(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/FR00/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/FR00/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , WO01/25463 (13) B1 (51) Int.Cl. C12N 15/861 ( ) C12N 15/10 ( ) C12N 5/10 ( ) A61K 48/00 ( ) (54) Sposób wytwarzania rekombinacyjnego adenowirusa i zestaw do wytworzenia rekombinacyjnego genomu adenowirusa (30) Pierwszeństwo: , FR, 99/12521 (73) Uprawniony z patentu: AVENTIS PHARMA S.A., Antony, FR (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 26/03 (72) Twórca(y) wynalazku: JEAN-JACQUES ROBERT, Sceaux, FR (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 02/12 (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Urszula Bartnik PL B1

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób wytwarzania rekombinacyjnego adenowirusa i zestaw do wytworzenia rekombinacyjnego genomu adenowirusa. Wytworzone adenowirusy można wykorzystywać do przenoszenia i/lub ekspresji genów w komórkach in vitro, in vivo i ex vivo lub w genomice funkcjonalnej. W szczególności, przedmiotem niniejszego wynalazku są szczególnie skuteczne sposoby wytwarzania banków adenowirusowych umożliwiających zastosowanie takich banków w genomice funkcjonalnej. W niniejszym wynalazku ujawnia się również plazmidy wykorzystywane do tworzenia tych adenowirusów, komórki zawierające te plazmidy i zestawy zawierające te plazmidy komórki i/lub banki adenowirusowe. Adenowirusy pod kątem przenoszenia i/lub ekspresji genów do komórek wykazują kilka interesujących cech. W szczególności, wykazują dosyć szerokie spektrum komórek gospodarzy, są zdolne do zakażania komórek w stanie spoczynku, mają dużą zdolność do klonowania i nie integrują się z genomem zainfekowanej komórki. Poza tym, jak do tej pory nie stwierdzono ich powiązania z istotnymi chorobami człowieka, tak więc stosuje się je do przenoszenia korzystnych genów do różnych tkanek ludzkich in vitro lub in vivo, na przykład do mięśni (Ragot i wsp., Nature 361 (1993) 647), wątroby (Jaffe i wsp., Nature Genetics 1 (1992) 372), układu nerwowego (Akli i wsp., Nature Genetics 3 (1993) 224), guzów nowotworowych, mięśniówki gładkiej, itd. Te same właściwości czynią z wektora adenowirusowego narzędzie z wyboru do wykorzystywania danych pochodzących z genomiki. Pod pojęciem genomiki funkcjonalnej rozumie się dziedzinę nauki wykorzystującą genomy lub dane z genomów różnych organizmów do wytłumaczenia funkcji genomu. Biorąc pod uwagę właściwości adenowirusów, wektory adenowirusowe z sekwencją egzogenną można wykorzystywać do oznaczania funkcji tej sekwencji w różnych modelach doświadczalnych. W szczególności, wektory adenowirusowe można wykorzystywać do badania celu terapeutycznego (w znaczeniu wykorzystywanym w przemyśle farmaceutycznym) w modelu komórkowym in vitro lub in vivo u zwierząt. Ponieważ sekwencja ta jest znana i znane są jej właściwości, wektory adenowirusowe mogą służyć do funkcjonalnego potwierdzenia tego celu. W szerszym znaczeniu, to znaczy w genomice funkcjonalnej wektor adenowirusowy przenoszący gen mógłby stanowić narzędzie do ustalenia funkcji sekwencji kwasu nukleinowego w eukariotycznym modelu doświadczalnym, mimo uprzedniego braku dokładnych informacji na temat rodzaju i funkcji tej sekwencji, również w sytuacjach, w których konieczne jest badanie wielu sekwencji na raz. Jednakże, wykorzystanie adenowirusów w przemyśle, terapii i genomice funkcjonalnej jest jeszcze ograniczone, ze względu na dotychczasowe metody wytwarzania tych rekombinacyjnych wirusów. W szczególności, dostępne obecnie metody nie pozwalają na wytworzenie w sposób prosty, szybki i klonalny populacji adenowirusów zawierających heterologiczne kwasy nukleinowe, zwłaszcza dlatego, że konieczne jest zbadanie wielu heterologicznych kwasów nukleinowych, jak to jest w przypadku genomiki funkcjonalnej. Niniejszy wynalazek przynosi rozwiązanie właśnie tych problemów. W niniejszym wynalazku opisano w istocie nowe narzędzia i nowe sposoby wytwarzania rekombinacyjnych adenowirusów. W wynalazku opisano w szczególności konstrukcje genetyczne (plazmidy), komórki i protokoły umożliwiające wytwarzanie adenowirusów ze znaczną szybkością i dobrej jakości. Wynalazek umożliwia bardziej szczegółowo tworzenie banków adenowirusowych zawierających dużą liczbę heterologicznych kwasów nukleinowych. Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania rekombinacyjnego adenowirusa, polegający na tym, że: a) wytwarza się pierwszy plazmid (zwany wahadłowym ), zawierający region 5' genomu adenowirusa ludzkiego typu 5 i zawierający co najmniej jeden heterologiczny kwas nukleinowy, przy czym plazmid ten nie podlega linearyzacji przed etapem rekombinacji i korzystnie jest plazmidem prokariotycznym; b) doprowadza się do zetknięcia tego pierwszego plazmidu, z drugim plazmidem (zwanym rodzicielskim ), skróconym w regionie 5' genomu adenowirusa ludzkiego typu 5 o regiony E1 i E2, zawierający co najmniej jeden heterologiczny kwas nukleinowy, komplementarny do pierwszego genomu, przy czym oba plazmidy są plazmidami o postaci kolistej co umożliwia za pomocą homologicznej rekombinacji wytworzenie końcowego plazmidu, zawierającego pełny rekombinacyjny genom adenowirusowy, przy czym rekombinację homologiczną prowadzi się w żywej komórce E. coli; c) wycina się pełny, liniowy rekombinacyjny genom adenowirusowowy z plazmidu końcowego i wprowadza się go do komórkowej linii enkapsydacji, w celu wytworzenia adenowirusów rekombina-

3 PL B1 3 cyjnych obejmujących pełny rekombinacyjny genom adenowirusowy, przy czym wspomniany plazmid wahadłowy i wspomniany plazmid rodzicielski, oba zawierają identyczny adenowirusowy region homologiczny, oba zawierają miejsce origin replikacji i dwa różne markery selekcji do selekcji każdego elementu i oba zawierają sekwencję odwróconego powtórzenia końcowego (ITR) otoczone miejscami restrykcyjnymi nie obecnymi w genomie adenowirusowym i jeden lub drugi zawiera sekwencję enkapsydacji. W korzystnym wykonaniu wynalazku sposób obejmuje ponadto zastosowanie wytworzonych adenowirusów rekombinacyjnych do zakażania: - materiału biologicznego zawierającego komórki oprócz człowieka, dla analizy właściwości kwasu nukleinowego, - hodowli komórkowej in vitro lub ex vivo, dla wytwarzania białka, polipeptydu lub peptydu kodowanego przez ten heterologiczny kwas nukleinowy, przy czym wszystkie etapy zastosowania przeprowadza się poza organizmem człowieka lub zwierzęcia. W kolejnym korzystnym wykonaniu sposób według wynalazku jest zastosowany do wytwarzania adenowirusowych bibliotek ekspresji. Przedmiotem wynalazku jest również zestaw charakteryzujący się tym, że zawiera plazmid wahadłowy, jak zdefiniowano powyżej i plazmid rodzicielski, jak zdefiniowano powyżej, za pomocą obu plazmidów mogący wytworzyć poprzez homologiczną rekombinację między dwoma skróconymi genomami adenowirusa plazmid końcowy, który zawiera pełny liniowy rekombinacyjny genom adenowirusa, otoczony przez jedno lub kilka miejsc restrykcyjnych, które są nieobecne w tym genomie, przy czym wspomniany plazmid wahadłowy i wspomniany plazmid rodzicielski, oba zawierają identyczny adenowirusowy region homologi rozciągający się od lewego ITR do regionu E3, oba zawierają miejsce origin replikacji i dwa różne markery selekcyjne dla selekcji każdego elementu i oba zawierają sekwencję odwróconego powtórzenia końcowego (ITR) otoczoną miejscami restrykcyjnymi nie obecnymi w genomie adenowirusowym i jeden lub drugi zawiera sekwencję enkapsydacji. Jednym z aspektów niniejszego wynalazku jest zatem zastosowanie rekombinacyjnych adenowirusów do ustalenia funkcji biologicznej kwasu nukleinowego