. Podobną objętość buforu do wiązania dodawano do innych studzienek (-). Inkubację kontynuowano w ciągu 10 minut. [0255] Supernatanty usuwano przez odessanie i komórki poddawano lizie w RPMI, 10 mm HEPES, ph 7,2, 1,0% obj./obj. TRITON-X100, 1,0% wag./obj. CHAPS (bufor lizujący), zawierającym 0,2 mm PMSF, 10 μg/ml leupeptyny i 10 TU/ml aprotyniny. Lizaty oczyszczano z nierozpuszczalnego materiału przez wirowanie. [0256] HER2 poddawano immunoprecypitacji stosując przeciwciało monoklonalne kowalencyjnie sprzęgane z żelem powinowactwa (Affi-Prep 10, Bio-Rad). Przeciwciało to (Ab-3, Oncogene Sciences) rozpoznaje epitop domeny cytoplazmatycznej. Immunoprecypitację prowadzono przez dodanie 10 μl zawiesiny żelu, zawierającej około 8,5 μg immobilizowanego przeciwciała do każdego lizatu, i umożliwiano mieszanie próbek w temperaturze pokojowej w ciągu dwóch godzin. Żele zbierano następnie przez wirowanie. Żele trzy razy okresowo przemywano buforem lizującym w celu usunięcia niezwiązanego materiału. Następnie dodawano bufor do próbek z SDS i próbki krótko ogrzewano we wrzącej łaźni wodnej. [0257] Supernatanty poddawano elektroforezie w 4-12% żelach poliakrylkoamidowych i elektroblottingowi na membrany nitrocelulozowe. Obecność HER3 oceniano jako sondę blotów z poliklonalnym przeciwciałem przeciw epitopom jego domeny cytoplazmatycznej (C-17, Santa Cruz Biotech). Bloty wizualizowano stosując substrat chemiluminescencyjny (ECL, Amersham). [0258] Jak przedstawiono na kontrolnych ścieżkach na Fig. 5A i 5B dla odpowiednio komórek MCF-7 i SK-BR-3, HER3 był obecny w immunoprecypitatach HER2 tylko kiedy komórki stymulowano HRG. Jeśli komórki najpierw inkubowano z monoklonalnym przeciwciałem 2C4, sygnał HER3 w komórkach MCF7 był zniesiony (Fig. 5A, ścieżka 2C4+) lub znacznie obniżony w komórkach SK-BR-3 (Fig. 5B, ścieżka 2C4+). Jak przedstawiono na Fig. 5A-B, monoklonalne przeciwciało 2C4 blokuje zależne od hereguliny łączenie się HER3 z HER2, zarówno w komórkach MCF7, jak i SK-BR-3 znacznie bardziej skutecznie niż Trastuzumab. Preinkubacja z Trastuzumabem zmniejszała sygnał HER3 w lizatach MCF7, ale

