(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 14/ EP B1 (13) (1) T3 Int.Cl. C12N 1/8 (06.01) C12N 1/38 (06.01) C12N 1/36 (06.01) C12N 1/17 (06.01) C12N 1/12 (06.01) A61K 48/00 (06.01) A61K 9/16 (06.01) (4) Tytuł wynalazku: Konstrukty kwasu nukleinowego () Pierwszeństwo:..03 US P (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 06/31 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 14/07 (73) Uprawniony z patentu: PowderJect Vaccines, Inc., New York, US (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 JAMES FULLER, Canberry TWP, US (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Marta Kawczyńska POLSERVICE KANCELARIA RZECZNIKÓW PATENTOWYCH SP. Z O.O. ul. Bluszczańska Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 17/P34193PL00 EP Opis DZIEDZINA WYNALAZKU [0001] Wynalazek dotyczy dziedzin biologii molekularnej i immunologii, a generalnie odczynników przydatnych w technikach immunizacji kwasem nukleinowym. Bardziej konkretnie, wynalazek dotyczy konstruktów kwasu nukleinowego do ekspresji polipeptydów antygenowych i strategii immunizacji kwasem nukleinowym z zastosowaniem takich odczynników. 1 TŁO WYNALAZKU 2 [0002] Terapia genowa i immunizacja kwasem nukleinowym są obiecującymi podejściami do leczenia i profilaktyki chorób zarówno nabytych, jak i wrodzonych. Te techniki dostarczają transferu pożądanego kwasu nukleinowego do osobnika, z następującą potem ekspresją in vivo. Transfer można uzyskać poprzez transfekcję komórek lub tkanek osobnika ex vivo i ponowne wprowadzenie transformowanego materiału do gospodarza. Alternatywnie, kwas nukleinowy można podawać biorcy bezpośrednio in vivo. [0003] Każda z tych technik wymaga wydajnej ekspresji kwasu nukleinowego w transfekowanej komórce, aby dostarczyć dostateczną ilość terapeutycznego lub antygenowego produktu genu. Wiadomo, że kilka czynników wpływa na poziomy otrzymywanej ekspresji, w tym

3 2 1 2 wydajność transfekcji i wydajność, z którą gen lub sekwencja będąca przedmiotem zainteresowania podlega transkrypcji, a mrna translacji. [0004] Opisano w tej dziedzinie wiele systemów ekspresyjnych, a każdy z nich typowo składa się z wektora zawierającego gen lub sekwencję nukleotydową będącą przedmiotem zainteresowania połączoną w sposób umożliwiający działanie z sekwencjami kontrolnymi dla ekspresji. Te sekwencje kontrolne obejmują transkrypcyjne sekwencje promotorowe oraz sekwencje startu i terminacji transkrypcji. Powszechnie stosowane promotory dla systemów ekspresji w komórkach ssaczych obejmują, między innymi, wczesny promotor SV40, promotor cytomegalowirusa (CMV), taki jak najwcześniejszy promotor CMV (Chapman i wsp. (1991) Nucl. Acids Res. 19: ), promotor z długimi końcowymi powtórzeniami (LTR, ang. long terminal repeat) wirusa raka sutka myszy, główny późny promotor adenowirusa (Ad MLP, ang. adenovirus major late promoter) i promotor wirusa opryszczki pospolitej (HSV, ang. herpes simplex virus). Powszechnie stosowane są także promotory niewirusowe, takie jak promotor pochodzący z genu metalotioneiny myszowatych. [000] Systemy ekspresji często obejmują transkrypcyjne elementy modulacyjne, określane jako wzmacniacze. Wzmacniacze są szeroko zdefiniowane jako czynnik działający w układzie cis, który, kiedy jest połączony w sposób umożliwiający działanie z sekwencją promotora/genu, będzie zwiększał transkrypcję tej sekwencji genu. Wzmacniacze mogą działać z pozycji, która znajduje się znacznie dalej od sekwencji będącej

4 3 1 2 przedmiotem zainteresowania niż inne elementy kontroli ekspresji (np. promotory); i może działać, kiedy znajduje się w każdej z orientacji względem sekwencji będącej przedmiotem zainteresowania (Banerji i wsp. (1981) Cell 27:299-8, devilleirs i wsp. (1981) Nucl. Acids Res 9: ). Wzmacniacze zidentyfikowanio z wielu źródeł wirusowych, w tym wirusa polyoma, wirusa BK, cytomegalowirusa (CMV), adenowirusa, małpiego wirusa 40 (SV40), wirusa mięsaka Moloneya, bydlęcego wirusa brodawczaka i wirusa mięsaka Rousa (devilleirs i wsp., jak wyżej, Rosenthal i wsp. (1983) Science 222:749-7, Hearing i wsp. (1983) Cell 33:69-703, Weeks i wsp. (1983) Mol. Cell. Biol. 3: , Levinson i wsp. (1982) Nature 29: oraz Luciw i wsp. (1983) Cell 33: ). [0006] Wiele systemów ekspresyjnych do immunizacji kwasem nukleinowym i terapii genowej wykorzystuje najwcześniejszy promotor hcmv (ang. hcmv immediate Elary promotor). Patrz, np., patenty USA nr i dla Stinski i opis patentowy EP B1. Wektory ekspresyjne wykorzystujące najwcześniejszy promotor hcmv obejmują na przykład, pwrg7128 (Roy i wsp., Vaccine 19, , 01) oraz pbc12/cmv i pjw43, które są wspomniane w WO 9/660. Chapman i wsp. (1991) donoszą o zmniejszonych poziomach ekspresji z najwcześniejszego promotora hcmv w nieobecności intronu A hcmv. Dokumenty WO i WO opisują konstrukty kwasu nukleinowego odpowiednie do stosowana w immunizacji kwasem nukleinowym.

5 4 STRESZCZENIE WYNALAZKU 1 [0007] Opracowano konstrukt kwasu nukleinowego wykorzystujący poddane manipulacjom wirusowe sekwencje promotorowe/ekspresyjne, który zapewnia wzmocnioną ekspresję heterologicznych sekwencji kodujących w komórkach gospodarza. Konstrukt jest odpowiedni do wydajnej ekspresji genów kodujących antygen, a zatem może być stosowany w immunizacji kwasem nukleinowym. Konkretnie, konstrukt może być dostarczany na cząsteczkach nośnika do zastosowania w immunizacji kwasem nukleinowym za pośrednictwem cząstek. [0008] A zatem, niniejszy wynalazek dostarcza co następuje: 1. Konstrukt kwasu nukleinowego zawierający: 2 (i) sekwencję chimerowego promotora, która zawiera: (a) sekwencję najwcześniejszego promotora hcmv; (b) ekson 1 i co najmniej część eksonu 2 z głównego najwcześniejszego genu hcmv, przy czym ten ekson 1 i co najmniej część eksonu 2 przylegają do siebie; i (c) intron heterologiczny, który zastępuje całkowicie albo częściowo natywny intron A głównego najwcześniejszego genu hcmv;

6 1 (ii) sekwencję kodującą przyłączoną w sposób umożliwiający działanie do sekwencji promotora (i); i (iii) sekwencję wzmacniacza 3' połączoną w sposób umożliwiający działanie z sekwencją kodującą (ii); przy czym sekwencja wzmacniacza pochodzi z 3'UTR sekwencji HBsAg, a sekwencja kodująca (ii) jest heterologiczna względem sekwencji wzmacniacza. 2. Konstrukt kwasu nukleinowego według punktu 1 zawierający ponadto niepodlegającą translacji sekwencję liderową pochodzącą z sekwencji antygenu pres2 HBV, sekwencji antygenu e HBV i sekwencji antygenu gd HSV typu 2, przy czym sekwencja liderowa jest połączona w sposób umożliwiający działanie z promotorem i sekwencją kodującą, a sekwencja kodująca jest heterologiczna względem niepodlegającej translacji sekwencji liderowej. 3. Konstrukt kwasu nukleinowego zawierający: 2 (i) sekwencję chimerowego promotora, która zawiera: (a) sekwencję najwcześniejszego promotora hcmv; (b) ekson 1 i co najmniej część eksonu 2 z głównego najwcześniejszego genu hcmv, przy czym ten ekson 1 i co najmniej część eksonu 2 przylegają do siebie; i

7 6 (c) intron heterologiczny, który zastępuje całkowicie albo częściowo natywny intron A głównego najwcześniejszego genu hcmv; (ii) sekwencję kodującą połączoną w sposób umożliwiający działanie z chimerowym promotorem; 1 (iii) niepodlegającą translacji sekwencję liderową, która jest wybrana spośród sekwencji antygenu pres2 HBV, sekwencji antygenu e HBV i sekwencji antygenu gd HSV typu 2 i która jest połączona w sposób umożliwiający działanie z chimerowym promotorem; i (iv) sekwencję wzmacniacza, która pochodzi z niepodlegającego translacji regionu 3' (UTR) sekwencji HBsAg, która jest połączona w sposób umożliwiający działanie z chimerowym promotorem i która jest poniżej sekwencji kodującej. 4. Konstrukt kwasu nukleinowego według dowolnego z poprzednich punktów, w którym: 2 (i) sekwencja najwcześniejszego promotora hcmv (a) zawiera NR ID. SEKW.: 1, jej funkcjonalny wariant z co najmniej 80% identyczności albo funkcjonalny fragment dowolnej z nich; i/lub (ii) sekwencja eksonowa (b) zawiera NR ID. SEKW.: 2, jej funkcjonalny wariant z co

8 7 najmniej 80% identyczności albo funkcjonalny fragment dowolnej z nich.. Konstrukt kwasu nukleinowego według dowolnego z poprzednich punktów, w którym: heterologiczny intron (c) zawiera sekwencję wybraną spośród sekwencji intronu A szczurzego genu insuliny, sekwencji intronu A kurzego genu keratyny, sekwencji intronu A kurzego genu aktyny mięśnia sercowego, jej funkcjonalnego wariantu z co najmniej 80% identycznością z taką sekwencją intronu A albo jej funkcjonalnego fragmentu Konstrukt kwasu nukleinowego według punktu, w którym sekwencja intronu A szczurzego genu insuliny zawiera sekwencję NR ID. SEKW.: 3, jej funkcjonalny wariant z co najmniej 80% identycznością albo funkcjonalny fragment dowolnej z nich. 7. Konstrukt kwasu nukleinowego według dowolnego z poprzednich punktów, w którym: 2 (i) niepodlegająca translacji sekwencja liderowa jest wybrana spośród NR ID. SEKW.:, NR ID. SEKW.: 6, NR ID. SEKW.: 7, funkcjonalnego wariantu z co najmniej 80% identyczności z dowolną sekwencją spośród NR ID. SEKW.: do NR ID. SEKW.: 7, albo funkcjonalnego fragmentu dowolnej sekwencji spośród NR ID. SEKW.: do NR ID. SEKW.: 7 lub takiego ich wariantu; i/lub

9 8 (ii) sekwencja wzmacniacza jest wybrana spośród NR ID. SEKW.: 8, funkcjonalnego wariantu z co najmniej 80% identyczności NR ID. SEKW.: 8 albo funkcjonalnego fragmentu z NR ID. SEKW.: 8 lub takiego jej wariantu. 8. Konstrukt kwasu nukleinowego według dowolnego z poprzednich punktów, który zawiera: (i) sekwencję poliadenylacji; i/lub (ii) sekwencję kodującą peptyd sygnałowy Konstrukt kwasu nukleinowego według dowolnego z poprzednich punktów, w którym: 2 (i) sekwencją poliadenylacji jest sekwencja poliadenylacji genu wybranego spośród króliczego genu β-globiny, wczesnego lub późnego genu ludzkiego wirusa brodawczaka (HPV, ang. human papilloma virus), genu HSV-2gB, najwcześniejszego genu małpiego CMV i późnego genu HSVgD, funkcjonalnego wariantu z co najmniej 80% identyczności z dowolną z tych sekwencji lub funkcjonalnego fragmentu dowolnej z tych sekwencji poliadenylacji albo tych ich funkcjonalnych wariantów; i/lub (ii) peptyd sygnałowy jest wybrany spośród peptydu sygnałowego ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu (htpasp, ang. tissue

10 9 plasminogen activator signal peptide), peptydu sygnałowego aprotyniny, peptydu sygnałowego ekstensyny tytoniu, peptydu sygnałowego kurzego lizozymu, funkcjonalnego wariantu z co najmniej 80% identyczności z dowolną z tych sekwencji kodujących peptyd sygnałowy lub tego ich funkcjonalnego fragmentu. 1. Konstrukt kwasu nukleinowego według punktu 9, w którym: sekwencja poliadenylacji jest wybrana spośród NR ID. SEKW.:, NR ID. SEKW.: 11, NR ID. SEKW.: 12, NR ID. SEKW.: 13, funkcjonalnego wariantu z co najmniej 80% identyczności z dowolną sekwencją z NR ID. SEKW.: do NR ID. SEKW.: 13 albo funkcjonalnego fragmentu dowolnej spośród sekwencji NR ID. SEKW.: do NR ID. SEKW.: 13 lub tego ich wariantu. 11. Konstrukt kwasu nukleinowego według dowolnego z poprzednich punktów, w którym sekwencja kodująca koduje antygen Konstrukt kwasu nukleinowego według punktu 11, w którym antygenem jest patogen wirusowy, bakteryjny, pasożyta lub grzybowy, antygen alergiczny lub antygen nowotworowy. 13. Konstrukt kwasu nukleinowego według punktu 12, w którym antygenem wirusowym jest antygen HPV, HIV, HSV1, HSV2, wirusa grypy, wirusa zapalenia wątroby typu A lub wirusa zapalenia wątroby typu B.

11 14. Konstrukt kwasu nukleinowego według punktu 13, w którym antygenem jest HBsAg. 1. Konstrukt kwasu nukleinowego według dowolnego z punktów od 1 do, w którym sekwencja kodująca koduje rybozylującą ADP bakteryjną podjednostkę A i/lub podjednostkę B, aktywny homolog jednej albo obydwu tych podjednostek, przy czym każdy homolog ma co najmniej 80% identyczności z odpowiednią taką podjednostką lub aktywnym fragmentem tej podjednostki lub jej tym aktywnym homologiem Konstrukt kwasu nukleinowego według punktu 1, w którym bakteryjna podjednostka jest wybrana spośród podjednostki A toksyny cholery, podjednostki B toksyny cholery, podjednostki A termolabilnej toksyny E. coli, podjednostki B termolabilnej toksyny E. coli, aktywnego homologa mającego co najmniej 80% identyczności z dowolną z tych podjednostek lub aktywnego fragmentu dowolnej z tych podjednostek lub tych aktywnych homologów Konstrukt kwasu nukleinowego według dowolnego z poprzednich punktów, którym jest DNA plazmidowy. 18. Powlekane cząstki, odpowiednie do dostarczania z urządzenia do dostarczania za pośrednictwem cząstek, które to cząstki zawierają cząstki nośnika powlekane konstruktem kwasu nukleinowego według dowolnego z poprzednich punktów.

12 Powlekane cząstki według punktu 18, gdzie cząstkami nośnika jest złoto lub wolfram.. Zbiornik do dawkowania do urządzenia do dostarczania za pośrednictwem cząstek zawierający powlekane cząstki według punktu 18 albo Urządzenie do dostarczania za pośrednictwem cząstek załadowane powlekanymi cząstkami według punktu 18 albo Urządzenie do dostarczania za pośrednictwem cząstek według punktu 21, którym jest bezigłowa strzykawka. 23. Preparat farmaceutyczny zawierający konstrukt kwasu nukleinowego według dowolnego z punktów 1 do 17 i farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę. 24. Szczepionka zawierająca konstrukt kwasu nukleinowego według dowolnego z punktów 11 do Szczepionka według punktu 24, zawierająca ponadto konstrukt adiuwantowy według punktu 1 albo Sposób in vitro otrzymywania ekspresji w komórkach ssaczych polipeptydu będącego przedmiotem zainteresowania, który to sposób obejmuje przenoszenie do takich komórek konstruktu kwasu

13 12 nukleinowego według dowolnego z punków 1 do 17 lub powlekanych cząstek według punktu 18 albo Konstrukt kwasu nukleinowego według dowolnego z punków 11 do 14 do zastosowania w immunizacji Konstrukt kwasu nukleinowego według punktu 27, gdzie immunizacja jest przeciwko zakażeniu patogenem, alergii lub nowotworowi. 29. Konstrukt kwasu nukleinowego według punktu 27 albo 28, gdzie dostarczanie ma być poprzez wstrzyknięcie, dostarczanie przy użyciu cząstek przeskórnych, inhalację, miejscowe, doustne, donosowe lub przezśluzówkowe. [0009] Te i inne przedmioty, aspekty, wykonania i korzyści niniejszego wynalazku będą oczywiste dla specjalistów w tej dziedzinie w świetle tego ujawnienia. KRÓTKI OPIS RYSUNKÓW 2 [00] Fig. 1 przedstawia poziomy ekspresji antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B (HBsAg, ang. hepatitis B virus surface antigen) otrzymane przy zastosowaniu różnych plazmidowych wektorów ekspresyjnych.

