Nowoczesne systemy ekspresji genów. Ekspresja białek w komórkach owadzich

Transkrypt

1 Nowoczesne systemy ekspresji genów Ekspresja białek w komórkach owadzich

2 Ekspresja białek w komórkach owadzich Spodoptera frugiperda dawca komórek z których wyprowadzono linie komórkowe Sf9 i Sf21 wykorzystywane w owadzich liniach komórkowych

3 Ekspresja białek w komórkach owadzich Systemy ekspresji białek heterogenicznych w wyselekcjonowanych liniach komórek owadzich Sf9 były pierwszymi systemami, które zrewolucjonizowały ekspresję białek

4 Ekspresja białek w komórkach owadzich Stało się to dzięki ich przewadze nad prokariotycznymi i drożdżowymi systemami ekspresji białek polegającej na: - zapewnieniu mechanizmów postranslacyjnej modyfikacji białek charakterystycznych dla komórek eukariotycznych - możliwości badania interakcji białek wystawianych na powierzchni komórek owadzich z innymi białkami, - możliwości ekspresji białek postranslacyjnie zmodyfikowanych do pożywki hodowlanej

5 Ekspresja białek w komórkach owadzich Ekspresja przejściowa Ekspresja stała Systemy bakulowirusowe

6 Ekspresja przejściowa Transient expressions Systems, TES w systemie tym ekspresja białek zachodzi tylko przez ściśle określony okres czasu Komórki owadzie są transfekowane ekspresyjnym wektorem plazmidowym nie posiadającym markera selekcyjnego, co prowadzi do jego utraty już po kilku kolejnych pasażach tej linii komórkowej

7 Ekspresja ciagła CES Countinuous Expression Systems in stably transfected cell lines, CES - w systemie uzyskujemy stabilne linie komórkowe umożliwiające ekspresję białek heterogenicznych

8 Ekspresja ciagła CES System CES różni się od TES, iż równolegle z transfekcją ekspresyjnym wektorem plazmidowym, przeprowadza się także transfekcje z wektorem plazmidowym niosącym marker selekcyjny, taki jak gen oporności na neomycynę Koegzystencja obu wektorów w komórkach poddanych presji wynikającej z obecności w pożywce neomycyny, umożliwia zachowanie zdolności linii rekombinantowych komórek nawet po 50 pasażach, co umożliwia akumulację dużej ilości rekombinowanego białka

9 Transfekcja komórek eukariotycznych Transfekcja (def.) - proces wprowadzenia obcego DNA lub RNA do komórki (częściej eukariotycznej, rzadziej prokariotycznej) Transdukcja (def.) - proces wprowadzenia nowego genu do komórki przez wirusa

10 Metody transfekcji komórek eukariotycznych 1. Metody chemiczne transfekcja kompleksami DNA z fosforanem wapnia lipofekcja - transfekcja liposomami zawierającymi DNA lub RNA 2. elektroporacja - transfekcja przy pomocy krótkotrwałego szoku elektrycznego w roztworze zawierającym kwas nukleinowy. Szok elektryczny powoduje przejściowe utworzenie mikroporów w błonie komórkowej, przez które może się dostać DNA lub RNA.

11 Metody transfekcji komórek eukariotycznych 3. Pocisk genowy - transfekcja balistyczna - wstrzeliwanie do wnętrza komórki mikrokulek złota opłaszczonych DNA (metoda przeznaczona głównie przy transfekcji komórek roślin i zwierząt, konstrukcja GMO) 4. Mikronastrzyknięcie roztwór DNA jest wstrzykiwany bezpośrednio do jądra komórkowego, lub w przypadku RNA do cytoplazmy, przy pomocy specjalnie spreparowanej szklanej kapilary.

12 Wektory plazmidowe systemów TES i CES W sytemach TES i CES wykorzystuje się te same wahadłowe plazmidowe wektory ekspresyjne Do najczęściej wykorzystywanych wektorów należą wektory plazmidowe z rodzin piex i pbiex firmy Novagen

13 Wektory plazmidowe systemów TES i CES Wektory serii piex zawierają wczesny bakulowirusowy promotor ie1, oraz jego natywny terminator ie1 Sygnał transkrypcyjny z promotora ie1 jest wzmocniny sekwencją bakulowirusowego wzmacniacza transkrypcji enhancer hr5

14 Wektory plazmidowe systemów TES i CES Z elementów prokariotycznych ta seria wektorów wahadłowych zawiera: Ori puc zapewnia wysoką ilość kopii plazmidu w E. coli, potrzebną do uzyskania wystarczającej masy DNA potrzebnego na etapie transfekcji komórek eukariotycznych Prokariotyczny marker selekcyjny, gen oporności na ampicylinę Amp (bla)

