Prokaryotyczne i eukaryotyczne systemy nadekspresji bia lek.

Transkrypt

1 Prokaryotyczne i eukaryotyczne systemy nadekspresji bia lek. Czyli jak produkować dużo, latwo i tanio dr ebiewski Zak lad Biotechnologii, Wydzia l Biologii i Nauk o Ziemi, Uniwersytet Miko laja Kopernika, Toruń ebiewski, WBiNoZ UMK Toruń 1

2 Nadekspresja bia lek Produkcja i oczyszczanie bia lek ma znaczenie zarówno naukowe, jak i przemys lowe: jeżeli chcemy scharakteryzować jakiejś bia lko (określić jego struktur e, zbadać aktywność itp.) musimy je oczyścić w dostatecznej ilości istnieja bia lka, które wykorzystuje sie przemys lowo (enzymy, szczepionki itd.), ich tania produkcja na duża skale ma wówczas kluczowe znaczenie Systemy do nadekspresji bia lek pozwalaja nadprodukować bia lka, czasem też u latwiaja ich oczyszczanie. ebiewski, WBiNoZ UMK Toruń 2

3 Systemy nadekspresji - rodzaje Systemy nadekspresji bia lek można podzielić ze wzgl edu na różne kryteria, najważniejsze z nich to: przynależność taksonomiczna organizmu w którym system dzia la systemy prokaryotyczne systemy eukaryotyczne tryb ekspresji systemy konstytutywne systemy indukowalne W przypadku uk ladów dzia laj acych w wyższych Eukaryota można je podzielić jeszcze na: stransformowane na sta le eksprymujace przejściowo (transient expression) tkankowo, organowo, uk ladowo specyficzne ebiewski, WBiNoZ UMK Toruń 3

4 nadprodukujace we wszystkich komórkach ebiewski, WBiNoZ UMK Toruń 4

5 Systemy ekspresyjne, co w tym siedzi? W sk lad uk ladów do nadekspresji wchodza minimum dwa elementy: 1. wektor 2. szczep (linia) gospodarza Wektor musi dawać możliwość wprowadzenia go do gospodarza, wyselekcjonowania klonów, które go pobra ly i stabilnego utrzymywania si e w trakcie hodowli. Najistotniejszym dla ekspresji elementem wektora jest promotor. ebiewski, WBiNoZ UMK Toruń 5

6 Dobór uk ladu Wybór uk ladu w którym b edziemy nadprodukować bia lko zależy od wielu czynników, np.: pochodzenia i rodzaju bia lka potrzebnej ilości czy zamierzamy je potem oczyszczać do czego ma s lużyć naszych możliwości sprzetowo-finansowych Dobranie w laściwego systemu jest pierwszym z kluczowych etapów w produkcji bia lka. ebiewski, WBiNoZ UMK Toruń 6

7 Systemy prokaryotyczne Prokaryotyczne uk lady do nadprodukcji bia lek najcześciej dzia laja w Escherichia coli. Praktycznie zawsze sa to systemy indukowalne. Stosujemy je z wyboru, kiedy nadeksprymujemy bia lko bakteryjne (z dowolnej bakterii), badź ma le bia lko eukaryotyczne, które nie jest glikozylowane, ani w inny sposób modyfikowane posttranslacyjnie. Zalety tych systemów to: latwość manipulacji genetycznych w bakteriach (szczególnie w E. coli) duża wydajność (do 50% totalnego bia lka) latwość i niski koszt hodowli możliwość prostego przeskalowania hodowli do rozmiarów przemys lowych Natomiast wady: trudno jest nadprodukować duże bia lka ebiewski, WBiNoZ UMK Toruń 7

8 brak eukaryotycznych modyfikacji posttranslacyjnych bia lka eukaryotyczne moga sie źle fa ldować ebiewski, WBiNoZ UMK Toruń 8

9 Systemy eukaryotyczne Eukaryotyczne uk lady do nadprodukcji bia lek podzielić można na pracujace w jednokomórkowych Eukaryota (np. drożdżach) i te oparte na wyższych eukaryontach. Dalej mamy podzia l uk ladów wielokomórkowych na dzia lajace w liniach komórkowych (owadzie, ssacze) i w ca lych organizmach (roślinne, zwierzece). System eukaryotyczny wybieramy zwracajac uwage na pokrewieństwo organizmu z którego pochodzi bia lko i organizmu w którym prowadzona bedzie nadprodukcja, wymagania co do modyfikacji posttranslacyjnych i możliwości techniczno-finansowe. Generalnie uk lady oparte na liniach komórkowych trudno si e skaluje, pozosta le można skalować wzgl ednie latwo. Oczyszczanie bia lka z eukaryontów jest trudniejsze, niż z bakterii. Wydajności nie sa tak duże, jak w przypadku prokaryontów. Manipulacje DNA w organizmach wyższych sa dużo trudniejsze, niż w bakteriach, dlatego wiekszość operacji wykonuje sie w E. coli. Przed luża to procedure ebiewski, WBiNoZ UMK Toruń 9