66 wywierała niewielki wpływ, bądź go nie wywierała, na ilość HER3 koprecypitującego z lizatów SK-BR-3. Preinkubacja z przeciwciałem skierowanym przeciw receptorowi EGF (Ab-1, Oncogene Sciences) nie wywiera żadnego wpływu na zdolność HER3 do koimmunoprecypitacji z HER2 dla żadnej z linii komórkowych. Przykład 3 Humanizowane przeciwciała 2C4 [0259] Zmienne domeny mysiego przeciwciała monoklonalnego 2C4 najpierw sklonowano w wektorze, który umożliwia wytwarzanie chimerycznego mysz/człowiek fragmentu Fab. Całkowity RNA wyizolowano z komórek hybrydomy stosując zestaw do ekstrakcji Stratagene zgodnie z protokołami producenta. Domeny zmienne zamplifikowano przez RT- PCR, oczyszczono w żelu i wstawiono do pochodnego plazmidu opartego na puc119, zawierającego ludzką domenę stałą kappa i ludzką domenę CH1, jak opisano uprzednio (Carter i współpracownicy, PNAS (USA) 89: 4285 (1992) i opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer ). Otrzymanym w wyniku plazmidem stransformowano szczep E. coli 16C9 dla uzyskania ekspresji fragmentu Fab. Prowadzenie hodowli, indukcja ekspresji białka i oczyszczanie fragmentu Fab przeprowadzono tak, jak opisano uprzednio (Werther i współpracownicy, J. Immunol. 157: (1996), Presta i współpracownicy, Cancer Research 57: (1997)) [0260] Oczyszczony chimeryczny fragment Fab 2C4 porównano z mysim macierzystym przeciwciałem 2C4 pod względem jego zdolności do hamowania wiązania 125 I-HRG z komórkami MCF7 i hamowania aktywacji przez rhrg fosforylacji tyrozyn p180 w komórkach MCF7. Jak przedstawiono na Fig. 6A, chimeryczny fragment Fab 2C4 jest bardzo skuteczny pod względem zaburzania tworzenia miejsca wiązania HER2-HER3 o wysokim powinowactwie na linii komórek ludzkiego raka sutka, MCF7. Względna wartość IC 50 obliczona dla nienaruszonego mysiego 2C4 wynosi 4,0 ± 0,4 nm, podczas gdy wartość dla fragmentu Fab wynosi 7,7 ± 1,1 nm. Jak zilustrowano na Fig. 6B, monowalentny chimeryczny fragment Fab 2C4 jest bardzo skuteczny pod względem zaburzania zależnej od HRG aktywacji HER2-HER3. Wartość IC 50 obliczona dla nienaruszonego mysiego przeciwciała monoklonalnego 2C4 wynosi 6,0 ± 2 nm, podczas gdy wartość dla fragmentu Fab wynosi 15,0 ± 2 nm. [0261] Zsekwencjonowanie DNA chimerycznego klonu umożliwiło identyfikację reszt CDR (Kabat i współpracownicy, Sequences of Proteins of Immunological Interest, wyd. 5, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)) (Fig. 7A i B). Stosując mutagenezę ukierunkowaną oligonukleotydami, wszystkie sześć tych regionów CDR wprowadzono do pełnego zrębu ludzkiego (podgrupa I V L kappa i podgrupa III V H ) zawartego w plazmidzie VX4, jak opisano uprzednio (Presta i współpracownicy, Cancer Research, 57: (1997)). Białko z uzyskanego "CDR-swap" poddano ekspresji i oczyszczono je jak wyżej. Badania wiązania przeprowadzono w celu porównania obu wersji. Krótko, płytkę NUNC MAXISORP powlekano 1 mikrogramem na ml domeny zewnątrzkomórkowej HER2 (ECD; wytwarzana jak opisano w WO 90/14357) w 50 mm

67 buforze węglanowym, ph 9,6, przez noc w temperaturze 4 C, i następnie zablokowano rozcieńczalnikiem do ELISA (0,5% BSA, 0,05% polisorbat 20, PBS) w temperaturze pokojowej w ciągu 1 godziny. Seryjne rozcieńczenia próbek w rozcieńczalniku do ELISA inkubowano w płytkach przez 2 godziny. Po przemyciu, związany fragment Fab wykrywano stosując biotynylowane mysie przeciwciało skierowane przeciw ludzkiemu łańcuchowi kappa (ICN ), a następnie skoniugowaną ze streptawidyną peroksydazę chrzanową (Sigma) i 3,3',5,5'-tetrametylobenzydynę (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) jako substrat. Absorbancję odczytywano przy długości fali 450 nm. Jak przedstawiono na Fig. 8A, w wyniku skonstruowania ludzkiego fragmentu Fab z CDR-swap utracono całą zdolność wiązania. [0262] W celu przywrócenia wiązania humanizowanego Fab, skonstruowano mutanty stosując DNA z CDR swap jako matrycę. Stosując model utworzony komputerowo (Fig. 9), te mutacje zaprojektowano w celu zmiany reszt ludzkiego regionu zrębowego na ich mysie odpowiedniki w pozycjach, w których zmiana mogłaby wpływać na konformacje CDR lub region kontaktu (interfejs) przeciwciało-antygen. Mutanty przedstawiono w Tablicy 2. Tablica 2 Projektowanie mutacji humanizowanego FR 2C4 Nr mutanta Podstawienia regionu zrębowego (FR) 560 ArgH71Val 561 AspH73Arg 562 ArgH71Val, AspH73Arg 568 ArgH71Val, AspH73Arg, AlaH49Gly 569 ArgH71Val, AspH73Arg, PheH67Ala 570 ArgH71Val, AspH73Arg, AsnH76Arg 571 ArgH71Val, AspH73Arg, LeuH78Val 574 ArgH71Val, AspH73Arg, IleH69Leu ArgH71Val, AspH73Arg, AlaH49Gly, PheH67Ala [0263] Krzywe wiązania dla różnych mutantów przedstawiono na Fig. 8A-C. Wydaje się, że wersja 574 humanizowanego Fab, ze zmianami ArgH71Val, AspH73Arg i IleH69Leu posiada przywrócone wiązanie do tego z oryginalnego chimerycznego fragmentu Fab 2C4. Dla bardziej szczegółowej analizy lub wzmocnienia wiązania humanizowanego przeciwciała można modyfikować dodatkowe reszty FR i/lub CDR, takie jak L2, L54, L55, L56, H35 i/lub H48 (np. podstawiać w następujący sposób - IleL2Thr, ArgL54Leu, TyrL55-Glu, ThrL56Ser, AspH35Ser i ValH48Ile). Alternatywnie, lub dodatkowo, humanizowane przeciwciało można