lub białka. Innym aspektem niniejszego wynalazku jest zastosowanie adenowirusów do konstrukcji banków ekspresji w celu analizy kwasów nukleinowych o nieznanej funkcji i/lub strukturze. Niniejszy wynalazek umożliwia stworzenie adenowirusowych banków ekspresji, to znaczy populacji adenowirusów zawierających inserty nukleinowe, pochodzące ze wszystkich banków DNA. W wynalazku opracowano w tym celu sposoby i narzędzia umożliwiające wytwarzanie takich adenowirusów, zwłaszcza takich banków, a w szczególności, korzystnie, jednoczesną konstrukcję rekombinacyjnych adenowirusów w oparciu o banki kwasów nukleinowych. Adenowirusy są wirusami DNA, dwuniciowymi, linowymi, o wielkości około 36 kb. Ich genom zawiera w szczególności odwrotną powtórzoną sekwencję (ITR) na każdym końcu, sekwencję enkapsydacji (Psi), geny wczesne i geny późne. Główne geny wczesne znajdują się w rejonach E1, E2, E3 i E4. Spośród tych genów, geny znajdujące się w rejonie E1 są niezbędne do rozprzestrzeniania się wirusów. Region E4 ma również znaczenie w regulacji replikacji genomu adenowirusowego. Główne geny późne znajdują się w rejonach do L1 do L5. Dokonano sekwencjonowania genomu wirusa Ad5; sekwencja ta jest dostępna w bazie danych (zobacz Genbank M73260). Dokonano również sekwencjonowania części, a nawet całości innych genomów adenowirusowych, ludzkich i/lub zwierzęcych (Ad2, Ad7, Ad12, CAV-2 itd.). Ponadto, jak to wspomniano uprzednio, adenowirusy wykorzystywano już do przenoszenia genów in vivo. W tym celu wytworzono różne wektory pochodzące od adenowirusów, zawierające różne geny (β-gal, OTC, α-1at, cytokiny, enzymy, czynniki wzrostu itd.). W każdej z tych konstrukcji genom adenowirusa zmodyfikowano w ten sposób, aby stał się on niezdolny do autonomicznej replikacji i/lub rozprzestrzeniania się po przeniesieniu genowym. I tak, konstrukcje znane ze stanu techniki są adenowirusami pozbawionymi jednego lub kilku regionów dobranych z grupy, do której należy region E1, E2, E3, E4, pix, Iva2, itd. Te szczególne konstrukcje są pozbawione na przykład: regionu E1, regionów E1 i E3, regionów E1 i E4, regionów E1, E3 i E4 lub też wszystkich regionów kodujących adenowirusa (wektory gutless ). Wektory te zawierają zwykle heterologiczny kwas nukleinowy, który chce się przenieść do komórek lub badać. Ten kwas nukleinowy można wprowadzać w różne miejsca w rekombinacyjnym genomie, zastępując regiony, które uległy delecji lub umieszczać go w innych miejscach. Przykłady wektorów adenowirusowych opisano w publikacjach, zwłaszcza Levrero i wsp., Gene 101 (1991) 195; Gosh-Choudhury i wsp., Gene 50 (1986) 161, WO 94/12649, WO 94/28152,

4 4 PL B1 WO 94/28938, WO 95/34671, WO 96/10088, WO 95/02697, WO 95/27071, itd., które włącza się do niniejszego opisu przez przywołanie. Rekombinacyjne adenowirusy wytwarza się przez transfekcję DNA wirusa rekombinacyjnego w kompetentnej linii komórkowej enkapsydacji. Może to być transfekcja prosta, kiedy dysponuje się konstrukcją zawierającą całość genomu wirusa rekombinacyjnego lub, częściej, transfekcja kilku fragmentów DNA wnoszących różne części rekombinacyjnego genomu wirusowego. W tym przypadku sposób obejmuje jeden lub kilka etapów rekombinacji homologicznej między różnymi konstrukcjami w linii komórkowej enkapsydacji, w celu wytworzenia DNA wirusa rekombinacyjnego. Dla zastosowania jednego lub drugiego z tych sposobów konieczne jest zatem dysponowanie odpowiednimi konstrukcjami, zawierającymi całość lub część genomu rekombinacyjnego adenowirusa, który chce się wytworzyć. Ze stanu techniki znanych jest kilka sposobów wytwarzania tych konstrukcji in vitro. Najczęściej stosowana technika polega na izolowaniu DNA wirusowego i zmodyfikowaniu go in vitro klasycznymi metodami biologii molekularnej (trawienie, ligacja itd.). Wytworzone konstrukcje można następnie oczyszczać i stosować do transfekowania linii enkapsydacji. Metoda ta obejmuje jednak wytwarzanie zapasów wirusa i oczyszczanie DNA wirusowego dla każdej konstrukcji lub dla każdej manipulacji DNA wirusa rekombinacyjnego, nie jest zatem dostosowana do wytwarzania partii różnych wirusów, czy wytwarzania banków. Dla pokonania tych niedogodności proponowano zastosowanie plazmidów prokariotycznych do wytwarzania DNA wirusowego, nadającego się do transfekcji. W szczególności, Bett i wsp. (PNAS 91 (1994) 8802) opisuje wytwarzanie plazmidu replikacyjnego w E. coli, zawierającego zmodyfikowany genom adenowirusowy (plazmid pbhg10). Bardziej szczegółowo, plazmid ten zawiera genom adenowirusowy pozbawiony regionów E1, E3 i Psi, któremu nadano kształt kolisty przez połączenie sekwencji ITR, i który zawiera część plazmidu pbr322, wprowadzoną na poziomie regionu genomu adenowirusa. Plazmid ten można replikować w E. coli poddanej obróbce w celu wprowadzenia danych genów, jest to jednak zawsze niedogodne. Wykorzystanie tego sposobu do wytwarzania wirusów wymaga zwłaszcza linearyzacji łączących ITR i rekombinacji, co biorąc pod uwagę konstrukcję, prowadzi do włączenia do rekombinacyjnego genomu adenowirusowego regionów pochodzących z plazmidu prokariotycznego. Inne plazmidy tego typu, wykazujące takie same niedogodności, opisał na przykład Graham (EMBOJ. 3 (12) (1984) 2917). Ostatnio opisano nowe sposoby, oparte w szczególności na homologicznej rekombinacji dwóch plazmidów, z zastosowaniem sztucznych chromosomów drożdży (YACs, Ketner i wsp. 1994) lub bakterii (Chartier i wsp. 1996, Crouzet i wsp. 1997, He i wsp. 1998). Sposoby te, chociaż bardziej wydajne niż poprzednie, są też bardziej złożone. System YAC wymaga hodowli i manipulacji hodowlami drożdży (Ketner i wsp. 1994). W układach E. coli konieczne jest przeprowadzenie kilku etapów (z których niektóre są krytyczne, na przykład elektrotransformacja, selekcja na sacharozie). Należy w szczególności zauważyć, że we wszystkich tych przypadkach konieczne jest dokonanie selekcji wśród klonów, by wybrać końcowy klonowy wektor rekombinacyjny, zawierający zakaźny genom adenowirusa. Sposoby te, pozwalające skutecznie wytworzyć w sposób klonalny pewną ilość adenowirusa zawierającego dany gen terapeutyczny, nie nadają się jednak w dostatecznym stopniu do zastosowania w wytwarzaniu rekombinacyjnych adenowirusów na dużą skalę, a zwłaszcza do jednoczesnego wytwarzania wielu adenowirusów rekombinacyjnych, zawierających różne kwasy nukleinowe. Zastosowanie wektora adenowirusowego jako systemu przenoszenia lub analizy reszt genowych jest zatem hamowane przez złożoność i liczbę etapów koniecznych do wytworzenia tych wirusów. Z dotychczasowego stanu techniki wynika zatem w sposób jasny konieczność opracowania sposobu wytwarzania odpowiednich plazmidów, łatwych do manipulacji i wytwarzania in vitro, do wytwarzania rekombinacyjnych genomów adenowirusowych. Ważne jest również, by tak wytworzone genomy były praktycznie pozbawione regionów pochodzących z plazmidów, które mogłyby (i) prowokować reakcję immunologiczną, (ii) kodować białka oporności i (iii) ograniczać zdolność wykorzystania wirusa jako wektora. Istnieje również konieczność opracowania sposobów umożliwiających wytwarzanie w sposób ułatwiony adenowirusów rekombinacyjnych w sposób klonalny, szybki i w dużej ilości. Celem niniejszego wynalazku jest pokonanie tych niedogodności. W niniejszym wynalazku opisano także nowe kompozycje oraz sposób według wynalazku do wytwarzania adenowirusów rekombinacyjnych, spełniających te kryteria. Kompozycje te, a także sposób według niniejszego wynalazku umożliwiają wytwarzanie klonalne, szybkie i w dużych ilościach, adenowirusów rekombinacyjnych nadających się do wykorzystania terapeutycznego lub do badań celów farmaceutycznych.