10 - trzeba przygotowany konstrukt wprowadzić do organizmu docelowego. ebiewski, WBiNoZ UMK Toruń 10

11 Przyk lady systemów ekspresyjnych 1. Systemy prokaryotyczne pet28 + E. coli BL21(DE3) 2. Systemy eukaryotyczne Systemy drożdżowe ppicz + Pichia pastoris Systemy roślinne wektory z promotorem alc z Aspergillus nidulans + np. Solanum tuberosum Systemy zwierzece pbac (wektor oparty na baculovirusie) + linia komórek owadzich pt-rex-dest30 + linia komórek ludzkich pbc1 + mysz ebiewski, WBiNoZ UMK Toruń 11

12 Uk lad bakteryjny - pet28 + E. coli BL21(DE3) Uk lad oparty jest na ekspresji z promotora faga T7. Jest to bardzo silny promotor, dzia lajacy wy l acznie z polimeraza RNA faga T7. Polimeraza znajduje sie pod kontrola promotora laktozowego w genomie gospodarza (BL21(DE3)). Pomiedzy promotorem, a poczatkiem wyrażanej ramki jest operator laktozowy, co daje podwójna kontrole. Zalety: bardzo duża i ściśle regulowana ekspresja, tani, latwo skalowalny. ebiewski, WBiNoZ UMK Toruń 12

13 Wady: bakteryjny... ebiewski, WBiNoZ UMK Toruń 13

14 Uk lad roślinny - psrn + palc + Lycopersicon esculentum Nie mam map plazmidów, ale postaram si e o nich opowiedzieć. Uk lad oparty jest na silnym, indukowalnym promotorze genu alc z Aspergillus nidulans. Czynnik transkrypcyjny blokujacy promotor alc (produkt genu alcr) wyrażany jest spod konstytutywnego promotora wirusa mozaiki kalafiora (CMV) w T-DNA plazmidu pomocniczego (psrn). Plazmid ekspresyjny zawiera w T-DNA wyrażany gen pod kontrola promotora alc. Obydwa plazmidy wprowadza si e do roślin przy pomocy Agrobacterium tumefaciens z plazmidem Ti. Indukcja ekspresji nastepuje po spryskaniu transgenicznych roślin etanolem adź aldehydem octowym. b Zalety: dobrze kontrolowana, silna ekspresja, latwa i tania indukcja, latwość skalowania ebiewski, WBiNoZ UMK Toruń 14

15 Wady: trudne oczyszczanie bia lek, roślinny wzór glikozylacji (to może też być zaleta ;)) ebiewski, WBiNoZ UMK Toruń 15

16 Uk lad zwierz ecy - pt-rex-dest30 + HeLa ebiewski, WBiNoZ UMK Toruń 16

17 Uk lad zwierz ecy - pt-rex-dest30 + HeLa Uk lad oparty jest na wczesnym promotorze cytomegalowirusa. Promotor ten jest konstytutywny, ale dzieki umieszczeniu za nim (a przed wyrażana ramka) dwóch sekwencji operatora tetracyklinowego (teto 2 ) jest on regulowany przez tetracykline. Do tego wymagana jest obecność represora tetracyklinowego (TetR) w komórkach gospodarza. Wektor stabilnie utrzymuje si e w komórkach ssaczych dzi eki replikonowi wirusa SV40. Można stosować dowolna linie komórkowa jeżeli stransformuje sie ja plazmidem wyrażajacym TetR, albo używa sie linii z TetR produkowanym z sekwencji wintegrowanej w genom. Zalety: ssacze modyfikacje posttranslacyjne Wady: d luga lista... Skomplikowanie, ma la wydajność ekspresji, trudno skalować, drogie, wymaga używania kultur komórek ssaczych itd. itp. ebiewski, WBiNoZ UMK Toruń 17

18 Uk lad zwierz ecy - pbc1 + Mus musculus Uk lad jest oparty na silnym, tkankowo specyficznym promotorze koziej β- kazeiny. Promotor ten jest aktywny wy l acznie w gruczole mlecznym w okresie laktacji. Wektor nie utrzymuje si e sam w komórkach gospodarza, wymaga integracji. Zalety: stosunkowo wysoka wydajność ekspresji (ok wyższa, niż w przypadku systemów opartych na kulturach komórkowych), ssacze modyfikacje, wzgl edna latwość oczyszczania bia lka z mleka. ebiewski, WBiNoZ UMK Toruń 18

19 Wady: doiliście kiedyś myszy??? No i drobny problem ze skonstruowaniem transgenicznego zwierzaka (a w naszym pi eknym kraju jeszcze dostaniem zezwolenia na prób e konstrukcji tegoż). ebiewski, WBiNoZ UMK Toruń 19

20 Podsumowanie Dla każdego coś si e znajdzie - to tylko kwestia dobrania odpowiedniego uk ladu. I pieni edzy... ebiewski, WBiNoZ UMK Toruń 20

21 Dzi ekuj e za uwag e Dziekuj e za uwag e! ebiewski, WBiNoZ UMK Toruń 21