(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (13) (1) T3 Int.Cl. C12N 1/ (06.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 12/29 EP B1 (4) Tytuł wynalazku: Oparty na FACS i białku reporterowym układ do wysokowydajnego opracowywania białek terapeutycznych () Pierwszeństwo: US P US P (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 09/23 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 12/12 (73) Uprawniony z patentu: Genzyme Corporation, Cambridge, US (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 CHRISTINE DEMARIA, Franklin, US SCOTT ESTES, Framingham, US KENNETH P. KAREY, Bolton, US VICTOR CAIRNS, Worcester, US (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Magdalena Tagowska PRZEDSIĘBIORSTWO RZECZNIKÓW PATENTOWYCH PATPOL SP.Z O.O. ul. Nowoursynowska 162 J Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 Opis POWIĄZANE ZGŁOSZENIA [0001] Niniejsze zgłoszenie korzysta z pierwszeństwa zgłoszenia tymczasowego US 60/847,70, dokonanego 27 września 06 r. oraz zgłoszenia tymczasowego US 60/846,223, dokonanego września 06 r. Całą treść powyższych zgłoszeń uważa się za zawartą niniejszym na drodze odniesienia. DZIEDZINA WYNALAZKU [0002] Ogólnie niniejszy wynalazek dotyczy wysokowydajnych układów do identyfikacji klonów o wysokim poziomie wytwarzania przydatnych w produkcji białek do celów terapeutycznych i diagnostycznych TŁO WYNALAZKU [0003] Komercyjne wytwarzanie białek terapeutycznych wymaga stabilnej rekombinantowej linii komórkowej charakteryzującej się wysokim poziomem ekspresji. Dotychczas znane w stanie techniki metody opierały się na liniach komórkowych jajnika chomika chińskiego (CHO, ang. Chinese Hamster Ovary) pozbawionych reduktazy dihydrofolianowej (DHFR), z których wyprowadzano linie komórkowe wytwarzające białko (białka). Wysoko wydajne klony są otrzymywane po kilkukrotnej selekcji puli namnożonych transfekowanych komórek przy użyciu takich czynników jak metotreksat (MTX). Taki proces jest bardzo czasochłonny, wymaga dużego nakładu pracy i nie gwarantuje specyficznej identyfikacji wysoko wydajnych klonów wytwarzających białko. [0004] W celu optymalizacji procesu otrzymywania i selekcji wydajnych linii komórkowych CHO zastosowano cytometrię przepływową lub FACS. Technologia ta umożliwiła szybką identyfikację wysoko wydajnych klonów i ich izolację z heterogennej populacji transfekowanych komórek. Jej zastosowanie pozwoliło na zmniejszenie nakładu pracy oraz nakładu czasu nieodłącznie związanych z tradycyjnymi technikami subklonowania oraz na identyfikację pożądanych komórek bez potrzeby stosowania kilkukrotnego namnażana i selekcji za pomocą MTX. [000] Wprawdzie za pomocą technik sortowania opartych o technikę FACS można wyizolować populacje klonalne, jednakże izolacja wysokowydajnej i jednocześnie stabilnej linii komórkowej wymaga prowadzenia badania przesiewowego odpowiednio dużej liczby klonów, co ciągle wiąże się ze sporym nakładem czasu. Dlatego na tym etapie wyprowadzania linii komórkowej nadzwyczaj korzystny byłby wydajny i precyzyjny sposób przesiewania (skriningu) klonów. Korzystne jest również wprowadzenie przesiewania już na etapie hodowli na 96-dołkowej płytce, ponieważ pozwala to na ograniczenie dalszego namnażania wyłącznie do klonów o wysokiej wydajności ekspresji. Zazwyczaj do identyfikacji klonów wydzielających wydajnie terapeutyczne białko wykorzystywane są próbki pożywki hodowlanej pobierane znad hodowli komórkowych klonów. Sposób ten nie jest optymalny i nie uwzględnia ani różnicy w gęstości komórek, ani różnicy w objętości pożywki między poszczególnymi dołkami. Posługując się tym sposobem nie można precyzyjnie przewidzieć, które dokładnie klony charakteryzuje wysoka wydajność i wysokie miano. Często też dla każdego nowego białka terapeutycznego będącego przedmiotem zainteresowania trzeba opracować nowy sposób testowania. [0006] Dlatego też w dziedzinie istnieje zapotrzebowanie na kompozycje i sposoby przesiewania populacji klonalnych w celu selekcji rekombinantowych linii komórkowych wydajnie wytwarzających białka będące przedmiotem zainteresowania. Niniejszy wynalazek wypełnia tę potrzebę, a także dostarcza innych korzyści. [0007] WO 01/7212 ujawnia sposób identyfikacji komórki gospodarza o kontrolowanej ekspresji testowanego genu przez dostarczenie wielu komórek gospodarza zawierających polinukleotyd, który zawiera w kolejności promotor podlegający regulacji, testowany gen, sekwencję IRES oraz sekwencję kodująca marker powierzchniowy, przy czym marker powierzchniowy zawiera wydzielniczą sekwencję sygnałową, 1

3 1 wykrywalne białko znakujące oraz kotwicę membranową. Ekspresja tego testowanego genu jest związana z ekspresją markera powierzchniowego w wyniku indukcji promotora i przez selekcję komórek gospodarza, które prezentują marker powierzchniowy. [0008] GAINS P i wsp. pires-cd4t, a dicistronic expression vector for MACS- or FACS-based selection of transfected cells BIOTECHNIQUES, Tom 26, nr 4, kwiecień 1999, str , ujawniają wektor plazmidowy, który kieruje wspólną ekspresją heterologicznych cząsteczek DNA oraz kasety w pozycji 3' kodującej skrócony marker CD4. Sekwencja IRES (ang. internal ribosomal entry site) wirusa zapalenia mózgu i mięśnia sercowego (ang. encephalomyocarditis virus) pośredniczy w inicjacji translacji z kasety w pozycji 3', a pod promotorem CMV (cytomegalowirusa, ang. cytomegalovirus) zachodzi ekspresja dwucistronowego tranksryptu. Medin J A i wsp.: A bicistronic therapeutic retroviral vector enables sorting of transduced CD34+ cells and corrects the enzyme deficiency in cells from Gaucher patients Blood, Tom.87, Nr, 1 marzec 1996, Str , ujawniają rekombinowany retrowirus bicistronowy, który dostarcza zarówno cdna terapeutycznej glukocerebrozydazy (GC) do leczenia choroby Gaucher'a, jak i mały mysi antygen powierzchniowy (antygen odporny na ciepło, ang. heat-stable antigen [HSA]) jako marker służący do selekcji. 2 3 STRESZCZENIE WYNALAZKU [0009] Niniejszy wynalazek definiują załączone zastrzeżenia. [00] W niniejszym wynalazku ujawniono sposoby identyfikacji, selekcji i wytwarzania populacji rekombinantowych eukariotycznych komórek gospodarza, które stabilnie wyrażają polipeptyd będący przedmiotem zainteresowania ( polipeptyd docelowy ) na wysokim poziomie odpowiednim do wytwarzania docelowego polipeptydu na dużą skalę. Eukariotyczna komórka gospodarza wykorzystywana w tych sposobach zawiera lub obejmuje rekombinowany polinukleotyd, który obejmuje element promotorowy, polinukleotyd kodujący powierzchniowy polipeptyd markerowy, polinukleotyd kodujący polipeptyd docelowy oraz polipeptyd posiadający aktywność biologiczną dowolnego polinukleotydu o sekwencji IRES (ang. internal ribosome entry site), w którym polinukleotyd o sekwencji IRES jest ulokowany w obrębie polinukleotydu rekombinowanego w taki sposób, że powierzchniowy polinukleotyd markerowy oraz polinukleotyd docelowy są przepisywane na tym samym mrna. W alternatywnym wykonaniu rekombinowany polinukleotyd obejmuje alternatywny kodon start inicjacji translacji. Alternatywny kodon start może występować razem z sekwencją IRES lub może zastępować sekwencję IRES. Do komórek gospodarza bezpośrednio lub pośrednio przyłącza się czynnik wiążący marker powierzchniowy komórki. Komórki te są następnie selekcjonowane i izolowane. Wyselekcjonowane i wyizolowane komórki są namnażane w celu uzyskania klonalnej populacji i hodowane przez pewien okres czasu. Następnie populacje klonalne są analizowane przez detekcję poziomu ekspresji markera powierzchniowego na powierzchni komórek populacji klonalnej. W wyniku tej analizy dokonuje się wyboru jednej lub kilku populacji klonalnych o wysokim poziomie ekspresji markera powierzchniowego. Wybrane populacje klonalne o wysokim poziomie ekspresji markera powierzchniowego to klonalne populacje wykazujące stabilny i wysoki za razem poziom ekspresji polipeptydu docelowego. Komórki wyselekcjonowane tymi sposobami można dalej hodować w warunkach, które umożliwiają wytwarzanie polipeptydu docelowego obecnego w komórkach gospodarza. Ponadto polipeptyd docelowy można izolować odpowiednio z komórek lub pożywek hodowlanych. [0011] Niniejszym ujawniono produkty wytworzone powyższymi sposobami oraz zestawy komponentów niezbędnych do wytwarzania białka tymi sposobami. 2

4 KRÓTKI OPIS FIGUR [0012] Fig. 1 przedstawia schemat kasety ekspresyjnej genu. W dowolnym wykonaniu niniejszego wynalazku cząsteczki DNA kodujące polipeptyd terapeutyczny oraz polipeptyd CD były połączone sekwencją IRES, co oznacza, że ulegały transkrypcji na tym samym mrna, ale ich translacja zachodziła niezależnie. [0013] Fig. 2A i 2B pokazują, że przesiewanie techniką FACS w oparciu o cząsteczkę CD pozwoliło na trafną identyfikację klonów o wysokim mianie rozpuszczalnego receptora. Komórki wysiano na sześciodołkową płytkę w ilości x komórek/1 ml. Trzeciego dnia komórki te testowano w FACS (Fig. 2A) pod kątem ekspresji CD. Równocześnie w HPLC na kolumnie z białkiem A (Fig. 2B) testowano kondycjonowaną pożywkę hodowlaną (otwarte słupki). Klony namnażano w butelkach o objętości 12 ml i przeprowadzano test miana białka (słupki cieniowane). Wyniki FACS przedstawiono w postaci słupków, które przedstawiają średnią geometryczną intensywności fluorescencji we względnych jednostkach fluorescencji (RFU). [0014] Fig. 3A i 3B pokazuje, że przesiewanie techniką FACS pod kątem obecności cząsteczki CD pozwoliło na trafną identyfikację klonów o wysokim mianie przeciwciał. Po osiągnięciu 80-90% konfluencji w dołkach na płytce 96-dołkowej, wszystkie komórki z każdego dołka przesiano do dołków na płytce 6- dołkowej. Po 7 dniach testowano zarówno komórki w FACS pod kątem ekspresji CD (Fig. 3A) jak i kondycjonowaną pożywkę w HPLC na kolumnie z białkiem A (otwarte słupki). Klony namnożono w butelkach o objętości 12 ml i przeprowadzono test miana przeciwciała (słupki cieniowane). W przypadku tych klonów, CD było wyrażane wspólnie z ciężkim łańcuchem przeciwciała, podczas gdy łańcuch lekki był wyrażany oddzielnie. Wyniki FACS są przedstawione w postaci słupków, które przedstawiają średnią geometryczną intensywności fluorescencji we względnych jednostkach fluorescencji (RFU). [001] Figury 4A do 4C prezentują ilościowe i jakościowe wyniki badania przesiewowego klonów za pomocą FACS w fazie wzrostu na płytce 96-dołkowej. Na Figurze 4A klony CHO wyrażające rozpuszczalny receptor były poddawane przesiewaniu techniką FACS w fazie wzrostu na płytce 96-dołkowej i w fazie wzrostu na płytce 6-dołkowej. Grupa wybranych klonów po badaniu przesiewowym techniką FACS w fazie wzrostu na płytce 96-dołkowej (słupki cieniowane) była bardzo podobna do grupy klonów wybranej po badaniu przesiewowym klonów w fazie wzrostu na płytce 6-dołkowej (słupki otwarte). Każdy słupek przedstawia wartość średniej geometrycznej intensywności fluorescencji we względnych jednostkach fluorescencji (RFU). Na Figurze 4B uzyskane w analizie FACS profile 2 reprezentatywnych klonów będących w fazie wzrostu na płytce 96-dołkowej i wyrażające rozpuszczalny receptor wskazują na korelację między wynikami uzyskanymi w FACS i ostatecznym mianem białka w hodowli bez zasilania prowadzonej w butelce z wytrząsaniem. Na Figurze 4C przedstawiono nałożone na siebie histogramy analizy FACS dla wyrażających IgG komórek z dwóch dołków płytki 96-dołkowej. W ten sposób pokazano jakościowe różnice między populacjami komórek o niemal identycznej intensywności fluorescencji (127. i RFU odpowiednio dla dołków 4G2 i 7G4). [0016] Na Figurze pokazano, że spadkowi wytwarzania białka terapeutycznego w komórkach towarzyszy spadek ekspresji CD. Klony na etapie wzrostu na płytce 96-dołkowej znakowano przeciwciałem anty- CD sprzężonym z PE. Wyniki te przedstawiono w porządku malejącym (słupki otwarte). Następnie klony namnażano w butelkach o objętości 12 ml i testowano ich wydajność (SPR) po 24 godzinach (cieniowane słupki). Po 24 godzinach hodowli w butelkach z wytrząsaniem komórki poddano testowi FACS znakując je przeciwciałem anty-cd sprzężonym z FITC (kropkowane słupki). Wyniki FACS są przedstawione w postaci słupków, które przedstawiają średnią geometryczną intensywności fluorescencji we względnych jednostkach fluorescencji (RFU). [0017] Figury od 6A do 6C pokazują, że przesiewanie klonów techniką FACS w oparciu o ekspresję CD pozwoliło na zidentyfikowanie klonów niestabilnych w czasie namnażania. Reprezentatywne wyniki badań 3