5 PL B1 5 Niniejszy wynalazek opiera się w szczególności na zastosowaniu dwóch plazmidów (zwłaszcza Procaryota), zdolnych do wytwarzania w jednym etapie homologicznej rekombinacji w komórce gospodarza (w szczególności w komórce prokariotycznej), plazmidu zawierającego pełny genom adenowirusowy, łatwy do wycięcia celem wytworzenia adenowirusów rekombinacyjnych. Ogólnie, sposób według niniejszego wynalazku obejmuje: w pierwszym etapie wytworzenie pierwszego plazmidu (zwanego wahadłowym - ang. shuttle vector ), korzystnie prokariotycznego, zawierającego pierwszy rekombinacyjny genom adenowirusowy, okrojony, zawierający przynajmniej jeden heterologiczny kwas nukleinowy (etap klonowania). Korzystnie, pierwszy skrócony genom zawiera ITR, heterologiczny kwas nukleinowy, region homologii adenowirusowej i ewentualnie sekwencję enkapsydacji. W drugim etapie ten pierwszy plazmid styka się z drugim plazmidem (zwanym rodzicielskim ), zawierającym drugi skrócony rekombinacyjny genom adenowirusowy komplementarny do pierwszego, umożliwiając przez homologiczną rekombinację wytworzenie ostatecznego plazmidu, zawierającego pełny rekombinacyjny genom adenowirusowy (etap rekombinacji). Korzystnie, drugi skrócony genom adenowirusowy zawiera co najmniej jedną ITR, region homologii adenowirusowej identyczny jak w pierwszym i sekwencję enkapsydacji (jeżeli nie znajduje się ona w pierwszym). Ten drugi skrócony genom adenowirusowy może ponadto zawierać również inny korzystny kwas nukleinowy. W trzecim etapie pełny rekombinacyjny genom adenowirusowy wycina się z ostatecznego plazmidu i wprowadza do linii enkapsydacji, w celu wytworzenia adenowirusów rekombinacyjnych, zawierających pełny rekombinacyjny genom adenowirusowy (etap wytwarzania adenowirusa). W czwartym etapie, fakultatywnym, rekombinacyjne adenowirusy stosuje się do zakażania: - materiału biologicznego zawierającego komórki, w celu analizy właściwości kwasu nukleinowego (etap analizy funkcjonalnej), - hodowli komórkowej in vitro lub ex vivo, w celu wytwarzania białka, polipeptydu lub peptydu kodowanego przez heterologiczny kwas nukleinowy, - komórki, tkanki lub narządy, w celu wytwarzania in vivo białka, polipeptydu lub peptydu kodowanego przez heterologiczny kwas nukleinowy. Niniejszy wynalazek umożliwia również wytwarzanie w jednym etapie (rekombinacja homologiczna) prokariotycznego plazmidu, zawierającego czynnościowy genom adenowirusowy (pełny), który można wyciąć jednym lub kilkom odpowiednimi enzymami. Ten ostateczny plazmid powstaje zatem z wprowadzenia pierwszego plazmidu ( wahadłowego ), zawierającego sekwencje adenowirusowe (co najmniej jedną sekwencję ITR i enkapsydacji) i wyposażonego w dany heterologiczny kwas nukleinowy, do drugiego plazmidu ( rodzicielskiego ) zawierającego komplementarne sekwencje adenowirusowe (co najmniej drugą sekwencję ITR) poprzez rekombinację homologiczną, za pośrednictwem sekwencji wspólnej dla dwóch plazmidów (sekwencja homologii adenowirusowej). Zjawisko to, homologicznej rekombinacji, powoduje powstanie, poprzez ten koagregat, funkcjonalnego genomu adenowirusowego. Jedną z korzystnych cech sposobu według niniejszego wynalazku jest jego prostota umożliwiająca równoległe wytwarzanie wielu plazmidów wahadłowych. Tak więc, pierwszy etap sposobu obejmuje korzystnie klonowanie banku kwasów nukleinowych w plazmidach wahadłowych, powodując w ten sposób powstanie końcowych banków plazmidów, zawierających funkcjonalny genom adenowirusowy, o strukturze identycznej, z wyjątkiem zawartych w nich insertów. Ten etap klonowania przeprowadza się, korzystnie, poprzez zachowanie każdego poszczególnego klonu, na przykład w zagłębieniu płytki do mikromiareczkowania. Ponadto, etap ten można przeprowadzać w sposób automatyczny. Bank plazmidów wahadłowych wykorzystuje się następnie w etapie rekombinacji, przy czym każdy plazmid wahadłowy z banku styka się z plazmidem rodzicielskim. Sposób ten prowadzi w ten sposób do wytwarzania równolegle i jednocześnie wielu adenowirusów rekombinacyjnych, zawierających heterologiczny kwas nukleinowy (to znaczy adenowirusowego banku ekspresji). Bank ten można następnie badać na materiale biologicznym (etap czwarty) w celu zidentyfikowania klonów wykazujących poszukiwaną aktywność biologiczną. Wynalazek można wykorzystać we wszystkich typach adenowirusów komórek prokariotycznych i w różnych bankach kwasów nukleinowych, co zostanie zilustrowane szczegółowo w dalszej części tekstu. Definicje Adenowirus rekombinacyjny: termin adenowirus rekombinacyjny, w rozumieniu niniejszego wynalazku, oznacza każdy adenowirus, którego genom zmodyfikowano poprzez delecję i/lub insercję,

6 6 PL B1 i/lub substytucję zasad. Termin ten oznacza zatem, bardziej szczegółowo, cząstkę adenowirusową, zwykle zakaźną, zawierającą rekombinacyjny genom adenowirusowy. Według jednej lub wielu modyfikacji wprowadzonych do genomu, wirus rekombinacyjny może być defektywny w odniesieniu do replikacji, to znaczy niezdolny do autonomicznej replikacji i/lub rozprzestrzeniania się w komórce. Adenowirus rekombinacyjny można wytwarzać z każdego serotypu adenowirusa, zwłaszcza z adenowirusów ludzkich (na przykład typu C jak Ad5, Ad2, Ad7, Ad12, itd.) lub zwierzęcych (takich jak adenowirusy psie, np. CAV-2). Genom adenowirusowy: termin genom adenowirusowy oznacza cząsteczkę DNA obecną w adenowirusie lub jej sekwencję, kopię lub replikę. Rekombinacyjny genom adenowirusowy jest kwasem nukleinowym, którego sekwencja odpowiada sekwencji genomu adenowirusa i zawiera jedną lub więcej modyfikacji. Modyfikacje zawierają np. delecję (np. całości lub części regionów E1, E2, E3, E4, itd.), insercję (jak na przykład jeden lub kilka heterologicznych kwasów nukleinowych) lub zmianę zastosowania kodonów. Rekombinacyjny genom adenowirusowy wytworzony dzięki zastosowaniu kompozycji i sposobu według niniejszego wynalazku jest, korzystnie, genomem pełnym, czyli funkcjonalnym, to znaczy nie wymaga dodania innych regionów przez rekombinację, ani przez ligację, do wytwarzania większych ilości wirusa w wybranych liniach enkapsydacji. Taki pełny genom zawiera zatem, korzystnie, co najmniej jedną sekwencję enkapsydacji i jeden heterologiczny kwas nukleinowy, otoczone sekwencjami ITR z każdej strony. Inna korzystna cecha plazmidów według niniejszego wynalazku pochodzi w istocie z tego, że pełny rekombinacyjny genom adenowirusowy nie jest przerwany regionami plazmidów