Regulacja ekspresji operonu ksylozowego

Transkrypt

1 Bacillus spp.

2 Bacillus spp. A - komórka Bacillus megaterium pod mikroskopem B zdjęcie komórek B.megaterium rosnących w postaci długich łańcuszków. Mikroskopia skaningowa. (Visuals Unlimited) C kolonie B.megaterium na płytce z agarem

3 Operon ksylozowy

4 Regulacja ekspresji operonu ksylozowego Regulatorową cząsteczką dla operonu xyl jest białko represorowe, kodowane przez gen xylr. Represor XylR pod nieobecność ksylozy wiąże sie z 25-nukleotydową sekwencją operatora (xylo) zapobiegając w ten sposób transkrypcji operonu xyl. Jeśli ksyloza występuje w pożywce, dochodzi do allosterycznej zmiany konformacji białka represorowego w wyniku jego reakcji z cząsteczką induktora, co skutkuje utratą powinowactwa represora do sekwencji operatorowej i w konsekwencji dochodzi do transkrypcji genów strukturalnych operonu.

5 Zalety Organizm GRAS (generally regarded as safe) Możliwość produkcji wielu białek do pożywki Bakterie dobrze scharakteryzowane (znany genom B. subtilis i B. licheniformis) Rośnie na ubogich podłożach Wysoka stabilność plazmidów używanych do transfomacji

6 Ograniczenia Preferowana ekspresja homologiczna: geny pochodzące z Bacillus sp. produkowane z dużą wydajnością (skala produkcji białek gram/litr) nniewydajna ekspresja białek eukariotycznych (skala produkcji białek mg/litr)

7 Klonowanie w B. subtilis pub110 Klonowanie w B. subtilis (plazmid pochodzi z S. aureus) kopii na komórkę Oporność na neoomycynę (w E. coli) Oporność na kanamycynę i neomycynę może być inaktywowana przez insercję w miejsca BglII i/lub BanI

8 Bacillus megaterium - MoBiTec Stabilna i wydajna ekspresja homologicznych i heterologicznych genów Ściśle regulowany za pomocą indukcyjnego operonu ksylozowego Brak enzymów proteolitycznych Możliwość produkcji białek wewnątrz i na zewnątrz komórki Wygodne systemy oczyszczania (6xHis-tag, Strep-tag, Strep/6xHis double-tag)

9 Bacillus megaterium - MoBiTec Kompatybilność wektorów stosowanych do transformacji Bacillus subtilis Brak endotoksyn w ścianie komórkowej bakterii Stabilna replikacja wektorów plazmidowych Niskie wymagania pokarmowe oraz łatwa hodowla drobnoustroju

10 pwh1520 wektor wahadłowy (E. coli/b.megaterium) TetR gen warunkujący oporność na tetracyklinę; AmpR gen oporności na ampicylinę; XylR represor funkcjonalnie zależny od ksylozy; XylA fragment genu izomerazy ksylozowej; PA promotor operonu xyla; MCS miejsce wielokrotnego klonowania; pbc16 ori origin replikacji dla Bacillus; pbr ori ColE1 origin replikacji Brak możliwości naturalnej transformacji Konieczność przeprowadzania transformacji protoplastów (Puyet et al.1987) Konieczność używania lizozymu do dezintegracji komórek

11 Możliwości klonowania Klonowanie do wektora pwh1520 insertu zawierającego własną sekwencję RBS (ribosome binding site) oraz kodon inicjacji translacji transkrypcja klonowanego genu jest niezależna od ekspresji białka izomerazy ksylozowej (XylA) i kończy sie dopiero na kodonie terminalnym obecnym w ramce odczytu translacja genu targetowego w tym przypadku jest sprzężona z translacją genu xyla, co może znacznie obniżać wydajność produkcji białka rekombinantowego 5 3 pwh1520 P xyla xyla MCS insert gen RBS stop

12 Możliwości klonowania wprowadzenie insertu z kodonem STOP klonowanie w dowolne miejsce restrykcyjne w obrębie genu xyla obecność kodonu terminalnego oraz kodonu START genu targetowego położonych blisko siebie zwiększa koncentrację rybosomów w tym obszarze, co w konsekwencji podnosi wydajność ekspresji białka rekombinantowego 5 3 pwh1520 P xyla xyla MCS insert gen RBS stop

13 Możliwości klonowania Możliwość wklonowania do ramki odczytu xyla wyłącznie sekwencji interesującego nas genu (uzyskuje się w taki sposób białko fuzyjne posiadające na N-końcu fragment białka izomerazy ksylozowej składający się z około 90 reszt aminokwasowych) 5 3 pwh1520 P xyla xyla MCS insert gen RBS stop

14 Plazmid pwh1520 Posiada również dwa markery selekcyjne: gen kodujący β-laktamazę eksprymowany jest wyłącznie w komórkach E. Coli gen tet Bacillus megaterium, warunkujący oporność na tetracyklinę Posiada dwa origin replikacji ori pbc16 (pochodzące z plazmidu występującego w komórkach Bacillus cereus) ori pbr (zapewniające inicjację replikacji wektora w komórkach Escherichia coli)