5 1 2 przesiewowych techniką FACS i wyniki analizy miana przeciwciał IgG pokazano dla dwóch klonów wybranych do dalszych badań w wyniku badania przesiewowego na etapie wzrostu na 96-dołkowej płytce. Klony namnażano w butelkach do hodowli z wytrząsaniem i wysiewano do niezasilanych hodowli wsadowych dni po badaniu przesiewowym na etapie wzrostu na płytce 96-dołkowej. Fig. 6A prezentuje uzyskane techniką FACS wyniki przesiewania 96-dołkowej płytki oraz początkowe miana białka w niezasilanych hodowlach w butelkach. Fig. 6B prezentuje wyniki badania przesiewowego techniką FACS prób pobranych z hodowli z wytrząsaniem (dzień 3) oraz miana przeciwciał IgG (dzień 14) po 3 dodatkowych tygodniach hodowli. Fig. 6C prezentuje wyniki badania przesiewowego techniką FACS prób pobranych z hodowli z wytrząsaniem (dzień 3) oraz miana przeciwciał IgG (dzień 14) po kolejnych 3 tygodniach hodowli. [0018] Fig. 7 prezentuje schemat kasety ekspresyjnej genu z alternatywnym kodonem start. W jednym z zastosowanych ssaczych wektorów ekspresyjnych, DNA kodujące polipeptyd CD9 zawierało alternatywny kodon start GTG dla miejsca inicjacji translacji. DNA kodujące polipeptyd terapeutyczny zawierało kodon start ATG inicjacji translacji i było ulokowane poniżej DNA kodującego białko CD9. Fragmenty DNA kodujące każdy polipeptyd były przepisywane na matrycy tej samej cząsteczki mrna. Translacja była inicjowana z miejsca start GTG lub ATG chronionego czapeczką ', przy czym to drugie miejsce było mnie wydajne, zatem translacja była inicjowana z niego z mniejszym prawdopodobieństwem. [0019] Na Fig. 8 pokazano, że zmiana kodonu start ATG powoduje obniżenie ekspresji polipeptydu CD9. Komórki CHO transfekowano kodującym CD9 wektorem ekspresyjnym zawierającym kodon start ATG lub GTG. Aby zapobiec powstaniu wewnętrznego miejsca inicjacji translacji w przypadku obu sekwencji DNA dokonano zmiany wewnętrznych kodonów ATG. Stabilne transfektanty hodowano w osobnych populacjach i analizowano pod kątem ekspresji CD9 inkubując z przeciwciałem anty-cd9 sprzężonym z FITC. Dla 2 reprezentatywnych populacji wyrażających CD9 przeprowadzono analizę FACS. W przypadku populacji z niezmienionym kodonem (ATG) CD9 wyrażało 99% komórek. Natomiast w populacji ze zmienionym kodonem (GTG) CD9 wyrażało tylko 4% komórek. Procent komórek pozytywnych dla CD9 ustalono licząc wszystkie komórki dające sygnał powyżej tła (komórki nie transfekowane). OPIS SZCZEGÓŁOWY [00] Stosowane w niniejszym dokumencie poszczególne terminy mają znaczenie zdefiniowane poniżej. 3 4 Definicje [0021] W praktyce w niniejszym wynalazku stosowano, o ile nie wskazano inaczej, konwencjonalne techniki immunologiczne, biologii molekularnej, techniki mikrobiologiczne, biologii komórki, a także techniki rekombinacyjne DNA, mieszczące się w umiejętnościach specjalisty w dziedzinie. Patrz np. Sambrook, Fritsch i Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Wyd. II (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel i wsp., (1987)); seria METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M.J. MacPherson, B.D. Hames i G.R. Taylor, (199)), Harlow i Lane, (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, and ANIMAL CELL CULTURE (R.I: Freshney, wyd. (1987)). [0022] W niniejszym dokumencie zarówno w opisie wynalazku jak i w zastrzeżeniach forma liczby pojedynczej odnosi się również do formy mnogiej tego samego rzeczownika, chyba że kontekst jednoznacznie wskazuje inaczej. Przykładowo, termin komórka obejmuje swoim znaczeniem wiele komórek w tym również ich mieszaninę. [0023] Stosowany niniejszym termin obejmujący w zamyśle oznacza, że kompozycje i sposoby obejmują szczegółowo opisane elementy składowe, ale nie wykluczają innych elementów. Wyrażenie składający się zasadniczo z stosowany do określenia kompozycji i sposobów, oznacza wyłączenie innych elementów 4

6 1 2 3 składowych o dowolnym znaczeniu dla mieszaniny/kombinacji. Zatem kompozycja definiowana w niniejszym dokumencie jako zasadniczo zawierająca określone elementy składowe może zawierać również ślady zanieczyszczeń pozostałe po izolacji i oczyszczaniu oraz farmaceutycznie dopuszczalne nośniki, takie jak roztwór buforowany fosforanem PBS, konserwanty i inne tego typu składniki. Wyrażenie składający się z oznacza wykluczenie wszystkich składników występujących w ilości większej niż ilości śladowe oraz istotne etapy w sposobie podawania kompozycji według niniejszego wynalazku. Wykonania określone przez każde z tych wyrażeń znajdują się w zakresie tego wynalazku. [0024] Stosowany niniejszym termin polinukleotyd oznacza dowolnej długości polimeryczną formę nukleotydu. Przykłady tej formy obejmują, lecz nie są ograniczone do następujących elementów: gen, fragment genu, egzony, introny, informacyjny RNA (mrna), transferowy RNA, rybosomalny RNA, rybozymy, cdna, rekombinowane polinukleotydy, rozgałęzione polinukleotydy, plazmidy, wektory, izolowany DNA o dowolnej sekwencji, sondy kwasów nukleinowych oraz startery. Polinukleotyd może obejmować modyfikowane nukleotydy, takie jak nukleotydy metylowane i analogi. [002] Stosowany niniejszym termin IRES lub polinukleotyd o biologicznej aktywności sekwencji IRES w zamyśle zawiera taką cząsteczkę jak polinukleotyd lub jej odwrotny transkrypt, który może w komórkach eukariotycznych bez udziału struktury czapeczki zainicjować translację polinukleotydu funkcjonalnie połączonego do sekwencji IRES. Sekwencja IRES lub polinukleotyd o aktywności biologicznej sekwencji IRES mogą być dokładnie takie same jak sekwencja IRES z pikornawirusa, mogą nie występować w naturze lub nie występować w swojej pierwotnej formie, ale po wprowadzeniu do odpowiedniej komórki gospodarza spełniają tę samą funkcję co sekwencja pierwotna lub naturalnie występująca. [0026] Stosowany niniejszym termin alternatywny kodon start w zamyśle ma obejmować dowolny nukleotyd nie będący ATG (zazwyczaj triplet), który służy jako miejsce inicjacji translacji o obniżonej wydajności w stosunku do translacji inicjowanej z kodonu start ATG (patrz na przykład Fig. 8). Stosowanie naturalnie występującego alternatywnego kodonu start jest znane w dziedzinie i opisane w Kozak (1991) J. Cell Biol. 11(4): ; Mehdi i wsp., (1990), Gene 91: ; Kozak (1989) Mol. Cell. Biol. 9(11): Generalnie, alternatywne kodony start wykazują mniejszą wydajność translacji w porównaniu do kodonów typu ATG. Przykładowo alternatywny kodon start GTG może wykazywać 3-% wydajności translacji w porównaniu do kodonu typu ATG (0%). Wydajność translacji alternatywnego kodonu start może zależeć także od kontekstu sekwencji w jakim się znajduje. Przykładowo, według doniesień optymalna konsensusowa sekwencja Kozak ma pozytywny wpływ na miejsce inicjacji translacji alternatywnych kodonów start ((Mehdi i wsp. (1990) Gene 91: ; Kozak (1989) Mol. Cell. Biol. 9(11): Całkowita konsensusowa sekwencja Kozak to GCCRCCATGG (kodon start ATG podkreślono), kodonu start ATG oznaczono jako pozycja +1, a R w pozycji -3 jest puryną (A lub G). Dwie najbardziej konserwatywne pozycje to puryny, korzystnie A w pozycji -3 oraz G w pozycji +4 ((Kozak (1991) J Cell Biol 11(4): ). Użycie alternatywnego kodonu dla atenuowanej ekspresji selekcjonowalnego markera opisano w zgłoszeniu US 06/ oraz zgłoszeniu US 06/ Specjalista w dziedzinie wie, że sekwencja opisana w niniejszym dokumencie jako DNA będzie miała w cząsteczce RNA odpowiadającą jej sekwencję np. sekwencji ATG w DNA będzie odpowiadać sekwencja AUG w RNA. [0027] Stosowany w niniejszym wynalazku termin wysoki poziom ekspresji odnosi się do poziomu ekspresji, który jest wyższy niż poziom ekspresji wynoszący co najmniej 0, 70, 80, 90, 9 lub 99% całkowitej liczby analizowanych komórek.

7 Zestawy, komórki i sposoby [0028] W celu poprawienia precyzji oraz wydajności procesu przesiewania klonów oraz w celu identyfikacji komórek stabilnie wyrażających polipeptyd docelowy na wysokim poziomie, niniejsze ujawnienie dostarcza sposobów obejmujących: (a) kontaktowanie z czynnikiem co najmniej jednej rekombinantowej eukariotycznej komórki gospodarza zawierającej rekombinowany polinukleotyd, który zawiera element promotorowy, polinukleotyd kodujący powierzchniowy polinukleotyd markerowy komórki, polinukleotyd kodujący polipeptyd docelowy oraz polinukleotyd posiadający aktywność biologiczną polinukleotydu sekwencji IRES lub alternatywny kodon start, przy czym polinukleotyd IRES lub alternatywny kodon start są zlokalizowane w obrębie rekombinowanego polinukleotydu w taki sposób, że powierzchniowy polinukleotyd markerowy komórki oraz polinukleotyd docelowy ulegają transkrypcji na tym samym mrna, a hodowla jest prowadzona w takich warunkach, że powierzchniowy polipeptyd markerowy komórki jest wyrażany na powierzchni komórki gospodarza, przy czym czynnik jest wykrywalnym czynnikiem rozpoznającym i bezpośrednio lub pośrednio wiążącym marker powierzchniowy komórki, jeśli marker ten jest obecny na powierzchni komórki gospodarza, a kontaktowanie zachodzi w warunkach sprzyjających wiązaniu tego czynnika z markerem powierzchniowym komórki; (b) selekcjonowanie komórki gospodarza, która jest bezpośrednio lub pośrednio związana z czynnikiem; (c) przygotowanie jednej lub więcej klonalnych populacji komórek gospodarza otrzymanych na etapie (b); oraz (d) analizowanie jednej lub więcej klonalnych populacji otrzymanych w etapie (c) przez detekcję poziomu ekspresji markera powierzchniowego na tej populacji klonalnej i selekcję jednej lub więcej populacji klonalnych o wysokim poziomie ekspresji tego markera, wybierając w ten sposób jedną lub więcej populacji klonalnych stabilnie wyrażających polipeptyd docelowy. [0029] W jednym wykonaniu etap (b) i/lub (d) prowadzi się stosując sortowanie komórek techniką cytofluorymetrii przepływowej (FACS). [00] W jednym wykonaniu etap (d) prowadzi się metodą sortowania w cytofluorymetrii przepływowej, a profil sortowanych metodą cytofluorymetrii przepływowej komórek klonalnej populacji wybranych w etapie (d) wskazuje na wąską dystrybucję wokół średniej, przez co wskazuje, że populacja jest klonalna i stabilnie wyraża polipeptyd docelowy. [0031] W innym wykonaniu etap (d) przeprowadzono 7-28 dni po etapie (c), alternatywnie po 7 dniach lub alternatywnie po dniach lub alternatywnie po 1 dniach lub alternatywnie po dniach lub alternatywnie po 2 dniach lub ponadto alternatywnie po 28 dniach po przeprowadzeniu etapu (c). [0032] W określonych wykonaniach, wysoki poziom ekspresji odnosi się do poziomu ekspresji markera powierzchniowego, który jest wyższy niż poziom ekspresji markera powierzchniowego komórki na powierzchni co najmniej 0, 70, 80, 90, 9 lub 99% komórek poddanych analizie w etapie (b) i/lub etapie (d). [0033] W innym wykonaniu w sposobach według wynalazku łączy się technikę cytometrii przepływowej z wykorzystaniem niefluorescencyjnego markera powierzchniowego. [0034] Sposoby wynalazku identyfikują rekombinantowe komórki, które utrzymują produkcję białka lub poziom ekspresji polipeptydu docelowego o wartości +/- % lub alternatywnie +/- 1 lub alternatywnie +/- % lub alternatywnie +/- 2% lub alternatywnie +/- % lub alternatywnie +/- 3% lub alternatywnie +/- % i dalej +/- 0% w porównaniu do wytwarzania białka przez pewien okres czasu mierzony przykładowo w ciągu lub więcej lub alternatywnie w ciągu lub więcej lub alternatywnie w ciągu 1 lub więcej lub alternatywnie w ciągu lub więcej lub alternatywnie w ciągu 2 lub więcej lub alternatywnie w ciągu lub więcej lub alternatywnie w ciągu 3 lub więcej lub alternatywnie w ciągu lub więcej lub alternatywnie w 6