prokariotycznych. Dlatego też, wytworzone genomy nie zawierają w zasadzie regionów plazmidu, których niekorzystne cechy zostały wymienione uprzednio. Na przykład, w plazmidach według niniejszego wynalazku ITR genomu adenowirusowego nie stykają się, co pozwala wytworzyć pełne liniowe, rekombinacyjne genomy wirusowe, nadające się bezpośrednio do wykorzystania do wytwarzania wirusów rekombinacyjnych. Korzystnie, rekombinacyjny genom adenowirusowy zawiera co najmniej sekwencję ITR i sekwencję pozwalającą na enkapsydację. Powtórzone sekwencje odwrócone (ITR) stanowią początek replikacji adenowirusa. Są one umiejscowione na obu końcach genomu wirusowego, z których można je łatwo wyizolować klasycznymi technikami biologii molekularnej, znanymi specjaliście. Sekwencję nukleotydową z sekwencji ITR adenowirusów ludzkich (zwłaszcza serotypów Ad2 i Ad5) opisano w piśmiennictwie, podobnie jak sekwencję adenowirusów psich (zwłaszcza CAV1 i CAV2). Jeżeli chodzi na przykład o adenowirus Ad5, sekwencja lewa ITR odpowiada regionowi zawierającemu nukleotydy genomu. Sekwencja enkapsydacji (zwana również sekwencją Psi) jest niezbędna do enkapsydacji genomu wirusowego. Znajduje się ona w genomie wirusów dzikich, pomiędzy lewym ITR a regionem E1. Można ją izolować lub syntetyzować sztucznie klasycznymi technikami biologii molekularnej. Sekwencję nukleotydową sekwencji enkapsydacji adenowirusów ludzkich (zwłaszcza serotypów Ad2 i Ad5) opisano w piśmiennictwie, podobnie jak adenowirusów psich (zwłaszcza CAV1 i CAV2). Jeżeli chodzi na przykład o adenowirus Ad5, sekwencja enkapsydacji funkcjonalnej znajduje się pomiędzy nukleotydami 194 a 358 genomu. W korzystnym sposobie wykonania według niniejszego wynalazku genom adenowirusa pozbawiony jest całości lub części regionu E1. Region E1 ma w istocie zasadnicze znaczenie dla replikacji wirusa i jego inaktywacji prowadzonej przy tworzeniu wirusów defektywnych w odniesieniu do replikacji, to znaczy niezdolnych do autonomicznej replikacji po przeniesieniu genowym in vivo. Region E1 i każdy inny rozpatrywany region wirusowy można pozbawić funkcjonalności wszystkimi sposobami znanymi specjaliście, zwłaszcza poprzez całkowite zniesienie, substytucję, częściową delecję lub addycję jednej lub kilku zasad w rozważanym genie lub genach. Takich modyfikacji można łatwo dokonać bezpośrednio na plazmidach według niniejszego wynalazku, na przykład sposobami inżynierii genetycznej. Korzystnie, wytworzony genom adenowirusa pozbawiony jest części regionu E1, zawartej pomiędzy nukleotydami 454 a 3328 (fragment PvuII-BglII) lub (fragment HinfII-Sau3A). Skrócony rekombinacyjny genom adenowirusowy oznacza DNA odpowiadające sekwencji części końcowej genomu adenowirusowego, to znaczy od jednego końca (ITR). Dwa okrojone genomy rekombinacyjne nazywa się komplementarnymi, ponieważ każdy z nich zawiera część komplementarną genomu adenowirusowego i ponieważ mogą one odtworzyć, poprzez rekombinację homologiczną, pełny rekombinacyjny genom adenowirusowy.

7 PL B1 7 Heterologiczny kwas nukleinowy: termin heterologiczny kwas nukleinowy oznacza każdy kwas nukleinowy włączony do rekombinacyjnego genomu adenowirusowego, którego przeniesienie, ekspresja lub badanie czynnościowe są celem przeprowadzania danej procedury. Chodzi tu zwłaszcza o kwas nukleinowy o pochodzeniu innym niż z adenowirusa ( heterologicznym ), na przykład o kwas pochodzący z komórek ludzkich, zwierzęcych, roślinnych, wirusowych (innych niż adenowirus stosowany jako wektor), prokariotycznych, eukariotycznych niższych lub pochodzenia syntetycznego, lub półsyntetycznego. Wielkość heterologicznego kwasu nukleinowego może być różna, o tyle, o ile rekombinacyjny genom adenowirusowy, zawierający ten kwas, nie przekracza wielkości maksymalnej, umożliwiającej jego enkapsydację do cząstki adenowirusowej (w sumie mniej niż 40 kb). Tak więc, może to być kwas nukleinowy o długości powyżej 30 kb, ponieważ delecji uległo wystarczająco dużo regionów adenowirusa. Kwas nukleinowy może wówczas zawierać region kodujący dane białko, polipeptyd lub peptyd, na przykład cdna, gdna lub DNA syntetyczne. Może także być to kwas nukleinowy o nieznanej strukturze, pochodzący na przykład z klonu banku kwasów nukleinowych. Ponadto, rekombinacyjny genom adenowirusowy może zawierać kilka heterologicznych kwasów nukleinowych, wprowadzonych w różnych miejscach genomu. Opis plazmidów Jak to wspomniano powyżej, przedmiotem niniejszego wynalazku są dwa plazmidy (prokariotyczne), plazmid wahadłowy i plazmid rodzicielski, z których każdy zawiera komplementarny fragment rekombinacyjnego genomu adenowirusa. Co najmniej jeden z tych plazmidów zawiera heterologiczny kwas nukleinowy (lub miejsce wprowadzenia takiego kwasu nukleinowego), korzystne z punktu widzenia terapii genowej, wytwarzania białka rekombinacyjnego lub genomiki funkcjonalnej. Korzystnie, końce (sekwencje ITR) każdego ze skróconych genomów znajdujących się w plazmidach sąsiadują (na końcu 5' w przypadku lewego ITR i na końcu 3' w przypadku prawego ITR) z miejscem nieobecnym w tym genomie, aby umożliwić wycięcie całego genomu po rekombinacji. Plazmidy te zawierają skrócony genom adenowirusa i nie mogą pojedynczo wytwarzać zakaźnego genomu adenowirusowego. Każdy z tych dwóch plazmidów zawiera część komplementarną do drugiego tak, aby wytwarzać przez kointegrację plazmid końcowy, posiadający zatem całość genomu adenowirusa, otoczoną przez dwa ITR i sąsiadującą z co najmniej jednym miejscem restrykcyjnym znajdującym się w tym genomie. Fragment genomu adenowirusa rekombinacyjnego, znajdujący się w tych plazmidach, jest genomem niepełnym, który sam nie może okazać się potem zakaźny. Jest to szczególnie korzystne, ponieważ jeden tylko kointegrat z dwóch plazmidów może wytwarzać funkcjonalny genom. Plazmidy takie przedstawiono na przykład na fig. 1 i opisano je bardziej szczegółowo w poniższym tekście. Plazmidy te są, korzystnie, plazmidami prokariotycznymi i zawierają na ogół region plazmidowy i region adenowirusowy. Region plazmidowy umożliwia replikację i/lub selekcję plazmidów w komórce gospodarzu, w szczególności w prokariotycznej komórce gospodarzu. Region adenowirusowy (genom skrócony) dostarcza części rekombinacyjnego genomu adenowirusowego, która po rekombinacji z regionem adenowirusowym komplementarnego plazmidu ( rodzicielskiego lub wahadłowego ) umożliwia odtworzenie pełnego rekombinacyjnego genomu adenowirusowego. Region