14 13 Fig. 2 pokazuje efekt dodania intronu na ekspresję HBsAg w komórkach SCC1 i beta-gal w komórkach B16 (średnia z trzech dośw.). Fig. 3 pokazuje efekt intronu A szczurzej insuliny i 3'UTR HBV na ekspresję beta-gal w komórkach SCC1 (średnia z trzech dośw.). Fig. 4 pokazuje efekt intronu A szczurzej insuliny i 3'UTR HBV na ekspresję HSVgD w komórkach SCC1 (średnia z trzech dośw.). 1 Fig. pokazuje efekt intronu A szczurzej insuliny i 3'UTR HBV na ekspresję SEAP w komórkach SCC1 i B16 (trzy powtórzenia na linię komórkową). 2 Fig. 6 pokazuje zdolność heterologicznych peptydów sygnałowych do kierowania sekrecją SEAP lub fragmentu hfc w komórkach B16. Fig. 7 przedstawia poziomy przeciwciał wykrywanych w surowicy myszy immunizowanych kwasami nukleinowymi kodującymi antygen zawartymi w rozmaitych plazmidowych wektorach ekspresyjnych. Fig. 8 to przedstawienie w postaci diagramu wektora ekspresyjnego pjv. pjv7389. Fig. 9 to przedstawienie w postaci diagramu

15 14 pjv7400. Fig. to przedstawienie w postaci diagramu pjv7468. Fig. 11 to przedstawienie w postaci diagramu pjv763. Fig. 12 to przedstawienie w postaci diagramu Fig. 13 przedstawia skład zasad dla pjv763. Krótki opis sekwencji 1 [0011] NR ID. SEKW.: 1 to sekwencja najwcześniejszego promotora hcmv (GenBank #M60321, X17403) NR ID. SEKW.: 2 to sekwencja z eksonów 1 i 2 głównego najwcześniejszego genu hcmv (GenBank #M60321, X17403) NR ID. SEKW.: 3 to sekwencja intronu A szczurzej insuliny (GenBank #J00748) 2 NR ID. SEKW.: 4 to sekwencja chimerowego promotora według niniejszego wynalazku NR ID. SEKW.: to sekwencja liderowa z sekwencji ' UTR antygenu pres2 HBV (GenBank #M4923)

16 1 NR ID. SEKW.: 6 to sekwencja liderowa z sekwencji ' UTR gd typu 2 HSV (GenBank #Z86099) NR ID. SEKW.: 7 to sekwencja liderowa z sekwencji ' UTR antygenu e HBV (GenBank #M4923) NR ID. SEKW.: 8 to sekwencja 3'UTR HBVenh (GenBank #AF1438) NR ID. SEKW.: 9 to sekwencja 3'UTR małpiego najwcześniejszego genu (GenBank #M16019) 1 NR ID. SEKW.: to sekwencja poli A króliczej β globiny (GenBank #K0326) NR ID. SEKW.: 11 to sekwencja poli A najwcześniejszego genu małpiego scmv (GenBank #M16019) NR ID. SEKW.: 12 to sekwencja poli A genu gb HSV2 (GenBank #Z86099) NR ID. SEKW.: 13 to sekwencja poli A wczesnego genu HPV16 (GenBank #K02718) 2 NR ID. SEKW.: 14 to sekwencja wektora ekspresyjnego pjv NR ID. SEKW.: 1 to starter do PCR JF93 NR ID. SEKW.: 16 to starter do PCR F1 NR ID. SEKW.: 17 to starter do PCR GW1

17 16 NR ID. SEKW.: 18 to starter do PCR JF24 NR ID. SEKW.: 19 to starter do PCR GW NR ID. SEKW.: to starter do PCR JF2 NR ID. SEKW.: 21 to starter do PCR DS1 NR ID. SEKW.: 22 to starter do PCR DA1 NR ID. SEKW.: 23 to starter do PCR JF1 NR ID. SEKW.: 24 to starter do PCR JF2 1 NR ID. SEKW.: 2 to starter do PCR JF84 NR ID. SEKW.: 26 to starter do PCR JF22 NR ID. SEKW.: 27 to starter do PCR JF33 NR ID. SEKW.: 28 to starter do PCR JF336 NR ID. SEKW.: 29 to starter do PCR JF37 2 NR ID. SEKW.: to starter do PCR JF36 NR ID. SEKW.: 31 to starter do PCR JF393 NR ID. SEKW.: 32 to starter do PCR JF406 NR ID. SEKW.: 33 to starter do PCR JF26

18 17 NR ID. SEKW.: 34 to starter do PCR JF27 NR ID. SEKW.: 3 to starter do PCR JF3 NR ID. SEKW.: 36 to starter do PCR JF321 NR ID. SEKW.: 37 to starter do PCR JF386 NR ID. SEKW.: 38 to starter do PCR FcAS NR ID. SEKW.: 39 to oligonukleotyd JF34 NR ID. SEKW.: 40 to starter do PCR JF3 1 NR ID. SEKW.: 41 to starter do PCR JF36 NR ID. SEKW.: 42 to oligonukleotyd JF348 NR ID. SEKW.: 43 to starter do PCR JF349 NR ID. SEKW.: 44 to starter do PCR JF NR ID. SEKW.: 4 to oligonukleotyd JF31 2 NR ID. SEKW.: 46 to starter do PCR JF32 NR ID. SEKW.: 47 to starter do PCR JF33 NR ID. SEKW.: 48 to starter do PCR JF4 NR ID. SEKW.: 49 to starter do PCR JF442

19 18 NR ID. SEKW.: 0 to starter do PCR JF421 NR ID. SEKW.: 1 to starter do PCR JF444 NR ID. SEKW.: 2 to sekwencja promotorowa wirusa pseudowścieklizny (PRV, ang. Pseudorabies virus). NR ID. SEKW.: 3 to sekwencja promotorowa wirusa mięsaka Rousa (RSV, ang. Rous sarcoma virus). SZCZEGÓŁOWY OPIS 1 2 [0012] Przed szczegółowym opisaniem niniejszego wynalazku, należy rozumieć, że ten wynalazek nie jest ograniczony do podanych konkretnie jako przykład cząsteczek lub parametrów sposobu, ponieważ te mogą oczywiście różnić się. Należy również rozumieć zrozumiałe, że stosowana tu terminologia jest przeznaczona jedynie dla celów opisania konkretnych wykonań wynalazku i nie ma być ograniczająca. Dodatkowo, przy wykonywaniu wynalazku będą stosowane, o ile nie zaznaczono, że jest inaczej, konwencjonalne metody wirusologii, mikrobiologii, technik rekombinowania DNA i immunologii, wszystkie będące w zakresie umiejętności specjalisty w tej dziedzinie. Takie techniki są w pełni wyjaśnione w piśmiennictwie. Patrz, np., Sambrook, i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Wydanie 2., 1989); DNA Cloning: A Practical Approach, tom. I, & 1 (D. Glover, red.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, red., 1984); A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); oraz

20 19 Fundamental Virology, Wydanie 2., tom. I & II (B.N. Fields i D.M. Knipe, red.). [0013] Należy odnotować, że tak jak jest to stosowane w tym opisie i załączonych zastrzeżeniach, formy w liczbie pojedynczej (ang. a, an i the ) obejmują ich odpowiedniki w liczbie mnogiej, o ile kontekst nie wskazuje wyraźnie, że jest inaczej. 1 2 A. Definicje [0014] O ile nie zdefiniowano, że jest inaczej, wszystkie stosowane tu terminy techniczne i naukowe mają takie samo znaczenie, jak powszechnie zrozumiałe przez specjalistów w dziedzinie, do której wynalazek należy. Jakkolwiek wiele metod i materiałów podobnych albo równoważnych tym tu opisanym można zastosować przy wykonywaniu niniejszego wynalazku, korzystne materiały i metody są tu opisane. [001] Przy opisywaniu niniejszego wynalazku, będą stosowane następujące terminy i mają one być zdefiniowane jak wskazano poniżej. [0016] Termin immunizacja kwasem nukleinowym jest tu stosowany w odniesieniu do wprowadzania cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej jeden albo większą liczbę wybranych antygenów do komórek gospodarza w celu uzyskania ekspresji in vivo antygenu lub antygenów. Cząsteczkę kwasu nukleinowego można wprowadzić bezpośrednio do osobnika biorcy, na przykład poprzez standardowe wstrzyknięcie domięśniowe lub doskórne; dostarczanie przy użyciu cząstek przeskórnych; inhalację; sposoby dostarczania miejscowo, doustnie,

21 1 2 donosowo lub przezśluzówkowo. Alternatywnie, cząsteczkę można wprowadzić ex vivo do komórek, które zostały pobrane od osobnika. W tym ostatnim przypadku, komórki zawierające cząsteczkę kwasu nukleinowego będącego przedmiotem zainteresowania, wprowadza się z powrotem do osobnika tak, że może być wzbudzona odpowiedź immunologiczna wobec antygenu zakodowanego przez cząsteczkę kwasu nukleinowego. Cząsteczki kwasu nukleinowego stosowane do takiej immunizacji są tu ogólnie określane jako szczepionki z kwasem nukleinowym. [0017] Termin adiuwant ma oznaczać materiał lub kompozycję zdolną do swoistego lub nieswoistego zmieniania, zwiększania, kierowania, przekierowywania, wzmacniania lub inicjowania reakcji immunologicznej swoistej wobec antygenu. Zatem współpodawanie adiuwanta z antygenem może skutkować niższą dawką lub mniejszą liczbą dawek antygenu niezbędnych dla uzyskania pożądanej odpowiedzi immunologicznej u osobnika, któremu antygen jest podawany, albo współpodawanie może skutkować jakościowo i/lub ilościowo inną odpowiedzią immunologiczną u osobnika. Konkretnie, podawanie adiuwanta może skutkować zwiększoną odpowiedzią immunologiczną, taką jak o większej wielkości i/lub czasie trwania. Skuteczność adiuwanta można określić poprzez podawanie zwierzętom adiuwanta z kompozycją szczepionki, równolegle z samą kompozycją szczepionki i porównanie odporności zależnej od przeciwciał i/lub komórek w dwóch grupach stosując standardowe testy, takie jak testy radioimmunologiczne, testy ELISA i testy CTL.

22 [0018] Nośnik rdzeniowy oznacza nośnik, który jest powlekany wprowadzanym kwasem nukleinowym (np. DNA, RNA), w celu uzyskania określonej wielkości cząstek, jak również wystarczająco dużej gęstości, aby osiągnąć wymagany pęd do penetracji błony komórkowej tak, że wprowadzana cząsteczka może być dostarczana przy zastosowaniu technik za pośrednictwem cząstek (patrz, np. patent USA nr,0,792). Nośniki rdzeniowe zazwyczaj obejmują materiały, takie jak wolfram, złoto, platyna, ferryt, polistyren i lateks. Patrz np. Particle Bombardment Technology for Gene Transfer, (1994) Yang, N. red., Oxford University Press, New York, NY, strony -11. [0019] Strzykawka bezigłowa oznacza urządzenie, które dostarcza kompozycję cząstek przezskórnie bez pomocy konwencjonalnej igły do przekłuwania skóry. Strzykawki bezigłowe do stosowania w niniejszym wynalazku są omówione w niniejszym dokumencie. [00] Termin dostarczanie przezskórne ma oznaczać podawanie doskórne (np. do skóry właściwej lub naskórka), przezskórne (np. przez skórę, ang. percutaneous ) i przez błony śluzowe, tj. dostarczanie poprzez przejście czynnika do lub przez tkankę skóry lub błony śluzowej. Patrz, np., Transdermal Drug Delivery: Developmental Issues and Research Initiatives, Hadgraft and Guy (red.), Marcel Dekker, Inc., (1989); Controlled Drug Delivery: Fundamentals and Applications, Robinson and Lee (red.), Marcel Dekker Inc., (1987); oraz Transdermal Delivery of Drugs, tomy 1-3, Kydonieus and Berner (red.), CRC Press, (1987). A zatem, termin ten obejmuje

23 dostarczanie ze strzykawki bezigłowej, jak opisano w patencie USA nr,6,796, jak również dostarczanie za pośrednictwem cząstek, jak opisano w patencie USA nr,86,796. [0021] Polipeptyd jest stosowany w najszerszym znaczeniu w odniesieniu do związku o dwóch lub większej liczbie podjednostek - aminokwasów, analogów aminokwasów lub innych peptydomimetyków. Podjednostki mogą być połączone wiązaniami peptydowymi lub innymi wiązaniami, na przykład estrowym, eterowym, itd. Tak jak jest tu stosowany, termin aminokwas odnosi się zarówno do naturalnych, jak i/lub syntetycznych lub nienaturalnych aminokwasów, w tym glicyny, i obydwu izomerów optycznych, D lub L, oraz analogów aminokwasów i peptydomimetyków. Peptyd o trzech lub więcej aminokwasach jest powszechnie nazywany oligopeptydem, jeśli łańcuch peptydowy jest krótki. Jeśli łańcuch peptydowy jest długi, peptyd typowo zwany jest polipeptydem lub białkiem. [0022] Termin antygen odnosi się do dowolnego czynnika, na ogół makrocząsteczki, która może wywoływać odpowiedź immunologiczną u osobnika. Termin ten może być stosowany w odniesieniu do pojedynczej makrocząsteczki albo homogennej lub heterogennej populacji makrocząsteczek antygenowych. Tak jak jest tu stosowany, termin antygen jest generalnie stosowany w odniesieniu do cząsteczki białka lub jej części, która zawiera jeden lub więcej epitopów. Dla celów niniejszego wynalazku, antygeny można otrzymać lub mogą one pochodzić z dowolnego odpowiedniego źródła. Ponadto, dla celów niniejszego wynalazku, antygen

24 obejmuje białko mające modyfikacje, takie jak delecje, addycje i podstawienia (na ogół o naturze konserwatywnej) względem sekwencji natywnej, o ile białko zachowuje wystarczającą immunogenność. Te modyfikacje mogą być zamierzone, np. poprzez ukierunkowaną mutagenezę, lub mogą być przypadkowe, takie jak poprzez mutacje gospodarzy, którzy wytwarzają antygeny. [0023] Odpowiedź immunologiczna wobec antygenu będącego przedmiotem zainteresowania jest to rozwinięcie się u osobnika humoralnej i/lub komórkowej odpowiedzi immunologicznej na ten antygen. Dla celów niniejszego wynalazku, humoralna odpowiedź immunologiczna odnosi się do odpowiedzi immunologicznej, w której pośredniczą cząsteczki przeciwciała, podczas gdy komórkowa odpowiedź immunologiczna to taka, w której pośredniczą limfocyty T i/lub inne białe krwinki. [0024] Termin cząsteczka kwasu nukleinowego i polinukleotyd są stosowane tu zamiennie i odnoszą się do polimerowej postaci nukleotydów o dowolnej długości, bądź deoksyrybonukleotydów, bądź rybonukleotydów, albo ich analogów. Polinukleotydy mogą mieć dowolną strukturę trójwymiarową i mogą pełnić dowolną funkcję, znaną lub nieznaną. Nieograniczające przykłady polinukleotydów obejmują gen, fragment genu, eksony, introny, RNA informacyjny (mrna), RNA przenośnikowy, RNA rybosomalny, rybozymy, cdna, polinukleotydy rekombinowane, polinukleotydy rozgałęzione, plazmidy, wektory, izolowany DNA o dowolnej sekwencji, izolowany

25 RNA o dowolnej sekwencji, kwasy nukleinowe - sondy i startery. [002] Polinukleotyd typowo składa się z określonej sekwencji czterech zasad nukleotydowych: adeniny (A), cytozyny (C), guaniny (G) i tyminy (T) (uracylu (U) zamiast tyminy (T), gdy polinukleotydem jest RNA). A zatem, termin sekwencja kwasu nukleinowego to alfabetyczne przedstawienie cząsteczki polinukleotydowej. To alfabetyczne przedstawienie może być wprowadzane do bazy danych w komputerze mającym jednostkę centralną przetwarzania i wykorzystywane do zastosowań bioinformatycznych, takich jak genomika funkcjonalna i poszukiwanie homologii. [0026] Wektor jest zdolny do przenoszenia sekwencji kwasów nukleinowych do docelowych komórek (np. wektory wirusowe, wektory niewirusowe, nośniki w postaci cząstek oraz liposomy). Typowo, konstrukt wektorowy, wektor ekspresyjny lub wektor do transferu genu oznacza dowolny konstrukt kwasu nukleinowego zdolny do kierowania ekspresją genu będącego przedmiotem zainteresowania i który może przenosić sekwencje genów do komórek docelowych. A zatem termin ten obejmuje nośniki do klonowania i ekspresji, a także wektory wirusowe. Plazmid to wektor w postaci pozachromosomowego elementu genetycznego. [0027] Sekwencja kwasu nukleinowego, która koduje wybrany antygen to cząsteczka kwasu nukleinowego, która podlega transkrypcji (w przypadku DNA) i translacji (w przypadku mrna) do polipeptydu in vivo, gdy jest umieszczona pod kontrolą odpowiednich sekwencji regulacyjnych. Granice sekwencji kodującej są

26 2 1 2 wyznaczane przez kodon startowy na końcu ' (koniec aminowy) i kodon stop na końcu 3' (karboksylowy). Dla celów wynalazku, takie sekwencje kwasu nukleinowego mogą obejmować, ale nie są ograniczone do tego, cdna z wirusowego, prokariotycznego lub eukariotycznego mrna, sekwencje genomowe z wirusowego lub prokariotycznego DNA lub RNA, a nawet sekwencje syntetycznego DNA. Sekwencja terminacyjna dla transkrypcji może być położona po stronie 3' względem sekwencji kodującej. [0028] Promotor to sekwencja nukleotydowa, która inicjuje i reguluje transkrypcję polinukleotydu kodującego polipeptyd. Promotory mogą obejmować promotory indukowalne (gdzie ekspresja sekwencji polinukleotydowej przyłączonej w sposób umożliwiający działanie do promotora jest indukowana przez analit, kofaktor, białko regulacyjne, itd.), promotory podlegające represji (gdzie ekspresja sekwencji polinukleotydowej przyłączonej w sposób umożliwiający działanie do promotora jest tłumiona przez analit, kofaktor, białko regulacyjne, itd.) i promotory konstytutywne. Termin promotor lub element kontrolny ma obejmować regiony promotorowe o pełnej długości oraz funkcjonalne (np. kontrolujące transkrypcję lub translację) odcinki tych regionów. [0029] Termin połączony w sposób umożliwiający działanie odnosi się do takiego uporządkowania elementów, gdzie części składowe tak opisane są tak skonfigurowane, aby spełniać ich zwykłą funkcję. A zatem, dany promotor połączony w sposób umożliwiający działanie z sekwencją kwasu nukleinowego jest zdolny do przeprowadzania ekspresji tej sekwencji, kiedy obecne

27 są właściwe enzymy. Promotor nie musi stanowić ciągu z sekwencją, o ile działa on bezpośrednio na jej ekspresję. A zatem, na przykład, sekwencje przerywnikowe niepodlegające translacji, ale podlegające transkrypcji mogą być obecne między sekwencją promotora i sekwencją kwasu nukleinowego, a sekwencja promotorowa może być nadal być uważana za połączoną w sposób umożliwiający działanie z sekwencją kodującą. [00] Rekombinowany stosuje się tu aby opisać cząsteczkę kwasu nukleinowego (polinukleotyd) pochodzenia genomowego, z cdna, półsyntetycznego lub syntetycznego, która, z racji swojego pochodzenia lub manipulacji, nie jest połączona z całym lub częścią polinukleotydu, z którym jest związana w naturze i/lub jest związana z polinukleotydem innym niż ten, z którym jest związana w naturze. Dwie sekwencje kwasu nukleinowego, które są zawarte w obrębie jednej rekombinowanej cząsteczki kwasu nukleinowego są heterologiczne w stosunku do siebie, gdy nie są one normalnie związane ze sobą w naturze. [0031] Jest tutaj odniesienie do homologów polinukleotydów. Typowo, polinukleotyd, który jest homologiczny do innego polinukleotydu, jest co najmniej w 70% homologiczny do polinukleotydu, korzystnie co najmniej w 80 lub 90%, a korzystniej co najmniej w 9%, 97%, 99% homologiczny do niego. Metody mierzenia homologii są dobrze znane w tej dziedzinie i będzie zrozumiałe dla specjalistów w tej dziedzinie, że w niniejszym kontekście, homologia jest obliczana na podstawie identyczności kwasu nukleinowego. Taka

28 homologia może występować w regionie wynoszącym co najmniej 1, korzystnie co najmniej, na przykład co najmniej 40, 60 lub 0 lub więcej przylegających do siebie nukleotydów. [0032] Metody mierzenia identyczności lub homologii polinukleotydów są znane w stanie w tej dziedzinie. Na przykład pakiet UWGCG dostarcza programu BESTFIT, który można zastosować do obliczania homologii (np. stosowany z jego ustawieniami domyślnymi) (Devereux i wsp. (1984) Nucleic Acids Research 12, str ). [0033] Algorytmy PILEUP i BLAST można również zastosować do obliczania homologii lub zestawiania sekwencji (typowo przy ustawieniach domyślnych), na przykład jak opisano w Altschul, S. F. (1993) J Mol Evol 36:290-0; Altschul, S. F. i wsp. (1990) J Mol Biol 21:403-. [0034] Oprogramowanie do przeprowadzania analiz BLAST jest publicznie dostępne za pośrednictwem National Centre for Biotechnology Information ( Ten algorytm obejmuje najpierw identyfikację par sekwencji o wysokiej punktacji (HSP, ang. high scoring sequence pair) poprzez identyfikację krótkich słów o długości W w sekwencji stanowiącej zapytanie, które bądź pasują, bądź spełniają wymóg pewnej progowej punktacji T o wartości dodatniej, kiedy są przyrównane ze słowem o tej samej długości w sekwencji z bazy danych. T określa się jako progową punktację dla sąsiednich słów (Altschul i wsp., jak wyżej). Te początkowe trafienia dla sąsiednich słów działają jako punkty wyjścia dla zapoczątkowania poszukiwań HSP, które je zawierają.