8 ciągu 4 lub więcej lub alternatywnie w ciągu 0 lub więcej lub alternatywnie ciągu lub więcej lub alternatywnie w ciągu 60 lub więcej generacji komórek. [003] W jednym aspekcie niniejszy wynalazek dostarcza sposoby identyfikacji, selekcji i namnażania populacji klonalnej rekombinantowych komórek eukariotycznych, które stabilnie wyrażają polipeptyd docelowy na wysokim poziomie ekspresji odpowiednim do wytwarzania produktu na dużą skalę np. do komercyjnej produkcji polipeptydu docelowego. [0036] W sposobach zastosowanie znalazły eukariotyczne rekombinantowe komórki gospodarza, takie jakie ujawniono w niniejszym dokumencie. Eukariotyczna komórka gospodarza zawiera lub obejmuje rekombinowany polinukleotyd, który obejmuje element promotorowy, polinukleotyd kodujący komórkowy powierzchniowy polipeptyd markerowy, polinukleotyd kodujący polipeptyd docelowy oraz polipeptyd posiadający aktywność biologiczną dowolnego polinukleotydu o sekwencji IRES, w którym polinukleotyd o sekwencji IRES jest ulokowany w obrębie polinukleotydu rekombinowanego w taki sposób, że powierzchniowy polinukleotyd markerowy oraz polinukleotyd docelowy ulegają transkrypcji na matrycy tej samej cząsteczki mrna. W alternatywnym wykonaniu niniejszego wynalazku powierzchniowy polinukleotyd markerowy obejmuje alternatywny kodon start inicjacji translacji. Czynnik bezpośrednio lub pośrednio wiążący marker powierzchniowy komórki przyłącza się do rekombinantowych komórek gospodarza. Te właśnie komórki są następnie poddane selekcji i izolacji. Wyselekcjonowane i wyizolowane komórki są następnie namnażane do uzyskania klonalnej populacji i hodowane przez pewien okres czasu. Klonalne populacje są analizowane przez detekcję poziomu ekspresji markera powierzchniowego na powierzchni komórek populacji klonalnej. W wyniku tej analizy dokonuje się wyboru jednej lub kilku populacji klonalnych o wysokim poziomie ekspresji markera powierzchniowego. Wybrane klonalne populacje o wysokim poziomie ekspresji markera powierzchniowego to klonalne populacje wykazujące stabilny i za razem wysoki poziom ekspresji polipeptydu docelowego. Komórki wyselekcjonowane tymi sposobami można dalej hodować w warunkach, które umożliwiają wytwarzanie polipeptydu docelowego obecnego w komórkach gospodarza. Następnie polipeptyd docelowy można izolować odpowiednio z komórek lub pożywek hodowlanych. [0037] Zestaw do realizacji sposobów, omawiany bardziej szczegółowo poniżej, jest również ujawniony niniejszym. W jednym aspekcie zestaw obejmuje i) rekombinantową eukariotyczną komórkę gospodarza zawierającą polinukleotyd, który wytwarza na tym samym mrna polinukleotyd kodujący powierzchniowy polipeptyd markerowy komórki oraz polipeptyd docelowy; ii) dowolny czynnik, który rozpoznaje, przez bezpośrednie lub pośrednie wiązanie do produktu ekspresji polinukleotydu kodującego powierzchniowy marker komórki oraz środki do identyfikacji komórek gospodarza, które mają kompleks czynnik:marker, po tym jak były doprowadzone na niewielką odległość, tak że czynnik może wiązać się do markera, jeżeli jest on obecny na rekombinantowych komórkach gospodarza. Na przykład, zestaw może ponadto obejmować płytkę wielodołkową do równoczesnego przesiewania lub selekcji wielu prób, np. płytkę 6-dołkową, 12- dołkowa, 24-dołkową, 48-dołkową, 96-dołkową lub alternatywnie 384-dołkową płytkę mikrotitracyjną. Z tego powodu sposób według wynalazku w zamyśle nie jest ograniczony do podanych w przykładzie płytek hodowlanych o 6- lub 96-dołkach. [0038] Ujawnienie dostarcza także eukariotycznej komórki gospodarza zawierającej rekombinowany polinukleotyd, który obejmuje: element promotorowy, polinukleotyd kodujący powierzchniowy polipeptyd markerowy komórki, polinukleotyd kodujący polipeptyd docelowy oraz polipeptyd posiadający aktywność biologiczną polinukleotydu o sekwencji IRES (wewnętrznego miejsca wejścia rybosomu), w którym polinukleotyd o sekwencji IRES jest ulokowany w obrębie polinukleotydu rekombinowanego w taki sposób, że powierzchniowy polinukleotyd markerowy komórki oraz polinukleotyd docelowy ulegają transkrypcji na tym samym mrna. W alternatywnym wykonaniu, polinukleotyd kodujący powierzchniowy polipeptyd markerowy zawiera ponadto alternatywny kodon start inicjacji translacji, występujący razem z elementem 7

9 IRES lub zamiast tego elementu. W tym wykonaniu polinukleotyd kodujący polipeptyd docelowy jest ulokowany poniżej polinukleotydu kodującego polipeptyd markerowy Komórki gospodarza [0039] Komórkami gospodarza, do których można wprowadzić rekombinowany polinukleotyd, mogą stanowić wymienione komórki lecz nie ograniczone do poniższych przykładów: komórki CHO, w tym linia CHO-K1, DG44, DUKX (zwana także DXB11) oraz CHO-S (dostępne komercyjnie z firmy Invitrogen) oraz linia komórek chomika BHK-21, mysie linie komórkowe o nazwie NIH3T3, NS0, C127, małpie linie komórkowe COS, Vero oraz ludzka linia komórkowa HeLa, HEK293 (zwana także 293), PER.C6 (komercyjnie dostępna z firmy Vrucell), U-937 oraz Hep G2. Dodatkowe przykłady obejmują komórki drożdży, komórki owadzie, komórki roślinne, komórki ptasie, komórki grzybów oraz komórki bydlęce. Przykłady komórek drożdży przydatnych w ekspresji obejmują, ale nie są ograniczone do komórek Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Hansenula, Candida, Torulopsis, Yarrowia lub Pichia. Patrz np. U.S. Pat. Nos. 4,812,; 4,818,700; 4,929,;,736,383;,9,349;,888,768 and 6,28,9. Komórki eukariotyczne można nabyć u takich dystrybutorów jak American Type Culture Collection (ATCC, Rockville Maryland, USA) lub samodzielnie wyprowadzić linie z wyizolowanych komórek sposobami znanymi w dziedzinie. [00] W jednym aspekcie komórki gospodarza wstępnie przesiewano i poddano selekcji pod kątem stabilnego wytwarzania białka lub peptydu będącego przedmiotem zainteresowania. Autorzy zgłoszenia stosowali selekcję chemiczną za pomocą metotreksatu lub inne sposoby selekcji znane w dziedzinie, których przykłady opisano w Liu i wsp., (00) Anal. Biochem. 280:-28; Barnes i wsp., (03) Biotechnol. Bioeng. 81: ; Sautter i Enenkel (0) Biotechnol. Bioeng. 89:-38. W alternatywnym wykonaniu, komórki nie zostały poddane wstępnej selekcji pod kątem stabilnej ekspresji białka lub polipeptydu docelowego. [0041] Eukariotyczne komórki gospodarza według niniejszego wynalazku zawierają rekombinowany polinukleotyd, który może być cząsteczką rekombinowanego mrna lub cdna, na bazie których powstaje cząsteczka mrna stanowiąca matrycę, na której zachodzi translacja docelowych lub markerowych polipeptydów. Taki efekt można osiągnąć stosując polinukleotyd o biologicznej aktywności sekwencji IRES ulokowany w obrębie tego samego polinukleotydu kodującego polipeptydy markerowe i docelowe. W jednym aspekcie element IRES jest ulokowany powyżej polinukleotydu kodującego polipeptyd docelowy i poniżej polinukleotydu kodującego marker powierzchniowy komórki. W innym aspekcie element IRES jest ulokowany powyżej polinukleotydu kodującego marker powierzchniowy i poniżej polinukleotydu kodującego polipeptyd docelowy. [0042] W alternatywnym wykonaniu polipeptyd docelowy i markerowy są kodowane przez tą samą cząsteczkę mrna, ale tylko jeden z polipeptydów ulega translacji z tej cząsteczki. Taki efekt uzyskuje się poprzez zastosowanie alternatywnego kodonu start inicjacji translacji (np. kodonu innego niż ATG) dla polipeptydu markerowego oraz zastosowanie kodonu start ATG inicjacji translacji dla polipeptydu docelowego. W tym wykonaniu polinukleotyd kodujący polipeptyd docelowy jest ulokowany poniżej polinukleotydu kodującego polinukleotyd markerowy. (patrz na przykład Fig. 7). [0043] Aby otrzymać rekombinantową komórkę gospodarza, rekombinowany polinukleotyd (polinukleotydy) może być wprowadzony do komórki gospodarza bezpośrednio przy użyciu odpowiedniej dowolnej techniki transferu genów. Alternatywnie, do wprowadzania polinukleotydu (polinukleotydów) do komórki gospodarza można użyć wektora. Przystosowane do tego celu wektory obejmują, lecz nie są ograniczone do wektorów wirusowych, wektorów związanych z wirusami i plazmidów. Przykłady odpowiednich wirusowych wektorów DNA obejmują adenowirusy (Ad) oraz wirusy towarzyszące adenowirusom (AAV). Wektory oparte o adenowirusy do dostarczania polinukleotydów są znane w dziedzinie. Można je otrzymać drogą komercyjną 8

10 lub sporządzając konstrukt za pomocą standardowych metod biologii molekularnej. Do grupy adenowirusów (Ad) należy 0 serotypów (patrz np. Międzynarodowe Zgłoszenie PCT Nr WO 9/ 27071). Adenowirusy nie wymagają integracji z genomem gospodarza. Skonstruowano także rekombinowane wektory oparte o adenowirusy, a szczególnie te, które obniżają możliwość potencjalnej rekombinacji i wygenerowanie wirusa dzikiego typu )patrz np. Międzynarodowe Zgłoszenie PCT Nr WO 9/ 006 i WO 9/ 11984). Generalnie rekombinowane wektory adenowirusowe oparte na adenowirusie typu 2 (Ad2) i adenowirusie typu (Ad) mogą także pochodzić od innych, nieonkogennych serotypów (patrz np. Horowitz, Adenoviridae and their Replication in VIROLOGY, Wyd. 2., Fields i wsp., red., Raven Press Ltd., New York, 1990). [0044] Inne wektory wirusowe do zastosowania w niniejszym wynalazku obejmują wektory otrzymane na bazie wirusa ospy, opryszczki i retrowirusów. Zwłaszcza wektory otrzymane na bazie herpeswirusa, szczególnie wirusa opryszczki pospolitej (HSV), takie jak w wynalazku opisanym w patencie US,672,344. [004] Wektory zawierające zarówno promotor jak i miejsce do klonowania, do którego można funkcjonalnie przyłączyć polinukleotyd, są znane w dziedzinie i komercyjnie dostępne. Za pomocą takich wektorów można przepisywać RNA w warunkach in vitro i in vivo. Są one komercyjnie dostępne z takich źródeł jak Stratagene (La Jolla, CA) oraz Promega Biotech (Madison, WI). W celu optymalizacji ekspresji oraz/lub transkrypcji in vitro, niezbędne może być usunięcie, dodanie lub zmiana nietranksrybowanego fragmentu w pozycji na końcu ' lub/i 3' klonów. Służy to eliminacji nadmiarowych potencjalnych, niewłaściwych kodonów inicjacji translacji lub innych sekwencji, które mogą zaburzać lub obniżać ekspresję zarówno na poziomie transkrypcji jaki translacji. Alternatywnie, aby wzmocnić ekspresję, można w pozycji ' od kodonu start wstawić konsensusowe miejsce wiązania rybosomu. [0046] Czynniki przenoszenia genów obejmują także szereg wektorów niewirusowych, w tym kompleksy DNA/liposomy oraz kompleksy białka wirusowe - DNA. W sposobie według wynalazku można także użyć liposomów, w tym liposomów ze specyficznym przeciwciałem lub jego fragmentem. W celu wzmocnienie procesu transportu przez błonę komórkową, kwasy nukleinowe lub białka według niniejszego wynalazku można poddać sprzężeniu z przeciwciałami lub ich fragmentami wiążącymi, które przyłączają się do powierzchni komórki np. do TCR lub CD3. [0047] Dalej według któregokolwiek z wykonań ujawniono rekombinantowe komórki gospodarza posiadające drugi rekombinowany polinukleotyd kodujący drugie białko docelowe lub polipeptyd pod kontrolą pierwszego lub drugiego elementu promotorowego. IRES [0048] Sekwencja IRES lub polinukleotyd o aktywności biologicznej sekwencji IRES może być dokładnie taki sam jak sekwencje IRES występujące w pikornawirusie lub mogą być niewystępującymi naturalnie sekwencjami, które po wprowadzeniu do odpowiedniej komórki gospodarza spełniają tą samą funkcję. Przykładowo bi- oraz policistronowe wektory ekspresyjne zawierające naturalnie występujące elementy IRES są znane w dziedzinie i opisane na przykład w Mosser i wsp., (1997) BioTechniques 22(1):-161; Pestova i wsp. (1998) Genes Dev. 12:67-83; Chen i wsp. (04) J. Immunol.Methods 29:49-6 oraz w Zgłoszeniu Międzynarodowym Nr WO 01/046, które po kolei na stronie 17 w linijkach od 3 do 38 cytuje kilka odnośników literaturowych obejmujących, lecz nie ograniczonych do Ramesh i wsp. (1996) Nucl. Acids Res. 24: ; Pelletier i wsp. (1988) Nature 334:3-32; Jan i wsp. (1989) J. Virol. 63: ; i Davies i wsp. (1989) J. Virol. 66: Akapit [0009] w Zgłoszeniu Patentowym Nr. 0/0014 A1ujawnia kilka przyznanych patentów US, w których elementy IRES pochodzenia wirusowego użyto do ekspresji obcego genu/genów w linearnej wielocistronowej cząsteczce mrna w komórkach ssaczych, roślinnych i ogólnie w komórkach eukariotycznych. Amerykańskie zgłoszenie patentowe nr 04/00834 A1ujawnia element IRES aktywny w komórkach owadzich. Metody identyfikacji nowych elementów IRES opisano także 9