umożliwiający replikację w komórkach prokariotycznych, stosowany w plazmidach według niniejszego wynalazku, może być jedynym początkiem replikacji funkcjonalnej w wybranych komórkach. Może to być początek replikacji pochodzący z plazmidów grupy niezgodności P (przykład = prk290), który umożliwia replikację w szczepach E. coli pol A. Bardziej ogólnie, może to być każdy początek replikacji pochodzący z plazmidu replikującego się w komórkach prokariotycznych. Ten plazmid może być pochodną pbr322 (Bolivar i wsp., 1977), pochodną puc (Viera i Messing, 1982) lub innych plazmidów pochodzących z tej samej grupy niezgodności, to znaczy na przykład z ColE1 lub z pmb1. Plazmidy te można dobierać zresztą z innych grup niezgodności replikujących się w Escherichia coli. Mogą to być plazmidy pochodzące z plazmidów należących do grup niezgodności, na przykład: A, B, FI, FII, FIII, FIV, H1, H11, I1, I2, J, K, L, N, OF, P, Q, T, U, W, X, Y, Z lub 9. Można również stosować inne plazmidy, w tym plazmidy nie replikujące się w E. coli, ale w innych gospodarzach, takich jak: B. subtilis, Streptomyces, P. putida, P. aeruginosa, Rhizobium meliloti, Agrobacterium tumefaciens, Staphylococcus aureus, Streptomyces pristinaespiralis, Enterococcus faecium lub Clostridium. Korzystnie, stosuje się początek replikacji pochodzący z plazmidów replikujących się w E. coli. Region umożliwiający selekcję komórek prokariotycznych, zawierających plazmidy według niniejszego wynalazku może być utworzony szczególnie przez każdy gen nadający oporność na produkt, szczególnie na antybiotyk. Można więc zacytować na przykład geny nadające oporność na kanamycynę (Kan r ), na ampicylinę (Amp r ), na tetracyklinę (tet r ) lub na spektynomycynę, które po-

8 8 PL B1 wszechnie stosuje się w biologii molekularnej (Maniatis i wsp., 1989). Selekcji plazmidów można dokonywać przez inne geny, takie jak geny kodujące markery oporności na antybiotyk. Ogólnie, chodzi o geny nadające bakterii funkcję, której ona już nie posiada (może to odpowiadać genowi, który uległ delecji na chromosomie lub stał się nieczynny), przy czym geny na plazmidzie przywracają tę funkcję. Na przykład może być to gen RNA transferu, który odtwarza brakującą funkcję chromosomalną (Somoes i wsp., 1991). Korzystnie, plazmid wahadłowy i plazmid rodzicielski zawierają początek replikacji i/lub różne markery, aby umożliwić selekcję każdego elementu. Region adenowirusowy zawarty w każdym z tych plazmidów odpowiada w zasadzie sekwencji okrojonego genomu adenowirusowego. Te okrojone genomy znajdujące się w każdym plazmidzie są komplementarne, to znaczy zdolne do wytwarzania pełnego rekombinacyjnego genomu adenowirusa (liniowego), po homologicznej rekombinacji. Poza tym, okrojone genomy, znajdujące się w każdym z plazmidów, są otoczone, korzystnie przez jedno lub wiele miejsc restrykcyjnych, które nie są obecne w genomie adenowirusowym tak, że pełny adenowirusowy genom rekombinacyjny, wytworzony przez rekombinację, jest otoczony przez takie miejsca. Skrócony genom obecny w plazmidzie wahadłowym Plazmid wahadłowy, jak to wspomniano uprzednio, przeznaczony jest do przyjmowania danego kwasu nukleinowego w celu jego włączenia w rekombinacyjny genom adenowirusowy. Region adenowirusowy plazmidu wahadłowego odpowiada części lewej lub części prawej genomu adenowirusowego od jego końca (sekwencji ITR) aż do wybranego regionu homologii adenowirusowej, który umożliwi rekombinację homologiczną między dwoma plazmidami. Poza tym, ten genom adenowirusowy zawiera jedną lub więcej modyfikacji genetycznych. Według pierwszego sposobu wykonania skrócony genom obecny w plazmidzie wahadłowym odpowiada części lewej ostatecznego rekombinacyjnego genomu adenowirusowego. W tym sposobie wykonania zawiera on na przykład jedną sekwencję od lewego ITR aż do regionu kodującego białko pix (i/lub Iva2), przy czym heterologiczny kwas nukleinowy jest włączony zamiast całości lub części regionu E1. W tym szczególnym sposobie wykonania region homologii adenowirusowej jest utworzony przez region kodujący białka pix (i/lub Iva2). W innym sposobie wykonania skrócony genom obecny w plazmidzie wahadłowym odpowiada części prawej końcowego rekombinacyjnego genomu adenowirusowego. W tym sposobie wykonania zawiera on na przykład sekwencję od prawego ITR aż do regionu kodującego białko pix (i/lub Iva2), przy czym heterologiczny kwas nukleinowy jest włączony zamiast całości lub części, na przykład regionu E4 lub E3. W tym szczególnym sposobie wykonania region homologii adenowirusowowej składa się również z regionu kodującego białko pix (i/lub Iva2). Ponadto, w szczególnie korzystnym sposobie wykonania region homologii utworzony jest przez zmodyfikowaną sekwencję adenowirusową. Tak więc, region homologii może być utworzony na przykład przez zmodyfikowany region adenowirusa, poprzez zmianę zastosowania kodonu, przy zastosowaniu degeneracji kodu genetycznego. Takie modyfikacje opisano w zgłoszeniu patentowym WO 99/25861, które włącza się do niniejszego opisu przez przywołanie. W szczególnym sposobie wykonania region homologii adenowirusowej utworzony jest przez zdegenerowany region kodujący białko pix (i/lub Iva2). Należy rozumieć, że w zależności od wybranej struktury ostatecznego rekombinacyjnego genomu adenowirusowego (który tworzy się po rekombinacji) region homologii adenowirusowej może odpowiadać różnym regionom genomu. I tak, region adenowirusowy plazmidu rodzicielskiego może rozciągać się od lewego ITR aż do regionu E3, a zatem to właśnie ten region stanowi strefę homologii adenowirusowej. Bardziej ogólnie, region homologii adenowirusowej jest sekwencją dopowiadającą każdemu regionowi genomu adenowirusowego dzikiego lub zmodyfikowanego, która umożliwia rekombinację pomiędzy plazmidem wahadłowym a plazmidem rodzicielskim, w taki sposób, aby wytworzyć ostateczny rekombinacyjny genom adenowirusowy. Ten region homologii jest zatem w zasadzie identyczny w plazmidzie wahadłowym i w plazmidzie rodzicielskim. Może on odpowiadać różnym częściom genomu adenowirusa, w zależności od zastosowanego typu konstrukcji. W szczególnym sposobie wykonania niniejszego wynalazku plazmid wahadłowy zawiera skrócony genom, zawierający lewy region ITR, sekwencję enkapsydacji, heterologiczny kwas nukleinowy i region homologii adenowirusowej, utworzony przez region kodujący białka pix (i/lub Iva2), dziki lub zdegenerowany (por. na przykład plazmidy pjj1 i pig5).