29 Trafione słowa rozciąga się w obydwu kierunkach wzdłuż każdej sekwencji tak daleko, jak kumulatywna punktacja przyrównania może być zwiększana. Wydłużenia trafionych słów w każdym kierunku trafionych są zatrzymywane, kiedy: kumulatywna punktacja przyrównania dąży do zera albo poniżej na skutek akumulacji jednej albo więcej przyrównań reszt dających wynik ujemny, lub osiągnięty zostaje koniec którejś z sekwencji. Parametry algorytmu BLAST: W, T i X określają czułość i szybkość przyrównania. Program BLAST stosuje jako wartości domyślne długość słowa (W) wynoszącą 11, przyrównanie (B) przy zastosowaniu macierzy porównywania BLOSUM62 (patrz Henikoff i Henikoff (1992) Proc. Natl. Natl. Acad. Sci. USA 89:91-919) wynoszące 0, wartość oczekiwanią (E) wynoszącą, M =, N = 4 i porównywanie obu nici. [003] Algorytm BLAST przeprowadza analizę statystyczną podobieństwa między dwiema sekwencjami, patrz, np., Karlin i Altschul (1993) Proc. Natl. Natl, Acad. Sci. USA 90: Jedną z miar podobieństwa dostarczaną przez algorytm BLAST jest najmniejsze prawdopodobieństwo sumaryczne (P(N)), które wskazuje na prawdopodobieństwo, że dopasowanie dwóch sekwencji nukleotydowych lub aminokwasowych mogłoby nastąpić losowo. Na przykład, sekwencję uważa się za podobną do innej sekwencji, jeżeli najmniejsze prawdopodobieństwo sumaryczne przy porównywaniu pierwszej kolejności do drugiej sekwencji wynosi mniej niż około 1, korzystnie mniej niż około 0,1, korzystniej mniej niż około 0,01, a najkorzystniej mniej niż około 0,001.

30 [0036] Homologi typowo hybrydyzują z odpowiednim polinukleotydem na poziomie znacząco powyżej tła. Poziom sygnału wytwarzanego przez oddziaływanie pomiędzy homologiem i polinukleotydem jest typowo co najmniej -krotnie, korzystnie co najmniej 0-krotnie tak intensywne, jak hybrydyzacji stanowiącej tło Intensywność oddziaływania można mierzyć, na przykład, poprzez znakowanie izotopem promieniotwórczym sondy, np., 32 P. Wybiórczą hybrydyzację uzyskuje się zazwyczaj stosując warunki o średniej do wysokiej ostrości, przykładowo, 0,03 M chlorek sodu i 0,003 M cytrynian sodu w temperaturze od około 0 C do około 60 C. [0037] Ostre warunki hybrydyzacji mogą obejmować 0% formamid, x roztwór Denhardta, x SSC, 0,1% SDS i 0 µg/ml zdenaturowanego DNA ze spermy łososia, a warunki płukania mogą obejmować 2x SSC, 0,1% SDS w 37 C, a następnie 1x SSC, 0,1% SDS w 68 C. Określanie odpowiednich warunków hybrydyzacji leży w zakresie umiejętności w tej dziedzinie. Patrz np. Sambrook i wsp., jak wyżej. [0038] Homolog może różnić się od sekwencji odpowiedniego polinukleotydu o mniej niż 3,,, 1, lub większą liczbę mutacji (z których każda może być podstawieniem, delecją lub insercją). Mutacje te można mierzyć na obszarze co najmniej, na przykład przynajmniej 40, 60 lub 0 lub więcej przylegających do siebie nukleotydów homologu. Tam, gdzie polinukleotyd koduje polipeptyd, podstawienia tworzą zmiany konserwatywne kodowanego aminokwasu. Są one definiowane zgodnie z następującą dalej tabelą. W przypadku konserwatywnych zmian aminokwasy w tym samym

31 bloku w drugiej kolumnie i korzystnie w tym samym wierszu w trzeciej kolumnie mogą być wzajemnie zastępowane. ALIFATYCZNE Niepolarne G A P I L V Polarne-bez ładunku Polarne-z ładunkiem C S T M N Q D E K R AROMATYCZNE H F W Y 1 [0039] Terminy osobnik i podmiot są tu stosowane wymiennie w odniesieniu do dowolnego przedstawiciela podgromady strunowców, obejmującego, bez ograniczania, ludzi i inne naczelne, w tym naczelne inne niż człowiek, takie jak szympansy oraz inne gatunki małp i małp bezogonowych; zwierzęta gospodarskie takie jak bydło, owce, świnie, kozy i konie; ssaki domowe, takie jak psy i koty; zwierzęta laboratoryjne, w tym gryzonie, takie jak myszy, szczury i świnki morskie; ptaki, w tym ptaki domowe, dzikie i łowne, takie jak kury, indyki i inne ptaki grzebiące, kaczki, gęsi i tym podobne. Terminy nie określają konkretnego wieku. A zatem, mogą być nim objęte zarówno osobniki dorosłe, jak i nowonarodzone. Sposoby tu opisane są przeznaczone do stosowania w dowolnym z powyższych gatunków kręgowców, ponieważ układy immunologiczne wszystkich tych kręgowców działają w podobny sposób.

32 31 B. Informacje ogólne 1 [0040] Niniejszy wynalazek w jego najszerszym znaczeniu jest zdefiniowany w niezależnych zastrzeżeniach. [0041] Wynalazek dotyczy konstruktów kwasu nukleinowego, które umożliwiają wydajną ekspresję heterologicznych sekwencji kodujących, a zwłaszcza genów kodujących antygen, w komórkach gospodarza. Ujawnienie dostarcza konstruktów kwasu nukleinowego zawierających lub, w niektórych wykonaniach, składających się zasadniczo z sekwencji chimerowego promotora i miejsca do klonowania tak, że gdy sekwencja kodująca jest wstawiona w miejscu klonowania, sekwencja kodująca jest w połączeniu umożliwiającym działanie z chimerowym promotorem. [0042] Chimerowy promotor zawiera lub składa się zasadniczo z: (a) sekwencji najwcześniejszego promotora hcmv; (b) eksonu 1 i co najmniej części eksonu 2 z głównego najwcześniejszego genu hcmv; i 2 (c) intronu heterologicznego dostarczanego zamiast natywnego intronu A głównego najwcześniejszego genu hcmv. [0043] Sekwencja najwcześniejszego promotora hcmv (a) może zawierać:

33 32 (i) sekwencję natywną najwcześniejszego promotora hcmv; (ii) jej funkcjonalny wariant homologiczny; lub (iii) funkcjonalny fragment (i) lub (ii). 1 2 [0044] Generalnie, sekwencja (a) zawiera około 0 do 600, korzystnie 0 do 600, na przykład 400 do 600 nukleotydów. Typowo, sekwencja (a) zawiera sekwencje obecne w (i), które wiążą czynniki transkrypcyjne lub polimerazę RNA, lub zamiast dowolnej z tych sekwencji, homologi tych sekwencji zdolne do wiązania tych samych czynników transkrypcyjnych i polimerazy RNA. Typowo, takie sekwencje lub ich homologi są obecne w sekwencji promotorowej (a) w tym samym porządku i/lub zasadniczo w tej samej względnej odległości co w (i). [004] Ogólnie, (i) zawiera co najmniej od nukleotydów -0 do -1, typowo - do -1, na przykład -00 do -1 lub -600 do -1, z głównego najwcześniejszego genu hcmv. Sekwencja (i) typowo zawiera rdzeniową sekwencję promotora hcmv i może również zawierać jeden lub więcej elementów wzmacniacza obecnych w sekwencji najwcześniejszego promotora hcmv. Na przykład, (i) może zawierać nukleotydy -118 do -1 lub -24 do -1, jak w US albo od nukleotydów -62 do 1 lub -46 do -1, jak w US [0046] Generalnie (i) zawiera blok TATA lub blok CAAT powszechnie występujące w sekwencjach promotorowych. Korzystnie, jeżeli sekwencja zawiera jedną lub większą

34 liczbę sekwencji powtórzeń z najwcześniejszego promotora hcmv. [0047] W korzystnym wykonaniu, natywna sekwencja najwcześniejszego promotora hcmv zawiera NR ID. SEKW.: 1. [0048] Sekwencję najwcześniejszego promotora hcmv można otrzymać przy zastosowaniu znanych metod. Natywny najwcześniejszy promotor hcmv można wyizolować bezpośrednio z próbki wirusa, przy zastosowaniu standardowych technik. US 38839, na przykład, opisuje klonowanie regionu promotora hcmv. Sekwencja najwcześniejszego promotora hcmv jest dostępna w GenBank #M60321 (szczep Towne hcmv) i X17403 (szczep AD 169 hcmv). Natywną sekwencję można zatem wyizolować przy zastosowaniu PCR z użyciem starterów PCR w oparciu o znaną sekwencję. Patrz np. Sambrook i wsp., jak wyżej, dla opisu technik stosowanych do uzyskiwania i izolowania DNA. Odpowiednią sekwencję promotora hcmv można także wyizolować z istniejącego wektora plazmidowego. Sekwencje promotorowe mogą być również wytwarzane syntetycznie. [0049] Funkcjonalny wariant (ii) lub fragment (iii) jest generalnie takim, który zachowuje i/lub uzupełnia aktywność natywnego promotora (i). Typowo tą aktywnością jest zdolność do powodowania (w tym inicjowania i regulowania) transkrypcji połączonego z nim w sposób umożliwiający działanie polinukleotydu, zwłaszcza głównego najwcześniejszego genu hcmv. W jednym wykonaniu, wariant lub fragment będzie zdolny do komplementacji aktywności natywnego promotorem wirusa

35 hcmv, na przykład umożliwiając wirusowi zachowanie zdolności do zakażania i/lub replikacji w komórkach. [000] Wariant homologiczny (ii) lub fragment (iii) można testować pod kątem zdolności do zachowania i/lub komplementacji aktywności (i). Na przykład, wariant lub fragment można testować pod kątem zdolności do przywracania funkcji (takiej jak zdolność do zakażania i/lub replikacji) zmutowanemu hcmv, w którym natywny najwcześniejszy promotor hcmv jest uszkodzony. [001] Wariant homologiczny (ii) lub fragment (iii) można testować pod kątem przydatności przy zastosowaniu porównawczego testu na ekspresję, poniżej. Sekwencja badanego promotora jest wstawiana do wektora podstawowego w miejsce natywnego najwcześniejszego promotora hcmv. Typowo, wariant lub fragment funkcjonalny umożliwia uzyskanie co najmniej 0%, na przykład 60, 70, 80, 90% lub więcej ekspresji, zapewnianej przy zastosowaniu przez wektora podstawowego. Generalnie, ekspresja jest zapewniana w co najmniej jednej, ale korzystnie dwóch typach komórek referencyjnych. Typowo, komórkami referencyjnymi są ssacze komórki HEK 293T, CHO, HeLa, BHK, 3T3 lub COS. [002] Dodatkowo lub alternatywnie, sekwencję promotorową można badać w porównawczym teście na immunogenność, poniżej. Badana sekwencja promotorowa jest wstawiana do wektora podstawowego w miejsce natywnego najwcześniejszego promotora hcmv. Funkcjonalna sekwencja promotorowa dostarcza mian przeciwciał, które są co najmniej tak wysokie lub wyższe niż te osiągane przy zastosowaniu wektora podstawowego z co najmniej jednym, korzystnie dwoma

36 3 1 antygenami. Miana przeciwciał są, korzystnie, co najmniej %, %, %, % lub 40% większe niż w przypadku wektora podstawowego. Korzystnymi antygenami są antygeny HBsAg, gd HSV2 i flu-m2. Według tego testu, funkcjonalny wariant homologiczny (ii) lub funkcjonalny fragment (iii) natywnej sekwencji promotorowej (i) jest takim, który pozwala uzyskać najwyższe miana przeciwciał uzyskiwane przy zastosowaniu sekwencji natywnej. [003] Jak wspomniano powyżej, konstrukt zawiera sekwencję eksonową (b), która obejmuje sekwencję pochodzącą z eksonu 1 i eksonu 2 z głównego najwcześniejszego genu hcmv. Eksony są sekwencjami kodującymi, które w naturze są generalnie rozdzielone przez introny. W natywnym głównym najwcześniejszym genie hcmv, eksony 1 i 2 są zwykle rozdzielone przez natywny intron A. W niniejszym chimerowym konstrukcie, sekwencja eksonu 2 jest położona po stronie 3' sekwencji eksonu 1 bez rozdzielającej sekwencji intronu tak, że sekwencje eksonu 1 i eksonu 2 przylegają do siebie. [004] Sekwencja eksonowa (b) może zawierać: 2 (i) natywną sekwencję eksonową, typowo ekson 1 i (cały lub część) eksonu 2; (ii) wariant homologiczny (i), który jest funkcjonalny; lub (iii) funkcjonalny fragment (i) lub (ii).

37 [00] Sekwencja (i) może zawierać od około 0 do 0% sekwencji eksonu 1 natywnego głównego najwcześniejszego genu hcmv, na przykład 60 do 90% lub 70 do 80%. Typowo, występuje co najmniej 0% naturalnej sekwencji naturalnego eksonu 1, na przykład 60%, 70%, 80%, 90% lub więcej. Sekwencja eksonowa (b) zawiera także co najmniej część sekwencji eksonu 2. W sekwencji (i) występuje, typowo, 2 lub więcej zasad natywnego eksonu 2, na przykład 2 do 9, 2 do 7 lub 3 do zasad. Występować może do 0%, włącznie, naturalnej sekwencji eksonu 2, na przykład do 9%, do 80% lub 40 do 60%. Typowo, wariant homologiczny ma dowolną z powyższych długości wymienionych dla sekwencji natywnej. [006] Korzystnie, jeżeli (b) zawiera NR ID. SEKW.: 2. [007] Odpowiednie sekwencje eksonowe (b) można otrzymać przy zastosowaniu znanych metod. Patrz np. Sambrook i wsp., jak wyżej, dla opisu technik stosowanych do uzyskiwania i izolowania DNA. Natywną sekwencję głównego najwcześniejszego genu hcmv można wyizolować bezpośrednio z próbki wirusa, przy zastosowaniu standardowych technik (patrz, na przykład, MacLean, A (1998) Preparation of HSV-DNA and Production of Infectious Virus w Herpes Simplex Virus Protocols S. Brown, A Maclean, redaktorzy, Humana Press, Totowa, NJ, str ). Sekwencja głównego najwcześniejszego genu hcmv, w tym położenie eksonu 1 i eksonu 2, jest dostępne w GenBank #M60321, X Natywne sekwencje eksonu 1 i 2 można zatem wyizolować poprzez cięcie natywnej sekwencji głównego genu w odpowiednich miejscach restrykcyjnych lub przy

38 zastosowaniu reakcji PCR z użyciem starterów do PCR opartych na znanej sekwencji. Odpowiednie sekwencje eksonowe można, alternatywnie, izolować z istniejącego wektora plazmidowego, takiego jak pwrg7128. Sekwencje eksonowe mogą być również wytwarzane syntetycznie, zamiast klonowania. Warianty sekwencji można łatwo skonstruować przy zastosowaniu rutynowych metod, takich jak ukierunkowana mutageneza. [008] Generalnie sekwencja eksonowa będzie, kiedy jest obecna w konstrukcie według wynalazku, zwiększać ekspresję, zwykle powodując porównywalne wzmocnienie co natywna sekwencja eksonu 1 i eksonu 2 (i), wspomniana powyżej. [009] Sekwencję eksonową można badać pod kątem pełnienia funkcji stosując porównawczy test na ekspresję, poniżej. Badana sekwencja eksonowa jest wstawiana do wektora podstawowego w miejsce obecnej już sekwencji eksonowej. Generalnie, sekwencja eksonowa pełni funkcję (jest funkcjonalna), jeżeli sekwencja nie znosi ekspresji, ale korzystnie zwiększa ekspresję w co najmniej jednym, ale korzystnie w dwóch typach komórek referencyjnych w porównaniu do wektora podstawowego. Typowo, komórkami referencyjnymi są ssacze komórki HEK 293T, CHO, HeLa, BHK, 3T3 lub COS. Korzystne jest, jeżeli ekspresja zwiększa się o co najmniej %, %, %, % lub 40%. Według tego testu funkcjonalny homologiczny wariant (ii) lub funkcjonalny fragment (iii) naturalnej sekwencji eksonowej (i) to taki, który pozwala uzyskać przynajmniej 0% poprawy ekspresji dostarczanej przez sekwencję naturalną.

39 [0060] Dodatkowo lub alternatywnie, sekwencję eksonową można badać w porównawczym teście na immunogenność, poniżej. Badana sekwencja eksonowa jest wstawiana do wektora podstawowego w miejsce obecnej już sekwencji eksonowej. Funkcjonalna sekwencja eksonowa dostarcza mian przeciwciał, które są co najmniej tak wysokie lub wyższe niż te osiągane przy zastosowaniu wektora podstawowego z co najmniej jednym, korzystnie dwoma antygenami. Miana przeciwciał są, korzystnie, co najmniej %, %, %, % lub 40% większe niż w przypadku wektora podstawowego. Korzystnymi antygenami są antygeny HBsAg, gd HSV2 i flu-m2. Według tego testu, funkcjonalny wariant homologiczny (ii) lub funkcjonalny fragment (iii) naturalnej sekwencji eksonowej (i) jest takim, która pozwala uzyskać najwyższe miana przeciwciał uzyskiwane przy zastosowaniu sekwencji naturalnej. [0061] Konstrukt chimerowego promotora zawiera heterologiczny intron (c) zamiast regionu natywnego intronu A głównego najwcześniejszego genu hcmv. Intron jest sekwencją niekodującą, która jest wycinana z hnrna transkrybowanego z genu. Heterologiczny intron jest takim, który nie występuje w sekwencji kodującej w naturze. [0062] Heterologiczny intron (c) zastępuje w całości lub częściowo, natywny intron A głównego najwcześniejszego genu hcmv. Typowo, natywny intron A jest nieobecny. [0063] Generalnie, heterologiczny intron (c) jest po stronie 3' sekwencji eksonowej (b). [0064] Typowo, heterologiczny intron (c) obejmuje:

40 39 (i) naturalny intron; (ii) funkcjonalny wariant homologiczny (i); lub (iii) funkcjonalny fragment (i) lub (ii). 1 2 [006] Heterologicznym intronem (c) jest generalnie intron wirusowy lub eukariotyczny. Korzystnie, jeżeli intronem jest intron ssaczy, a zwłaszcza intron inny niż ludzki, na przykład intron szczurzy lub kurzy. Korzystnie, jeżeli intronem jest intron A, na przykład intron A szczurzej insuliny, intron A kurzej keratyny lub intron A kurzej aktyny mięśnia sercowego. [0066] Typowo, intron (c) ma długość wynoszącą od około 0 nukleotydów do około 00 nukleotydów, na przykład od około 0 do około 00 nukleotydów. Intron (c) może na przykład zawierać 0 do 00 nukleotydów, na przykład do 0, 0, 0 lub 400 nukleotydów. Korzystnie, jeżeli intron zawiera sekwencję znajdującą się w pozycji nukleotydów około 0 do 133 natywnego intronu A szczurzej insuliny lub homolog tej sekwencji. [0067] Korzystnie, jeżeli heterologiczny intron (c) może podlegać wycinaniu z transkryptu RNA w eukariotycznej komórce gospodarza. Generalnie, intron zawiera jedną lub więcej sekwencji donorowych (takich jak GT), sekwencję akceptorową (taką jak AG), leżący po stronie 3' region bogaty w pirymidyny i sekwencję rozgałęzienia. Region bogaty w pirymidyny, jeśli jest obecny, może zawierać na przykład co najmniej, 8, lub więcej pirymidyn. Korzystnie, jeżeli intron zawiera

41 co najmniej jedną sekwencję donorową, sekwencję akceptorową i sekwencję rozgałęzienia. Typowo, w konstrukcie chimerowym intron (c) zawiera nieintronowe sekwencje flankujące, które pochodzą z sekwencji eksonowych występujących na granicy intron/ekson naturalnego intronu (i). Flankującą sekwencją eksonową może być natywna sekwencja eksonowa lub homolog tej sekwencji, który zachowuje zasadniczo tę samą aktywność, co sekwencja natywna, na przykład zachowuje funkcje składania RNA. Zazwyczaj od do, korzystnie 7 do zasad sekwencji eksonowych jest włączonych na każdym końcu intronu. [0068] Intronem (c) może być intron sztuczny, pod warunkiem, że intron jest funkcjonalny. Na przykład, można zastosować intron rekombinowany lub chimerowy. Taki intron może zawierać sekwencję z więcej niż jednego naturalnego intronu. [0069] Typowo, intron (c) zawiera sekwencje obecne w intronie A hcmv, które wiążą czynniki transkrypcyjne lub białka regulacyjne, albo, zamiast dowolnej z tych sekwencji, homologi tych sekwencji zdolne do wiązania tych samych czynników lub białek. Typowo, takie sekwencje lub ich homologi są obecne w intronie (c), w tym samym porządku i/lub zasadniczo w tym samym względnym odstępie co intronie A hcmv. [0070] Intron (c) może obejmować wariant homologiczny (ii), w którym sekwencja naturalnego intronu (i) została zmodyfikowana w celu usunięcia wewnętrznego miejsca restrykcyjnego. Na przykład, można zastosować homologiczny wariant intronu A szczurzej insuliny, w którym wewnętrzne miejsce NheI zostało zniszczone.