11 1 2 w patencie US 6,833,24. Ze względu na to, że DNA kodujący polipeptyd markerowy oraz DNA kodujący polipeptyd docelowy są przepisywane na matrycy tej samej cząsteczki mrna, w danej komórce poziom ekspresji polipeptydu markerowego możne wskazywać na względne poziomy ekspresji polipeptydu docelowego. [0049] W przykładowej poniżej opisanej komórce gospodarza fragment o sekwencji IRES został zakupiony w firmie Clontech Laboratories (pires Vector), a jego sekwencję podano na stronie firmy. W celu uzyskania słabszej wydajności translacji sekwencja IRES została poddana mutacji przez producenta (usunięto kodon ATG w pozycji 11 i 12) (jak opisano w informacjach pires Vector Information, Clontech Laboratories, Inc. (0) Protokół Nr. PT3266-, Wersja Nr. PR9976 i zawarte referencje). [000] W zamyśle stosowany termin IRES lub polinukleotyd o biologicznej aktywności IRES oznacza sekwencję podobną do sekwencji ujawnionej w patencie US 6,63,132. Patent ujawnia fragment sekwencji (opisany jak SP 163) składający się z sekwencji pochodzących z '-UTR czynnika VEGF (genu czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego, ang. Vascular Endothelial Growth Factor gene), który został przypuszczalnie wygenerowany w wyniku nieznanego mechanizmu alternatywnego składania. Właściciele patentów donoszą, że SP 163 jest naturalnie występującym w komórkach elementem IRES, który w warunkach stresu silnie pobudza translację oraz pełni rolę mediatora translacji niezależnej od struktury czapeczki. [001] Ponadto przez użycie terminu IRES lub polinukleotyd o biologicznej aktywności IRES rozumie się inne, nie występujące naturalnie sekwencje, które pełnią funkcję elementów IRES opisanych przykładowo w patencie US 0/ A1. [002] Marker powierzchniowy oraz polipeptydy docelowe są funkcjonalnie połączone z elementem IRES. Funkcjonalnie połączony oznacza taką lokalizację, która w pełni umożliwia prawidłowe funkcjonowanie. Inne elementy, które mogą być funkcjonalnie połączone do powyższej grupy obejmują, ale nie są ograniczone do promotora, sekwencji wzmacniającej, sekwencji terminalnej i sekwencji będącej sygnałem do poliadenylacji. Konstrukcja oraz zastosowanie takich sekwencji są znane w stanie techniki i łączone z zastosowaniem elementów IRES oraz sekwencjami białkowymi przy użyciu metod rekombinacji. 3 4 Alternatywne Kodony Start [003] W wynalazku, zamiast IRES w obrębie DNA kodującego polipeptyd markerowy ulokowany jest alternatywny kodon start w taki sposób, że translacja polipeptydu markerowego jest mniej wydajna niż polipeptydu docelowego. Aby otrzymać obniżoną wydajność translacji kodon ATG polipeptydu markerowego został zamieniony na alternatywny kodon start, którego przykłady obejmują, ale nie są ograniczone do: CTG, GTG, TTG, ATT, ATA, ACG. [004] Stosując alternatywny kodon start do inicjacji translacji można uzyskać niższą ekspresję polipeptydu lub białka reporterowego (markerowego) w porównaniu do ekspresji polipeptydu lub białka docelowego. Co więcej, aby zapobiec wewnętrznej inicjacji translacji oprócz zmiany kodonu start, DNA kodujące polipeptyd markerowy jest modyfikowane w miejscach występowania wszystkich wewnętrznych ATG. W jednym wykonaniu polipeptyd markerowy posiada krótką sekwencję aminokwasową ( mniej niż 0 aminokwasów) z nielicznymi (mniej niż ) kodonami ATG. W jednym wykonaniu wszystkie kodony ATG polipeptydu markerowego nie są w tej samej ramce odczytu co sekwencja kodująca polipeptyd. W jednym wykonaniu każdy wewnętrzny kodon ATG, który jest w ramce odczytu razem z sekwencją kodującą polipeptyd jest zmieniony na kodon TTG kodujący aminokwas leucynę. [00] Aby rozpocząć proces translacji mrna kodującego zarówno polipeptyd markerowy jak i docelowy rybosomy rozpoczynają przeszukiwanie cząsteczki mrna w miejscu czapeczki w pozycji ', przy czym w większości przypadków mijają alternatywny kodon start (np. GUG) i inicjują translację poniżej kodonu start

12 1 AUG (np. Fig. 7). Jednakże inicjacja translacji w miejscu alternatywnego kodonu start może zachodzić z niską częstotliwością, w rezultacie czego ekspresja polipeptydu reporterowego jest niska (np. patrz Fig. 8). W tym aspekcie wynalazku, ze względu na to, że powierzchniowy polinukleotyd markerowy oraz polinukleotyd docelowy są przepisywane z tej samej cząsteczki mrna, poziom ekspresji polipeptydu markerowego można wykorzystać do przewidywania względnego poziomu ekspresji polipeptydu docelowego biorąc pod uwagę pojedynczą komórkę. [006] Zatem, w tym aspekcie wynalazku populacje klonalne są przesiewane przez detekcję polinukleotydu markerowego, który jest wyrażany przy użyciu alternatywnego kodonu start. Populacje klonalne o wysokim poziomie ekspresji polipeptydu markerowego to klonalne populacje wykazujące wysoki poziom jednocześnie wyrażanego polipeptydu docelowego. [007] W dalszym aspekcie wynalazku, aby otrzymać niższy poziom ekspresji polipeptydu markerowego w porównaniu do poziomu ekspresji polipeptydu docelowego do inicjacji translacji polipeptydu markerowego wykorzystano alternatywny kodon start. W tym wykonaniu polinukleotyd kodujący polipeptyd docelowy jest ulokowany poniżej polinukleotydu kodującego polipeptyd markerowy (patrz np. Fig. 7). W tym aspekcie niniejszego wynalazku zamierzonym użyciem alternatywnego kodonu start jest użycie tego kodonu w ekspresji polipeptydu markerowego wykrywalnego na powierzchni komórek w procesie wysokoprzepustowego przesiewania klonów, jak wyjaśniono w sposobach według niniejszego wynalazku. 2 3 Promotory [008] Promotory to sekwencje, które kierują transkrypcją białka markerowego lub docelowego. Należy je specyficznie dobierać do danej komórki gospodarza np. komórki ssaczej, owadziej lub roślinnej. W komórkach ssaczych funkcjonują promotory wirusowe lub ssacze. Promotory mogą być konstytutywne lub indukowalne. Ich przykłady są znane i opisane w dziedzinie. Mogą być ulokowane powyżej polinukleotydu kodującego powierzchniowy polipeptyd markerowy oraz powyżej polinukleotydu kodującego polipeptyd docelowy. W innym aspekcie, promotor jest funkcjonalnie połączony z polinukleotydem kodującym powierzchniowy polipeptyd markerowy. W alternatywnym wykonaniu, promotor jest funkcjonalnie połączony z polinukleotydem kodującym polipeptyd docelowy. [009] Przykładowe promotory obejmują, ale nie są ograniczone do promotorów wirusowych, ssaczych lub drożdżowych pozwalających na uzyskanie wysokich poziomów ekspresji, np. promotor β-aktyny, ssaczy promotor CMV, promotor drożdżowej oksydazy alkoholowej, promotor kinazy fosfoglicerynowej, indukowalny promotor laktozowy, promotor galaktozydazy, promotor wirusów związanych z adenowirusami, promotor bakulowirusowy, promotor wirusa ospy, promotor retrowirusowy, promotor adenowirusowy, promotor SV, promotor TK (kinazy tymidynowej), promotor 7.K lub HR, późny promotor adenowirusowy typu 2 MPC, promotor Alfa-trypsyny, promotor czynnika IX, promotor immunoglobulinowy, promotor surfaktanta CFTR, promotor albuminy oraz promotor transferyny. [0060] Ponadto ujawnione są rekombinantowe komórki gospodarza zawierające którekolwiek z opisanych powyżej postaci wykonania i dodatkowo zawierające, w obrębie rekombinowanego polinukleotydu, polinukleotyd, który podnosi lub wzmacnia transkrypcję, np. sekwencję wzmacniającą (enhancer). 4 Markery Powierzchniowe [0061] Stosowany niniejszym termin powierzchniowy polipeptyd markerowy komórki lub polipeptyd markerowy jest powszechnie używany i obejmuje wyrażany przez komórkę polipeptyd służący do identyfikacji i opcjonalnie do selekcji komórek. Przykłady komórkowych powierzchniowych polipeptydów markerowych komórki obejmują, ale nie są ograniczone do polipeptydów receptorowych tj. do CD2, CD, CD2 lub CD9. W innej postaci wykonania powierzchniowy polipeptyd markerowy komórki nie jest 11

13 1 polipeptydem CD4 lub polinukleotydem kodującym polipeptyd CD4. Dodatkowe przykładowe powierzchniowe polipeptydy markerowe przedstawiono w dacie zgłoszenia na stronie internetowej <ebioscience.com/ebioscience/whatsnew/humancdchart.htm>. [0062] W innym aspekcie polinukleotyd kodujący powierzchniowy polipeptyd markerowy zawarty w komórce gospodarza to polinukleotyd kodujący polipeptyd o charakterze egzogennym dla eukariotycznej komórki gospodarza. W innym aspekcie dowolny polinukleotyd kodujący powierzchniowy polipeptyd markerowy jest endogennie obecny w komórce gospodarza i w komórkach nie transfekowanych ulega ekspresji na niewielkim poziomie. [0063] W szczególnym aspekcie tego ujawnienia, polinukleotyd koduje CD. Sekwencje kodujące markery CD są znane w dziedzinie i można je w Gen Bank odnaleźć pod następującym numerem dostępu: NM_12866; NM_12867; NM_02190; NM i NM_ W pewnych aspektach niniejszego wynalazku, pożądane jest wykorzystanie genów nie pochodzących od człowieka, sekwencji polinukleotydowych znanych w dziedzinie. Patrz przykładowo numery dostępu w Genbank NM_007641, NM_ i XM_4248. [0064] Powierzchniowy polipeptyd markerowy wykorzystano do identyfikacji tych komórek, które stabilnie wyrażają polipeptyd docelowy na wysokim poziomie i są potencjalnymi klonami -kandydatami do wykorzystania w produkcji na dużą skalę. 2 Polipeptydy Docelowe [006] Polipeptyd docelowy może być dowolnym polipeptydem lub białkiem wytwarzanym w komórkach gospodarza, a w aspekcie podanym tu jako przykład, polipeptyd docelowy, np. przeciwciała, fragmenty przeciwciał lub enzym, wybrano w oparciu o potencjalne możliwości jego wykorzystania jako czynnik terapeutyczny lub leczniczy. Tym niemniej, zestawy oraz ich użycie nie jest ograniczone do selekcji oraz zwiększania skali wytwarzania białek terapeutycznych. Za pomocą sposobów i zestawów ujawnionych w niniejszym wynalazku można przykładowo zidentyfikować białka o charakterze diagnostycznym lub białka do wytwarzania na dużą skalę [0066] W jednym aspekcie docelowy polipeptyd jest hormonem stymulującym tarczycę. W alternatywnym aspekcie polipeptyd docelowy obejmuje białko lub polipeptyd związany z przebiegiem choroby spichrzania lizosomalnego (LSD), które nie są ograniczone do podanych w tabeli poniżej. [0067] Przykłady schorzeń należących do chorób spichrzania lizosomalnego oraz odpowiadające im enzymy o zaburzonym działaniu lub brak enzymu. 12