9 PL B1 9 Ponadto, w korzystnym sposobie wykonania skrócony genom adenowirusowy jest otoczony, oprócz ITR, miejscem, które nie znajduje się w genomie adenowirusowym, na przykład PacI. Skrócony genom obecny w plazmidzie rodzicielskim Plazmid rodzicielski, jak to wspomniano powyżej, zawiera skrócony genom adenowirusowy, zdolny do uzupełnienia przez rekombinację okrojonego genomu obecnego w plazmidzie wahadłowym. Struktura jego zależy więc od struktury plazmidu wahadłowego. Ponadto, plazmid rodzicielski może zawierać także kwas nukleinowy, różny od kwasu znajdującego się w plazmidzie wahadłowym. I tak, ponieważ region adenowirusowy plazmidu wahadłowego odpowiada lewej części genomu adenowirusowego, skrócony genom obecny w plazmidzie rodzicielskim odpowiada jego części prawej, rozciągającej się od ITR aż do regionu homologii adenowirusowej. I odwrotnie, ponieważ region adenowirusowy plazmidu wahadłowego odpowiada prawej części genomu adenowirusowego, skrócony genom obecny w plazmidzie rodzicielskim odpowiada jego części lewej, rozciągającej się od ITR aż do regionu homologii adenowirusowej. W pierwszym sposobie wykonania skrócony genom obecny w plazmidzie rodzicielskim odpowiada części prawej ostatecznego rekombinacyjnego genomu adenowirusowego. W tym sposobie wykonania zawiera on na przykład sekwencję od prawego ITR aż do regionu kodującego białko pix (i/lub Iva2). Ponadto, genom może zawierać modyfikacje genetyczne, takie jak na przykład delecję całości lub części regionów E4 lub E3. W innym sposobie wykonania skrócony genom obecny w plazmidzie rodzicielskim odpowiada lewej części ostatecznego rekombinacyjnego genomu adenowirusowego. W tym sposobie wykonania zawiera on na przykład sekwencję od lewego ITR aż do sekwencji bliskiej regionu E4. Ponadto, genom może zawierać modyfikacje genetyczne, takie jak na przykład delecję całości lub części regionu E1. Korzystnie, plazmid rodzicielski zawiera skrócony genom odpowiadający prawej części genomu adenowirusowowego i zawiera niefunkcjonalny region E3. Bardziej korzystnie, zawiera on niefunkcjonalny region E4. Jeszcze korzystniej, zawiera on delecję całości lub części faz ORF3 i/lub ORF6 regionu E4. W innym korzystnym sposobie wykonania, plazmid rodzicielski zawiera skrócony genom, odpowiadający części prawej genomu adenowirusowego oraz zawiera funkcjonalne regiony E3 i E4. Konkretnymi przykładami takich plazmidów są pose1, pose10-00, pose30-00, pose17-00 i pose37-00 (por. fig. 1 i fig. 4). W tym sposobie wykonania plazmid wahadłowy zawiera skrócony genom odpowiadający lewej części genomu adenowirusowego i delecję całości lub części regionu E1. Dwoma szczególnie korzystnymi plazmidami według niniejszego wynalazku są plazmid po-se17-00 i plazmid pig5. POSE17-00 (plazmid rodzicielski ) zawiera początek replikacji plazmidu RK2, gen oporności na tetracyklinę i fragment genomu adenowirusowego, rozpoczynający się od zasady 3520 Ad5 i ciągnący się do prawego ITR, sąsiadującego z miejscem PacI. Ten fragment genomu posiada niefunkcjonalny region E3 i sekwencję zmodyfikowaną w pix i Iva2, jak to opisano w zgłoszeniu WO 99/ Plazmid pig5 (plazmid wahadłowy ) zawiera początek replikacji RK6 i nie może się replikować w szczepach E. coli pir-. Gen pig5 zawiera region ITR i region enkapsydacji, poprzedzone miejscem PacI, korzystną kasetę ekspresji i region homologiczny do pose17-00 (sekwencja zmodyfikowana pix i Iva2, jak to opisano w zgłoszeniu WO 99/25861). Korzystny genom ulega zatem rekonstrukcji przez homologiczną rekombinację dzięki obecności regionu homologicznego pomiędzy dwoma plazmidami (to znaczy zmodyfikowanej sekwencji pix i Iva2, jak to opisano w zgłoszeniu WO 99/25861). Sposób według niniejszego wynalazku pozwala również na wytwarzanie pełnego genomu rekombinacyjnego (zakaźnego) z dwóch plazmidów zawierających po części genomu (plazmid zawierający lewą sekwencję ITR, poprzedzoną miejscem PacI i zespół sekwencji wirusowych i nie wirusowych oraz plazmid poprzedzony sekwencjami wirusowymi lub nie wirusowymi, zawierający prawe ITR, po którym następuje miejsce PacI, przy czym wybór sekwencji wirusowych lub nie wirusowych zależy od doboru planowanej konstrukcji, a rekombinacyjny wektor adenowirusowy poddano delecji całości lub części genów wirusowych); oba plazmidy zawierają przy tym sekwencje wspólne, wystarczające do dokonania homologicznej rekombinacji i zawierają zachodzące na siebie fragmenty sekwencji, co umożliwia pojawienie się homologicznej rekombinacji. W szczególności, sposób ten umożliwia, w schemacie porównywalnym ze schematem przedstawionym dla wprowadzania sekwencji egzogennych do regionu E1, wprowadzanie sekwencji egzogennych do regionu E4 za pomocą odpowiednich plazmidów. W tym przypadku rekombinacja zachodzi między plazmidem rodzicielskim (zawierającym prawy region ITR i region enkapsydacji, poprzedzony miejscem restrykcji dla enzymu PacI i skróco-

10 10 PL B1 nym genomem adenowirusowym w pobliżu regionu E4) a plazmidem wahadłowym (zawierającym sekwencję bliską regionu E4, identyczną z wektorem rodzicielskim, która będzie brała udział w rekombinacji i następnie kasetę ekspresji danej sekwencji oraz prawy region ITR i unikalne miejsce PacI). Według szczególnie korzystnego sposobu wykonania, wytworzony genom adenowirusa jest również pozbawiony całości lub części regionu E3 i/lub E4, i/lub Iva2. Te dodatkowe delecje umożliwiają zwiększenie bezpieczeństwa wektora i podniesienie jego wydajności. Korzystnie, genom adenowirusowy jest pozbawiony części regionu E4, zawierającej co najmniej fazy ORF3 i ORF6. Genom adenowirusowy może również być zmodyfikowany, jak to opisano w zgłoszeniu FR , które włącza się do niniejszego opisu przez przywołanie, w taki sposób, aby uniknąć ryzyka zanieczyszczenia cząstek replikacji. W szczególnym sposobie wykonania wytworzony pełny rekombinacyjny genom adenowirusowy jest genomem określanym jako gutless, to znaczy, jest pozbawiony wszystkich regionów kodujących adenowirusa. W tym sposobie wykonania skrócony genom plazmidów zawiera z jednej strony ITR region enkapsydacji, a z drugiej strony ITR, region homologiczny, który może składać się z samego heterologicznego kwasu nukleinowego lub ze sztucznej sekwencji, włączonej do każdego plazmidu. Dlatego też, region homologii obecny w każdym plazmidzie może być, ogólnie, sekwencją nie wirusową, sztuczną lub nie, umożliwiającą rekombinację homologiczną. Genom rekombinacyjny może również zawierać kasety nadające się do wycięcia in vivo (WO 97/47757) i zmodyfikowane sekwencje