42 41 [0071] Korzystnie, jeżeli intron (c) obejmuje: (i) NR ID. SEKW.: 3; (ii) funkcjonalny wariant homologiczny (i); lub (iii) funkcjonalny fragment (i) lub (ii). 1 2 [0072] Sekwencję intronową (c) można otrzymać z użyciem standardowych technik klonowania. Przykładowo, sekwencja intronu A szczurzej insuliny jest dostępna w GenBank J00748, sekwencja intronu A kurzej keratyny w GenBank J00847, a sekwencją intronu A kurzej aktyny mięśnia sercowego w GenBank X Sekwencję intronową można wyizolować ze źródeł naturalnych, stosując startery oparte na znanej sekwencji. Sekwencję można wytworzyć syntetycznie. Wariant sekwencji można otrzymać poprzez mutagenezę. [0073] Typowo, funkcjonalna sekwencja intronowa, na przykład wariant funkcjonalny (ii) lub fragment funkcjonalny (iii) jest taką, która ma zasadniczo taką samą aktywność, jak i/lub uzupełnia aktywność naturalnego intronu (i). W jednym wykonaniu aktywnością jest aktywność składania RNA. [0074] Sekwencje intronowe (c) można badać pod kątem aktywności składania RNA przy zastosowaniu rutynowego testu na składanie RNA. Generalnie, funkcjonalny homolog (ii) lub funkcjonalny fragment (iii) będzie wykazywać co najmniej 0%, np. 60%, 70%, 80%, 90% i do 0% lub więcej z wydajności składania RNA naturalnego intronu (i) w tym teście.

43 [007] Generalnie, heterologiczna sekwencja intronowa będzie, jeżeli jest obecna w konstrukcie według wynalazku, zwiększać ekspresję. Typowo, wariant (ii) lub fragment (iii) intronu spowoduje porównywalne wzmocnienie do naturalnego intronu (i). [0076] Funkcjonalność potencjalnej sekwencji intronowej (c) można badać stosując porównawczy test na ekspresję, poniżej. Heterologiczny intron jest wstawiany do wektora podstawowego. Generalnie, sekwencja heterologicznego intronu jest funkcjonalna, jeżeli dodanie sekwencji zwiększa ekspresję w co najmniej jednym, ale korzystnie dwóch typach komórek referencyjnych o co najmniej 2% lub więcej w porównaniu do wektora podstawowego. Typowo, komórkami referencyjnymi są ssacze komórki HEK 293T, CHO, HeLa, BHK, 3T3 lub COS. Wzrost ekspresji może być o co najmniej 3%, 4%, % lub więcej. Według tego testu funkcjonalny wariant homologiczny (ii) lub funkcjonalny fragment (iii) naturalnej sekwencji intronowej (i) to taki, która pozwala uzyskać przynajmniej 0% poprawy ekspresji uzyskiwanej przy zastosowaniu sekwencji naturalnej. [0077] Sekwencję heterologicznego intronu (c) można, dodatkowo lub alternatywnie, badać w porównawczym teście na immunogenność, poniżej. Sekwencja intronowa (c) jest dodawana do wektora podstawowego. Funkcjonalna sekwencja intronowa (c) dostarcza mian przeciwciał, które są co najmniej tak wysokie lub wyższe niż te osiągane przy zastosowaniu wektora podstawowego z co najmniej jednym, korzystnie dwoma antygenami. Miana przeciwciał są, korzystnie, co najmniej % lub %, na

44 przykład %, % lub 40% większe niż w przypadku wektora podstawowego. Korzystnymi antygenami są antygeny HBsAg, gd HSV2 i flu-m2. Według tego testu, funkcjonalny wariant (ii) lub funkcjonalny fragment (iii) naturalnej sekwencji intronowej (i) to taki, który pozwala uzyskać najwyższe miana przeciwciał uzyskiwane przy zastosowaniu sekwencji naturalnej. [0078] Odpowiednią heterologiczną sekwencję intronową można uzyskać stosując standardowe techniki klonowania. Przykładowo, sekwencja intronu A szczurzej insuliny jest dostępna w GenBank J00748, intronu A kurzej keratyny w GenBank J00847, a intronu A kurzej aktyny mięśnia sercowego w X Sekwencję intronową można wyizolować ze źródeł natywnych, stosując startery oparte na znanej sekwencji. Odpowiednią sekwencję można również wytworzyć syntetycznie. [0079] Sekwencje składowe (a), (b) i (c) mogą być dostarczone jako odpowiednio połączone ze sobą, z wytworzeniem chimerowego promotora, przy zastosowaniu standardowego klonowania lub technik biologii molekularnej. Korzystnie, jeżeli sekwencja intronowa (c) znajduje się po stronie 3' sekwencji eksonowej (b). Konstrukt chimerowego promotora jest połączony z miejscem do klonowania w taki sposób, że promotor będzie dawał ekspresję sekwencji kodującej wstawionej w to miejsce, kiedy obecne są tam odpowiednie enzymy. Odpowiednie miejsca do klonowania, w tym zgrupowania miejsc do klonowania są znane w tej dziedzinie, np. zgrupowanie miejsc do klonowania z puc19; pbc SK, pbluescript II KS, cdna3.1, psp72, pgem 7Z.

45 [0080] Typowo, kwas nukleinowy do wstawiania (lub wstawiony) do miejsca klonowania koduje polipeptyd istotny terapeutycznie. Korzystne jest, jeżeli sekwencja kodująca jest odpowiednia do stosowania w immunizacji kwasem nukleinowym lub terapii genowej. Wstawka kwasu nukleinowego może zatem zawierać sekwencję zdolną do dostarczania odporności, na przykład sekwencję immunogenną, która wywołuje humoralną i/lub komórkową odpowiedź immunologiczną, kiedy jest dostarczana osobnikowi. Alternatywnie, kwas nukleinowy może zawierać jeden lub więcej genów kodujących polipeptyd terapeutyczny, np. białko wadliwe lub którego brak jest w genomie komórki docelowej lub nienatywne białko mające pożądany efekt biologiczny lub terapeutyczny (np. funkcję przeciwwirusową). Do leczenia zaburzeń genetycznych, osobnikowi można podawać funkcjonalne geny odpowiadające genom, o których wiadomo, że brakuje ich w konkretnych zaburzeniach. Korzystnie kwasem nukleinowym jest DNA. [0081] Odpowiednie kwasy nukleinowe do wstawiania obejmują te stosowane do leczenia chorób zapalnych, chorób autoimmunologicznych, przewlekłych i zakaźnych, obejmujących zaburzenia, takie jak AIDS, nowotwór, choroby neurologiczne, choroby sercowo-naczyniowe, hypercholestemię; różne zaburzenia krwi, takie jak różne anemie, talasemia i hemofilia; wad genetycznych takich jak mukowicydoza, choroba Gauchera, niedobór deaminazy adenozyny (ADA), rozedma płuc, itd. [0082] Przykładowo, w sposobach leczenia guzów litych, geny kodujące peptydy toksyczne (tj. środki chemioterapeutyczne, takie jak rycyna, toksyna błonicy

46 4 1 2 i czynnik jadu kobry), geny supresorowe nowotworu, takie jak p3, geny kodujące sekwencje mrna, które są antysensowne względem transformujących onkogenów, peptydy przeciwnowotworowe, takie jak czynnik martwicy nowotworu (TNF) i inne cytokiny lub transdominujące mutanty negatywne transformujących onkogenów można wstawić tak, aby ulegały ekspresji w lub w pobliżu miejsca guza. [0083] Podobnie, mogą być również wstawiane kwasy nukleinowe kodujące polipeptydy, o których wiadomo, że wykazują aktywność przeciwwirusową i/lub przeciwbakteryjną lub stymulują układ immunologiczny gospodarza. Kwas nukleinowy może kodować jedną z wielu różnych cytokin (lub ich funkcjonalne fragmenty), takie jak interleukiny, interferony i czynniki stymulujące kolonie. Kwas nukleinowy może kodować antygen do leczenia lub zapobiegania wielu stanom, obejmującym, ale bez ograniczania się do tego, nowotwór, alergie, toksyczność i zakażenie patogenem, takim jak, ale bez ograniczania się do tego, grzyb, wirusy, w tym ludzkie wirusy brodawczaka (HPV), HIV, HSV2/HSV1, wirus grypy (typu A, B i C), wirus polio, wirus RSV, rinowirusy, rotawirusy, wirus zapalenia wątroby typu A, grupa wirusa Norwalk, enterowirusy, astrowirusy, wirus odry, wirus paragrypy, wirus świnki, wirus ospy wietrznej i półpaśca, cytomegalowirus, wirus Epsteina-Barra, adenowirusy, wirus różyczki, wirus ludzkiego chłoniaka komórek T typu I (HTLV-I, ang. Human T-cell Lymphoma type I virus), wirus zapalenia wątroby typu B (HBV), wirus zapalenia wątroby typu C (HCV), wirus zapalenia wątroby typu D, wirus ospy, Marburg i Ebola; bakterie,

47 obejmujące M. tuberculosis, Chlamydia, N. gonorrhoeae, Shigella, Salmonella, Vibrio Cholera, Treponema pallidua, Pseudomonas, Bordetella pertussis, Brucella, Franciscella tulorensis, Helicobacter pylori, Leptospria interrogaus, Legionella pnumophila, Yersinia pestis, Streptococcus (typy A i B), Pneumococcus, Meningococcus, Hemophilus influenza (typ b), Toxoplama gondic, Complybacteriosis, Moraxella catarrhalis, Donovanosis i Actinomycosis; patogeny grzybowe, obejmujące kandydozę i aspergilozę; patogeny pasożytnicze obejmujące tasiemce, przywry, robaki obłe, ameby, Giardia, Cryptosporidium, Schitosoma, Pneumocystis carinii, rzęsistki i włośnie. Kwas nukleinowy można także zastosować do zapewnienia odpowiedniej odpowiedzi immunologicznej przeciwko wielu chorobom weterynaryjnym, takim jak pryszczyca, koronawirusowi, Pasteurella multocida, Helicobacter, Strongylus vulgaris, Actinobacillus pleuropneumonia, wirusowi bydlęcej biegunki wirusowej (BVDV, ang. Bovine viral diarrhea virus), Klebsiella pneumoniae, E. coli, Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis i Bordetella brochiseptica. A zatem, w jednym aspekcie, konstrukty kwasu nukleinowego według niniejszego wynalazku mogą znaleźć zastosowanie w szczepionce. [0084] W niektórych wykonaniach, konstrukt kwasu nukleinowego będzie kodować adiuwant. A zatem, sekwencje wstawione do miejsca do klonowania do wstawiania sekwencji kodującej mogą kodować polipeptyd, który może działać jako adiuwant. W korzystnym przypadku, zakodowanym adiuwantem może być toksyna bakteryjna rybozylująca ADP. Obejmuje to toksynę

48 błoniczą (DT, ang. diphtheria toxin), toksynę krztuśca (PT, ang. pertussis toxin), toksynę cholery (CT), termolabilną toksynę E. coli (LT1 i LT2), endotoksynę A Pseudomonas, egzotoksynę S Pseudomonas, egzoenzym B. cereus, toksynę B. sphaericus, toksyny C2 i C3 C. botulinum, egzoenzym C. limosum oraz toksyny z C. perfringens, C spiriforma i C. difficile oraz EDIN Staphylococcus aureus. Większość toksyn bakteryjnych rybozylujących ADP zawiera podjednostki A i B. Konstrukt może wyrażać podjednostkę A, podjednostkę B i/lub obydwie podjednostki. [008] W korzystnym przypadku, konstrukt kwasu nukleinowego może kodować termolabilną toksynę E. coli i/lub toksynę cholery, a zwłaszcza może wyrażać termolabilną toksynę E. coli. Wejście do GenBank dla kompletnych sekwencji genów podjednostek A i B CT można znaleźć w Locus VIBCTXABB (numer dostępu D03), a wejście GenBank dla kompletnych sekwencji genów podjednostek A i B LT można znaleźć w locus AB (nr dostępu AB011677). [0086] Konstrukt może wyrażać aktywne warianty lub fragment konkretnego adiuwanta. O wariancie lub fragmencie będzie można powiedzieć, że jest aktywny, jeśli zachowuje przynajmniej część aktywności adiuwantowej polipeptydu, od którego pochodzi. Zatem wariant i/lub fragment będzie nadal zdolny do zwiększania odpowiedzi immunologicznej przeciwko konkretnemu antygenowi w porównaniu z odpowiedzią immunologiczną widoczną, gdy nie podaje się adiuwanta z antygenem. Zakodowaną sekwencją mogą być aktywne fragmenty lub warianty podjednostek A i/lub B CT, a

49 zwłaszcza mogą być aktywne fragmenty podjednostek A i/lub B LT. [0087] Podjednostka toksyny może mieć usuniętą swoją naturalnie występującą sekwencję sygnałową. Naturalnie występująca podjednostka egzotoksyny może być zmodyfikowana w celu detoksykacji toksyny. Podjednostka A może być zmodyfikowana tak, aby zniszczyć lub inaktywować aktywność ADP-rybozylotransferazy. [0088] A zatem, konstrukty adiuwantowe według wynalazku można zastosować do wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej przeciw określonym antygenom. Wzmocniona odpowiedź immunologiczna może obejmować odpowiedź immunologiczną o większej wielkości lub czasie trwania. To może oznaczać, że gdy antygen zostanie ponownie napotkany, odpowiedź immunologiczna jest wtedy wyższa niż w przypadku braku podawania adiuwanta. Wzmocnienie odpowiedzi immunologicznej może skutkować wyższymi mianami przeciwciał. W przypadku niektórych konstruktów, a w szczególności takich, które wyrażają podjednostki egzotoksyny, adiuwant może spowodować zwiększoną odpowiedź komórkową i odpowiedź immunologiczną typu pomocniczych komórek T 1 przeciwko badanemu antygenowi. [0089] Kwas nukleinowy do wstawiania do miejsca klonowania może zawierać sekwencję poliadenylacji (poli A). Taka sekwencja poli A jest generalnie natywna wobec sekwencji kodującej. Alternatywnie, w konstrukcie kwasu nukleinowego według wynalazku może być dostarczona heterologiczna sekwencja poli A. Typowo sekwencja poli A będzie dostarczona poniżej miejsca klonowania tak, że jest połączona w sposób umożliwiający działanie z

50 49 sekwencją kodującą, wstawioną w miejscu klonowania. Dowolna odpowiednia sekwencja poli A może zostać zawarta w konstrukcie, przy zastosowaniu standardowych technik klonowania. Takie sekwencje poli A są znane w tej dziedzinie. [0090] Sekwencją poli A może być: (i) naturalna sekwencja poli A; (ii) funkcjonalny wariant homologiczny (i); lub (iii) funkcjonalny fragment (i) lub (ii). 1 2 [0091] Naturalną sekwencją poli A (i) może być na przykład poli A króliczego genu β globiny, poli A wczesnego lub późnego genu ludzkiego wirusa brodawczaka (HPV), poli A genu HSV-2gB, poli A najwcześniejszego genu małpiego CMV lub poli A późnego genu HSVgD. [0092] Korzystnie, jeżeli naturalna sekwencja poli A (i) jest wybrana z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: (GenBank K0326), NR ID. SEKW.: 11 (nr dostępu GenBank M16019), NR ID. SEKW.: 12 (GenBank Z80699) i NR ID. SEKW.: 13 (GenBank K02718). [0093] Generalnie, funkcjonalna sekwencja polia to taka, która zachowuje aktywność poliadenylacji. [0094] Sekwencję poli A można testować pod kątem zdolności do przeprowadzenia poliadenylacji transkryptu RNA, stosując rutynowy test na ekspresję. Funkcjonalny wariant homologiczny (ii) lub funkcjonalny fragment (iii) typowo wykazuje co najmniej 0%, np. 60%, 70% 80%

51 0 1 2 lub więcej aktywności poli A naturalnej sekwencji poli A w teście. [009] Ogólnie, sekwencja poli A będzie, jeśli występuje w konstrukcie według wynalazku, zwiększać ekspresję, typowo powodując wzmocnienie porównywalne z naturalną sekwencją poli (i), wspomnianą powyżej. [0096] Sekwencję poli A można także badać pod kątem funkcjonalności przy zastosowaniu porównawczego testu na ekspresję, poniżej. Region poli A jest wstawiany do wektora podstawowego w miejsce RBGpA. Badaną poli A uznaje się za funkcjonalną, jeśli poli A nie znosi ekspresji, ale, korzystnie zwiększa ekspresję w co najmniej jednym, a korzystnie w dwóch typach komórek referencyjnych, w porównaniu do wektora podstawowego. Korzystne jest zwiększenie ekspresji o co najmniej %, %, %, %, 40% lub 0% lub więcej. Korzystnymi typami komórek są ssacze komórki HEK293T, CHO, HeLa, BHK, 3T3 lub komórki COS. Według testu, homologiczny wariant (ii) lub fragment (iii) jest funkcjonalny, jeśli pozwala na większą niż 0% poprawę ekspresji uzyskiwanej przy zastosowaniu naturalnej sekwencji poli A (i). [0097] Alternatywnie lub dodatkowo, sekwencje poli A można badać pod kątem aktywności w porównawczym teście na immunogenność, poniżej. Sekwencja poli A jest wstawiana do wektora podstawowego w miejsce RBGpA. Funkcjonalna sekwencja poli A dostarcza mian przeciwciał, które są co najmniej tak wysokie lub wyższe niż te osiągane przy zastosowaniu wektora podstawowego z co najmniej jednym, korzystnie dwoma antygenami. Miana przeciwciał są korzystnie o co

52 1 1 najmniej %, %, na przykład %, % lub 40% większe niż w przypadku wektora podstawowego. Korzystnymi antygenami są antygeny HBsAg, gd HSV2 i flu-m2. Homologiczny wariant (ii) lub fragment (iii) jest funkcjonalny, jeżeli pozwala uzyskać najwyższe miana przeciwciał uzyskiwane przy zastosowaniu naturalnej sekwencji poli A (i). [0098] Konstrukt kwasu nukleinowego może zawierać dodatkowe sekwencje kontrolne, które mają wpływ na ekspresję sekwencji kodującej wstawionej w miejscu do klonowania. Konstrukt może zawierać niepodlegającą translacji sekwencję liderową. Sekwencja jest dostarczana w konstrukcie jako połączona w sposób umożliwiający działanie z chimerowym promotorem, a zatem również z sekwencją kodującą wstawioną w miejscu klonowania. Lider dostarcza miejsca startu translacji dla ekspresji wstawionej sekwencji kodującej i typowo zawiera sekwencję Kozak. [0099] Typowo, niepodlegająca translacji sekwencja liderowa obejmuje: (i) naturalną niepodlegającą translacji sekwencję liderową; 2 (ii) funkcjonalny wariant homologiczny (i); lub (iii) funkcjonalny fragment (i) lub (ii). [00] Generalnie, naturalna sekwencja (i) jest sekwencją eukariotyczną lub sekwencją wirusową, zwłaszcza wirusa, który zakaża eukariota. Korzystnie,