15 Wektory plazmidowe systemów TES i CES

16 Wektory plazmidowe systemów TES i CES Wektory serii pbiex są wektorami wahadłowymi umożliwiającymi prowadzenie ekspresji białek wklonowanych w MCS w dwóch systemach ekspresyjnych

17 Wektory plazmidowe systemów TES i CES 1. Dzięki obecności prokariotycznych elementów regulacji ekspresji takich jak promotor T7lac, terminator T7, genu represora laci można wykorzystywać wektory plazmidowe pbiex do ekspresji genów w sytemieie pet E. coli

18 Wektory plazmidowe systemów TES i CES 2. Dzięki obecności eukariotycznych elementów regulacji ekspresji, promotora i terminatora ie1 wektory te umożliwiają również ekspresję w komórkach owadzich linii Sf9 i Sf2

19 Wektory plazmidowe systemów TES i CES 3. Prokariotyczne ori replikacji i markery selekcyjne są identyczne jak w wektorach serii piex

20 Wektory plazmidowe systemów TES i CES

21 pie1-neo, wektor plazmidowy używany w konstrukcji stabilnych lini komórkowych Sf9 w systemie CES pie1-neo Wektor pie1-neo jest wektorem serii piex z wklonowanym genem oporności na neomycynę W celu uzyskania stabilnych ekspresyjnych linii Sf9 w CES należy dokonać kotransfekcji dwoma wektorami plazmidowymi tj. plazmidem pie1-neo i plazmidem serii piex lub pbiex z wklonowanym genem, którego ekspresję chcemy uzyskać w CES Następnie pasażować linie komórkowe na pożywkach zawierających antybiotyk G-418

22 Bakulowirusy

23 Bakulowirusy Gospodarzami dla bakulowirusów są rózne gatunki bezkręgowców między innymi owady Nie są zagrożeniem dla kręgowców, ani dla roślin

24 Bakulowirusy Genom jest kowalencyjnie zamknięty, podwójnoniciowy ok.134 kbp, dzieki temu można wstawiać duże fragmenty obcego DNA

25 Bakulowirusy Dzielą się na dwie grupy nukleopolihedrowirusy (NPV) granulowirusy

26 Bakulowirusy Bakulowirusy powielanie w komórkach owadzich Możliwość modyfikacji białek, jak w wyższych organizmach eukariotycznych Promotory bakulowirusowe są nieaktywne w komórkach ssaczych

27 Bakulowirusowy system ekspresyjny Rekombinowane bakulowirusy są stosowane jako wektory do produkcji białek heterologicznych Geny heterologiczne klonowane są pod silny promotor polihedrynowy Autographa californica polyhedrosis virus (AcNPV) Transpozycja kasety ekspresyjnej z wirusa do genomu komórek owadzich

28 Hodowla komórek owadzich Temperatura C ph Napowietrzanie

29 Typy hodowli Monowarstwa Zawiesina

30 Typy owadzich linii ekspresyjnych cells Doubling time Cell appearance Medium Origin Type of culture Sf 9 72 hrs Spherical, granular, regular in size, firm attachment to surface TNM-FH IPLBSF-21 cell lines of the fall army worm spodoptera frugiperda Grow well as monolayer and suspension Sf hrs Spherical, granular, different in size, firm attachment to surface TNM-FH IPLBSF-21 cell lines of the fall army worm spodoptera frugiperda Grow well as monolayer and suspension High-five 18 hrs Spherical, granular, regular in size, loose attachment to surface Express five SFM Ovarian cells of cabbage looper Grow well as monolayer, also as suspension

31 Ekspresja genów w komórkach owadzich z zastosowaniem systemu pbacvector Wektory bakulowirusowe systemu pbacvector są pochodnymi bakulowirusa AcNPV ćmy z gatunku Autograpfa californica

32 Ekspresja genów w komórkach owadzich z zastosowaniem wektorów bakulowirusowych pbacvector Uzyskanie rekombinantowych stabilnych linii komórkowych Sf9 z użyciem wektorów bakulowirusowych wymaga użycia wektora transferowego pbac lub pbacgus

33 Wydajność kotransfekcji > 95%

34 BacVector Triple Cut Virus DNA BacVector Triple Cut Virus DNA jest dostarczany w postaci defektywnego wirusa powstałego poprzez trawienie specyficzną nukleazą bakulowirusa AcNPV niosącego gen IacZ pod promotorem polh Promotor polh Gen 1629