genetyczne (geny włókna lub pentonu), umożliwiające modyfikację tropizmu wirusa. Poza tym, organizacja genomowa wirusa może również ulec modyfikacji, w celu poprawy bezpieczeństwa wytworzonych wirusów (WO 96/13596), Jak to wspomniano powyżej, rekombinacyjny genom adenowirusa jest, korzystnie, otoczony jednym lub kilkoma miejscami restrykcji, nieobecnymi w tym genomie. To miejsce lub miejsca umożliwiają proste i skuteczne wycięcie rekombinacyjnego genomu adenowirusowego plazmidu. Sekwencja genomowa adenowirusa jest znana i dostępna; specjalista może wybrać na drodze rutynowych doświadczeń miejsce restrykcyjne, nieobecne w tym genomie. Przykładowo, można wspomnieć o miejscach PacI, NspV i Swal (dla Ad5) lub SnabI (w Ad2). Można również nadać pewnym miejscom unikalność, zmieniając sekwencję genomu adenowirusowego. Tak więc, można stosować inne enzymy, jeżeli odpowiednie miejsca restrykcyjne ulegają zahamowaniu, modyfikacji lub delecji, w wytworzonej sekwencji adenowirusowej w E. coli. Miejsca mogą być umieszczane obok końców genomu adenowirusowego lub rozdzielone kilkoma parami zasad. Plazmidy według niniejszego wynalazku można wytwarzać stosując adenowirusy różnego pochodzenia. W istocie scharakteryzowano kilka serotypów adenowirusów, których struktura i właściwości trochę się różnią. Spośród tych serotypów korzystne jest stosowanie, według niniejszego wynalazku, adenowirusów ludzkich typu 2 lub 5 (Ad2 lub Ad5), lub adenowirusów pochodzenia zwierzęcego (patrz zgłoszenie WO 94/26914). Spośród adenowirusów pochodzenia zwierzęcego, które można zastosować według niniejszego wynalazku, można zacytować adenowirusy pochodzenia psiego, bydlęcego, mysiego (na przykład: Mavl, Beard i wsp. Virology 75 (1990) 81), owczego, świńskiego, ptasiego lub małpiego (na przykład: SAV). Korzystnie, adenowirusem pochodzenia zwierzęcego jest adenowirus psi, korzystniej adenowirus CAV2 [na przykład szczep manhattanski lub A26/61 (ATCC VR- -800)]. Według szczególnego sposobu wykonania niniejszego wynalazku stosowanym adenowirusem jest adenowirus pochodzenia ludzkiego. Według korzystnego sposobu wykonania, adenowirusem jest adenowirus pochodzenia zwierzęcego. Rekombinacja homologiczna i wytwarzanie wirusa Etap rekombinacji homologicznej (umożliwiający odtworzenie pełnego genomu) można wykonać technikami znanymi specjaliście, przez transfekcję (lub kotransfekcję) plazmidów w odpowiedniej komórce, korzystnie, komórce prokariotycznej. W korzystnym sposobie wykonania homologicznej rekombinacji dokonuje się w E. coli, stosując szczep pola w celu selekcji zdarzeń rekombinacji homologicznej. Oczywiste jest, że konstrukcje te można również wytwarzać przy braku systemów umożliwiających selekcję wydarzeń rekombinacji. W istocie takie zdarzenia rekombinacji można poddawać badaniu przesiewowemu celem minipreparacji, utraty lub nabycia znacznika, lub też badaniu przesiewowemu za pomocą sond radioaktywnych swoistych dla uzyskanych lub utraconych połączeń. Ponadto, istnieją inne techniki umożliwiające selekcję zdarzeń rekombinacji homologicznej w E. coli. Wśród nich wspomnijmy o zastosowaniu plazmidów termowrażliwych do ich replikacji (Hamilton i wsp. 1989), zastosowaniu cząsteczek kolistych nie replikujących się (opisane np. przez Slater i Maurer, 1993), zastosowaniu szczepów, w których zastosowany wektor się nie replikuje (Miller i Mekalanos 1988,

11 PL B1 11 Zeef i wsp. 1984), itd. Wszystkie te systemy można stosować zamiast szczepów pola i transformacji plazmidem pochodnym pbr322 lub jego licznych pochodnych, lub innych plazmidów, do replikacji zależnej od pola, lub też plazmidów nie replikujących się w E. coli. Innym celem niniejszego wynalazku jest każda komórka prokariotyczna zawierająca plazmid taki, jak to określono powyżej. Może to być w szczególności każda bakteria, dla której istnieje system wektora, do którego można wprowadzić rekombinacyjne DNA. Wymieńmy na przykład Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa, Agrobacterium tumefaciens, Rhizobium meliloti lub bakterie z rodzaju Streptomyces. Komórki te wytwarza się, korzystnie, poprzez transformację technikami znanymi specjaliście. Transformacja może w szczególności być wykonana techniką transformacji z zastosowaniem CaCl 2 (Dagert i Ehrlich, 1979) lub techniki opracowanej przez Hanahan i wsp. (1983), lub każdą techniką pochodną (Maniatis i wsp. 1989), jak również poprzez elektrotransformację (Wirth i wsp. 1989). Zobacz również techniki ogólne biologii molekularnej opisane poniżej. Innym celem niniejszego wynalazku jest sposób wytwarzania rekonstrukcyjnych genomów adenowirusowych. Według tego sposobu komórki prokariotyczne, takie jak opisano poniżej, hoduje się i następnie w drugim etapie odzyskuje się z nich plazmidy. Korzystnie, hodowlę prowadzi się przez czas dostatecznie długi do wytworzenia odpowiedniej ilości plazmidów. Plazmid można odzyskać ogólną techniką znaną specjaliście służącą wytworzeniu DNA plazmidowego. I tak, plazmid można odzyskać poprzez preparację przezroczystego lizatu i następnie odwirowanie w gradiencie chlorku cezu (Maniatis i wsp., 1989). Można stosować inne sposoby odwołujące się do innych sposobów lizy z zastosowaniem np. triton x-100 (Ausubel i wsp., 1987) lub kolumny anionowymiennej po etapie lizy i oddzielenia DNA plazmidowego od większości DNA chromosomowego białek. Tak wytworzone plazmidy mogą następnie być oczyszczane i traktowane w obecności enzymu restrykcyjnego odpowiadającego miejscom okalającym genom wirusowy. Pozwala to w jednym etapie na wytworzenie genomu liniowego rekombinacyjnego genomu adenowirusowego, nadającego się bezpośrednio do wykorzystania do klonalnego wytwarzania rekombinacyjnych wirusów. Tak więc, pierwszy sposób wytwarzania rekombinacyjnych wirusów polega na transfekowaniu genomu wirusowego wytworzonego z plazmidu według niniejszego wynalazku, w kompetentnej linii komórkowej enkapsydacji, tzn. w komórkach wykazujących wszystkie funkcje niezbędne do uzupełnienia defektywnego wirusa. Funkcje te, korzystnie, są zintegrowane z genomem komórki, co ogranicza ryzyko rekombinacji i nadaje większą stabilność linii komórkowej. Drugi sposób polega na kotransfekcji w odpowiedniej linii komórkowej wytworzonego genomu rekombinacyjnego i DNA jednego lub kilku wirusów lub plazmidu pomocniczego ( helper ). Według tego sposobu nie trzeba dysponować kompetentną linią komórkową zdolną do uzupełnienia wszystkich funkcji defektywnych adenowirusa rekombinacyjnego. Część tych funkcji jest w istocie uzupełniana przez wirus lub wirusy