53 2 1 2 naturalną sekwencją (i) jest sekwencja HBV lub HSV, na przykład sekwencja antygenu pres2 HBV, sekwencja antygenu e HBV lub sekwencja antygenu typu gd HSV2. Szczególnie korzystnie, jeżeli (i) jest wybrany z grupy składającej się z NR ID. SEKW.:, NR ID. SEKW.: 6 i NR ID. SEKW.: 7. [01] Typowo, sekwencja liderowa zawiera sekwencje obecne w (i), które wiążą składniki transkrypcyjne lub białka regulacyjne, albo homologi tych sekwencji, które są zdolne do wiązania tych samych składników lub białek. Typowo, takie sekwencje lub ich homologi są obecne w sekwencji liderowej w tym samym porządku i/lub zasadniczo w tej samej względnej odległości co w (i). Generalnie sekwencja liderowa zawiera miejsce startu translacji dla ekspresji wstawionej sekwencji kodującej. Typowo, sekwencja liderowa zawiera sekwencję Kozak. [02] Generalnie, niepodlegająca translacji sekwencja liderowa ma długość wynoszącą od około do około 0 nukleotydów, na przykład od około 1 do nukleotydów, korzystnie 1 do około 1 nukleotydów. Można zastosować sekwencje liderowe zawierające, na przykład, 1, 0, 7 lub 0 nukleotydów. [03] Generalnie, funkcjonalna, niepodlegająca translacji sekwencja liderowa to taka, która jest zdolna do dostarczania miejsca startu translacji dla ekspresji sekwencji kodującej będącej w połączeniu umożliwiającym działanie z sekwencją liderową. Zazwyczaj funkcjonalny wariant (ii) lub fragment (iii) ma zasadniczo taką samą aktywność, jak i/lub uzupełnia aktywność naturalnej sekwencji (i), zwykle w ułatwianiu

54 3 1 2 lub wzmacnianiu ekspresji sekwencji kodującej będącej w połączeniu umożliwiającym działanie z sekwencją. [04] Wariant (ii) lub fragment (iii) można badać pod kątem aktywności jako niepodlegająca translacji sekwencja liderowa względem naturalnej sekwencji liderowej, stosując standardowe protokoły. Na przykład, można wytworzyć wektory ekspresyjne zawierające naturalną sekwencję liderową (i) połączoną w sposób umożliwiający działanie ze swoją natywną sekwencją kodującą i monitorować ekspresję w odpowiednich komórkach gospodarza, na przykład ssaczych komórkach HEK 293T CHO, HeLa, BHK, 3T3 lub COS. Można wytwarzać konstrukty testowe, w których naturalna sekwencja liderowa jest zastąpiona przez wariant homologiczny lub fragment, i ponownie monitorować ekspresję w tych samych komórkach gospodarza. Generalnie, wariant (ii) lub fragment (iii) dostarcza co najmniej 0%, na przykład 60%, 70%, 80%, 90% lub 0% lub więcej ekspresji dostarczanej przez naturalną sekwencję. [0] Potencjalną sekwencję liderową można także badać pod kątem użyteczności przy zastosowaniu porównawczego testu na ekspresję, poniżej. Badana sekwencja liderowa jest wstawiana do wektora podstawowego w miejsce 'UTR pres2 HBV. Funkcjonalna sekwencja liderowa nie znosi ekspresji, ale korzystnie zwiększa ekspresję w co najmniej jednym, a korzystnie dwóch typach komórek referencyjnych, w porównaniu do wektora podstawowego. Generalnie ekspresja jest zwiększona o co najmniej %, %, %, %, 40% lub 0% lub więcej. Korzystnymi typami komórek są ssacze komórki HEK293T, CHO, HeLa, BHK, 3T3 lub komórki COS.

55 4 1 2 Według testu wariant homologiczny (ii) lub fragment (iii) jest funkcjonalny, jeśli pozwala na większą niż 0% poprawę ekspresji uzyskiwanej przy zastosowaniu naturalnej sekwencji liderowej. [06] Alternatywnie lub dodatkowo, sekwencję liderową można badać pod kątem aktywności w porównawczym teście na immunogenność, poniżej. Sekwencja liderowa jest wstawiana do wektora podstawowego w miejsce 'UTR pres2 HBV. Funkcjonalna sekwencja liderowa dostarcza mian przeciwciał, które są co najmniej tak wysokie lub wyższe niż te osiągane przy zastosowaniu wektora podstawowego z co najmniej jednym, korzystnie dwoma antygenami. Miana przeciwciał są, korzystnie, co najmniej o %, %, na przykład %, % lub 40% większe niż w przypadku wektora podstawowego. Korzystnymi antygenami są antygeny HBsAg, gd HSV2 i flu-m2. Wariant homologiczny (ii) lub fragment (iii) jest funkcjonalny, jeżeli pozwala uzyskać najwyższe miana przeciwciał uzyskiwane przy zastosowaniu naturalnej sekwencji liderowej (i). [07] Odpowiednią sekwencję liderową można otrzymać przy zastosowaniu standardowych protokołów. Na przykład, sekwencja antygenu pres2 HBV, sekwencja antygenu e HBV i sekwencja antygenu typu gd HSV2 jest dostępna w GenBank, odpowiednio, jako M4923, M4923 i Z Można zaprojektować startery w oparciu o te znane sekwencje i zastosować je do izolowania sekwencji homologicznych. Sekwencje liderowe można zsyntetyzować w oparciu o znane sekwencje. [08] Konstrukt kwasu nukleinowego zawiera sekwencję wzmacniacza, jak wyszczególniono w zastrzeżeniach.

56 Sekwencja wzmacniacza jest typowo dostarczana po stronie 3' miejsca klonowania w połączeniu umożliwiającym działanie zarówno z chimerowym promotorem, jak i wstawioną sekwencją kodującą, i działa w celu zwiększenia transkrypcji wstawionej sekwencji. [09] Generalnie, wzmacniacz obejmuje: (i) wzmacniacz naturalny; (ii) funkcjonalny wariant homologiczny (i); lub (iii) funkcjonalny fragment (i) lub (ii). 1 2 [01] Sekwencja wzmacniacza zawiera generalnie od około 0 do około 80 nukleotydów, na przykład od około 7 do około 00 nukleotydów. Można stosować wzmacniacze składające się z około 0, 0, 0 lub 400 nukleotydów. [0111] Wzmacniacz jest z 3'UTR sekwencji HBsAg. [0112] Korzystnie (i) zawiera sekwencję NR ID. SEKW.: 8. [0113] Generalnie wzmacniacz w konstrukcie zawiera sekwencje znajdujące się w (i), które wiążą składniki transkrypcyjne lub białka regulacyjne, na przykład czynniki transkrypcyjne lub homologi tych sekwencji, które wiążą się do tych samych elementów lub białek. Korzystnie, jeżeli te sekwencje są obecne we wzmacniaczu w tym samym porządku i/lub zasadniczo w tej samej względnej odległości co w (i). [0114] Generalnie, funkcjonalny wzmacniacz jest takim,

57 6 1 2 który wzmacnia lub zwiększa ekspresję polinukleotydu, na przykład sekwencji kodującej, który jest połączony w sposób umożliwiający działanie z sekwencją wzmacniacza. Typowo, funkcjonalny wariant homologiczny (ii) lub fragment (iii) ma zasadniczo taką samą aktywność (na przykład, wzmocnienie ekspresji), jak i/ lub uzupełnia działanie naturalnego wzmacniacza (i). [011] Aktywność wzmacniacza można badać przy zastosowaniu testu na wyłapywanie wzmacniacza. Protokoły są znane w tej dziedzinie. Funkcjonalny homologiczny wariant (ii) lub fragment (iii) korzystnie dostarcza co najmniej 0% aktywności wzmacniacza wykazywanej przez naturalny wzmacniacz w takim teście. Typowo, aktywność wynosi co najmniej 60%, 70%, 80%, 90, 0% lub więcej aktywności naturalnego wzmacniacza. Ogólnie, funkcjonalny wariant (ii) lub fragment (iii) może uzupełniać działanie naturalnego wzmacniacza (i) w teście. [0116] Przydatność wzmacniacza można także badać przy zastosowaniu porównawczego testu na ekspresję przedstawionego poniżej. Badaną sekwencję 3'UTR wstawia się do wektora podstawowego. 3'UTR jest przydatny, jeśli nie znosi ekspresji, ale korzystnie zwiększa ekspresję w co najmniej jednym, a korzystnie dwóch typach komórek referencyjnych, w porównaniu do wektora podstawowego w tym teście. Korzystnie ekspresja jest zwiększona o co najmniej %, %, %, %, 40% lub 0% lub więcej. Korzystnymi typami komórek są ssacze komórki HEK293T, CHO, HeLa, BHK, 3T3 lub komórki COS. Według tego testu homologiczny wariant (ii) lub fragment (iii) jest funkcjonalny, jeśli pozwala na

58 7 1 2 większą niż 0% poprawę ekspresji uzyskiwanej przy zastosowaniu sekwencji naturalnego wzmacniacza (i). [0117] Dodatkowo lub alternatywnie, sekwencje wzmacniacza można badać pod kątem aktywności w teście porównawczym na immunogenność, poniżej. 3'UTR jest wstawiany do wektora podstawowego. Funkcjonalna sekwencja wzmacniacza dostarcza mian przeciwciał, które są co najmniej tak wysokie lub wyższe niż te osiągane przy zastosowaniu wektora podstawowego z co najmniej jednym, korzystnie dwoma antygenami. Korzystnie, jeżeli miana przeciwciał są co najmniej o %, %, %, % lub 40% większe niż w przypadku wektora podstawowego. Korzystnymi antygenami są antygeny HBsAg, gd HSV2 i flu-m2. Homologiczny wariant (ii) lub fragment (iii) jest funkcjonalny, jeżeli pozwala uzyskać najwyższe miana przeciwciał uzyskiwane przy zastosowaniu naturalnej sekwencji wzmacniacza (i). [0118] Odpowiednią sekwencję wzmacniacza można uzyskać przy zastosowaniu standardowych sposobów klonowania. Na przykład, sekwencję 3'UTR HBsAg lub sekwencję 3'UTR najwcześniejszego genu małpiego CMV można uzyskać z GenBank jako AF1438 i M W oparciu o tę znaną sekwencję można zaprojektować startery i użyć do izolowania sekwencji homologicznych. [0119] W korzystnym wykonaniu, konstrukt kwasu nukleinowego zawiera heterologiczną sekwencję poli A, heterologiczną sekwencję liderową i heterologiczny wzmacniacz, wszystkie w połączeniu umożliwiającym działanie z chimerowym promotorem, dla wydajnej ekspresji wstawionej sekwencji kodującej.

59 8 [01] W dalszym aspekcie, niniejsze ujawnienie dostarcza także konstruktu kwasu nukleinowego zawierającego, lub czasem składającego się zasadniczo z: (i) sekwencji promotorowej; (ii) niepodlegającej translacji sekwencji liderowej pochodzącej z sekwencji antygenu pres2 HBV, sekwencji antygenu e HBV i sekwencji antygenu typu gd HSV2; oraz (iii) sekwencji kodującej połączonej w sposób umożliwiający działanie z (i) i (ii); 1 2 przy czym sekwencja kodująca jest heterologiczna względem niepodlegającej translacji sekwencji liderowej. [0121] Typowo, sekwencja promotorowa (i) pochodzi z wirusowej lub eukariotycznej sekwencji promotorowej. Sekwencją promotorową może być naturalna sekwencja promotorowa, funkcjonalny homolog naturalnej sekwencji lub funkcjonalny fragment każdej z nich. Odpowiednie naturalne promotory obejmują, na przykład, najwcześniejszy promotor hcmv, promotor wirusa pseudowścieklizny (PRV) lub promotor wirusa mięsaka Rousa (RSV). Korzystnie, jeżeli naturalny promotor zawiera sekwencję NR ID. SEKW.: 2 lub NR ID. SEKW.: 3. [0122] Konstrukt sztucznego promotora, takiego jak promotor chimerowy opisany powyżej, może być stosowany, pod warunkiem, że promotor jest funkcjonalny.

60 9 1 2 [0123] Generalnie, funkcjonalna sekwencja promotorowa to taka, która ma zdolność do powodowania (w tym inicjowania i regulowania) transkrypcji sekwencji kodującej połączonej z nią w sposób umożliwiający działanie w odpowiedniej komórce gospodarza. [0124] Sekwencję promotorową można testować pod kątem aktywności promotora, stosując rutynowy test na ekspresję. Funkcjonalny homolog lub fragment naturalnej sekwencji promotorowej zwykle zapewnia co najmniej 0%, na przykład co najmniej 60, 70, 80 lub 90% ekspresji zapewnianej przez sekwencję naturalną w takim teście. [012] Niepodlegająca translacji sekwencja liderowa (ii) jest jak opisano powyżej. Odpowiednie sekwencje kodujące (iii) obejmują te już opisane w odniesieniu do konstruktu chimerowego promotora. Jednakże, w niniejszym aspekcie wynalazku, sekwencja kodująca jest heterologiczna względem niepodlegającej translacji sekwencji liderowej. Niniejszy konstrukt typowo zawiera sekwencję poli A, która, jak już opisano, może być natywna wobec sekwencji kodującej lub dostarczona jako heterologiczna sekwencja poli A w konstrukcie. Odpowiednie sekwencje poli A zostały już opisane. Konstrukt może dodatkowo zawierać sekwencję wzmacniacza po stronie 3' sekwencji kodującej. Odpowiednie sekwencje wzmacniaczy są opisane powyżej w odniesieniu do konstruktu chimerowego promotora. [0126] W innym aspekcie, ujawnienie dostarcza konstruktu kwasu nukleinowego zawierającego, lub w niektórych wykonaniach, składającego się zasadniczo z: (i) sekwencji promotorowej;

61 60 (ii) sekwencji kodującej połączonej w sposób umożliwiający działanie z sekwencją promotorową (i); i (iii) sekwencji wzmacniacza po stronie 3' i połączonej w sposób umożliwiający działanie z sekwencją kodującą (ii); 1 2 przy czym sekwencja wzmacniacza (iii) pochodzi z 3'UTR sekwencji HBsAg lub 3'UTR sekwencji najwcześniejszego genu małpiego CMV, a sekwencja kodująca (ii) jest heterologiczna względem sekwencji wzmacniacza. [0127] Konstrukt może zawierać niepodlegającą translacji sekwencję liderową, taką jak te już opisane w odniesieniu do konstruktu chimerowego promotora. [0128] Typowo, sekwencja promotorowa (i) pochodzi z wirusowej lub eukariotycznej sekwencji promotorowej. Sekwencją promotorową może być naturalna sekwencja promotorowa, funkcjonalny homolog naturalnej sekwencji lub funkcjonalny fragment każdej z nich. Odpowiednie naturalne promotory obejmują, na przykład, najwcześniejszy promotor hcmv, promotor wirusa pseudowścieklizny (PRV) lub promotor wirusa mięsaka Rousa (RSV). Korzystnie, jeżeli naturalny promotor zawiera sekwencję NR ID. SEKW.: 2 lub NR ID. SEKW.: 3. [0129] Konstrukt sztucznego promotora, takiego jak promotor chimerowy opisany powyżej, może być stosowany, pod warunkiem, że promotor jest funkcjonalny.

62 [01] Generalnie, funkcjonalna sekwencja promotorowa to taka, która ma zdolność do powodowania (w tym inicjowania i regulowania) transkrypcji sekwencji kodującej połączonej z nią w sposób umożliwiający działanie w odpowiedniej komórce gospodarza. [0131] Sekwencję promotorową można testować pod kątem aktywności promotora, stosując rutynowy test na ekspresję. Funkcjonalne homologi lub fragmenty naturalnej sekwencji promotorowej zwykle dostarczają co najmniej 0%, na przykład co najmniej 60, 70, 80 lub 90% ekspresji dostarczanej przez sekwencję naturalną w takim teście. [0132] Odpowiednie sekwencje kodujące (ii) obejmują te już wspomniane w odniesieniu do konstruktu promotora chimerowego. Jednakże, w niniejszym aspekcie, sekwencja kodująca jest heterologiczna względem sekwencji wzmacniacza po stronie 3'. Sekwencja wzmacniacza (iii) z konstruktu jest opisana powyżej. Niniejszy konstrukt typowo zawiera sekwencję poli A. Tak jak w przypadku konstruktu promotora chimerowego, ten region poli A może być natywny względem sekwencji kodującej (ii) lub może być dostarczany jako heterologiczny składnik poli A w konstrukcie. [0133] Konstrukt według dowolnego z aspektów niniejszego wynalazku może zawierać sekwencję peptydu sygnałowego. Sekwencja peptydu sygnałowego jest wstawiona w połączeniu umożliwiającym działanie z promotorem tak, że peptyd sygnałowy jest wyrażany i ułatwia wydzielanie polipeptydu kodowanego przez sekwencję kodującą także w połączeniu umożliwiającym działanie z promotorem.

63 62 [0134] Typowo, sekwencja peptydu sygnałowego koduje peptyd złożony z do aminokwasów, na przykład 1 do aminokwasów. Często aminokwasy są w przeważającym stopniu hydrofobowe. W typowej sytuacji, peptyd sygnałowy kieruje rosnący łańcuch polipeptydowy niosący peptyd sygnałowy do retikulum endoplazmatycznego komórki, w której następuje ekspresja. Peptyd sygnałowy jest odcinany w retikulum endoplazmatycznym, co pozwala na wydzielanie polipeptydu poprzez aparat Golgiego. [013] Peptyd sygnałowy do zastosowania w wynalazku może obejmować: (i) naturalną sekwencję peptydu sygnałowego; 1 (ii) wariant homologiczny (i), który zachowuje aktywność peptydu sygnałowego, lub 2 (iii) fragment (i) lub (ii), który zachowuje aktywność peptydu sygnałowego. [0136] Sekwencją (i) może być, na przykład, peptyd sygnałowy ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu (htpasp) (GenBank L00141), peptyd sygnałowy aprotyniny (GenBank AAD1368), peptyd sygnałowy ekstensyny tytoniu (GenBank JU046) lub peptyd sygnałowy kurzego lizozymu (GenBank AF4481). [0137] Peptyd sygnałowy, odpowiedni do stosowania w niniejszym wynalazku, jest takim, który umożliwi wydzielanie białek heterologicznych. Funkcjonalny peptyd sygnałowy może być zidentyfikowany w teście, który porównuje efekt badanego peptydu sygnałowego z

64 efektem znanego peptydu sygnałowego - np. peptydu sygnałowego ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu (htpasp) i z efektem braku peptydu sygnałowego. Można zastosować porównawczy test na ekspresję przedstawiony poniżej, ale z następującą modyfikacją. Konstruuje się sekrecyjne wektory ekspresyjne zawierające wektor podstawowy bądź z badanym peptydem sygnałowym, htpasp bądź bez peptydu sygnałowego. Sekwencje kodujące dla polipeptydów pozbawionych ich naturalnie występujących peptydów sygnałowych wstawia się do wektorów i wektorami transformuje się referencyjne komórki gospodarza. Korzystnie, jeżeli komórkami ssaczymi są komórki HEK293T, CHO, HeLa, BHK, 3T3 lub COS. Pożywki z komórek analizuje się pod kątem poziomów ekspresji polipeptydu. Funkcjonalny peptyd sygnałowy umożliwia sekrecję polipeptydu na wyższym poziomie niż wektor pozbawiony peptydu sygnałowego z co najmniej jednym, korzystnie dwoma polipeptydami. Typowo, sekrecja jest o % wyższa lub korzystniej o % wyższa, na przykład lub 0% wyższa lub więcej. Typowo, poziomy sekrecji są porównywalne z tymi uzyskanymi przy użyciu htpasp. [0138] Umożliwienie sekrecji zakodowanego białka na zewnątrz komórki, w której następuje ekspresja może mieć wiele zalet, zwłaszcza, gdy białkiem jest antygen. Na przykład, zwiększona sekrecja antygenu mogłaby umożliwić większe pobieranie antygenu i odpowiedź przez komórki immunologiczne (makrofagi, komórki Langehana, komórki B, komórki T, itp.), zwiększyć zdolność antygenu do dotarcia do krwiobiegu i komórek sygnałowych (cytokiny), umożliwić antygenowi