68 poddawać dojrzewaniu powinowactwa (patrz powyżej) w celu dalszej poprawy jego powinowactwa i/lub innych aktywności biologicznych. [0264] Wersję 574 humanizowanego 2C4 poddawano dojrzewaniu powinowactwa stosując metodę prezentacji fagowej. Krótko, Humanizowany Fab 2C4.574 sklonowano w wektorze do prezentacji fagowej w postaci fuzji z genem III. Jeśli cząstki fagowe indukuje się przez infekcję fagiem wspomagającym M13K07, fuzja ta umożliwia prezentację Fab na N-końcu białka włókna "ogona", produktu genu III (Baca i współpracownicy, J. Biol. Chem., 212: (1997)). [0265] Skonstruowano indywidualne biblioteki dla każdego z 6 CDR określonych powyżej. W tych bibliotekach aminokwasy w CDR, które zidentyfikowano stosując model komputerowy (Fig. 9) jako będące ewentualnie istotne w wiązaniu z HER2, poddano losowym mutacjom stosując oligonukleotydy zawierające "NNS" jako kodony. Następnie biblioteki selekcjonowano wobec powlekanych ECD HER2 płytek NUNC MAXISORP z 3% mlekiem w proszku w PBS z 0,2% TWEEN 20 (MPBST) stosowanym zamiast wszystkich roztworów blokujących. W celu selekcji fagów o powinowactwach wyższych od tego z 2C4.574, w 3, 4 i 5 turach selekcji dodawano rozpuszczalną ECD HER2 lub rozpuszczalny Fab 2C4.574 podczas etapów przemywania jako czynnik współzawodniczący. Czas przemywania wydłużono do 1 godziny w temperaturze pokojowej. [0266] Po 5 turach selekcji, pojedyncze klony ponownie analizowano przez ELISA fagi. Pojedyncze klony hodowano w 96-studzienkowych płytkach do hodowli tkankowych o studzienkach z dnem w kształcie litery U, Costar, i fagi indukowano przez dodanie faga wspomagającego. Po wzroście w ciągu nocy, komórki E. coli granulowano i zawierające fagi supernatanty przenoszono do 96-studzienkowych płytek, w których faga blokowano z MPBST w ciągu jednej godziny w temperaturze pokojowej. Płytki NUNC MAXISORP powlekane EDC HER2 również blokowano MPBST, jak powyżej. Blokowanego faga inkubowano na płytkach w ciągu 2 godzin. Po przemywaniu, związane fagi wykrywano stosując sprzężone z peroksydazą chrzanu przeciwciało monoklonalne skierowane przeciw M13 (Amersham Pharmacia Biotech, Inc., ) rozcieńczone 1:5000 w MPBST, a następnie 3,3',5,5'-tetrametylobenzydynę jako substrat. Absorbancję odczytywano przy długości fali 450 nm. [0267] Sekwencjonowaniu DNA z każdej biblioteki poddano 48 klonów, które dawały najwyższe sygnały. Te klony, których sekwencje występowały najczęściej zsubklonowano w opisanym powyżej wektorze, który umożliwia ekspresję rozpuszczalnych Fab. Faby te indukowano, oczyszczono białka i oczyszczone Faby analizowano pod względem wiązania w opisanym powyżej oznaczeniu ELISA i wiązanie porównano z tym z wyjściowej humanizowanej wersji 2C [0268] Po zidentyfikowaniu interesujących mutacji w poszczególnych CDR, skonstruowano i badano jak wyżej dodatkowe mutanty, które posiadają różne kombinacje tych mutacji. Mutanty, które wykazywały ulepszone powinowactwo w stosunku do 574 opisano w Tablicy 3.