14 Schorzenia związane z zaburzeniem spichrzania lizosomalnego Enzym o zaburzonym działaniu lub brak enzymu (hydrolaza lizosomalna) choroba Fabry'ego α-galaktozydaza A choroba Farbera Kwaśna ceramidaza fukozydoza Kwaśna α-l-fukozydaza choroba Gauchera typ 1, 2 i 3 Kwaśna β-glukocerebrozydaza (GCR) gangliozydoza GM1 Kwaśna β-gangliozydaza Choroba Huntera Idurano-2-sulfataza Choroba Huntera i Scheie α-l-iduronidaza choroba Krabbego galaktocerebrozydaza α-mannozydoza Kwaśna α-manozydaza β-mannozydoza Kwaśna β-mannozydaza Choroba Marateaux-Lamy Arylosulfataza B leukodystrofia metachromatyczna Arylosulfataza B Zespół Morquio typ A N-acetylogalaktozamina-6-siarczano sulfataza Zespół Morquio B Kwaśna β-galaktozydaza choroba Niemanna i Picka Kwaśna sfingomielinaza choroba Pompego Kwaśna α-glukozydaza choroba Sandhoffa Β-heksoaminidaza B Choroba Sanfilippo typ A Heparyn N-sulfatazy Choroba Sanfilippo typ B α-n-acetyloglukozoaminidaza Choroba Sanfilippo typ C Acetylo-CoA alfa-glukozaminido N- acetylotransferaza Choroba Sanfilippo typ D N acetyloglukozamino 6-siarczano sulfataza Choroba Schindler-Kanzaki α-n-acetylogalaktozoaminidaza Sialidoza sialidaza Choroba Sly β-glukuronidaza choroba Taya i Sachsa β-heksoaminidaza A 1 [0068] Choroby spichrzania lizosomalnego należą do klasy chorób genetycznych obejmujących ponad czterdzieści zaburzeń związanych z brakiem aktywności hydrolazy lizosomalnej. Lizosom jest głównym kompartmentem komórkowy, w którym zachodzi degradacja. Zawiera szereg enzymów niezbędnych do przeprowadzania procesów degradacji. Cechą charakterystyczną chorób LSD jest nieprawidłowa akumulacja metabolitów w lizosomach, która prowadzi do formowania dużej liczby napęczniałych lizosomów. W związku z tym LSD można leczyć podając czynnik terapeutyczny zastępujący enzym odpowiadający hydrolazie lizosomalnej o zaburzonym działaniu lub uzupełniający niedobór tego enzymu związany z konkretną choroba LSD. [0066] W jednym aspekcie docelowy polipeptyd jest hormonem stymulującym tarczycę. W alternatywnym aspekcie polipeptyd docelowy obejmuje białko lub polipeptyd choroby spichrzania lizosomalnego (LSD) nie ograniczone do podanych w powyższej tabeli. [0070] W jednym aspekcie tego wynalazku dodatkowy polipeptyd podlega transkrypcji i translacji z osobnego rekombinowanego polinukleotydu, w wyniku czego w komórce gospodarza powstaje funkcjonalne białko. Polinukleotyd rekombinowany nie wymaga sekwencji IRES lub białka markerowego, chociaż w jednym aspekcie może być obecne. [0071] Specjalista w dziedzinie rozumie, że polinukleotydy oraz zawierające je komórki gospodarza muszą zostać wytworzone przed etapem wymagającym użycia sposobów według niniejszego wynalazku. W zależności od poszczególnych składników, specjalista w dziedzinie może te składniki lub elementy tych składników kupić ze źródeł komercyjnych. 13

15 Wykrywanie markerów powierzchniowych [0072] Po wprowadzeniu polinukleotydu rekombinowanego, komórkę gospodarza hoduje się w warunkach, które pozwalają na ekspresję markera powierzchniowego na komórce gospodarza. Do detekcji markera powierzchniowego można zastosować dowolny sposób znany w dziedzinie w połączeniu ze sposobami według wynalazku. Przykładowo można zastosować przeciwciało specyficznie wiążące się do powierzchni komórki lub inny czynnik bezpośrednio kontaktujący się z komórką w warunkach sprzyjających wiązaniu przeciwciała do markera a tym samym do komórki gospodarza. Wybór czynnika wiążącego lub przeciwciała jest determinowany przez: 1) jego zdolność do selektywnego wiązania do powierzchniowego polipeptydu markerowego komórki wyrażanego na komórce gospodarza oraz 2) jego podatność na znakowanie wykrywalnym znacznikiem lub zdolność wiązania do wykrywalnego znacznika, np. do zastosowania w cytometrii przepływowej. Do wysortowania pojedynczej komórki w oparciu o właściwości optyczne, w tym fluorescencję, stosuje się sortowanie komórek w cytofluorymetrii przepływowej (FACS, ang. fluorescence activated cell sorting). Stosuje się ją do przesiewania dużych populacji komórek w stosunkowo krótkim czasie. Inne metody przesiewania obejmują MAC, jak opisano w Gaines (1999) Biotechniques 26(4): [0073] W jednym aspekcie czynnik wiążący marker powierzchniowy jest przeciwciałem. Przeciwciało może być poliklonalne lub monoklonalne lub może być fragmentem przeciwciała poliklonalnego lub monoklonalnego. Może być chimeryczne, humanizowane, dwuspecyfczne, dwufunkcjonalne lub w pełni pochodzenia ludzkiego. Można wykorzystać dowolny fragment funkcjonalny lub pochodną przeciwciała taka jak Fab, Fab', Fab2, Fab'2, regiony zmienne pojedynczego łańcucha i ich warianty. [0074] W alternatywnym wykonaniu, pierwszy czynnik może być białkiem lub peptydem wiążącym się do polipeptydu markerowego, przy czym pierwszy czynnik wiąże się również do drugiego czynnika, który można wyznakować wykrywalnym znacznikiem. Nie zawsze jest to wyrażone wprost, ale w zamyśle tego wynalazku wyrażenie pośrednie wiązanie do markera obejmuje użycie dowolnej liczby partnerów pośrednich. W tym wykonaniu przyłączenie pierwszej reszty znacznika do potencjalnego czynnika wiążącego odbywa się na ogół metodami znanymi specjalistom w dziedzinie i może obejmować techniki przedstawione powyżej pozwalające na inkorporację znaczników fluorescencyjnych, enzymatycznych, kolorymetrycznych i innych znaczników wykrywalnych. [007] W jednym wykonaniu czynnik wiąże się bezpośrednio do komórkowego markera powierzchniowego i obejmuje znacznik fluorescencyjny. Odpowiednie znaczniki fluorescencyjne obejmują, ale nie są ograniczone do fluoresceiny, rodaminy, tetrametylorodaminy, eozyny, erytrozyny, kumaryny, metylokumaryny, pirenu, zieleni malachitowej, stylbenu, żółtej lucyferyny, Cascade Blue oraz Texas Red. Inne odpowiednie barwniki optyczne opisano w wydaniu Molecular Probes Handbook by Richard P. Haugland z 1996 r. [0076] W innym aspekcie znacznik fluorescencyjny jest modyfikowany przez dodanie grup(y) funkcyjnej, aby ułatwić wiązanie kowalencyjne z czynnikiem. Odpowiednie grupy funkcyjne obejmują, lecz nie ograniczają się do grup izotiocjanianowych, grup aminowych, grup haloacetylowych, maleimidów, estrów sykcynoimidylowych, halogenków sulfonylowe, z których wszystkie można wykorzystać do wiązania znacznika fluorescencyjnego do drugiej cząsteczki. Wybór grupy funkcyjnej znacznika fluorescencyjnego zależy od miejsca przyłączenia zarówno do łącznika, czynnika, markera jak i drugorzędowego czynnika znakującego. [0077] Przyłączenie znacznika fluorescencyjnego do przeciwciała i/lub czynnika może zachodzić bezpośrednio przez łącznik. W jednym aspekcie łącznik jest stosunkowo krótką resztą sprzęgającą, która zasadniczo wykorzystywana jest do przyłączania cząsteczek. We niniejszym wykonaniu przyłączenie pierwszej reszty znacznika do potencjalnego czynnika wiążącego odbywa się na ogół metodami znanymi 14

16 specjalistom w dziedzinie i możne obejmować techniki przedstawione powyżej pozwalające na inkorporację znaczników fluorescencyjnych. [0078] Materiały oraz techniki projektowania i konstrukcji znakowanych przeciwciał oraz innych czynników do zastosowania w cytometrii są znane w dziedzinie i opisane np. w Bailey i wsp., (02) Biotech. Bioeng. 80(6): ; Carroll i Al-Rubeai (04) Expt. Opin. Biol. Therapy 4: ; Yoshikawa i wsp., (01) Biotech. Bioeng. 74:43-442; Meng i wsp., (00) Gene 242:1-7; Borth i wsp., (01) Biotechnol. Bioeng. 71 (4): ; Zeyda i wsp., (1999) Biotechnol. Prog. 1:93-97; Klucher i wsp., (1997) Nucleic Acids Res. 2(23): ; i Brezinsky i wsp., (04) J. Immunol. Methods 277: [0079] Wiążące się ze sobą pary przystosowane do pośredniego łączenia znacznika do łącznika (który z kolei wiąże marker) obejmują, ale nie ograniczają się do par antygeny/przeciwciała, w tym digoksygenina/przeciwciało, dinitrofenyl (DNP)/ przeciwciało anty-dnp, dansyl-x/przeciwciało anty-dansyl, fluoresceina/przeciwciało anty-fluoresceina, żółta lucyferyna/przeciwciało anty-żółta lucyferyna, rodamina/przeciwciało anty-rodamina, biotyna/awidyna (lub biotyna/streptawidyna). Wiążące się ze sobą pary powinny charakteryzować się wysokim powinowactwem do swojego liganda, wystarczającym aby wytrzymać siły ścinające w czasie sortowania FACS lub w innym systemie detekcji stosowanym w niniejszym wynalazku. [0080] Zatem w pewnych aspektach niniejszego wynalazku, reszty znacznika pierwszorzędowego (w przypadku, kiedy stosowany jest znacznik drugorzędowy) obejmują, ale nie ograniczają się do haptenów, takich jak biotyna. Biotynylacja cząsteczek docelowych jest dobrze znana. Przykładowo dobrze znane są czynniki biotynylujące, w tym czynniki reagujące z grupami aminowymi i tiolowymi stosowanymi do biotynylacji białek, kwasów nukleinowych, węglowodanów i kwasów karboksylowych. Podobnie, dobrze jest znana grupa reagentów haptenizujących. [0081] Przeciwciała stosowane w ramach zestawu mogą być wytwarzane w hodowli komórkowej, za pomocą faga lub w różnych zwierzętach, obejmujących ale nie ograniczonych do krów, królików, kóz, myszy, szczurów, chomików, świnek morskich, owiec, psów, kotów, małp nieczłekokształtnych, szympansów, małp człekokształtnych, itd., o ile fragment albo pochodna zachowuje specyficzność wiązania do białka lub jego fragmentu. W określonych warunkach eksperymentu przeciwciała można testować pod kątem specyficzności wiązania przez porównanie wiązania do odpowiedniego antygenu, do niespecyficznego antygenu lub do mieszaniny tych antygenów. [0082] W wykonaniach, w których przeciwciało lub czynnik skierowany przeciwko markerowi powierzchniowemu komórki nie jest bezpośrednio znakowany, przeciwciało lub czynnik korzystnie zawiera i zachowuje również zdolność wiązania czynnika drugorzędowego wykrywalnego po związaniu z komórką gospodarza przez polipeptyd markera powierzchniowego komórki. Same znaczniki muszą być możliwe do wykrywania i odpowiednimi przykładami znaczników do zastosowania w wynalazku np. są znaczniki fluorescencyjnych do cytometrii przepływowej lub MACS. [0083] W szczególnym wykonaniu, kiedy komórkowym markerem powierzchniowym jest CD, przeciwciało zestawu jest skierowane przeciwko CD. Przeciwciało anty-cd odnosi się do przeciwciała, które specyficznie rozpoznaje i wiąże polipeptyd lub białko CD. Przeciwciała anty-cd można otrzymać metodami znanymi w dziedzinie) (patrz na przykład Harlow i Lane, red. (1988) supra i Freshney, red. (1987) supra). Ponadto, kilka przeciwciał anty-cd jest komercyjnie dostępnych z firmy BD Pharmigen; Beckman Coulter, Inc. (Fullerton, CA, wiele klonów w tym klon H299 (B1) Nr kat ; Izotyp IgG2a oraz klon L26, Nr kat. IM16, Izotyp IgG2a); Invitrogen (Carlsbad, CA, klon: BH-, Izotyp: IgG2a i klon: B-H, Izotyp: IgG2a); BioLegend (San Diego, CA, Nr kat. 21, klon : 2H7, Izotyp : IgG2b, e); EMD Biosciences, Inc., CALBIOCHEM Brand (San Diego, CA, Nr kat Clone 2H7, Izotyp: IgG2b); i Anaspec (San Jose, CA, Nr kat. 2987). 1