pomocnicze. Ten (lub te) wirusy pomocnicze same w sobie są defektywne. Spośród nadających się do wykorzystania linii komórkowych można wymienić zwłaszcza linie komórek zarodkowych nerki ludzkiej 293 (Graham i wsp., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59). Linia ta zawiera w szczególności zintegrowaną w genom lewą część genomu adenowirusa ludzkiego Ad5 (12%). Transfekcji można dokonać, korzystnie, bezpośrednio z produktem trawienia plazmidu uzyskanym według sposobu opisanego uprzednio bez etapu oczyszczania genomu adenowirusowego. Innymi liniami są na przykład linie wytworzone z komórek zarodkowych siatkówki (HER), komórek wątroby itd. Mogą to być linie uzupełniające funkcje E1 (293, komórki PERC-6), E1 i E6 (IGRP2), E1 i E2, itd. Linie takie opisano w stanie techniki, są one znane ze stanu techniki i mogą być wykorzystane przez specjalistę. Tak wytworzone adenowirusy można izolować lub oczyszczać technikami znanymi specjaliście (chlorek cezu, chromatografia, itd). Można je stosować w różnych zastosowaniach, takich jak wytwarzanie produktów terapeutycznych lub profilaktycznych in vitro, ex vivo lub in vivo, jak również do analizy funkcjonalnej genomu (i do tworzenia banków). Korzyści z zastosowania nowego sposobu są następujące: uproszczenie i większa szybkość wytwarzania wirusa rekombinacyjnego i brak konieczności etapu przesiewania związanego z systemami wielokrotnej selekcji uczestniczącymi w procesie i ze strukturą niefunkcjonalnego wektora rodzicielskiego. Przeciwnie do sposobów znanych ze stanu techniki, siła sposobu opiera się na jednoczesnym przeprowadzaniu selekcji, co prowadzi w jednym etapie do wybrania jednego końcowego plazmidu zawierającego funkcjonalny genom adenowirusowy. Wytworzenie nowego wektora rekombinacyjnego

12 12 PL B1 tylko w jednym etapie znacznie ogranicza konieczny czas pracy w porównaniu ze znanymi sposobami. Nie są potrzebne etapy przesiewania, tak więc ilość niezbędnej pracy jest znacznie mniejsza w porównaniu ze znanymi sposobami. Ponadto, brak konieczności przesiewania otwiera drogę do jednoczesnego wytwarzania wielu rekombinacyjnych wektorów adenowirusowych przez jedną osobę. Inną, korzystną cechą procesu według niniejszego wynalazku jest to, że oba plazmidy stosowane do wytwarzania plazmidu ostatecznego posiadającego genom funkcjonalny, nie są żywotne. Żaden z tych dwóch plazmidów początkowych nie posiada oddzielnie całości funkcji, które pozwoliłyby na wytworzenie funkcjonalnego genomu adenowirusowego. Tak więc, w skrajnym przypadku ucieczki do narzuconych środków selekcjonujących (antybiotyki), jeżeli oba typy konstrukcji (konstrukcja pożądana i plazmidy początkowe) musiałyby współistnieć po rekombinacji w szczepie bakteryjnym, wynik ten nie miałby wpływu na wytwarzanie pożądanego wektora rekombinacyjnego po transfekowaniu tej mieszaniny do wytwarzającej komórki eukariotycznej. Istotnie, tylko pożądana konstrukcja, powstała po rekombinacji homologicznej, wykazuje żywotność i namnaża się w wytwarzającej komórce eukariotycznej, natomiast plazmidy początkowe nie są żywotne (brak co najmniej jednego regionu ITR dla każdego plazmidu). Wyżej wspomniane cechy sposobu według niniejszego wynalazku przyczyniają się do uproszczenia wytwarzania wektorów adenowirusowych i odbierają możliwość wytwarzania wektorów rekombinacyjnych z dużą wydajnością. Można zatem wytwarzać jednocześnie rekombinacyjne wektory adenowirusowe zawierające znane sekwencje, dla których chcemy potwierdzić funkcje lub zespoły wektorów rekombinacyjnych zawierających sekwencje o nieznanej naturze, których funkcje chce się poznać. W tym ostatnim przypadku mówi się o adenowirusowych bankach ekspresji. Zastosowanie w terapii genowej Adenowirusy mogą być wykorzystywane w zastosowaniach terapeutycznych. W tym celu heterologiczny kwas nukleinowy może zawierać jeden lub kilka genów terapeutycznych i jeden lub kilka genów kodujących peptydy antygenowe. Geny terapeutyczne, które można w ten sposób przenosić, są to wszystkie geny, których transkrypcja i ewentualnie translacja w komórce docelowej powoduje powstanie produktów wykazujących działanie terapeutyczne. Mogą to być produkty homologiczne w stosunku do komórki docelowej (tzn. produkty, które normalnie są wydzielane przez komórkę docelową, kiedy nie ulega ona żadnemu procesowi patologicznemu). W tym przypadku ekspresja umożliwia na przykład złagodzenie skutków niedostatecznego wydzielania w komórce lub ekspresji białka nieczynnego lub słabo czynnego wskutek modyfikacji, lub też umożliwia zwiększenie wydzielania tego białka. Gen terapeutyczny może również kodować mutant białka komórkowego o zwiększonej stabilności, zmodyfikowanej aktywności, itd. Produkt może być również heterologiczny w stosunku do komórki docelowej. W tym przypadku wydzielane białko może na przykład uzupełniać lub nadawać brakującą funkcję komórki pozwalając jej zwalczać proces patologiczny. Spośród produktów terapeutycznych można wspomnieć szczególnie o enzymach, produktach krwiopochodnych, hormonach, limfokinach: interleukinach, interferonach, TNF, itd. (WO 93/19191), czynnikach wzrostu, neuroprzekaźnikach lub ich prekursorach, lub enzymach, syntetycznych czynnikach wzrostu: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, afgf, bbgf, NT3, NT5, itd.; apolipoproteinach: ApoAI, ApoAIV, ApoE, itd. (WO 94/25073), dystrofinie lub minidystrofinie (FR ), genach supresorowych guzów: p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, itd. (WO 94/24297), genach kodujących czynniki krzepnięcia: czynnik VII, VII, IX, genach samobójczych (TK, itd.), itd. Gen terapeutyczny może również być genem lub sekwencją antysensowną, której sekwencja w komórce docelowej umożliwia kontrolę sekwencji genów lub transkrypcji mrna komórkowego. Sekwencje takie mogą na przykład ulegać transkrypcji w komórce docelowej do RNA komplementarnego do mrna komórkowego i blokować w ten sposób ich translację do białek sposobem opisanym w patencie EP nr Jak to wspomniano uprzednio, dany kwas nukleinowy może również zawierać jeden lub wiele genów kodujących peptyd antygenowy, zgodny do wywoływania u człowieka reakcji odpornościowej. W tym korzystnym sposobie wykonania wynalazek umożliwia zatem wytwarzanie szczepionek umożliwiających uodpornianie człowieka, szczególnie przeciwko drobnoustrojom lub wirusom. Może to szczególnie dotyczyć peptydów antygenowych swoistych dla wirusa Epstein-Barr, wirusa HIV, wirusa zapalenia wątroby typu B (EP nr ), wirusa pseudowścieklizny lub peptydów swoistych dla nowotworów (EP nr ).