69 Tablica 3. Projektowanie mutantów otrzymanych przez dojrzewanie powinowactwa 2C4.574 Nazwa mutanta Zmiana w stosunku do 574 Mutant/574* H3.A1 serh99trp, meth34leu 0,380 L2.F5 serl50trp, tyrl53gly, meth34leu 0,087 H1.3.B3 thrh28gln,thrh30ser, meth34leu 0,572 L3.G6 tyrl92pro, ilel93lys, meth34leu 0,569 L3.G11 tyrl92ser, ilel93arg, tyrl94gly, meth34leu L3.29 tyrl92phe, tyrl96asn, meth34leu 0,552 L3.36 tyrl92phe, tyrl94leu, tyrl96pro, meth34leu 0, serl50trp, meth34leu 0, meth34ser 0, serl50trp, meth34ser 0,076 L2.F5.H3.A1 serl50trp, tyrl53gly, meth34leu, serh99trp 0,175 L3G6.H3.A1 tyrl92pro, ilel93lys, meth34leu, serh99trp H1.3.B3.H3.A1 thrh28gln, thrh30ser, meth34leu, serh99trp 0,306 L3.G11.H3.A1 tyrl92ser, ilel93arg, tyrl94gly, meth34leu, serh99trp 0, H3.A1 serl50trp, meth34leu, serh99trp 0, L3.G6 serl50trp, meth34leu, tyrl92pro, ilel931ys 0, L3.29 serl50trp, meth34leu, tyrl92phe, tyrl96asn 0, L3.36 serl50trp, meth35leu, tyrl92phe, tyrl94leu, tyrl96pro *Stosunek ilości mutanta potrzebnej do otrzymania średniej OD krzywej standardowej do ilości 574 potrzebnej do otrzymania średniej OD krzywej standardowej w ELISA ECD Erb2. Liczba niższa od 1,0 wskazuje, że mutant wiąże Erb2 lepiej niż 574. [0269] Skonstruowano również poniższe mutanty i są one obecnie poddawane ocenie:

70 L3.G6 659.L3.G L L3.36 L2F5.L3G6 L2F5.L3G11 L2F5.L29 L2F5.L36 serl50trp, meth34ser, tyrl92pro, ilel93lys serl50trp, meth34ser, tyrl92ser, ilel93arg, tyrl94gly serl50trp, meth34ser, tyrl92phe, tyrl96asn serl50trp, meth34ser, tyrl92phe, tyrl94leu, tyrl96pro serl50trp, tyrl53gly, meth34leu, tyrl92pro, ilel931ys serl50trp, tyrl53gly, meth34leu, tyrl92ser, ilel93arg, tyrl94gly serl50trp, tyrl53gly, meth34leu, tyrl92phe, tyrl96asn serl50trp, tyrl53gly, meth34leu, tyrl92phe, tyrl94leu, tyrl96pro L2F5.L3G6.655 serl50trp, tyrl53gly, meth35ser, tyrl92pro, ilel93lys L2F5.L3G serl50trp, tyrl53gly, meth34ser, tyrl92ser, ilel93arg, tyrl94gly L2F5.L L2F5.L serl50trp, tyrl53gly, meth34ser, tyrl92phe, tyrl96asn serl50trp, tyrl53gly, meth34ser, tyrl92phe, tyrl94leu, tyrl96pro Obecnie są konstruowane następujące mutanty, sugerowane przez przeszukiwanie pod względem homologii: 678 thrh30ala 679 thrh30ser 680 lysh64arg 681 leuh96val 682 thrl97ala 683 thrl97ser 684 tyrl96phe 685 tyrl96ala 686 tyrl91phe 687 thrl56ala 688 glnl28ala 689 glnl28glu

71 [0270] Korzystnym aminokwasem w pozycji H34 mogłaby być metionina. Można dokonać zmiany na leucynę, jeśli w tej pozycji miałoby być prowadzone utlenianie. [0271] Stwierdzono, że bardzo korzystne dla wiązania są AsnH52 i asnh53. Zmiana tych reszt na alaninę lub kwas asparaginowy dramatycznie zmniejszała wiązanie. Otrzymano nienaruszone przeciwciało zawierające domeny zmienne łańcucha lekkiego i ciężkiego humanizowanej wersji 574 z regionem stałym łańcucha ciężkiego ludzkiej IgG1 (patrz opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer ). Nienaruszone przeciwciało wytwarzają komórki jajnika chomika chińskiego (CHO). Cząsteczkę tę oznaczono tu jako Pertuzumab. Przykład 4 Monoklonalne przeciwciało 2C4 blokuje aktywację MAPK i kinazy Akt z udziałem EGF, TGF-α lub HRG [0272] Wiele receptorów czynnika wzrostu przekazuje sygnały poprzez szlak aktywowanej mitogenem kinazy białkowej (MAPK). Te kinazy o podwójnej specyficzności są jednym z kluczowych celów w szlakach przekazywania sygnałów, które ostatecznie wyzwalają podział komórek rakowych. Zdolność monoklonalnego przeciwciała 2C4 lub Trastuzumabu do hamowania aktywacji MAPK przez EGF, TGF-α lub HRG oceniano w poniższy sposób. [0273] Komórki MCF7 (10 5 komórek/studzienkę) wysiewano w podłożach zawierających surowicę w 12-studzienkowych płytkach do hodowli komórkowych. Następnego dnia usuwano podłoża i do każdej studzienki dodawano świeże podłoża zawierające 0,1% surowicę. Następnie procedurę tę powtarzano kolejnego dnia i przed oznaczeniem podłoża zastępowano wolnym od surowicy buforem do wiązania (Jones i współpracownicy, J. Biol. Chem. 273: (1998) i Schaefer i współpracownicy, J. Biol. Chem. 274: (1999)). Umożliwiano zrównoważenie temperatury komórek do temperatury pokojowej, a następnie inkubowano w ciągu 30 minut z 0,5 ml 200 nm Trastuzumabu lub monoklonalnego przeciwciała 2C4. Następnie na komórki podziałano 1 nm EGF, 1 nm TGF-α lub 0,2 nm HRG w ciągu 15 minut. Reakcję zatrzymywano przez odessanie podłoża, a następnie dodawano 0,2 ml buforu do próbek SDS-PAGE zawierającego 1% DTT. Aktywację MAPK oceniano przez blotting typu Western stosując przeciwciało skierowane przeciw aktywnej MAPK (Promega), jak opisano uprzednio (Jones i współpracownicy, J. Biol. Chem., 273: (1998)). [0274] Jak przedstawiono na Fig. 10, monoklonalne przeciwciało 2C4 znacząco blokuje aktywację MAPK przez EGF, TGF-α i HRG, w zakresie wyższym niż Trastuzumab. Dane te sugerują, że monoklonalne przeciwciało 2C4 wiąże się z powierzchnią HER2, która jest wykorzystywana do jego łączenia lub z EGFR, lub z HER3, i w ten sposób zapobiega tworzeniu przekazującego sygnały kompleksu receptorowego. [0275] Wykazano również, że monoklonalne przeciwciało 2C4 hamuje zależną od HRG aktywację Akt. Aktywacja szlaku przekazywania sygnałów kinazy PI3 jest ważna dla przeżywania komórek (Carraway i współpracownicy, J. Biol. Chem., 270: (1995)). W komórkach rakowych aktywacja kinazy PI3 może odgrywać rolę w fenotypie inwazyjnym