65 znalezienie jego ligandów komórkowych i pełnienie funkcji (przeciwciała, toksyny, takie jak toksyny cholery, LT E. coli) oraz uczestniczenia w normalnych biochemicznych procesach komórkowych (receptory komórkowe). [0139] Konstrukt kwasu nukleinowego według wynalazku może być w postaci plazmidowego wektora ekspresyjnego. Wektor może wtedy zawierać dodatkowe elementy, takie jak początek replikacji lub geny selekcyjne. Takie elementy są znane w tej dziedzinie i mogą być wstawiane przy zastosowaniu standardowych technik. W jednym wykonaniu, wektor plazmidowy ma sekwencję NR ID. SEKW.: 14. Alternatywnie, konstrukt może być zawarty w wirusowym konstrukcie wektorowym. [0140] W niektórych wykonaniach, kwas nukleinowy, konstrukt według wynalazku może zawierać dwa lub większą liczbę zdefiniowanych tu promotorów chimerowych. A zatem, konstrukt może zawierać wiele promotorów chimerowych, a konkretnie konstrukt może mieć dwa, trzy, cztery, pięć lub więcej promotorów chimerowych. Korzystnie, jeżeli każdy z promotorów chimerowych będzie osobno połączony w sposób umożliwiający działanie z miejscem klonowania do wstawiania sekwencji kodującej. A zatem, konstrukt może umożliwiać ekspresję dwóch, trzech, czterech, pięciu lub więcej sekwencji kodujących. Podlegającymi ekspresji sekwencjami kodującymi może być dowolna z tu wymienionych. W korzystnym przypadku, konstrukt ma dwa promotory chimerowe, z których każdy ma sekwencję kodującą połączoną z nim w sposób umożliwiający

66 6 1 2 działanie. Konkretnie, dwa promotory mogą być transkrybowane z dala od siebie. [0141] Konkretnie, konstrukty z dwoma promotorami mogą dawać ekspresję podjednostek A i B ADP-rybozylującej toksyny bakteryjnej, w tym dowolnej z tych tu wymienionych, a korzystnie podjednostki A i B LT. [0142] W przypadkach, gdy konstrukt ma wiele chimerowych promotorów, każdy z nich może zawierać lub być połączony w sposób umożliwiający działanie z dowolną ze wspomnianych tu sekwencji. W szczególnie korzystnym przypadku, heterologicznym intronem jednego lub więcej promotorów może być sekwencja intronu A szczurzego genu insuliny. Korzystne jest również, jeżeli jeden lub więcej chimerowych promotorów zawiera 'UTR pre-s2 2gB HSV. Jeden lub więcej promotorów może zawierać sekwencję poliadenylacji ze szczurzego genu beta-globiny. [0143] W korzystnym przypadku, konstrukt kwasu nukleinowego według wynalazku może zawierać dwie chimerowe sekwencje promotorowe, przy czym każda sekwencja promotorowa jest połączona w sposób umożliwiający działanie z miejscem do klonowania, który ma wstawioną do niego sekwencję kodującą, przy czym każdy chimerowy promotor zawiera (a) sekwencję najwcześniejszego promotora hcmv; (b) ekson 1 i co najmniej część eksonu 2 z głównego najwcześniejszego genu hcmv; i (c) heterologiczny intron dostarczony zamiast regionu intron A głównego najwcześniejszego genu hcmv,

67 66 przy czym sekwencja kodująca połączona w sposób umożliwiający działanie z jednym chimerowym promotorem koduje podjednostkę A LT, a sekwencja kodująca połączona z innym, koduje podjednostkę B LT. Konstrukt może zatem dawać ekspresję obydwu podjednostek. Korzystne jest, jeżeli: - heterologicznym intronem każdego promotora jest sekwencja intronu A szczurzego genu insuliny; 1 - sekwencja kodująca każdą podjednostkę LT jest połączona w sposób umożliwiający działanie z 'UTR pre-s2 HBV; i/lub - każda sekwencja kodująca LT jest połączona w sposób umożliwiający działanie z sekwencją poliadenylacji szczurzego genu beta-globiny. 2 [0144] Konstrukt polinukleotydowy według wynalazku może być zasadniczo wolny od albo związany z komórkami lub z materiałem komórkowym. Może on być w postaci zasadniczo wyizolowanej albo może być w postaci zasadniczo oczyszczonej, w którym to przypadku, będzie zawierać generalnie co najmniej 90%, np. co najmniej 9%, 98% lub 99% polinukleotydu lub suchej masy w preparacie. [014] Cząsteczki kwasu nukleinowego według niniejszego wynalazku mogą być dostarczane do odpowiednich komórek gospodarza w celu ekspresji polinukleotydu w połączeniu umożliwiającym działanie z

68 promotorem. Korzystnie, jeżeli komórkami gospodarza są komórki ssacze, w szczególności ludzkie komórki. Odpowiednie metody dostarczania kwasów nukleinowych do takich komórek są znane w tej dziedzinie i obejmują, na przykład, transfekcję za pośrednictwem dekstranu, precypitację fosforanem wapniowym, elektroporację oraz bezpośrednie wstrzyknięcie do jąder. [0146] Jak opisano powyżej, kwas nukleinowy stanowiący sekwencję kodującą w konstrukcie może kodować polipeptyd istotny terapeutycznie. Niniejsze konstrukty można zatem stosować do immunizacji kwasem nukleinowym lub terapii genowej przy zastosowaniu standardowych protokołów dostarczania genów. Odpowiednie sposoby dostarczania genów są znane w tej dziedzinie, jak dyskutowano poniżej. Cząsteczki kwasu nukleinowego mogą być dostarczane bezpośrednio osobnikowi, lub alternatywnie, dostarczane ex vivo do komórek pochodzących od osobnika, po czym komórki ponownie przeszczepia się osobnikowi. [0147] Do stosowania w immunizacji kwasem nukleinowym lub terapii genowej, konstrukty kwasu nukleinowego mogą zatem być wytwarzane jako konwencjonalne preparaty farmaceutyczne. Można tego dokonać przy zastosowaniu standardowych związków chemicznych i metodologii do wytwarzania preparatów farmaceutycznych, które są dostępne dla specjalistów w tej dziedzinie. Na przykład, kompozycje zawierające jedną lub więcej sekwencji kwasu nukleinowego (np. obecne w odpowiedniej postaci wektora, takiej jak DNA plazmidowy) można zmieszać z jednym lub więcej farmaceutycznie

69 dopuszczalnych zaróbek lub nośników w celu dostarczenia preparatu ciekłego. [0148] W zaróbce lub nośniku mogą być obecne substancje pomocnicze, takie jak środki zwilżające lub emulgujące, substancje buforujące ph i tym podobne. Te zaróbki, nośniki i substancje pomocnicze są na ogół środkami farmaceutycznymi, które mogą być podawane bez nadmiernej toksyczności, i które w przypadku kompozycji szczepionek nie indukują odpowiedzi immunologicznej u danego osobnika przyjmującego kompozycję. Farmaceutycznie dopuszczalne zaróbki obejmują, ale nie są do tego ograniczone, ciecze, takie jak woda, sól fizjologiczna, glikol polietylenowy, kwas hialuronowy, glicerol i etanol. Mogą być w nich również zawarte farmaceutycznie akceptowalne sole, na przykład, sole kwasów mineralnych, takie jak chlorowodorki, bromowodorki, fosforany, siarczany i tym podobne, oraz sole kwasów organicznych, takie jak octany, propioniany, maloniany, benzoesany i tym podobne. Będzie także korzystne, chociaż nie wymagane, aby preparat zawierał farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę, która służy jako stabilizator, w szczególności dla peptydu, białka lub innych podobnych cząsteczek, jeśli mają być one zawarte w kompozycji. Przykłady odpowiednich nośników, które działają również jako stabilizatory dla peptydów, obejmują, bez ograniczania, dekstrozę o czystości farmaceutycznej, sacharozę, laktozę, trehalozę, mannitol, sorbitol, inozytol, dekstran i tym podobne. Inne odpowiednie nośniki obejmują, znowu bez ograniczania, skrobię, celulozę, fosforany sodowe lub wapniowe, kwas cytrynowy, kwas

70 winowy, glicynę, glikole polietylenowe o wysokiej masie cząsteczkowej (PEG) oraz ich kombinację. Szczegółowe omówienie farmaceutycznie dopuszczalnych zaróbek, nośników i substancji pomocniczych jest dostępne w REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co, NJ 1991), włączonym tu jako odniesienie. [0149] W kompozycjach mogą być również zawarte niektóre substancje ułatwiające pobieranie i/lub ekspresję kwasów nukleinowych ( środki ułatwiające transfekcję ), na przykład substancje pomocnicze, takie jak bupiwakaina, kardiotoksyna i sacharoza oraz nośniki ułatwiające transfekcję, takie jak preparaty liposomowe lub lipidowe, które są rutynowo stosowane do dostarczania cząsteczek kwasu nukleinowego. Anionowe i obojętne liposomy są powszechnie dostępne i znane do dostarczania cząsteczek kwasu nukleinowego (patrz, np., Liposomes: A Practical Approach, (1990) RPC New Ed., IRL Press). Kationowe preparaty lipidowe są również dobrze znanymi nośnikami do stosowania w dostarczaniu cząsteczek kwasu nukleinowego. Odpowiednie preparaty lipidowe obejmują DOTMA (chlorek N-[1-(2,3-dioleiloksy) propylo]-n, N, N-trimetyloamoniowy), dostępny pod nazwą handlową Lipofectin i DOTAP (1,2-bis(oleiloksy)-3- (trimetyloamonio)propan), patrz, np., Felgner i wsp. (1987) Proc. Natl. Natl. Acad. Sci. USA 84: ; Malone i wsp. (1989) Proc. Natl. Natl. Acad. Sci. USA 86: ; patenty USA nr,283,18 i,27,928 oraz międzynarodowa publikacja nr WO 90/192, WO 91/1 i WO 9/2636. Te lipidy kationowe mogą być korzystnie stosowane w połączeniu z obojętnym lipidem, w szczególności DOPE (na przykład

71 dioleilofosfatydyloetanoloaminą). Jeszcze inne kompozycje ułatwiające transfekcję, które można dodawać do powyższych preparatów lipidowych lub liposomowych obejmują pochodne sperminy (patrz np. międzynarodowa publikacja nr WO 93/1879) i związki permealizujące błonę, takie jak GALA, gramicydyna S i kationowe sole żółciowe (patrz, np. międzynarodowa publikacja nr WO 93/19768). [0] Alternatywnie, cząsteczki kwasu nukleinowego według niniejszego wynalazku mogą być zamknięte w kapsułkach, zadsorbowane na lub związane z nośnikami w postaci cząstek. Odpowiednie nośniki w postaci cząstek obejmują te pochodzące z polimerów polimetylometakrylanu, jak również mikrocząstki PLG otrzymywane z poli(mleczanów) i poli(mleczano-koglikolidów). Patrz, np., Jeffery i wsp. (1993) Pharm. Res. : Można również zastosować inne systemy cząsteczkowe i polimery, na przykład, polimery, takie jak polilizyna, poliarginina, poliornityna, spermina, spermidyna, jak również koniugaty tych cząsteczek. [011] Po sporządzeniu preparatów, kompozycje mogą być dostarczane osobnikowi in vivo przy zastosowaniu rozmaitych znanych dróg i technik. Na przykład, preparaty ciekłe mogą być dostarczane jako roztwór do wstrzykiwania, zawiesina lub emulsja i podawane poprzez wstrzykiwanie pozajelitowe, podskórne, śródskórne, domięśniowe, dożylne z zastosowaniem konwencjonalnej igły i strzykawki, albo przy użyciu systemu do szybkiego wstrzykiwania cieczy. Preparaty ciekłe mogą być również podawane miejscowo do skóry lub tkanki śluzówkowej albo dostarczane jako silnie rozdrobniony

72 spray odpowiedni do podawania do dróg oddechowych lub płuc. Inne sposoby podawania obejmują podawanie doustne, jako czopki oraz techniki aktywnego lub biernego dostarczania przeskórnego. [012] Alternatywnie, kompozycje mogą być podawane ex vivo, na przykład znane jest dostarczanie i ponowne wszczepienie tych transformowanych komórek do osobnika (np. transfekcja za pośrednictwem dekstranu, wytrącanie fosforanem wapniowym, elektroporacja oraz bezpośrednie mikrowstrzyknięcie do jąder). [013] Kompozycje podaje się podmiotowi w ilości, która jest zgodna z preparatem do dawkowania oraz która będzie skuteczna profilaktycznie i/lub terapeutycznie. Odpowiednia skuteczna ilość będzie pozostawać w stosunkowo szerokim zakresie, ale może być łatwo określona przez specjalistę w dziedzinie na drodze rutynowych prób. Physicians Desk Reference i Goodman and Gilman s The Pharmacological Basis of Therapeutics są przydatne do określania potrzebnej ilości. Na przykład, ogólnie oczekuje się, że skuteczna dawka polinukleotydu będzie mieścić się w zakresie od około 0,001 do 00 μg, korzystniej od 0,01 do,0 μg. [014] W jednym przypadku, konstrukt kwasu nukleinowego według wynalazku można stosować łącznie z innym konstruktem kwasu nukleinowego. W jednym przypadku konstruktem kwasu nukleinowego może być jeden z opisanych tu dla ekspresji adiuwanta, a innym konstruktem może być konstrukt kodujący jeden lub większą liczbę antygenów. W korzystnym przypadku, oba konstrukty mogą wykorzystywać promotory chimerowe według wynalazku.

73 [01] W przypadku, gdy jeden konstrukt wyraża adiuwant, a drugi antygen lub antygeny, antygeny mogą być zwłaszcza z HSV i wirusa zapalenia wątroby (w szczególności wirusa zapalenia wątroby typu B). Antygenami mogą być, w szczególności antygeny ICP0, ICP4 ICP 22 i ICP 27 HSV, a korzystnie wszystkie cztery. W przypadkach, gdy takie antygeny są wyrażane, konstrukt adiuwantowy będzie w szczególności dawał ekspresję LTA i/lub LTB, a zwłaszcza obu. [016] Oba konstrukty mogą być podawane oddzielnie, jednocześnie lub kolejno. Oba mogą być podawane w tej samej lub różnych kompozycjach. W szczególności, jeśli jeden konstrukt ma efekt adiuwantowy, dwa będą dostarczane tak, że widoczny jest efekt adiuwantowy, tak, że wytwarzana odpowiedź immunologiczna będzie większa i/lub dłuższa niż w przypadku, gdy adiuwant nie był podawany z antygenem. W korzystnym przypadku, dwa konstrukty mogą być dostarczane w tej samej kompozycji, korzystnie w tych samych cząstkach nośnikowych. [017] W korzystnym wykonaniu, konstrukty kwasu nukleinowego według wynalazku są dostarczane do komórek docelowych, przy użyciu techniki dostarczania za pośrednictwem cząstek. Metody dostarczania preparatów kwasów nukleinowych za pośrednictwem cząstek są znane w tej dziedzinie. [018] Cząstki do dostarczania za pośrednictwem cząstek można wytworzyć poprzez powlekanie cząsteczkami kwasów nukleinowych według niniejszego wynalazku cząstek nośnika (np. nośników rdzeniowych) przy zastosowaniu różnych technik, znanych w tej dziedzinie. Cząstki nośnika wybiera się z materiałów, które mają

74 odpowiednią gęstość w zakresie rozmiarów cząstek, zwykle stosowanych do dostarczania do wnętrza komórki przy użyciu urządzenia do podawania za pośrednictwem cząstek. Zazwyczaj cząstki nośnika mają średnicę od 0,1 do m, na przykład od 0, do 3 m, korzystnie od 1 do 2 μm. Optymalna wielkość cząstek nośnika będzie, oczywiście, zależeć od średnicy komórek docelowych. Alternatywnie, można zastosować cząstki koloidalnego złota, gdzie powlekane złoto koloidalne podaje się (np. wstrzykuje) do tkanki (np. skóry lub mięśni), a następnie jest pobierane przez komórki immunokompetentne. [019] Zazwyczaj cząstki nośnika są wybrane spośród metali obojętnych. Metale są obojętne w tym znaczeniu, że nie są aktywne fizjologicznie. Dla celów wynalazku można zastosować cząstki nośnikowe wolframowe, złote, platynowe i irydowe. Korzystne są cząstki wolframowe i złote. Cząstki wolframowe są łatwo dostępne w średnich rozmiarach 0, do 2,0 m średnicy. Chociaż takie cząstki, które mają optymalną gęstość do stosowania w sposobach podawania z przyspieszaniem cząstek i umożliwiają bardzo skuteczne powlekanie przez DNA, wolfram może być potencjalnie toksyczny dla niektórych typów komórek. Cząstki złota lub złoto mikrokrystaliczne (np. proszek złota A170, dostępny z Engelhard Corp, East Newark, NJ) będzie również znajdować zastosowanie w obecnych sposobach. Cząstki złota zapewniają jednorodność wielkości (dostępne z Alpha Chemicals jako cząstki o rozmiarach 1-3 m lub dostępne z Degussa, South Plainfield, NJ w pewnym zakresie rozmiarów cząstek, w tym 0,9 m) i obniżoną

75 74 toksyczność. Złoto mikrokrystaliczne daje zróżnicowany 1 2 rozkład wielkości cząstek, zwykle w zakresie 0,1- m. Jednakże, nierównomierna powierzchnia złota mikrokrystalicznego zapewnia wysoce wydajne powlekanie kwasami nukleinowymi. [0160] Znanych jest i zostało opisanych wiele sposobów powlekania lub wytrącania DNA lub RNA na cząstkach złotych lub wolframowych. Według większości takich metod, generalnie, ustaloną ilość złota lub wolframu miesza się z DNA plazmidowym, CaCl 2 i spermidyną. Powstały roztwór miesza się na wotreksie w sposób ciągły w czasie procedury powlekania w celu zapewnienia jednorodności mieszaniny reakcyjnej. Po wytrąceniu kwasu nukleinowego, powlekane cząstki można przenieść na odpowiednie błony i pozostawić do wyschnięcia przed użyciem, powlekać na powierzchniach modułu lub kasety dla próbek lub wprowadzać do kasety do dostarczania w do stosowania w konkretnych urządzeniach do dostarczania za pośrednictwem cząstek. [0161] Alternatywnie, polinukleotydy według wynalazku można preparować w kompozycje w postaci stałych. Wytwarzanie preparatu przeprowadzić z zastosowaniem opisanych powyżej standardowych procedur chemicznych dla preparatów farmaceutycznych. Przykładowo, polinukleotydy można mieszać z jedną lub więcej farmaceutycznie dopuszczalnych zaróbek lub nośników, aby uzyskać odpowiednią kompozycję. Uzyskane preparaty kompozycji są następnie przygotowywane w postaci cząstek przy zastosowaniu standardowych technik, takich jak proste odparowanie (suszenie na powietrzu), suszenie próżniowe, suszenie poprzez rozpylanie,

76 7 1 2 suszenie po zamrożeniu (liofilizacja), suszenie poprzez rozpylanie i zamrażanie, powlekanie poprzez rozpylanie, wytrącanie, wytwarzanie cząstek z cieczy nadkrytycznej i tym podobne. Jeśli jest to pożądane, otrzymane cząstki można zagęszczać stosując techniki opisane w stanowiącej wspólną własność publikacji międzynarodowej WO 97/4848, włączoną tu jako odniesienie. [0162] Te metody można stosować, aby otrzymać cząstki kwasu nukleinowego o wielkości w zakresie od około 0,01 do około m, korzystnie około do około m, a najkorzystniej około do około 60 m; a gęstość cząstek w zakresie około 0,1 do około 2 g/cm 3 i gęstość nasypową około 0, do około 3,0 g/cm 3 lub więcej. [0163] Po wytworzeniu, cząstki zawierające cząsteczki kwasu nukleinowego mogą być pakowane w pojedynczych dawkach jednostkowych lub pojemnikach wielodawkowych. Takie pojemniki mogą obejmować hermetycznie uszczelniony pojemnik zawierający odpowiednią ilość cząstek. Cząstki mogą być pakowane w postaci jałowego preparatu, a hermetycznie uszczelniony pojemnik może więc być przeznaczony do zachowania jałowości preparatu do czasu zastosowania do dostarczania podmiotowi. Pojemniki są korzystnie przystosowane do bezpośredniego stosowania w urządzeniu do dostarczania za pośrednictwem cząstek. Typowo, takie pojemniki mają postać kapsułek, torebek foliowych, saszetek, kaset i tym podobnych. Urządzenia do dostarczania cząstek mogą być także dostarczane jako uprzednio załadowane, zawierające odpowiednią dawkę cząstek. Urządzenie

77 uprzednio załadowane można następnie również zapakować w szczelnie zamkniętym pojemniku. [0164] Pojemnik, w którym zapakowane są cząstki można ponadto zaopatrzyć w etykietę dla identyfikacji kompozycji i dostarczenia informacji o odpowiednim dawkowaniu. Ponadto pojemnik można zaopatrzyć w etykietę z zawiadomieniem w formie przewidzianej przez agencję rządową, na przykład, Food and Drug Administration, gdzie zawiadomienie wskazuje na dopuszczenie przez agencję na mocy ustawy federalnej dla wytwarzania, stosowania lub sprzedaży preparatów nukleinowych w nim zawartych do podawania ludziom. [016] Urządzenia do przyspieszenia cząstek, odpowiednie do dostarczania za pośrednictwem cząstek są znane w tej dziedzinie. Na przykład, obecne działa genowe wykorzystują wyładowanie wybuchowe, elektryczne lub gazowe do wprowadzenia w ruch powlekanych cząstek nośnika w kierunku komórek docelowych. Powlekane cząstki nośnika mogą być przymocowane z możliwością uwalniania do mogącej się przemieszczać płytki nośnika lub mogą być przymocowane z możliwością uwalniania do powierzchni, wzdłuż której przechodzi strumień gazu, unosząc cząstki z powierzchni i przyspieszając je w kierunku celu. Przykład urządzenia z wyładowaniem gazowym jest opisany w patencie USA nr,4,23. Urządzenie typu wybuchowego opisano w patencie USA nr 4,94,00. Jeden przykład urządzenia z wyładowaniem elektrycznym odpowiedniego do stosowania w niniejszym wynalazku jest opisany w patencie USA nr,1,67. Inne urządzenie z wyładowaniem elektrycznym opisano w patencie USA nr,149,6.