17 1 2 3 [0084] W czasie zastosowania sposobu, co najmniej jedna rekombinantowa eukariotyczna komórka, jak opisano niniejszym, jest kontaktowana z czynnikiem, który bezpośrednio lub pośrednio wiąże marker powierzchniowy komórki, jeżeli jest on obecny na powierzchni komórki gospodarza. Kontaktowanie przebiega w warunkach sprzyjających lub odpowiednich do specyficznego wiązania (pośredniego lub bezpośredniego) czynnika lub przeciwciała z markerem. Następnym etapem jest selekcja komórki gospodarza bezpośrednio lub pośrednio związanej z czynnikiem lub przeciwciałem związanym do markerowego polipeptydu na powierzchni komórki. Sposób obejmuje selekcję i izolację jednej lub więcej komórek gospodarza, do której przyłączony jest czynnik oraz przygotowanie klonalnej populacji z wykorzystaniem w ten sposób wyselekcjonowanych komórek. Przygotowanie klonalnej populacji można przeprowadzić dowolnym sposobem znanym w dziedzinie. Przykładowo, w jednym wykonaniu, wyselekcjonowane komórki można posiać na 96-dołkową (lub płytkę innego rozmiaru) w gęstości wynoszącej jedną komórkę na dołek hodując komórki przez pewien okres czasu (np. zazwyczaj 7-28 dni). Pozwala to z pojedynczej macierzystej komórki otrzymać wielokomórkową kolonię pochodną (tj. populację klonalną). Sposób ten ponadto obejmuje analizę jednej lub więcej populacji klonalnych przez detekcję poziomu ekspresji markera powierzchniowego populacji i selekcję jednej lub więcej populacji klonalnej o wysokim poziomie ekspresji tego markera, wybierając w ten sposób jedną lub więcej populacji klonalnych stabilnie wyrażających polipeptyd docelowy. W określonych wykonaniach, przed analizą populacja klonalna jest hodowana przez 7-28 dni po wysianiu pojedynczej komórki. Ponadto sposób obejmuje doprowadzenie populacji klonalnej do kontaktu z wykrywalnym czynnikiem, który bezpośrednio lub pośrednio wiąże marker powierzchniowy komórki, jeżeli jest on na powierzchni komórki gospodarza, w warunkach sprzyjających kontaktowani czynnika z markerem oraz selekcję jednej lub więcej komórek gospodarza, które są bezpośrednio lub pośrednio związane z czynnikiem będącym przeciwciałem związanym z obcym polipeptydem markerowym na powierzchni komórek. Komórki te można także wyizolować i hodować. Klonalna populacja komórek wykazująca wysoki poziom ekspresji określana jest nazwą komórki wytwarzające. [008] Komórki wytwarzające można wykorzystać do wytwarzania polipeptydu docelowego, który następnie można z tych komórek lub hodowli tych komórek wyizolować. [0086] Selekcję komórki lub komórek wytwarzających można przeprowadzić, jak tu podano przykładowo, stosując sortowanie w cytofluorymetrii przepływowej lub sortowanie w polu magnetycznym (MACS, ang. magnetic activated cell sorter), albo inną metodą znaną w dziedzinie. [0087] Wynalazek dostarcza zestawów do stosowania sposobów ujawnionych w niniejszym wynalazku. W tych aspektach niniejszego wynalazku, zestaw detekcyjny zawiera co najmniej jedną eukariotyczna komórkę gospodarza opisaną w niniejszym dokumencie, czynnik, który bezpośrednio lub pośrednio wiąże się do powierzchniowego polipeptydu markerowego komórki oraz środki do detekcji tego czynnika bezpośrednio lub pośrednio związanego z powierzchniowym polipeptydem markerowym komórki. Odpowiednie komórki gospodarza, czynniki oraz środki detekcji i selekcji opisano powyżej. Są one również znane w dziedzinie. [0088] Następujące przykłady eksperymentalne w zamyśle ilustrują, ale nie ograniczają zakresu wynalazku. 4 PRZYKŁADY Materiały i Metody [0089] Konstrukcja wektorów ekspresyjnych DNA. Otwarte ramki odczytu dla polipeptydów wyrażanych wspólnie z CD [rozpuszczalny receptor, łańcuch ciężki przeciwciała (Hc), hormon tyreotropowy (TSH) (podjednostka β)] wprowadzono do ssaczego wektora ekspresyjnego poniżej chomiczego promotora β- aktyny i powyżej sekwencji IRES, która poprzedzała cdna dla ludzkiego CD i SV Poly(A). Z sekwencji IRES (pires, Clontech Laboratories, Mountain View, CA) usunięto kodony AUG w pozycji 11 i 12 obniżając 16

18 wydajność inicjacji translacji z tych kodonów (Davies i Kaufman (1992) J. Virol. 66: i pires Vector Information, Clontech Laboratories, Inc. (0) Protokół Nr. PT3266-, Wersja Nr PR9976). Otwarte ramki odczytu dla polipeptydów nie wyrażanych wspólnie z CD [łańcuch lekki przeciwciała (Lc), hormon tyreotropowy (TSH) (podjednostka α)] wprowadzono do ssaczego wektora ekspresyjnego poniżej chomiczego promotora dla β-aktyny i powyżej SV Poly)A. Podstawowa wersja wszystkich wektorów ekspresyjnych zawierała także kasetę ekspresyjną dla DHFR umożliwiającą selekcję za pomocą MTX w pożywce bez nuleotydów. [0090] Hodowla Komórek i Transfekcja. Jeżeli nie zaznaczono inaczej, wszystkie pożywki i suplementy pochodziły z firmy Invitrogen (Carlsbad, CA). Linia komórkowa CHO DXB11 (Urlaub i Chasin (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (7): ) została przystosowana do wzrostu w warunkach hodowli bez składników pochodzenia zwierzęcego (ang. ADC-free growth conditions) przy zastosowaniu metod i materiałów znanych w dziedzinie. Linię CHO SF-DG44 otrzymano z firmy Invitrogen. Komórki hodowano w zawiesinie stosując wentylowane butelki do hodowli z wytrząsaniem (Coming, Corning, NY) w inkubatorze Multitron (Infors HT, Bottmingen, Switzerland) w temperaturze 37 C, atmosferze % CO 2 przy wilgotności wynoszącej 70% z wytrząsaniem przy 12 rpm. Pożywkę hodowlaną CD DG44 wzbogacono o L-glutaminę o stężeniu 4 mm i 0.01% Pluronic F-68. Komórki transfekowano wykorzystując elektroporator GenePulser Xcell (BioRad Laboratories, Hercules, CA) przez elektroporację pojedynczym wektorem (rozpuszczalny receptor) lub równomolarną ilością dwóch wektorów (przeciwciała Lc + przeciwciała Hc, TSH α + TSH β). Przed transfekcją plazmidowe DNA wszystkich wektorów zlinearyzowano a następnie wytrącono za pomocą EtOH. Po godzinach od transfekcji komórki przesiewano do pożywki CD CHO bez nukleotydów uzupełnionej o 4 mm L-glutaminę. Stabilne populacje komórek poddano pojedynczej selekcji za pomocą 0 nm MTX (Calbiochem/EMD Biosciences, San Diego, CA) lub dwuetapowej selekcji za pomocą MTX o stężeniu nm/0 nm lub nm/0 nm. Bezpośrednio po sortowaniu komórki wysiewano na 96-dołkową płytkę w rozcieńczeniu 1 komórka/dołek. Dołki sprawdzano wizualnie 4-7 dni po sortowaniu w celu identyfikacji klonów pochodzących od pojedynczej komórki. Od tego momentu hodowli klony hodowano w pożywce CD CHO bez MTX. [0091] Sortowanie cytometrią przepływową i przesiewanie kolonii. 7- dni przed sortowaniem stabilnie transfekowane populacje przesiewano do pożywki CD CHO bez MTX uzupełnionej o 4 mm L-glutaminę i hodowano w takiej pożywce tak długo jak było to potrzebne do dnia sortowania. We wszystkich etapach sortowania i hodowli używano sterylnych reagentów i pracowano w sterylnych warunkach. We wszystkich etapach przemywania używano schłodzonego buforu fosforanowego PBS (Invitrogen). W czasie przygotowywania do sortowania komórki inkubowano z przeciwciałem anty-ludzki CD sprzężonym z FITC (BD Pharmingen, San Diego, CA) przez min. na lodzie przemywając je przed i po inkubacji. Komórki zawieszano w schłodzonym PBS w gęstości 1x 6 żywych komórek/1 ml i poddawano sortowaniu w sorterze FACStar PLUS flow cytometer (BD Biosciences, San Jose, CA) wykorzystując laser argonowy przy długości 488 nm i wykrywając emisję FITC z wykorzystaniem filtra /. Bramka. przez którą sortowano komórki, była kombincją bramki dla komórek żywych (FSC-H do SSC-H na bazie dot plot) bramką dla najsilniejszego sygnału % fluorescencji (na bazie histogramu zielonej fluorescencji FL-1). Dla potrzeb badania przesiewowego klonów rosnących na płytkach 6-dołkowych i w butelkach do hodowli z wytrząsaniem, w określonym czasie zbierano żywe komórki w ilości od 1x 6 do 2x 6. Komórki przygotowywano dokładnie tak jak opisana powyżej w procedurze przygotowania do sortowania czyli zawieszano w schłodzonym PBS w gęstości około 1x 6 żywych komórek/1 ml i poddawano analizie w cytometrze FACSalibur (BD Biosciences) wykorzystując laser argonowy przy długości 488 nm i wykrywając emisję FITC z wykorzystaniem filtra /. Do przesiewania klonów rosnących na płytce 96-dołkowej, około 0% komórek o 70-90% konfluencji hodowli przenoszono do pojedynczego dołka na 96-dołkowej płytce o konicznych dołkach. Komórki 17

19 1 przemywano, inkubowano z przeciwciałem anty-cd sprzężonym z PE (BD Pharmingen) przez min., przemywano i zawieszano w 0 µl schłodzonego PBS na dołek. Komórki analizowano w FACSArray Bioanalyzer (BD Biosciences) wykorzystując laser argonowy o emisji przy 32 nm i detekcji emisji PE z wykorzystaniem filtra w zakresie długości fali 8/42. Do analizy wyników wszystkich eksperymentów cytometrycznych używano oprogramowania CellQuest i Cell QuestPro (BD Biosciences). Prezentowane histogramy generowano stosując oprogramowanie Cell Quest Pro lub FlowJo (Tree Star Inc., Ashland, OR). W danych otrzymanych z badania przesiewowego za pomocą FACS, każdy rezultat przedstawiono ilościowo jako średnią geometryczną intensywności fluorescencji (GMFI) we względnych jednostkach fluorescencji (RFU). [0092] Analiza miana białek. Dla potrzeb analizy komórek rosnących na płytce 6-dołkowej, komórki przesiewano do dołków jak przedstawiono w opisiefigur, następnie 3 lub 7 dnia po wysianiu z dołków pobierano pożywkę jak w opisie. Dla potrzeb analizy hodowli bez zasilania, komórki wysiewano do butelek o objętości 12 ml w ml pożywki CD CHO z 4 mm L-glutaminą i inkubowano w inkubatorze Multitron jak opisano powyżej. Komórki wytwarzające rozpuszczalny receptor lub przeciwciało (jako polipeptyd docelowy) wysiewano w gęstości 3x żywych komórek/1 ml i pobierano kondycjonowana pożywkę 14 dnia hodowli. Komórki wytwarzające TSH (jako polipeptyd docelowy) wysiewano w gęstości 1x 6 żywych komórek/1 ml, a po 24 godzinach hodowli pobierano próby kondycjonowanej pożywki. Próbki kondycjonowanej pożywki wirowano w celu usunięcia komórek i zanieczyszczeń i przechowywano w temperaturze -80 C. Aby oznaczyć białkowe miano rozpuszczalnego receptora (fuzja Fc) i przeciwciała (IgG4), kondycjonowaną pożywkę analizowano w HPLC. W przypadku próbek z TSH, do oszacowania wydajności wytwarzania przypadającej na komórkę, najpierw wyznaczano całkowitą ilość komórek, a następnie metodą ELISA oznaczano miano TSH Wyniki [0093] Dokładne przewidywanie miana klonalnej formy terapeutycznego białka przez badanie przesiewowe z wykorzystaniem FACS w oparciu o CD. Procedurę z wykorzystaniem FACS w oparciu o reporter początkowo opracowano do sortowania komórek wykazujących wysoki poziom ekspresji. Gen kodujący białko będące przedmiotem zainteresowania (białko docelowe) wyrażano w ssaczym wektorze ekspresyjnym wspólnie z powierzchniowym białkiem receptorowym CD (powierzchniowy polipeptyd markerowy) nie wyrażany w naturze na komórkach CHO (Fig. 1). W systemie tym poziom ekspresji białka CD wykorzystano do oszacowania względnego poziomu ekspresji docelowego białka terapeutycznego w przeliczeniu na jedna komórkę. Po stabilnej transfekcji komórek CHO, populacja wyselekcjonowana za pomocą MTX została przetestowana pod kątem powierzchniowej ekspresji CD w cytometrii przepływowej. Populacje o wysokim poziomie fluorescencji poddano sortowaniu w celu zebrania pojedynczych komórek o wysokiej ekspresji CD. [0094] Po sortowaniu komórki wysiano na płytki 96-dołkowe aby otrzymać klony pochodzące od pojedynczej komórki (w celu przygotowania klonalnej populacji). Zazwyczaj, klony z płytki 96-dołkowej przesiewano poddając analizie kondycjonowaną pożywkę pobieraną z dołków przy 80-90% konfluencji komórek. W oparciu o to badanie przesiewowe wybierano 0-0 najlepszych klonów i namnażano je, a następnie ponownie przesiewano analizując kondycjonowaną pożywkę pobieraną z płytki 6-dołkowej w celu ustalenia które klony wykazujące najwyższe miano białka nadawałyby się do wytwarzania na dużą skalę. Ze względu na pierwotny cel czyli ograniczenie czasu upływającego od momentu hodowli na płytce 6-dołkowej do wyboru klonów o stabilnej i wysokiej ekspresji, pożądane było ustalenie wcześniejszego punktu czasowego analizy np. dzień 3 lub 4 a nie -14. W dalszych etapach hodowli (w butelkach do hodowli z wytrząsaniem o objętości 12 ml) analiza FACS w oparciu o CD klonów CHO wyrażających rekombinowany receptor 18