72 (Tan i współpracownicy, Cancer Research, 59: (1999)). Szlak zapewniający przeżywanie zachodzi głównie za pośrednictwem kinazy serynowo/treoninowej AKT (Bos i współpracownicy, Trends Biochem. Sci., 20: (1995)). Kompleksy tworzone pomiędzy HER2 a lub HER3, lub EGFR mogą inicjować te szlaki w odpowiedzi odpowiednio na heregulinę lub EGF (Olayioye i współpracownicy, Mol.& Cell. Biol., 18: (1998); Karunagaran i współpracownicy, EMBO Journal, 15: (1996) i Krymskaya i współpracownicy, Am. J. Physiol., 276: L (1999)). Inkubacja komórek raka sutka MCF7 z 2C4 hamuje zachodzącą za pośrednictwem hereguliny aktywację ATK. Ponadto, podstawowy poziom aktywacji ATK występujący przy braku dodawania hereguliny jest dalej obniżany przez dodanie 2C4. Przykład 5 Leczenie raka opornego na platynę [0276] Ten przykład demonstruje bezpieczeństwo, tolerancję i skuteczność pertuzumabu w połączeniu z gemcytabiną u pacjentek z wtórną opornością na leczenie związkami platyny raka jajnika, pierwotnego raka otrzewnej lub raka jajowodów. Wpływ pertuzumabu i gemcytabiny na przeżycie wolne od progresji, jest oceniany u wszystkich pacjentek, a w podgrupie pacjentek, których nowotwory zawierają markery, wskazujące aktywację HER2. [0277] Pacjentki, u których choroba postępowała podczas leczenia, lub w ciągu 6 miesięcy od otrzymania schematu chemioterapii opartej na związkach platyny kwalifikują się do tego badania. Pacjentki losowo otrzymują gemcytabinę w połączeniu z pertuzumabem, lub gemcytabinę w połączeniu z placebo. Pacjentki leczone tu obejmują te, które nie otrzymały uprzednio schematu leczenia ratującego dla choroby opornej na związki platyny przed wejściem do badań i te, które otrzymały uprzednio schemat leczenia choroby opornej na związki platyny. [0278] Gemcytabinę podaje się w dawce 1000 mg/m 2 w dniach 1 i 8 każdego 21 dniowego cyklu. Gemcytabinę podaje się w postaci infuzji po raz pierwszy w ciągu 30 minut. Zmniejszenie dawki jest dozwolone ze względu na toksyczność. Placebo lub pertuzumab podaje się w dniu 1 21 dniowego cyklu. Pacjentki losowo przydziela się do otrzymania pertuzumabu, podawanemu we wstępnej dawce nasycającej 840 mg (1 cykl), a następnie 420 mg w 2 cyklach i dalej. Pacjentki losowo przydziela się do otrzymania placebo, w tej samej objętości jak podawano w ramieniu z pertuzumabem dla cyklu 1, cykli 2 i dalej. Pacjentki bez postępującej choroby mogą otrzymać leczenie przez do maksymalnie 17 cykli, lub 1 rok. [0279] Pacjentkom standardowo zmniejsza się dawkę gemcytabiny i utrzymuje się dawkę w wyniku cytopenii. Pertuzumab również utrzymuje się dla wszelkich dawek gemcytabiny dnia 1. Kolejne dawki są w zmniejszonych dawkach i nie będą zwiększone. Jeśli zmniejszenie dawki lub utrzymywanie dawki jest wymagane w więcej niż 4 razy, lub jeśli dawki są utrzymywane przez ponad 3 tygodnie, wtedy zostanie zakończone podawanie gemcytabiny i za zgodą lekarza prowadzącego i medycznego monitorowania, utajniony (zaślepiony) lek może być podawany do czasu progresji choroby. Jeżeli dnia 8 dawki gemcytabiny są