35 Bakulowirusowe plazmidowe wektory transportowe Bakulowirusowe plazmidowe wektory transportowe serii pbac zapewniają : Wysoki poziom ekspresji białek rekombinantowych z wektora bakulowirusowego w postaci fuzji umożliwiających detekcje i oczyszczanie tych białek Opcjonalnie przy zastosowaniu wektorów pbacgus, ułatwiają selekcję rekombinantowych komórek dzięki obecności genu gus kodującego enzym - glukuronidazę

36 Bakulowirusowe plazmidowe wektory transportowe serii pbac Poprzez dobór różnych plazmidów transportowych można wybierać promotory inne niż polh, które umożliwiają ekspresję w późniejszych etapach cyklu rekombinantowych bakulowirusów z serii BacVector Przez dobór odpowiednich plazmidowych wektorów transportowych istnieje możliwość zapewnienia transport białka rekombinantowego na zewnątrz komórki lub na jej powierzchnię

37 Bakulowirusowe plazmidowe wektory transportowe pbacgus elementy genetyczne 1629, 603, lef-2 umożliwiają rekombinację homologiczną z DNA baculowirusowego wektora serii BacVector Gen markerowy gus znajduje się pod kontrolą konstytutywnego eukariotycznego promotora P 6.9

38 Bakulowirusowe plazmidowe wektory transportowe pbacsurf-1 wektor ten pozwala na wystawienie eksprymowane białko rekombinantowe na zewnątrz komórki owadziej lub dojrzałego bakulowirusa, odbywa się to poprzez jego fuzję z domeną kotwiczącą bakulowirusowego białka gp64

39 Bakulowirusowe plazmidowe wektory transportowe

40 Oczyszczanie białek rekombinantowych eksprymowanych w komórkach owadzich Liza komórek owadzich przebiega łatwo w buforach fosforanowych, z dodatkiem łagodnych detergentów Białka oczyszczamy z zastosowaniem klasycznych technik takich jak, precypitacja siarczanem amonu, chromatografia jonowymienna, chromatografia powinowactwa etc.

41 QIAgenes Expression Kits Insect/Mammalia

42 QIAgenes Expression Kits Insect/Mammalia Układ stosowany do ekspresji białek na wysokim poziomie w układach - Komórki owadzie - Komórki ssacze - W owadzich lub ssaczych systemach expressji białek in vitro Białka rekombinowane z domeną fuzyjną 10xHis na C terminalnym końcu

43 QIAgenes Expression Kits Insect/Mammalia

44 QIAgenes Expression Kits Insect/Mammalia Cel: Qiagen i Geneart stwotrzyło platformę do optymalizacji ekspresji genów w systemach komórek owadzich i ssaczych - Poprawa Codon Usage - Zmiana zawartości GC przedłużenie czasu życia mrna - Usunięcię wewnętrznych struktur polia - Usunięcie intronów - Usunięcie struktur II rzędowych RNA w rejonach inicjacji translacji - Usunięcie elmentów niestabilnych w mrna sekwencji ARES (bogatych w U i A) - Usunięcie sekwencji repetytywnych

45 QIAgenes Expression Kits Insect/Mammalia Przykłady zmian sekwencji genu syntezy genów określonych białek

46 QIAgenes Expression Kits Insect/Mammalia Schemat funkcjonowania Bioinformatycznej pltformy GeneArt

47 QIAgenes Expression Kits Insect/Mammalia Oczyszczanie białek po ekspresji w systemie in vitro w lizacie komórek owadzich w systemie chromatografii Ni-NTA CL- lizat po ekspresji białka S1 płukanie P białko związane z Ni-NTA Magnetic agarose S2 białko po elucji z Ni-NTA W kolejne frakcje płukania białka w większej skali oczyszczania E eluaty z oczyszczonym białkiem

48 QIAgenes Expression Kits Insect/Mammalia BacMagic Tworzenie wirusa rekombinantowego Nasz konstrukt

49 QIAgenes Expression Kits Insect/Mammalia Schemat postępowania tworzenie bakulowirusa zawierającego rekombinantowe DNA Rozhodowanie komórek owadzich Przygotowanie mieszaniny do transfekcji Transfekcja komórek mieszaniną

50 QIAgenes Expression Kits Insect/Mammalia Etap II amplifikacja wirusa rekombinantowego Inkubacja 5 dni Zebranie medium z wirusami 200 ml hodowli komórek Sf9 +0,5 ml zawiesiny wirusów (amplifikacja wirusa)

51 QIAgenes Expression Kits Insect/Mammalia Etap III ocena miana wirusa Plaque Assay Liczenie łysinek w hodowli komórek owadzich