78 [0166] Cząstki mogą być również podawane przy użyciu urządzenia z bezigłową strzykawką, takiego jak to opisane w patencie USA nr,6,796 dla Bellhouse i wsp. (urządzenie z bezigłową strzykawką PowderJect ) oraz w międzynarodowych publikacjach nr WO 94/24263, WO 96/04947, WO 96/1213 i WO 96/022. [0167] Urządzenia, takie jak opisane w patencie USA nr,6,796, mogą być dostarczone jako przyrząd w kształcie pióra, zawierający, w porządku liniowym, poruszając się od góry do dołu, cylinder gazowy, kasetę lub pojemnik z cząstkami i naddźwiękową dyszę z towarzyszącym jej tłumikiem. Cząstki są dostarczone w odpowiednim pojemniku, np. kasecie utworzonej przez dwie podlegające przerwaniu błony polimerowe, które są zgrzane z elementem oddzielającym w kształcie bębna, tworząc samodzielną zamkniętą jednostkę. Materiały błony można wybrać dla uzyskania określonego trybu otwierania i ciśnienia rozrywającego, które określają warunki, w których naddźwiękowy przepływ jest inicjowany. [0168] W trakcie pracy, urządzenie jest uruchamiane, z uwolnieniem sprężonego gazu z cylindra do komory rozprężania w urządzeniu. Następuje kontakt uwalnianego gazu z kasetą z cząstkami i, gdy powstanie dostateczne ciśnienie, następuje gwałtowne rozerwanie błony kasety, z wprowadzeniem cząstek do naddźwiękowej dyszy do następującego potem dostarczania. Dysza jest przeznaczona do osiągnięcia określonej prędkości gazu i wzoru przepływu do dostarczania pewnej ilości cząstek do powierzchni docelowej w określonym obszarze. Tłumik

79 jest stosowany do tłumienia hałasu wytwarzanego przez naddźwiękowy przepływ gazu. [0169] System dostarczania opisany w międzynarodowej publikacji nr WO 96/022 także wykorzystuje energię sprężonego źródła gazu do przyspieszania i dostarczania sproszkowanych kompozycji. Jednakże, różni się on od systemu z patentu USA nr,6,796 zastosowaniem fali uderzeniowej zamiast przepływu gazu do przyspieszenia cząstek. Bardziej konkretnie, wzrost ciśnienia chwilowego dostarczany przez falę uderzeniową wytworzoną za elastyczną kopułą uderza w tylną część kopuły, powodując nagłe wywinięcie giętkiej kopuły w kierunku powierzchni docelowej. To nagłe wywinięcie wyrzuca sproszkowaną kompozycję (która znajduje się na zewnątrz kopuły) z odpowiednią prędkością, a więc pędem, by penetrować tkankę docelową, np., tkankę śluzową jamy ustnej. Sproszkowana kompozycja jest uwalniana w punkcie pełnego wywinięcia kopuły. Kopuła służy również do tego, aby całkowicie pomieścić przepływ gazu pod wysokim ciśnieniem, który w związku z tym nie wchodzi w kontakt z tkanką. Ponieważ gaz nie jest uwalniany w czasie tej operacji dostarczania, właściwością systemu jest to, że jest on cichy. Ten projekt może być użyty w innych zamkniętych lub innych wymagających zastosowaniach, na przykład do dostarczania cząsteczek do minimalnie inwazyjnych miejsc zabiegów chirurgicznych. [0170] Cząstki mogą być dostarczane in vivo bezpośrednio osobnikowi lub ex vivo do komórek pobranych od podmiotu, a transformowane komórki są następnie ponownie przeszczepiane osobnikowi. W

80 przypadku dostarczania in vivo wstrzyknięcie cząstek jest zazwyczaj podskórne, donaskórkowe, śródskórne, dośluzówkowe (np. donosowe, doodbytnicze i/lub dopochwowe), dootrzewnowe, dożylne, doustne lub domięśniowe. Korzystnie, jeżeli dostarczanie jest do ostatecznie zróżnicowanych komórek; jednakże cząstki mogą być również dostarczane do komórek niezróżnicowanych lub częściowo zróżnicowanych, takich jak komórki macierzyste krwi i fibroblasty skóry. Najkorzystniej, jeżeli dostarczanie jest do komórek naskórkowych skóry. [0171] Cząstki podaje się osobnikowi w sposób zgodny z postacią preparatu do dawkowania oraz w ilości, która będzie profilaktycznie i/lub terapeutycznie skuteczna. Terapeutycznie skuteczna ilość kompozycji w postaci cząstek według niniejszego wynalazku będzie wystarczająca do przeprowadzenia leczenia lub zapobiegania objawom choroby lub stanu i będzie pozostawać w stosunkowo szerokim zakresie, który można określić przeprowadzając rutynowe próby. Generalnie cząsteczki są dostarczane w ilości od 0,001 do 00 μg, korzystniej 0,01 do,0 μg kwasu nukleinowego na dawkę. Jednakże dokładna niezbędna ilość będzie zależeć od wieku i ogólnego stanu leczonego osobnika i konkretnej wybranej sekwencji nukleotydowej, jak i innych czynników. Odpowiednią skuteczną ilość można łatwo określić poprzez badanie kliniczne. Physicians Desk Reference i Goodman and Gilman s The Pharmacological Basis of Therapeutics są przydatne do określania potrzebnej ilości.

81 80 Testy Porównawczy test na ekspresję 1 2 [0172] Odpowiedni test na przydatność elementu określa wpływ elementu na ekspresję polipeptydu. Podstawą porównania dla testowania przydatności elementów jest wektor podstawowy, generalnie (o ile nie zaznaczono, że jest inaczej) plazmid z promotorem hcmv, eksonem 1 hcmv, 9 zasadami eksonu 2 hcmv, 'UTR z pres2 HBV oraz regionem poliadenylacji króliczej β-globiny, w takim położeniu, aby kierować ekspresją sekwencji kodującej. Typowo wektorem podstawowym jest pjv7384, PJV7401, PJV740 lub PJV733. Dodawane są heterologiczne introny i 3'UTR, albo sekwencje promotorowe, eksony, 'UTR i miejsca polia są podmieniane w wektorach podstawowych, z wytworzeniem testowych wektorów ekspresyjnych. A zatem można badać warianty funkcjonalne lub fragmenty. [0173] Wektory podstawowe i wektory badane transformuje się do odpowiednich komórek gospodarza i komórki analizuje pod kątem poziomów ekspresji polipeptydu. Korzystnie stosuje się ssacze komórki gospodarza. Odpowiednie komórki obejmują ssacze komórki HEK 293T, CHO, HeLa, BHK, 3T3 lub COS. [0174] Typowo, funkcjonalny element powoduje ekspresję, która jest porównywalna z wektorem podstawowym, na przykład co najmniej taka sama lub większa. Korzystnie, jeżeli ekspresję bada się w więcej niż jednym typie komórek i z więcej niż jedną sekwencją kodującą.

82 81 [017] Odpowiednie protokoły doświadczalne są dostarczone, na przykład, w Przykładach 1 do 13, poniżej. Porównawczy test na immunogenność 1 2 [0176] Tam, gdzie polipeptydem, który ma być poddawany ekspresji, jest antygen, można przeprowadzić dalsze badanie w celu zidentyfikowania funkcjonalnych lub szczególnie korzystnych elementów konstruktu. W tym teście wpływ elementu na odpowiedź immunologiczną określa się po dostarczeniu wektora ekspresyjnego do badanego organizmu. Poziomy przeciwciał przeciwko antygenowi są najprostszym sposobem, aby ocenić odpowiedź immunologiczną. Szczepi się grupy myszy wektorami podstawowymi lub wektorami badanymi skonstruowanymi jak wyżej. Surowice zbiera się po upływie odpowiedniego czasu i analizuje pod kątem poziomów przeciwciał. [0177] Ten eksperyment przeprowadza się dwukrotnie, a poziomy przeciwciał ze wszystkich grup w obydwu doświadczeniach nanosi się na wykres. Funkcjonalne elementy będą dawać co najmniej tak wysokie lub wyższe miana przeciwciał w obydwu doświadczeniach dla konkretnego antygenu, co wektor podstawowy. Korzystnie, jeżeli wynik będzie widoczny dla więcej niż jednego antygenu, aby wykazać szeroką przydatność elementu(elementów) w tym panelu ekspresyjnym. [0178] Odpowiednie protokoły doświadczalne są dostarczone na przykład w Przykładzie 14, poniżej.

83 82 C. Część eksperymentalna [0179] Poniżej przedstawiono przykłady konkretnych wykonań dla realizacji niniejszego wynalazku. Przykłady są podane jedynie w celach ilustracyjnych i nie mają na celu ograniczania zakresu niniejszego wynalazku w jakikolwiek sposób. [0180] Dołożono starań, aby zapewnić dokładność w odniesieniu do stosowanych liczb (np. ilości, temperatur, itd.), ale pewne błędy doświadczalne i odchylenia powinny być oczywiście dozwolone. Metody 1 Standardowe warunki PCR 2 [0181] Standardowe warunki PCR stosowane do konstrukcji wektorów były następujące: 1 x podstawowy bufor do PCR/1, mm MgCl 2 (Promega Corporation, Madison, WI), 0,400 μm każdego ze starterów, 0 μm każdego z dntp (USB, Cleveland, Inc., OH), 2, µ polimerazy Taq (Promega Corporation, Madison, WI), 1,0 ng matrycy DNA, woda do 0 l i olej mineralny (Aldrich Chemical, Inc, Milwaukee, WI) jako wierzchnia warstwa. Termocykler PTC-0 (MJ Research, Inc, Waltham, Massachusetts) został zaprogramowany, aby dawać następujący rutynowy przebieg: C, cykli (1'@9 C), '@72 C, trzymanie 4 C). Produkty amplifikacji zostały wyodrębnione z reakcji PCR przy użyciu QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen

84 83 Inc, Valencia, CA) przed cięciem enzymami restrykcyjnymi (New England Biolabs, Beverly, MA). [0182] Wszystkie produkty PCR zsekwencjonowano po klonowaniu w celu zapewnienia wierności amplifikacji. Przykład 1. Konstruowanie zestawów wektorowych dla antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B (HBsAg) [0183] Skonstruowano kilka plazmidowych wektorów ekspresyjnych dla ekspresji HBsAg. Materiały wyjściowe 1 [0184] 2 (i) pwrg7128 (Roy, M, i wsp. Vaccine (01) 19: ), który zawiera sekwencję najwcześniejszego promotora hcmv, pierwszy ekson, pierwszy intron i częściowy ekson drugi z głównego najwcześniejszego genu hcmv, sekwencję kodującą HBsAg z regionami flankującymi (sekwencja pochodząca z 'UTR pres2 HBV i element odpowiedzi potranskrypcyjnej 3') oraz region poliadenylacji bydlęcego hormonu wzrostu (BGHpA) (ii) pjv7284, pochodna pwrg7128, w której BGHpA jest zastąpiony przez region poliadenylacji króliczej β globiny (RBGpA). (a) pjv7384 (CMV (bez intronu), 'UTR pres2 HBV i RBGpA)

85 pwrg7128 poddano reakcji PCR przy użyciu JF93 (NR ID. SEKW.: 1) i F1 (NR ID. SEKW.: 16), stosując standardowe warunki, i przecięto SalI i BamHI, aby wyizolować fragment stanowiący wstawkę zawierający promotor CMV, ekson 1 i część sekwencji eksonu 2. pam6 (ATCC Mannassas, VA) przecięto BamHI i BstXI, aby wyizolować fragment stanowiący wstawkę, który zawierał '-UTR HBsAg i około 70% z regionu kodującego HBsAg. pjv7284 przecięto SalI i BstXI, aby wytworzyć fragment wektorowy, do którego dwa fragmenty stanowiące wstawki zostały włączone poprzez ligację, uzyskując w rezultacie pjv7293. pwrg7128 został poddany reakcji PCR ze starterami GW1 (SEK NR ID: 17) i JF24 (NR ID. SEKW.: 18) i strawiony BstXI i BglII, aby wyizolować fragment stanowiący wstawkę, który zawierał koniec 3' regionu kodującego HBsAg. pjv7293 przecięto BstXI i BglII, aby wytworzyć fragment wektorowy, do którego dwa fragmenty stanowiące wstawki zostały włączone poprzez ligację, uzyskując w rezultacie wektor pjv7384. (b) pjv7382 (CMV (bez intronów), 3'UTR HBsAg, 'UTR pres2 HBV i RBGpA) pjv7293 przecięto XhoI i XbaI, aby wytworzyć fragment stanowiący wstawkę zawierający promotor CMV/eksony i '-UTR z końcem ' sekwencji kodującej HBsAg. pwrg7128 przecięto XbaI i BclI, aby wytworzyć fragment stanowiący wstawkę zawierający większą część sekwencji kodującej HBsAg i 3'-UTR. pjv7284 przecięto XhoI i BglII, aby wytworzyć fragment wektorowy, do którego dwa fragmenty stanowiące

86 8 1 wstawki zostały włączone poprzez ligację, uzyskując w rezultacie wektor pjv7382. (c) pjv7389 (CMV (RIA), 3'UTR HBsAg, 'UTR pres2 HBV i RBGpA) Intron A szczurzej insuliny (RIA) wytworzono w reakcji PCR z plazmidu p'rins (nieznanego pochodzenia) ze starterami GW (NR ID. SEKW.: 19) i JF2 (NR ID. SEKW.: ). Produkt PCR przecięto BamHI i wstawiono do pjv7382 zlinearyzowanego BamHI, uzyskując w rezultacie pjv7389. (d) pjv7387 (CMV (RIA), 'UTR pres2 HBV i RBGpA) pjv7384 przecięto BstXI i EcoRI, aby wyizolować fragment stanowiący wstawkę zawierający koniec 3' regionu kodującego HBsAg i RBGpA. pjv7389 przecięto BstXI i EcoRI, aby wytworzyć fragment wektorowy, do którego dwa fragmenty stanowiące stanowiące wstawki zostały włączone poprzez ligację, uzyskując w rezultacie pjv7387. Przykład 2. Konstruowanie zestawów wektorowych dla antygenu - glikoproteiny D wirusa opryszczki pospolitej (HSVgD) 2 [018] Skonstruowano kilka plazmidowych wektorów ekspresyjnych dla ekspresji HSVgD.

87 86 Materiały wyjściowe [0186] 1 (a) pjv7334, pochodna pwrg7284 (pjv 7284), w której sekwencja kodująca HBsAg jest zastąpiona przez NheI w ramce bezpośrednio za kodonem start ATG, a po czym następuje fragment wypełniający z BamHI, bezpośrednio po stronie ' HBV Enh. (b) pwrg72, pochodna pgem3z (Promega) z fragmentem wypełniającym, który umożliwia fuzję sekwencji kodującej z peptydem sygnałowym ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu (TPA), poniżej miejsca NheI. (a) pjv7392 (CMV (natywny intron), 3'UTR HBsAg, 'UTR HBsAg i RBGpA) 2 [0187] Region kodujący gd HSV2 uzyskano w reakcji PCR z zapasu wirusowego DNA (Advanced Biotech, Inc, Columbia, MD) przy użyciu starterów DS1 (NR ID. SEKW.: 21) i DA1 (NR ID. SEKW.: 22) i przecięto NheI i EcoRI, aby wytworzyć fragment stanowiący wstawkę. pwrg72 przecięto NheI i EcoRI, aby wytworzyć fragment wektorowy, do którego fragment stanowiący wstawkę włączono poprzez ligację, uzyskując w rezultacie pjv7391. [0188] pjv7391 przecięto NheI i BglII, aby wyizolować fragment stanowiący wstawkę zawierający sekwencję kodującą gd HSV2. pjv7334 strawiono NheI i BamHI, aby wytworzyć fragment wektorowy, do którego fragment

88 87 stanowiący wstawkę włączono poprzez ligację, uzyskując w rezultacie pjv7392. Ten wektor składa się z następujących elementów ekspresyjnych: sekwencji najwcześniejszego promotora hcmv, pierwszego eksonu, pierwszego intronu i częściowego drugiego eksonu z głównego najwcześniejszego genu hcmv, sekwencji 'UTR z HBsAg, sekwencji kodującej dla genu gd HSV2, 3'-UTR z HBsAg i RBGpA. (b) pjv7399 (CMV(bez intronu), 3'UTR HBsAg, 'UTR HBsAg i RBGpA) 1 [0189] Bezintronową wersję pjv7392 skonstruowano jak następuje. pjv7384 przecięto HindIII i NdeI, aby wyizolować fragment stanowiący wstawkę zawierający końce ' genu oporności na kanamycynę i promotor CMV. pjv7384 przecięto NdeI i SspI, aby wyizolować fragment stanowiący wstawkę zawierający koniec 3' promotora CMV, ekson 1/2 CMV i koniec ' '-UTR z HBsAg. Te fragmenty stanowiące wstawki wstawiono do pjv7392, z którego usunięto fragment HindIII-SspI, uzyskując w rezultacie pjv (c) pjv7400 (CMV(RIA), 3'UTR HBsAg, 'UTR HBsAg i RBGpA) [0190] Wersję pjv7392 z RIA skonstruowano jak następuje. pjv7384 przecięto HindIII i NdeI, aby wyizolować fragment stanowiący wstawkę zawierający końce ' genu oporności na kanamycynę i promotor CMV. pjv7384 przecięto NdeI i SspI, aby wyizolować fragment

89 88 stanowiący wstawkę zawierający koniec 3' promotora CMV, ekson 1/2(częściowy) CMV i koniec ' '-UTR z HBsAg. Te fragmenty stanowiące wstawki wstawiono do pjv7392, z którego usunięto fragment HindIII-SspI, uzyskując w rezultacie pjv7400. (d) pjv7401 (CMV (bez intronu), 'UTR HBsAg i RBGpA) 1 [0191] Wersję pjv7399 bez 3'-UTR skonstruowano jak następuje. pjv7391 przecięto Bsp1I i BglII, aby wyizolować fragment stanowiący wstawkę zawierający koniec 3' genu gd HSV2. pjv7284 przecięto BglII i EcoRI, aby wyizolować sygnał RBGpA. Te fragmenty stanowiące wstawki wstawiono do pjv7399, z którego usunięto fragment Bsp11-EcoRI, uzyskując w rezultacie pjv7401. (e) pjv7402 (CMV (RIA), 'UTR HBsAg i RBGpA) 2 [0192] Wersję pjv7400 bez 3'-UTR skonstruowano jak następuje. pjv7391 przecięto Bsp1I i BglII, aby wyizolować fragment stanowiący wstawkę zawierający koniec 3' genu gd HSV2. pjv7284 przecięto BglII i EcoRI, aby wyizolować sygnał RBGpA. Te fragmenty stanowiące wstawki wstawiono do pjv7400, z którego usunięto fragment Bsp11-EcoRI, uzyskując w rezultacie pjv7402.