20 rozpuszczalny, przeprowadzona w 3 dniu po wysianiu na płytkę 6-dołkową okazała się metodą bardzo miarodajną. W rzeczywistości korelacja była lepsza niż korelacja wyników analizy białka w kondycjonowanej pożywce pobranej z płytki 6-dołkowej i miana białka z hodowli prowadzonej w butelkach z wytrząsaniem (Fig.2). Podobną korelację obserwowano dla klonów linii CHO wyrażających IgG 4. W tym przypadku, analiza kondycjonowanej pożywki pobranej z płytki 6-dołkowej później (7 dnia) nie dawała dokładnych wyników prognostycznych dla klonów z wysoką ekspresją, podczas gdy analiza FACS przeprowadzona 7 dnia umożliwiała taką prognozę (Fig. 3). Figura ta prezentuje również użyteczności techniki FACS w przypadku, kiedy polipeptyd docelowy jest wyrażany jako dwa polipeptydy, przy czym tylko jeden z nich jest wyrażany razem z CD. [009] Analiza przesiewowa klonów rosnących na płytce 96-dołkowej techniką FACS pod kątem jakościowym i ilościowym. Przesiewanie za pomocą analizy FACS w poparciu o CD okazało się lepszym narzędziem prognostycznym niż analiza kondycjonowanej pożywki pobieranej z 6-dołkowej płytki hodowlanej. Powstała zatem hipoteza, że analogiczna analiza FACS mogłaby dostarczać wyniki trafnie identyfikujące klony już na etapie hodowli na płytce 96-dołkowej. Wcześniej przeprowadzone badanie przesiewowe i analiza wyników pozwoliłoby na namnażanie wyłącznie klonów o stabilnej i silnej ekspresji, bez potrzeby namnażania i analizy niepożądanych klonów (tj. klonów z niestabilna lub niską ekspresją oraz populacji nieklonalnych). W celu ewaluacji wyników przesiewania techniką FACS na etapie hodowli na 96- dołkowej płytce w oparciu o ekspresję CD przeprowadzono porównawcze badanie przesiewowe 34 klonów komórek CHO wyrażających rekombinowany rozpuszczalny receptor na etapie hodowli na płytce 96- dołkowej i 6-dołkowej. Jak przedstawiono na Figurze 4A, biorąc pod uwagę ekspresję CD i mierząc rezultaty we względnych jednostkach fluorescencji (RFU), przesiewowa technika FACS hodowli z płytki 96- i 6-dołkowej wskazały na tę samą grupę kolonii. Fig. 4B prezentuje profile analizy FACS. Profile te pokazują związek między intensywnością fluorescencji w oparciu o CD dla komórek z płytki 96-dołkowej a mianem rozpuszczalnego receptora w kondycjonowanej pożywce pobranej z butelek o objętości 12 ml, do których wysiano komórki 3 tygodnie po badaniu przesiewowym klonów na płytce 96-dołkowej. [0096] Oprócz badania przesiewowego klonów na etapie hodowli na płytce 96-dołkowej pod kątem jakościowym, technika FACS pozwala na ilościową ocenę klonów przeznaczonych do dalszej hodowli i badań. Na etapie hodowli na płytce 96-dołkowej, wykorzystano profile FACS do identyfikacji klonów wizualizując wszystkie przypadki heterogenności związanej z niestabilności w populacji. Analizą ta objęto też klony ewaluowane pod kątem jakościowym. W jednym przykładzie w przypadku komórek wyrażających przeciwciało IgG 4 obserwowano ilościowe różnice między komórkami z dołków wykazujących tą samą fluorescencje określona w oparciu o analizę CD (Fig. 4C). W badaniu przesiewowym dla płytki 96- dołkowej, intensywność fluorescencji w oparciu o analizę CD dołków 4G2 i 7G4 wynosiła odpowiednio 127. i RFU. Komórki z dołka 7G4 namnożono ze względu na niska heterogenność pod względem fluorescencji w populacji (rozkład wokół średniej fluorescencji), komórki z dołka 4G2 wyeliminowano ze względu na większą heterogenność wskazującą na niestabilność i najprawdopodobniej na nieklonalny charakter populacji. Dlatego też badanie przesiewowe według wynalazku w oparciu o cechy jakościowe i ilościowe można stosować we wczesnym etapie procedury wyprowadzania linii komórkowej do selekcji klonów wytwarzających. [0097] Eliminacja niestabilnych klonów z procesu wyprowadzania linii komórkowych w badaniu przesiewowym według niniejszego wynalazku. Rzadko w analizie pojawiały się klony charakteryzujące się niższym mianem dla hodowli w butelkach bez zasilania niż się spodziewano opierając się na wynikach przesiewowych hodowli na płytce 96-dołkowej. Takie klony prawdopodobnie nie posiadają stabilnej ekspresji, która ulega zmniejszeniu w czasie namnażania po etapie przesiewania hodowli na płytce 96- dołkowej ((Bames i wsp. (03) Biotech. Bioeng. 81: i Kim i wsp. (1998) Biotech. Bioeng., 60:679-19

21 ). Ponowne przesiewanie tych klonów w FACS w oparciu o CD na etapie hodowli w butelkach z wytrząsaniem rzeczywiście wykazała obniżenie fluorescencji zgodne z obniżeniem wytwarzania białka terapeutycznego. Reprezentatywne przykłady przedstawiono na Figurze. Dla klonów CHO wytwarzających TSH, analiza FACS na etapie hodowli na płytce 96-dołkowej dokładnie wyselekcjonowała klony pod kątem wydajności wytwarzania w hodowli w butelkach z wytrząsaniem, za wyjątkiem 2 przypadków - klonów 11B3 i 1E7. W przypadku tych 2 klonów wykazujących niższy poziom wytwarzania niż przewidziany w oparciu o przesiewanie na etapie hodowli na płytce 96-dołkowej, analiza FACS w oparciu o CD hodowli z butelek pokazała obniżenie fluorescencji korelujące z mniejszym wytwarzaniem białka, co wskazuje na niestabilną ekspresje transgenu. [0098] Dlatego tez przesiewanie według wynalazku można wykorzystywać nie tylko do skutecznej identyfikacji klonów o wysokim poziomie wytwarzania (tj. klonalnej populacji o wysokiej ekspresji) na etapie hodowli na płytce wielodołkowej, lecz także do monitorowania najlepiej wyrażających klonów po etapie namnażania i do szybkiej identyfikacji (i eliminacji) klonów niestabilnych. Aby to wykazać, w celu oznaczenia miana IgG klony wyselekcjonowane jako najbardziej wydajne na etapie hodowli na płytce 96-dołkowej, namnożono i hodowano w butelkach we wsadowej hodowli bez zasilania. Czas upływający od badania przesiewowego na etapie hodowli na płytce 96-dołkowej do zaszczepienia wsadowej hodowli bez zasilania wynosił dni. Miano IgG wyznaczano po 14 dniach hodowli. Komórki stale pasażowano przez następne 6 tygodni, wysiewając do hodowli bez zasilania co 3 tygodnie. Hodowle te testowane w FACS 3 dnia, a miano IgG oznaczano 14 dnia hodowli. Jak pokazano na Figurze 6, w przypadku klonu 14A fluorescencja związana z CD była niższa w porównaniu do obserwowanej na etapie przesiewania hodowli na płytce 96- dołkowej w ciągu pierwszych 3 tygodni namnażania. Obniżenie ekspresji CD zachodziło równolegle z obniżeniem miana IgG pokazując, że badanie przesiewowe w czasie namnażania było trafnym wskaźnikiem niestabilnych klonów. Dla porównania klon 29H6 utrzymywał stabilne miano IgG znajdujące odzwierciedlenie w stabilnej wartości fluorescencji związanej z ekspresja CD w tych samych ramach czasowych. Wyniki te ilustrują użyteczność badania przesiewowego według wynalazku do eliminacji niestabilnych klonów w dowolnym momencie wyprowadzania linii komórkowej. W porównaniu do metod tradycyjnych, główną zaletą badania przesiewowego według niniejszego wynalazku jest wczesna analiza (3 a nie 14 dzień ) połączona z natychmiastową wizualizacją nie wymagającą dalszej obróbki wyników niezbędnej do wyznaczenia miana. 3 4 Omówienie [0099] Zastosowanie cytometrii przepływowej do izolacji komórek wyrażających pożądany poziom rekombinowanego genu będącego przedmiotem zainteresowania opisano w Liu i wsp., (00) Anal. Biochem. 280:-28; Klucher i wsp., (1997) Nucleic Acids Res. 2(23): ; Mosser i wsp., (1997) BioTechniques 22(1):-161; Gaines i wsp., (1999) BioTechniques 26(4): ; Choe i wsp., (0) Nucleic Acids Res. 33:1-7 i Zeyda i wsp., (1999) Biotechnol. Prog. 1:93-97). Dokładniej, dla celów izolacji komórek CHO wydzielających białka na wysokim poziomie, cytometria przepływowa okazała się przydatnym narzędziem zwiększania efektywności procesu opracowywania linii komórkowej. W niektórych przypadkach komórki CHO wytwarzające białko będące przedmiotem zainteresowania wyizolowano przez bezpośrednią detekcję białka będącego przedmiotem zainteresowania w czasie przyłączania się tego białka do macierzy zewnątrzkomórkowej w trakcie wydzielania ((Brezinsky i wsp. (03) J. Immunol. Methods 277:141-1) bądź poprzez technologię wychwytywania białka w oparciu o powinowactwo (ang. affinity matrix protein capture technology) (Borth i wsp., (01) Biotechnol. Bioeng. 71(4): ). Jednakże, bezpośrednia detekcja jest ograniczona przez dostępność przeciwciał specyficznych dla danego wyrażanego białka terapeutycznego. Co więcej dla wielu rekombinowanych białek terapeutycznych linia komórkowa jest wyprowadzana zanim takie przeciwciała staną się dostępne. Istnieją również doniesienia dotyczące komórek

22 CHO o detekcji w oparciu o FACS i białko reporterowe np. GFP ((Bailey i wsp., (02) Biotechnol. Bioeng. 80(6): ) lub zmutowanego enzymu (Sautter i Enenkel (0) Biotech. Bioeng. 89:-38 i Chen (04) J. Immunol. Meth. 29:49-6) wyrażano wspólnie z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. W obu procedurach, zarówno pośrednich jak i bezpośrednich, w celu wyizolowania wydajnych klonów położono nacisk na sortowaniu populacji komórek. Wcześniejsze badania opisują wzbogacanie populacji heterogennych o wysokowydajne komórki (subpopulacja lub pojedyncze komórki) lub wzbogacanie populacji klonalnych w subklony z potencjalnie wyższą wydajnością ekspresji białka. Wcześniejsze metody pomagały uzyskać lepszą wydajność poprzez izolację pożądanych komórek z populacji komórek transfekowanych, natomiast obszar dokładnego wysokoprzepustowego przesiewania klonów wymagał dopracowania. [00] Ostatecznie niniejszy wynalazek dostarcza oparte na białku reporterowym i technice FACS przesiewanie klonów do szybkiej identyfikacji stabilnych i wydajnie wyrażających klonów na wczesnym etapie wyprowadzania linii komórkowej, tj. na etapie wzrostu na 96-dołkowej płytce. Tego typu badanie przesiewowe precyzyjnie identyfikuje klony w oparciu o ich właściwości jakościowe i ilościowe, pozwalając na skupieniu zasobów oraz na poświęcenie czasu wyłącznie klonom nadającym się do dalszej obróbki. Takie badanie przesiewowe jest efektywniejsze niż dwa inne tradycyjne sposoby przeszukiwania klonów. Po pierwsze jest to lepsze narzędzie prognostyczne pozwalające na wczesnym etapie wskazać na klony, które później, na etapie bardziej zaawansowanym charakteryzuje wysokie miano wytwarzanego białka. Po drugie, sposób ten pozwala na wizualną ocenę jakości klonów, co nie jest możliwe przeprowadzając ewaluację prób kondycjonowanej pożywki pod kątem miana białka. Niestabilne klony można łatwo zidentyfikować w badaniu przesiewowym za pomocą FACS jako populacje o dużej heterogenności intensywności sygnału fluorescencji lub jako dwie osobne populacje. Dwie osobne populacje mogą także wskazywać na nieklonalną populację. Wprawdzie procedura wysiewania komórek na 96-dołkowa płytkę zapewnia z wysokim prawdopodobieństwem, że na jeden dołek przypada jedna lub mniej niż jedna komórka, niektóre dołki mogą zawierać populacje pochodzącą od więcej niż jednej komórki (tj. populację nieklonalną). Za pomocą badania przesiewowego opartego na FACS według wynalazku, klony o różnym profilu ekspresji wyprowadzone z pojedynczego dołka można łatwo rozróżnić, bez potrzeby ich namnażania i dalszej ewaluacji. [01] Oprócz tego, że badanie przesiewowe według niniejszego wynalazku jest sposobem wydajniejszym, dostarcza także innych korzyści, tj. narzędzia do wyprowadzania linii komórkowych wytwarzających wiele różnych białek i polipeptydów docelowych. Po pierwsze, ze względu na to, że system ten opiera się o detekcję jednocześnie wyrażanego białka reporterowego, nie ma potrzeby używania przeciwciała specyficznego dla polipeptydu docelowego. To pozwala na łatwą implementację sposobu według niniejszego wynalazku do wyprowadzania dowolnej linii komórkowej na najwcześniejszym etapie. Dodatkowo, białko reporterowe CD (polipeptyd markerowy) jest wyrażane na powierzchni komórki, więc różnice między poszczególnymi klonami w stopniu retencji białek i/lub pod względem współczynnika dysocjacji z macierzy zewnątrzkomórkowej nie są czynnikiem wpływającym na detekcję FACS lub otrzymywane wyniki. Co ciekawe, sposób według niniejszego wynalazku w porównaniu do sposobu, w którym białko docelowe (IgG) jest bezpośrednio wykrywane przez przeciwciało (anty-fc lub anty-igg), pozwala na precyzyjniejszą prognozę, które klony wytwarzają białko (polipeptyd docelowy) na wysokim, średnim i niskim poziomie. Jest to wskazanie, że przynajmniej dla części białek docelowych, bezpośrednia detekcja wydzielanego białka może generować wyższy procent rezultatów fałszywie pozytywnych lub fałszywie negatywnych, nie identyfikując tym samym klonów ze stabilną i wysoką ekspresją polipeptydu docelowego. Przykładowo, jeżeli komórka wytwarza pożądane białko docelowe na wysokim poziomie, ale białko to nie pozostaje przyłączone do macierzy zewnątrzkomórkowej wystarczająco aby umożliwić detekcję z użyciem przeciwciała, taka komórka będzie w badaniu przesiewowym drogą bezpośredniej detekcji pominięta ze względu na niski sygnał. 21