15 Inne wektory phis1522 i phis1525 pmm1522 i pmm1525 pstrep1525 i pstrephis1525 pochodne wektora pwh1520

16 Wektory phis1522 i phis1525 Klonowanie do wektorów phis1522 i phis1525 umożliwia uzyskanie fuzji transkrypcyjnej lub translacyjnej Obecność domen polihistydynowych, ułatwiających oczyszczanie i detekcję syntetyzowanych białek

17 Wektory phis1522 i phis1525 Obecność sekwencji sygnalnej w plazmidzie phis1525,kodującej esterazę zewnątrzkomórkową (LipA) Bacillus subtilis warunkuje zdolność do sekrecji eksprymowanego białka poza komórkę Dodatkowe miejsce cięcia dla enzymu BsrGI umieszczone przed kodonem inicjatorowym pozwala na klonowanie bez zmiany N-końcowej sekwencji białka

18 phis1522 TetR gen warunkujący oporność na tetracyklinę w komórkach B. megaterium (TetR brak oporności); AmpR gen oporności na ampicylinę eksprymowany w komórkach E. coli XylR represor ksylozowy orf1 - otwarta ramka odczytu, znajdująca sie pod kontrolą promotora Pxyl PxylA promotor operonu xyla MCS miejsce wielokrotnego klonowania repu - gen odpowiedzialny za replikacje plazmidu pbc16 ori origin replikacji dla B. megaterium pbr ori origin replikacji dla E. coli

19 Dodatkowe miejsce cięcia dla enzymu BsrGI umieszczone przed kodonem inicjatorowym pozwala na klonowanie bez zmiany N- końcowej sekwencji białka Wektory phis1522 i phis1525 A - sekewncja MCS dla wektora phis1522; B sekwencja MCS dla wektora phis1525. SP lipa -sekwencja sygnalna, kodująca esterazę zewnątrzkomórkową; 6xHis-domena polihistydynowa

20 Wektory pstrep1522 i pstrep-his1525 posiadają domenę Strep-tag, umożliwiającą oczyszczanie białek rekombinantowych wektor pstrep-his1525 posiada również domenę polihistydynową (w zależności od wybranej strategii klonowania możliwe jest otrzymanie białka zawierającego obie domeny fuzyjne, co pozwala na dwustopniowe oczyszczanie produktu) w obrębie MCS wektorów pstrep1522 i pstrep-his1525 również występuje sekwencja esterazy zewnątrzkomórkowej LipA odpowiedzialnej za ekspresję białka poza komórkę

21 pstrephis1525 TetR (Bac) gen warunkujący oporność na tetracyklinę, eksprymowany jest w komórkach B.megaterium, (TetR brak oporności); AmpR (E.coli) gen oporności na ampicylinę eksprymowany jest w komórkach E.coli; XylR represor ksylozowy orf1-otwarta ramka odczytu,znajdująca sie pod kontrolą promotora Pxyl PxylA promotor operonu xyla MCS miejsce wielokrotnego klonowania repu -gen odpowiedzialny za replikacje plazmidu pbc16 ori origin replikacji dla Bacillus; pbr ori ColE1 origin replikacji 6xHis - domena polihistydynowa; Strep-Tag - domena srep-tag

22 pstrep1522 i pstrep-his1525 A - sekewncja MCS dla wektora pstrep1522; B sekwencja MCS dla wektora pstrep- HIS1525. SP lipa - sekwencja sygnalna, kodująca esterazę zewnątrzkomórkową; 6xHis - domena polihistydynowa

23 Zalety wektorów wahadłowych B.megaterium/E.coli Stabilna i wydajna ekspresja w komórkach B.megaterium Operon ksylozowy pozwala na ścisłą regulację syntezy białka Możliwość dwukierunkowego klonowania w związku z obecnością sekwencji polilinkera skierowanego w przeciwna stronę do promotora Pxyl

24 Zalety wektorów wahadłowych B.megaterium/E.coli Kilka strategii klonowania Możliwość sekrecji eksprymowanego białka poza komórkę Łatwe oczyszczanie białek ze względu na obecność domen fuzyjnych 6xHis-tag, Strep-tag oraz Strep/6xHis double-tag

25 Bacillus licheniformis Brak egzoproteaz Ekspresja białek heterogenicznych: Interleukin-3EGF Esteraza z Pseudomonas sp. Ekspresja białek homologicznych: B. stearothermophilus xylanase Esteraza naproxenu Amylazy Proteazy

26 Białka eksprymowane w Bacillus spp. B. megaterium: siałko kontroli katabolicznej CcpA [Siedel i wsp., 2005] represor ksylozowy XylR [Rygus,1991] represor trehalozy TreR [Burklen i wsp., 1998] termostabilne białko HpR z PTS (szlaku transportu cukrów z udziałem fosfotransferazy) [Kraus i wsp., 1998] mutarotaza Mro [Rygus, Hillen, 1991] dehydrogenaza glukozowa Gdh [Rygus, Hillen, 1991] β galaktozydaza [ Rygus, Hillen, 1991] ludzka jednoniciowa urokinaza-aktywator plazminogenu rscupa [Rygus, Hillen, 1991] toksyna A Clostridium difficile [ Burger i wsp., 2003] acylaza penicylinowa [Rygus, Hillen, 1991] witamina B12

27 Expression systems for commercial production of cellulase and xylanase in Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis

28 Inne systemy - Staphylococcus carnosus (Artes) Niepatogenna bakteria Gram+ Możliwość sekrecji białka do pożywki Brak proteaz Stabilność genetyczna