73 utrzymywane, wtedy dawka dnia 8 zostanie pominięta i kolejne leczenie rozpoczyna się z następnym cyklem (dzień 22 cyklu poprzedniego). [0280] Gemcytabinę utrzymuje się i dawkę zmniejsza zgodnie z zaleceniami w poniższej Tablicy: Bezwzględna liczba granulocytów (x10 6 /l) Liczba płytek krwi (x10 6 /l) % Pełna dawka > 1000 i > lub 50,000-99, <500 lub <50,000 Utrzymanie [0281] Kolejne dawki dla każdej pacjentki wymagającej zmniejszenia dawki będą w zmniejszonej dawce. Jeśli dawki są utrzymywane przez ponad 3 tygodnie w wyniku cytopenii, zakłada się, że u pacjentek występuję niedozwolona toksyczność i przerywa się podawania gemcytabiny. Jeśli nie ma inne dodatkowych toksyczności klasy III lub IV, kontynuacja zaślepionego leku pozostaje w gestii lekarza i medycznego monitorowania. Hematologiczna toksyczność gemcytabiny jest związana z szybkością podawania dawki. Gemcytabinę podaje się w czasie 30 minut bez względu na całkowitą dawkę. Stosowanie środków stymulujących tworzenie kolonii dla cytopenii stopnia 2 NCI-CTC pozostaje w gestii lekarza. [0282] Jest proponowana opcja zmiany leczenia na pojedynczy środek pertuzumab. Dawkę nasycającą 840 mg podaje się w kolejnym cyklu z powodu kontynuacji 420 mg z kolejnych cyklach co 21 dni. Należy przygotować i poddać ocenie zatopione w parafinie próbki nowotworu lub slajdy niebarwionej parafiny reprezentatywnego nowotworu zawierającego raka ze względu na stan fosforylacji HER2. Około 20-40% pacjentek chorych na raka jajnika może mieć wykrywalną fosforylację HER2. [0283] Odpowiedzi zostaną poddane ocenie z końcem cykli 2, 4, 6, 8, 12 i 17. Wymierne choroby ocenia się za pomocą kryteriów oceny odpowiedzi dla guzów stałych (RECIST), oceny klinicznej i skanu CT lub równoważnych. Odpowiedź dla osób z chorobą ocenianą będzie oszacowane zgodnie ze zmianami dla CA-125 i objawów klinicznych i radiologicznych choroby. Odpowiedzi należy potwierdzić 4-8 tygodni po wstępnej dokumentacji odpowiedzi. Oceniane osoby obejmują osoby, które miały co najmniej jedną ocenę odpowiedzi i mają określony status fosforylacji HER2. [0284] Następujące wyniki leczenia podlegają ocenie. Pierwotny punkt końcowy oceny skuteczności