52 QIAgenes Expression Kits Insect/Mammalia Etap IV Ekspresja białka w komórkach owadzich Rozhodowanie komórek owadzich Dodanie rekombinowanego wirusa w medium Zbieranie komórek po 24, 48, 72 i 96 h w celu zbadania wydajności ekspresji białka Lub supernatantu jeśli białko jest wydzielane na zewnątrz komórek Analiza ekspresji białka z użyciem SDS-PAGE

53 Bac to bac

54 Bac to bac Idea systemu (Invitrogen) Bacteria to Baculovirus 1. Konstrukcja plazmidu 2. Transformacja do E. coli DH10Bac (zawiera plazmid Bacmid DNA wirusa na plazmidzie) 3. Rekombinancja naszego plazmidu in vivo w E.coli selekcja na podstawie insercji w LacZ

55 Bac to Bac II Etap izolacja Bacmidu i transfekcja komórek owadzich Powstają wirusy rekombinantowe

56 Bac to Bac Etap III (jak poprzednio) - Namnożenie wirusa - Plaque assay

57 Bac to bac Schemat postępowania

58 Bac to bac Przykład wektora docelowego Zmiana ATG an ATT przesunięcie inicjacji translacji Usuwanie domeny His6 z użyciem proteazy TEV (Tobacco Etch Virus)

59 Bac to bac Miejsce integracji w Bacmidzie Transpozycja (rekombinancja) jest mozliwa dzięki plazmidowi pomocniczemu (helper) kodującemu białka odpowiedzialne za rekombinację miejscowo-specyficzną rejonu atttn7

60 Bac to bac Dual system klonowanie 2 białek do jednego wirusa pfast Bac Dual Miejsca rekombinacji z Bacmidem MCS 1 MCS 2 Miejsca rekombinacji z Bacmidem

61 BaculoDirect GST Gateway Expression Kit

62 BaculoDirect GST Gateway Expression Kit Idea systemu DNA bakulowirusa Gen docelowy wklonowany do plazmidu z sekwencjami aatl Rekombinacja in vitro Katalizowana przez LR Clonase II Rekombinacja in vitro Katalizowana przez LR Clonase II

63 BaculoDirect GST Gateway Expression Kit Clonase II Clonase to mieszanina bałek Int integrazy Oraz IHF (integration host factor) Białek odpowiedzialnych za integrację faga Lambda do genomu E. coli

64 BaculoDirect GST Gateway Expression Kit Działanie enzymu Clonase

65 BaculoDirect GST Gateway Expression Kit Schemat postępowania

66 BaculoDirect GST Gateway Expression Kit Schemat postępowania

67 BaculoDirect GST Gateway Expression Kit Schemat postępowania

68 BaculoDirect GST Gateway Expression Kit Wektor Firma Invitrogen skonstruowala serię wektorów w technologi Tzw. Gateway Gdzie elementem wspólnym jest obecność rejonów attl1 i attl2 rozpoznawanych przez Clonase i przenoszonych do innych układów ekspresyjnych

69 BaculoDirect GST Gateway Expression Kit DNA bakulowirusa miejsce integracji

70 BaculoDirect GST Gateway Expression Kit Struktura kasety eskpresyjnej regionu po rekombinacji z DNA wirusa Domena GST Oczyszczanie białka

71 Patent GENERATION OF RECOMBINANT INFLUENZA VIRUS USING BACULOVIRUS DELIVERY VECTOR WO (A1)

72 Patent Wirus grypy A lub B ssrna nt Koduje : 8 białek struktury i geny regulacyjne NS1, NS2 Zalety zastosowania bakulowirusa w badaniach nad wirusem grypy to brak możliwości infekcji komórek ssaczych Możliwość klonowania do bakulowirusa nawet 38 kpz sklonowanie całego genomu wirusa grypy

73 Patent System bakulowirusowy pozwolił na badanie pojedynczych genów wirusa, jak i ich kombinacji Uzyskany bakulowirus przenosił wirusa lub jego mutanty i pozwolił na badanie odtwarzalności wirusa grypy w komórkach ssaczych Vero

74 Patent Wirus grypy

75 Patent Schemat postępowania Izolacja wirusowego ssrna ssrna cdna Wektor Wektor Modyfikacje genomu wirusa (delecje) Konstrukcja różnych mutantów wirusa grypy (delecja regionów)

76 Patent Plazmidy z mutacjami wirusa grypy + DNA bakulowirusa Transfekcja komórek owadzich Uzyskano różne bakulowirusy rekombinantowe Izolacja DNA bakulowirusów rekombinantowych Transfekcja DNA do komórek ssaczych VERO

77 Patent Badanie uzyskanych mutantów wirusa grypy pod względem rejonów odpowiedzialnych za inwazyjność i regulację namnażania się wirusa