23 [02] Po drugie sposób według wynalazku pozwala na stosowanie tego samego protokołu w przypadku polipeptydów wyrażanych jako polipeptyd pojedynczy lub jako dwa polipeptydy kodowane przez osobne ramki odczytu na różnych plazmidach ekspresyjnych. W przypadku komórek wyrażających przeciwciało lub hormon tyreotropowy, reporterowe białko CD (polipeptyd markerowy) było jednocześnie wyrażane odpowiednio tylko z jednym ciężkim łańcuchem lub podjednostką β i zastosowane skutecznie do identyfikacji klonów wytwarzających wysoki poziom w pełni zasocjowanych białek. W przypadku wytwarzania przeciwciał, wspólna ekspresja CD i łańcucha ciężkiego dostarczała dodatkowych korzyści. Ostatnie doniesienia pokazują, że maksymalna ekspresja łańcucha ciężkiego jest niezbędna do otrzymania w pełni zasocjowanego przeciwciała ((Schlatter i wsp., (0) Biotechnol. Prog. 21: i Jiang i wsp., (06) Biotechnol. Prog. 22: ). Dlatego też powiązanie poziomu ekspresji CD na komórkę z poziomem ekspresji łańcucha ciężkiego, pozwala na identyfikację klonów z wysoką ekspresją łańcucha ciężkiego i co za tym idzie o wysokiej ekspresji w pełni zasocjowanych przeciwciał. [03] Po trzecie sposób oparty na FACS i CD według niniejszego wynalazku dostarcza szybką i jakościową metodę oznaczania stabilności klonów w czasie namnażania komórek miedzy etapem hodowli na 96-dołkowej płytce a hodowlą w butelkach. Sposób ten służył jako drugorzędowe badanie przesiewowe namnażanych klonów, po przeszukiwaniu na etapie hodowli na płytce 96-dołkowej. Możliwość przesiewania komórek 3 dni po wysianiu z hodowli, w dowolnym momencie namnażania do dużej skali, generowała wyniki szybciej niż tradycyjna analiza kondycjonowanej pożywki z ostatniej hodowli. Co więcej, identyfikacji niestabilnych klonów w dowolnym momencie ich namnażania zapobiegała niepotrzebnemu wyprowadzaniu nieprzydatnych linii komórkowych. Ostatecznie, oprócz zastosowania dla komórek CHO, sposób według niniejszego wynalazku znajduje zastosowanie dla innych typów komórek do ekspresji białek będących przedmiotem zainteresowania. W ten sposób do wspólnej ekspresji z białkami będącymi przedmiotem zainteresowania (tj. polipeptydami docelowymi) możliwe jest użycie innych niż CD, alternatywnych komórkowych powierzchniowych białek reporterowych (tj. polipeptydy markerowe). [04] Sposób ten dostarcza zasadniczą korzyść dla procesu wyprowadzania linii komórkowych, ponieważ pozwala na efektywne poszukiwanie klonów stabilnie i silnie wyrażających białka będące przedmiotem zainteresowania na etapie wzrostu komórek na 96-dołkowej płytce. W przypadku wyprowadzania wielu linii komórkowych z wielu klonów, przesiewanie w oparciu o FACS 96-dołkowej płytki skuteczniej i precyzyjniej identyfikuje klony, które charakteryzuje wysokie miano białka przed ich namnożeniem niż pomiar miana białka w pożywce pobieranej z dołków płytki 96-dołkowej. Co więcej, format 96-dołkowej płytki pozwala na obróbkę klonów z wysoką przepustowością. Wykorzystując cytometr z przystawką na płytki, przeprowadzono analizę 00 klonów w ciągu jednego dnia, znacząco redukując czas i nakład pracy wymagany do badania przesiewowego klonów. Dodatkową korzyścią tego sposobu był fakt, że obniżenie fluorescencji zależnej od CD w czasie namnażania klonów korelowało bezpośrednio z obniżeniem wytwarzania polipeptydu terapeutycznego obserwowanym dla niestabilnych klonów, pozwalając na szybkie rozpoznanie tych klonów i ich eliminację. Stosując ten sposób potencjalne terapeutyczne linie komórkowe są identyfikowane w sposób bardziej wydajny i namnażane do dalszej ewaluacji w bardziej bezpośredni, uproszczony sposób. Tym samym obróbka upstream pożądanych linii komórkowych wytwarzających białka jest precyzyjniejsza, szybsza i wymaga mniejszych nakładów pracy oraz szybciej osiąga etap obróbki downstream. Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób selekcji komórek wytwarzających komórek gospodarza stabilnie wyrażających polipeptyd docelowy na wysokim poziomie, w którym: (a) co najmniej jedną rekombinantową eukariotyczną komórkę gospodarza zawierającą rekombinowany polinukleotyd, który obejmuje element promotorowy, polinukleotyd kodujący powierzchniowy polipeptyd 22

24 markerowy komórki oraz polinukleotyd kodujący polipeptyd docelowy, przy czym polinukleotyd kodujący powierzchniowy polipeptyd markerowy komórki zawiera alternatywny kodon start, oraz polinukleotyd kodujący powierzchniowy polipeptyd markerowy komórki i polinukleotyd docelowy ulegają transkrypcji na tym samym mrna, a hodowlę komórki gospodarza prowadzi się w takich warunkach, że powierzchniowy polipeptyd markerowy jest wyrażany na powierzchni komórki gospodarza, kontaktuje się z wykrywalnym czynnikiem, który rozpoznaje i bezpośrednio lub pośrednio wiążące marker powierzchniowy komórki, jeśli jest on obecny na powierzchni komórki gospodarza, przy czym kontaktowanie odbywa się w warunkach sprzyjających wiązaniu tego czynnika z markerem powierzchniowym komórki; (b) selekcjonuje się jedną lub więcej komórek gospodarza, które są bezpośrednio lub pośrednio związane z czynnikiem, (c) przygotowuje się jedną lub więcej klonalnych populacji komórek gospodarza otrzymanych na etapie (b) oraz (d) analizuje jedną lub więcej klonalnych populacji otrzymanych na etapie (c) przez detekcję poziomu ekspresji markera powierzchniowego komórki na tych populacjach klonalnych i wybiera jedną lub więcej populacji klonalnych o wysokim poziomie ekspresji tego markera, w ten sposób dokonując selekcji jednej lub więcej populacji klonalnych stabilnie wyrażających polipeptyd docelowy. 2. Zestaw do selekcji eukariotycznej rekombinantowej komórki gospodarza wyrażającej polipeptyd docelowy stabilnie i na wysokim poziomie, przy czym zestaw zawiera następujące elementy: (a) co najmniej jedną eukariotyczną rekombinantową komórkę gospodarza zawierającą rekombinowany polinukleotyd, który obejmuje element promotorowy, polinukleotyd kodujący powierzchniowy polipeptyd markerowy komórki oraz polinukleotyd kodujący polipeptyd docelowy, przy czym polinukleotyd kodujący powierzchniowy polipeptyd markerowy komórki zawiera alternatywny kodon start, oraz polinukleotyd kodujący powierzchniowy polipeptyd markerowy komórki i polinukleotyd kodujący polinukleotyd docelowy ulegają transkrypcji na tym samym mrna; (b) czynnik, który bezpośrednio lub pośrednio wiąże powierzchniowy polipeptyd markerowy komórki; oraz (c) środki do detekcji czynnika, kiedy jest on bezpośrednio lub pośrednio związany do powierzchniowego polipeptydu markerowego komórki. 3. Sposób według zastrz. 1, w którym etap (b) i/lub etap (c) prowadzi się metodą sortowania w cytofluorymetrii przepływowej. 4. Sposób według zastrz. 1, w którym etap (d) prowadzi się metodą sortowania w cytofluorymetrii przepływowej i w którym profil sortowanych metodą cytofluorymetrii przepływowej komórek klonalnej populacji wybranej w etapie (d) wskazuje na wąską dystrybucję wokół średniej, przez co wskazuje, że populacja jest klonalna i stabilnie wyraża polipeptyd docelowy.. Sposób według zastrz.1, w którym etap (d) prowadzi się od 7 do 28 dnia po etapie (c). 6. Sposób według zastrz. 1, w którym wysoki poziom ekspresji jest poziomem ekspresji powierzchniowego markera komórki, który jest wyższy niż poziom ekspresji co najmniej 0, 70, 80, 90, 9 lub 99% komórek poddanych analizie w etapie (b) i/lub etapie (d). 7. Sposób według zastrz. 1 lub zestaw według zastrz. 2, w którym promotor jest promotorem eukariotycznym. 8. Sposób według zastrz. 1 lub zestaw według zastrz. 2, w którym polinukleotyd powierzchniowego markera komórki koduje powierzchniowy marker komórki inny niż polipeptyd CD4 lub w którym polinukleotyd powierzchniowego markerowa komórkowego koduje powierzchniowy marker komórki wybrany z grupy składającej się z CD, CD2 i CD9. 9. Sposób według zastrz. 1 lub zestaw według zastrz. 2, w którym polipeptyd docelowy obejmuje polipeptyd lub białko terapeutyczne. 23

25 1 2. Sposób według zastrz. 1 lub zestaw według zastrz. 2, w którym promotor ulokowany jest powyżej polinukleotydu kodującego powierzchniowy polipeptyd markerowy komórki lub powyżej polipeptydu kodującego polipeptyd docelowy. 11. Sposób według zastrz. 1 lub zestaw według zastrz. 2, w którym promotor jest funkcjonalnie połączony z polinukleotydem kodującym powierzchniowy polipeptyd markerowy komórki lub funkcjonalnie połączony z polinukleotydem kodującym polipeptyd docelowy. 12. Sposób według zastrz. 1 lub zestaw według zastrz. 2, w którym rekombinowany polinukleotyd zawiera ponadto polinukleotyd, który podwyższa lub wzmacnia transkrypcję. 13. Sposób według zastrz. 1 lub zestaw według zastrz. 2, w którym eukariotyczna komórka gospodarza obejmuje drugi rekombinowany polinukleotyd kodujący drugi polipeptyd docelowy pod kontrolą drugiego elementu promotorowego. 14. Sposób według zastrz. 1 lub zestaw według zastrz. 2, w którym polipeptyd docelowy jest wybrany z grupy obejmującej przeciwciało, fragment przeciwciała, hormon, enzym, białko receptorowe, białko upośledzonego spichrzania lizosomalnego, α-galaktozydazę A i kwaśną α-glukozydazę. 1. Sposób według zastrz. 1 lub zestaw według zastrz. 2, w którym komórka eukariotyczna jest komórką drożdżową lub ssaczą. 16. Zestaw według zastrz. 2, który ponadto zawiera: (d) środki do izolacji co najmniej jednej rekombinantowej komórki, której komórkowy marker powierzchniowy związany jest pośrednio lub bezpośrednio z czynnikiem. 17. Zestaw według zastrz. 16, który ponadto zawiera: (e) środki do hodowli co najmniej jednej rekombinantowej komórki wyizolowanej za pomocą środków z (d) 18. Zestaw według zastrz. 2, w którym czynnik z (b) jest przeciwciałem wyznakowanym w sposób umożliwiający detekcję, które bezpośrednio lub pośrednio wiąże się do powierzchniowego polipeptydu markerowego komórki kodowanego przez polinukleotyd. 19. Zestaw według zastrz. 2, w którym środki z (c) stanowią urządzenie do prowadzenia cytometrii przepływowej. 24

26 Odnośniki cytowane w opisie Poniższa lista odnośników cytowanych przez zgłaszającego ma na celu wyłącznie pomoc dla czytającego i nie stanowi części dokumentu patentu europejskiego. Pomimo, że dołożono największej staranności przy jej tworzeniu, nie można wykluczyć błędów lub przeoczeń i EUP nie ponosi żadnej odpowiedzialności w tym względzie. Dokumenty patentowe cytowane w opisie Literatura niepatentowa cytowana w opisie 36

27 37