74 Czas przeżycia wolny od progresji choroby, jak określony przez ocenę badacza za pomocą RECIST lub zmian CA-125, po wszczęciu leczenia przypisanego do badań wszystkich osób w każdym ramieniu. Czas przeżycia wolny od progresji choroby, jak określony przez ocenę badacza za pomocą RECIST lub zmian CA-125, po wszczęciu leczenia przypisanego do badań w każdym ramieniu w następujących podgrupach: Osoby z wykrywalnymi markerami aktywacji HER2. Osoby z niewykrywalnymi markerami aktywacji HER2. Wtórne punkty końcowe oceny skuteczności Odpowiedź obiektywna (PR or CR) Czas trwania odpowiedzi Czas przeżycia Wolne od progresji po 4 miesiącach Te punkty końcowe będą podlegać ocenie u wszystkich osób, w każdym ramieniu i w następujących podgrupach: Osoby z wykrywalnymi markerami aktywacji HER2. Osoby z niewykrywalnymi markerami aktywacji HER2 [0285] Celem zapobiegania lub leczenia możliwych nudności i wymiotów, pacjent może być premedykowany z antagonistami serotoniny, sterydami, i/lub benzodiazepinami. Do zapobiegania lub leczenia możliwej wysypki, mogą być stosowane standardowe terapie stosowane w trądziku, obejmujące miejscowe i/lub doustne antybiotyki. Inne możliwe leki towarzyszące stanowią dowolne leki przepisywane na receptę lub preparaty stosowane w wolnym obrocie, stosowane przez osobę w przedziale od 7 dni poprzedzających dzień 1 i nadal stosowane do ostatniego dnia okresu obserwacji. Osoby, które doświadczyły związanym z infuzją wzrostu temperatury do > 38,5 C lub innych objawów związanych z infuzją mogą być leczone objawowo z paracetamolem, difenhydraminą lub meperidyną. Nie doświadczalne hematopoetyczne czynniki wzrostu mogą być podawane w przypadku NCI- CTC klasy 2 cytopenii. [0286] U pacjenta leczonego jak wyżej nastąpi poprawa w oznakach lub objawach występujących w raku jajnika, pierwotnego raka otrzewnej lub raka jajowodu, jak oceniane przez jeden lub więcej pierwotnych i wtórnych punktów końcowych skuteczności. Ponadto pacjent oporny na związki platyny leczony jak opisano powyżej z kombinacją Pertuzumabu i gemcytabiny wykazuje większą poprawę w jakichkolwiek oznakach lub objawach raka, w porównaniu z pacjentem opornym na związki platyny leczonym tylko z gemcytabiną. Iwona Płodzich-Hennig Rzecznik patentowy

75 Zastrzeżenia patentowe 1. Przeciwciało skierowane przeciw HER2, które hamuje dimeryzację HER bardziej skutecznie niż Trastuzumab, do stosowania w sposobie leczenia raka opornego na platynę wybranego z grupy składającej się z raka jajnika, pierwotnego raka otrzewnej i raka jajowodów, który to sposób obejmuje podawanie pacjentowi przeciwciała skierowanego przeciw HER2 i gemcytabiny, każdego w ilościach skutecznych do leczenia raka. 2. Przeciwciało skierowane przeciw HER2, które hamuje dimeryzację HER bardziej skutecznie niż Trastuzumab i gemcytabina, do stosowania w sposobie leczenia raka opornego na platynę, wybranego z grupy składającej się z raka jajnika, pierwotnego raka otrzewnej i raka jajowodów, który to sposób obejmuje podawanie pacjentowi przeciwciała i gemcytabiny, każdego w ilościach skutecznych do leczenia raka. 3. Przeciwciało z zastrzeżenia 1 lub 2, w którym przeciwciało skierowane przeciw HER2 wiąże się z Domeną II HER2. 4. Przeciwciało z zastrzeżenia 1 lub z zastrzeżenia 2, w którym przeciwciałem skierowanym przeciw HER2 jest Pertuzumab. 5. Przeciwciało z któregokolwiek z poprzednich zastrzeżeń, w którym próbka nowotworu pacjenta wykazuje aktywację HER. 6. Przeciwciało z zastrzeżenia 5, w którym próbka nowotworu pacjenta wykazuje aktywację HER2. 7. Przeciwciało z któregokolwiek z poprzednich zastrzeżeń, w którym sposób prowadzi do poprawy przeżycia w stosunku do pacjenta, leczonego tylko gemcytabiną. 8. Przeciwciało z zastrzeżenia 7, w którym sposób prowadzi do poprawy przeżycia bez progresji w stosunku do pacjenta leczonego tylko gemcytabiną. 9. Przeciwciało z zastrzeżenia 7, w którym w sposób prowadzi do poprawy całkowitego przeżycia w stosunku do pacjenta leczonego tylko gemcytabiną. 10. Przeciwciało z któregokolwiek z poprzednich zastrzeżeń, w którym sposób prowadzi do obiektywnej odpowiedzi. 11. Przeciwciało z zastrzeżenia 10, w którym sposób prowadzi do pełnej odpowiedzi. 12. Przeciwciało z zastrzeżenia 10, w którym sposób prowadzi do częściowej odpowiedzi. 13. Przeciwciało z któregokolwiek z poprzednich zastrzeżeń, w którym przeciwciało skierowane przeciw HER2 jest przeznaczone do podawania jako dawka nasycająca 840 mg, a następnie 420 mg co 3 tygodnie. 14. Przeciwciało z jednego lub więcej z zastrzeżeń 1 do 12, w którym przeciwciało skierowane przeciw HER2 jest przeznaczone do podawania jako dawka 1050 mg podawana co 3 tygodnie.

76 Przeciwciało z któregokolwiek z poprzednich zastrzeżeń, w którym gemcytabina jest przeznaczona do podawania w dawce od 600 mg/m 2 do 1250 mg/m 2 w dniach 1 i 8 z 3-tygodniowego cyklu. 16. Przeciwciało z któregokolwiek z poprzednich zastrzeżeń, w którym gemcytabina jest przeznaczona do podawania przed lub po podawaniu przeciwciała skierowanego przeciw HER Przeciwciało z zastrzeżenia 16, w którym przedział czasowy pomiędzy co najmniej jednym podawaniem gemcytabiny i co najmniej jednym podawaniem przeciwciała skierowanego przeciw HER2 wynosi 1 miesiąc lub mniej. 18. Przeciwciało z zastrzeżenia 17, w którym przedział czasowy pomiędzy co najmniej jednym podawaniem gemcytabiny i co najmniej jednym podawaniem przeciwciała skierowanego przeciw HER2 wynosi około 2 tygodnie lub mniej. 19. Przeciwciało z któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do 15, w którym gemcytabina i przeciwciało skierowane przeciw HER2 przeznaczone do podawania jednocześnie pacjentowi, w jednym preparacie lub odrębnych preparatach. 20. Przeciwciało z zastrzeżenia 1 lub 2, w którym w raku nie zachodzi nadekspresja HER Przeciwciało z któregokolwiek z poprzednich zastrzeżeń, w którym sposób ponadto obejmuje podawanie pacjentowi drugiego środka chemioterapeutycznego. 22. Przeciwciało z zastrzeżenia 21, w którym drugi środek chemioterapeutyczny jest wybrany z grupy składającej się z taksanu, kapecytabiny, środka chemioterapeutycznego opartego na platynie, antracykliny, liposomalnej doksorubicyny, topotekanu, pemetreksedu, alkaloidu vinca i TLK Przeciwciało z któregokolwiek z poprzednich zastrzeżeń, w którym leczenie kombinacją gemcytabiny i przeciwciała skierowanego przeciw HER2 prowadzi do synergistycznej, lub większej niż sumaryczna, korzyści dla pacjenta. 24. Przeciwciało z któregokolwiek z poprzednich zastrzeżeń, w którym przeciwciało skierowane przeciw HER2 jest przeciwciałem nagim. 25. Przeciwciało z któregokolwiek z poprzednich zastrzeżeń, w którym przeciwciało skierowane przeciw HER2 jest przeciwciałem nienaruszonym. 26. Przeciwciało z któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do 24, w którym przeciwciało skierowane przeciw HER2 jest fragmentem przeciwciała, zawierającym region wiążący antygen. 27. Przeciwciało z któregokolwiek z poprzednich zastrzeżeń, w którym rak jest rakiem jajnika. 28. Przeciwciało z któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do 26, w którym rak jest rakiem pierwotnym otrzewnej. 29. Przeciwciało z któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do 26, w którym, rak jest rakiem jajowodów.

77 Przeciwciało skierowane przeciw HER2, które wiąże się z heterodimerycznym miejscem wiązania na HER2, do stosowania w sposobie leczenia raka opornego na platynę wybranego z grupy składającej się z raka jajnika, pierwotnego raka otrzewnej i raka jajowodów, który to sposób obejmuje podawanie pacjentowi przeciwciała skierowanego przeciw HER2, i gemcytabiny, każde w ilości skutecznej do leczenia raka, w którym przeciwciało HER2 blokuje heterodimeryzację HER2 z EGFR lub HER Przeciwciało skierowane przeciw HER2, które wiąże się z Domeną II HER2, do stosowania w sposobie leczenia raka opornego na platynę wybranego z grupy składającej się z raka jajnika, pierwotnego raka otrzewnej i raka jajowodów, obejmującym podawanie pacjentowi przeciwciała skierowanego przeciw HER2, i gemcytabiny, każdego w ilościach skutecznych do leczenia raka, w którym przeciwciało skierowane przeciw HER2 blokuje heterodimeryzację HER2 z EGFR lub HER Przeciwciało z zastrzeżenia 31, które wiąże się w miejscu połączenia pomiędzy domenami I, II i III HER Zastosowanie przeciwciała skierowanego przeciw HER2 z któregokolwiek z poprzednich zastrzeżeń, do wytwarzania leku do leczenia raka opornego na platynę, wybranego z grupy składającej się z raka jajnika, pierwotnego raka otrzewnej i raka jajowodów, sposobem określonym w którymkolwiek z poprzednich zastrzeżeń. Iwona Płodzich-Hennig Rzecznik patentowy

78 - 77 -

79 - 78 -

80 - 79 -

81 - 80 -

82 - 81 -