90 89 Przykład 3. Konstruowanie zestawów wektorowych dla antygenu Flu M2 (a) pjv740 (CMV(bez intronu), UTR HBsAg i RBGpA) [0193] Region kodujący dla Flu M2 wytworzono w reakcji PCR z plazmidu pfl-m2 (Joel Haynes, PJV) stosując startery JF1 (NR ID. SEKW.: 23) i JF2 (NR ID. SEKW.: 24) i przecięto NheI i BglII, aby wytworzyć fragment stanowiący wstawkę. pjv7401 przecięto NheI i BglII, aby wytworzyć fragment wektorowy, do którego fragment stanowiący wstawkę włączono poprzez ligację, uzyskując w rezultacie pjv (b) pjv742 (CMV (bez intronu), 3 UTR HBsAg, UTR HBsAg i RBGpA) [0194] Fragment 3'UTR wytworzono w reakcji PCR z pjv7389 przy użyciu starterów JF84 (NR ID. SEKW.: 2) i JF22 (NR ID. SEKW.: 26), przecięto Bsp1I, wypełniono polimerazą DNA T4 i dodano linkery BglII (# kat. 36, New England Biolabs). Fragment przecięto następnie BglII i EcoRI, aby wyizolować fragment stanowiący wstawkę zawierający 3'UTR z HBsAg i region RBGpA. pjv740 przecięto BglII i EcoRI, aby wytworzyć fragment wektorowy, do którego fragment stanowiący wstawkę włączono poprzez ligację, uzyskując w rezultacie pjv742.

91 90 (c) pjv748 (CMV(RIA), ' UTR HBsAg i RBGpA) [019] Wersję pjv740 zawierającą RIA skonstruowano jak następuje: pjv7389 przecięto BamHI, aby wyizolować fragment stanowiący wstawkę zawierający RIA. pjv740 przecięto BamHI, aby wytworzyć fragment wektorowy, do którego fragment stanowiący wstawkę włączono poprzez ligację, uzyskując w rezultacie pjv748. (d) PJV7468 (CMV(RIA), 3 UTR HBsAg, UTR HBsAg i RBGpA) 1 [0196] Wersję pjv748 zawierającą 3'UTR z HBsAg skonstruowano jak następuje: pjv742 przecięto BglII i EcoRI, aby wyizolować fragment stanowiący wstawkę zawierający 3'UTR HBsAg i RBGpA. pjv748 przeciętobglii i EcoRI, aby wytworzyć fragment wektorowy, do którego fragment stanowiący wstawkę włączono poprzez ligację, uzyskując w rezultacie pjv7468. Przykład 4. Konstruowanie zestawów wektorowych dla beta-gal 2 [0197] (a) pjv7488 (CMV (bez intronu), 3'UTR HBsAg, 'UTR HBSAg i RBGpA) CMV-beta (Clontech) wytworzono w reakcji PCR przy użyciu starterów JF33 (NR ID. SEKW.: 27) i JF336 (NR ID. SEKW.: 28), i przecięto NheI i BglII, aby wyizolować fragment stanowiący wstawkę kodujący

92 beta-galaktozydazę. pjv742 przecięto NheI i BglII, aby wytworzyć fragment wektorowy, do którego fragment stanowiący wstawkę włączono poprzez ligację, uzyskując w rezultacie pjv7488. (b) pjv733 (CMV (bez intronu), 'UTR HBsAg i RBGpA) pjv740 przecięto BglII i EcoRI, aby wyizolować fragment stanowiący wstawkę zawierający RBGpA. pjv7488 przecięto BglII i EcoRI, aby wytworzyć fragment wektorowy, do którego fragment stanowiący wstawkę włączono poprzez ligację, uzyskując w rezultacie pjv733. (c) pjv71 (CMV(RIA/NheI), 3'UT4HBsAg, 'UTR HBsAg i RBGpA) pjv7 (patrz Przykład ) przecięto XhoI i BamHI, aby wyizolować fragment stanowiący wstawkę zawierający promotor CMV wraz z RIA. pjv733 przecięto XhoI i BamHI, aby wytworzyć fragment wektorowy, do którego fragment stanowiący wstawkę włączono poprzez ligację, uzyskując w rezultacie pjv71. (d) pjv72(cmv(ria/nhei), UTR HBsAg i RBGpA) pjv7 przecięto XhoI i BamHI, aby wyizolować fragment stanowiący wstawkę zawierający promotor CMV wraz z RIA. pjv73 w przecięto XhoI i BamHI, aby wytworzyć fragment wektorowy, do którego fragment stanowiący wstawkę włączono poprzez ligację, uzyskując w rezultacie pjv72.

93 92 Przykład. Konstruowanie plazmidów ekspresyjnych pjv (pjv763) 1 (a) pjv7496 [0198] pjv7389 poddano reakcji PCR przy użyciu starterów JF37 (NR ID. SEKW.: 29) i JF36 (NR ID. SEKW.: ), traktowano polimerazą DNA T4, aby wytępić końce i przecięto SalI, aby wyizolować fragment stanowiący wstawkę kodujący oporność na kanamycynę. pjv7389 przecięto AvaI, traktowano polimerazą DNA T4, aby wytępić końce i przecięto SalI, aby wyizolować fragment wektorowy, do którego fragment stanowiący wstawkę włączono poprzez ligację, uzyskując w rezultacie pjv7496. (b) pjv7 2 [0199] pjv7389 poddano reakcji PCR przy użyciu starterów JF393 (NR ID. SEKW.: 31) i JF406 (NR ID. SEKW.: 32), i przecięto BglII i BamHI, aby wyizolować fragment stanowiący wstawkę zawierający RIA pozbawiony wewnętrznego miejsca NheI. pjv7496 przecięto BamHI, aby wytworzyć fragment wektorowy, do którego fragment stanowiący wstawkę włączono poprzez ligację, uzyskując w rezultacie pjv7. (c) pjv749 [00] pjv7468 przecięto BamHI i EcoRV, aby wyizolować fragment stanowiący wstawkę zawierający M2 i część 3'ENH HBV. pjv7 przecięto BamHI i EcoRV, aby

94 93 wytworzyć fragment wektorowy, do którego fragment stanowiący wstawkę włączono poprzez ligację, uzyskując w rezultacie pjv749. (d) pjv763 1 [01] Przyłączono startery JF26 (NR ID. SEKW.: 33) i JF27 (NR ID. SEKW.: 34), aby wytworzyć fragment stanowiący wstawkę składający się ze zgrupowania miejsc do klonowania. pjv749 przecięto NheI i BglII, aby wytworzyć fragment wektorowy, do którego fragment stanowiący wstawkę włączono poprzez ligację, uzyskując w rezultacie pjv763. Mapa plazmidu pjv763 jest dostarczona na Fig. 12. Skład zasad dla plazmidu pjv763 jest dostarczony na Fig. 13. Składniki i ich pozycja w plazmidzie pjv763 są następujące: 1-44 Sekwencje transpozonu Sekwencja kodująca odporność na kanamycynę z transpozonu Sekwencje transpozonu Miejsce SalI Promotor CMV Niepodlegająca translacji sekwencja liderowa z najwcześniejszego genu CMV

95 Fuzja miejsc dla enzymów restrykcyjnych BamH1 i BglII Intron A szczurzej insuliny Miejsce BamHI Niepodlegający translacji lider ' antygenu powierzchniowego HBV Syntetyczny kodon start/miejsce do klonowania NheI Syntetyczne miejsca do klonowania Wzmacniacz HBV 24-2 Sekwencja starego wektora. Nie ma trafień w bazach danych NCBI Region poliadenylacji szczurzej betaglobiny Sekwencja wektora puc19

96 9 Przykład 6. Konstruowanie Zestawów do ekspresji peptydu sygnałowego przy użyciu ludzkiej wydzielanej alkalicznej fosfatazy (SEAP) i fragmentu Fc ludzkiej IgG (hfc) jako antygenów modelowych (i) pjv707 (htpasp i SEAP) 1 [02] pseap-basic (Clontech) poddano reakcji PCR przy użyciu starterów JF3 (NR ID. SEKW.: 3) i JF321 (NR ID. SEKW.: 36), a następnie przecięto NheI i BglII, aby wyizolować fragment stanowiący wstawkę składający się z fragmentu ludzkiej SEAP. pjv7079 (Macklin i wsp.) przecięto NheI i BglII, aby wytworzyć fragment wektorowy, do którego fragment stanowiący wstawkę włączono poprzez ligację, uzyskując w rezultacie pjv707. (ii) pjv708 (htpasp i hfc) 2 [03] Ludzki DNA poddano reakcji PCR przy użyciu starterów JF386 (NR ID. SEKW.: 37) i FcAS (NR ID. SEKW.: 38), a następnie przecięto NheI i BglII, aby wyizolować fragment stanowiący wstawkę składający się z fragmentu ludzkiego Fc IgG. pjv7079 przecięto NheI i BglII, aby wytworzyć fragment wektorowy, do którego fragment stanowiący wstawkę włączono poprzez ligację, uzyskując w rezultacie pjv708.

97 96 (iii) Wytwarzanie sekwencji kodującej peptyd sygnałowy aprotyniny [04] Syntetyczny oligo JF34 (NR ID. SEKW.: 39) poddano reakcji PCR przy użyciu starterów JF3 (NR ID. SEKW.: 40) i JF36 (NR ID. SEKW.: 41), aby wytworzyć sekwencję kodującą dla peptydu sygnałowego aprotyniny. (iv) Wytwarzanie sekwencji kodującej peptyd sygnałowy ekstensyny tytoniu 1 [0] Syntetyczny oligo JF348 (NR ID. SEKW.: 42) poddano reakcji PCR przy użyciu starterów JF349 (NR ID. SEKW.: 43) i JF (NR ID. SEKW.: 44) aby wytworzyć sekwencję kodującą peptyd sygnałowy ekstensywny tytoniu. 2 (v) Wytwarzanie sekwencji kodującej peptyd sygnałowy kurzego lizozymu [06] Syntetyczny oligo JF31 (NR ID. SEKW.: 4) poddano reakcji PCR przy użyciu starterów JF32 (NR ID. SEKW.: 46) i JF33 (NR ID. SEKW.: 47) aby wytworzyć sekwencję kodującą peptyd sygnałowy kurzego lizozymu. (a) Zestawy dla peptydu sygnałowego Flu M2 [07] pjv7499 (CMV (bez intronu), 'UTR HBsAg, RBGpA, s.p. aprotyniny) [08] pjv7497 (CMV (bez intronu), 'UTR HBsAg, RBGpA, s.p. ekstensyny tytoniu)

98 [09] PJV700 (CMV(bez intronu), 'UTR HBsAg, RBGpA, s.p. kurzego lizozymu) [02] Sekwencje kodujące dla peptydów sygnałowych przecięto SpeI u NheI, aby wyizolować fragmenty stanowiące wstawki. pjv740 przecięto NheI, aby wytworzyć fragment wektorowy, do którego fragment stanowiący wstawkę włączono poprzez ligację, uzyskując w rezultacie pjv7499 (aprotynina), pjv7497 (ekstensyna tytoniu) i pjv700 (kurzy lizozym). [0211] (b) Zestawy dla peptydu sygnałowego SEAP [0212] pjv713 (CMV (bez intronu), 'UTR HBsAg, RBGpA, s.p. aprotyniny) [0213] pjv712 (CMV(bez intronu), 'UTR HBsAg, RBGpA, s.p. ekstensyny tytoniu) [0214] pjv7 (CMV (bez intronu), 'UTR HBsAg, RBGpA, s.p. kurzego lizozymu) [021] pjv7499; 7497 i 700 przecięto XhoI i NheI, aby wyizolować fragment stanowiący wstawkę składający się z promotora CMV z sekwencją kodującą peptyd sygnałowy plazmidów. PJV707 przecięto XhoI i NheI, aby wytworzyć fragment wektorowy, do którego fragment stanowiący wstawkę włączono poprzez ligację, uzyskując w rezultacie pjv713 (aprotynina), pjv712 (ekstensyna tytoniu) i pjv7 (kurzy lizozym). (c) Zestawy dla peptydu sygnałowego hfc [0216] pjv724 (CMV (bez intronu), 'UTR HBsAg, RBGpA, s.p. aprotyniny) [0217] pjv72 (CMV (bez intronu), 'UTR HBsAg, RBGpA, s.p. ekstensyny tytoniu)

99 98 [0218] pjv726 (CMV (bez intronu), 'UTR HBsAg, RBGpA, peptyd sygnałowy kurzego lizozymu) [0219] pjv7499, 7497 i 700 przecięto XhoI i NheI, aby wyizolować fragment stanowiący wstawkę składający się z promotora CMV wraz z sekwencją kodującą peptyd sygnałowy plazmidów. PJV708 przecięto XhoI i NheI, aby wytworzyć fragment wektorowy, do którego fragment stanowiący wstawkę włączono poprzez ligację, uzyskując w rezultacie pjv724 (aprotynina), pjv72 (ekstensyna tytoniu) i pjv726 (kurzy lizozym). Przykład 7. Konstruowanie zestawów dla ludzkiej wydzielanej alkalicznej fosfatazy (SEAP) 1 (a) pjv731 (CMV (bez intronu), 'UTR HBsAg, RBGpA, s.p. kurzego lizozymu) 2 [02] pjv7 przecięto SalI and BglII, aby wyizolować fragment stanowiący wstawkę zawierający promotor CMV wraz z peptydem sygnałowym lizozymu. pjv740 przecięto SalI i BglII, aby wytworzyć fragment wektorowy, do którego fragment stanowiący wstawkę włączono poprzez ligację, uzyskując w rezultacie pjv731. (b) pjv74 (CMV(RIA/NheI), 'UTR HBsAg, RBGpA, s.p. kurzego lizozymu) [0221] pjv7 przecięto XhoI i BamHI, aby wyizolować fragment stanowiący wstawkę zawierający promotor CMV wraz RIA. pjv731 przecięto XhoI i BamHI, aby wytworzyć

100 99 fragment wektorowy, do którego fragment stanowiący wstawkę włączono poprzez ligację, uzyskując w rezultacie pjv74. (c) pjv768 (CMV (bez intronu), 3'UTR HBsAg, 'UTR HBsAg, RBGpA, s.p. kurzego lizozymu) [0222] pjv763 przecięto BglII i EcoRI, aby wyizolować fragment stanowiący wstawkę zawierający 3'-UTR HBV i RBGpA. pjv731 przecięto BglII i EcoRI, aby wytworzyć fragment wektorowy, do którego fragment stanowiący wstawkę włączono poprzez ligację, uzyskując w rezultacie pjv (d) pjv772 (CMV(RIA/NheI), 3 UTR HBsAg, 'UTR HBsAg, RBGpA, s.p. kurzego lizozymu) [0223] pjv763 przecięto BglII i EcoRI, aby wyizolować fragment stanowiący wstawkę zawierający 3'-UTR HBV i RBGpA. pjv74 przecięto BglII i EcoRI, aby wytworzyć fragment wektorowy, do którego fragment stanowiący wstawkę włączono poprzez ligację, uzyskując w rezultacie pjv772. 2

101 0 Przykład 8. Konstruowanie wektorów z beta-gal i HBsAg z użyciem intronów z kurzej keratyny i kurzej aktyny mięśnia sercowego (a) pjv77 (Beta-gal, CMV (intron ca), 3'UTR HBsAg, 'UTR HBsAg i RBGpA) 1 [0224] Kurzy DNA poddano reakcji PCR przy użyciu starterów JF4 (NR ID. SEKW.: 48) i JF442 (NR ID. SEKW.: 49), i przecięto BglII i BamHI, aby wyizolować fragment stanowiący wstawkę składający się z intronu i flankujących sekwencji eksonowych z kurzej aktyny mięśnia sercowego. pjv7488 przecięto BamHI, aby wytworzyć fragment wektorowy, do którego fragment stanowiący wstawkę włączono poprzez ligację, uzyskując w rezultacie pjv77. 2 (b) pjv78 (Beta-gal, CMV (intron ck), 3'UTR HBsAg, 'UTR HBsAg i RBGpA) [022] Kurzy DNA poddano reakcji PCR przy użyciu starterów JF421 (NR ID. SEKW.: 0) i JF444 (NR ID. SEKW.: 1) i przecięto BglII i BamHI aby wyizolować fragment stanowiący wstawkę składający się z intronu i flankujących sekwencji eksonowych z genu kurzej keratyny. pjv7488 przecięto BamHI, aby wytworzyć fragment wektorowy, do którego fragment stanowiący wstawkę włączono poprzez ligację, uzyskując w rezultacie pjv78.

102 1 (c) pjv778 (HBsAg, CMV(cA intron), 3'UTR HBsAg, 'UTR HBsAg i RBGpA) [0226] pjv77 przecięto SalI i BamHI, aby wyizolować fragment stanowiący wstawkę składający się z promotora CMV wraz regionami intronowymi. pjv7496 przecięto SalI i BamHI, aby wytworzyć fragment wektorowy, do którego fragment stanowiący wstawkę włączono poprzez ligację, uzyskując w rezultacie pjv78. (d) pjv779 (HBsAg, CMV(intron ck), 3'UTR HBsAg, 'UTR HBsAg i RBGpA) 1 [0227] pjv78 przecięto SalI i BamHI, aby wyizolować fragment stanowiący wstawkę składający się z promotora CMV wraz regionami intronowymi. pjv7496 przecięto SalI i BamHI, aby wytworzyć fragment wektorowy, do którego fragment stanowiący wstawkę włączono poprzez ligację, uzyskując w rezultacie pjv79. Przykład 9. Analiza in-vitro ekspresji antygenu dla zestawu wektorów z HBsAg 2 [0228] Dnia pierwszego, komórki SCC1 (ATCC) lub B16 (pochodzenie nieznane, wersje dostępne w ATCC) wysiano na 6-studzienkowe płytki do hodowli tkankowej przy konfluencji -40% i umożliwiono wzrost przez noc w inkubatorze. Komórko gospodarza namnażano w pożywkach rekomendowanych przez ATCC. [0229] Reakcję transfekcji przeprowadzono drugiego dnia. Dla każdego wektora, który miał być badany,

103 2 1 2 dodawano µl odczynnika Lipofectin (Life Technologies Inc., Grand Island, NY) do 180 µl pożywek Optimem (Life Technologies, Grand Island, NY) i umożliwiono inkubację w temperaturze pokojowej przez 4 minut. Dla każdego wektora, który miał być badany, 2 µg wektora zmieszano z 0 µl Optimem na 40 minut. W 4 minucie, roztwory wektora i Lipofectin zmieszano razem i pozostawiono w temperaturze pokojowej na dodatkowe minut. W trakcie tej ostatecznej inkubacji, wysiane komórki gospodarza wyjęto z inkubatora i przepłukano dwukrotnie pożywką Optimem. Po minutach, do mieszaniny Lipofectin /wektor dodawano 1,6 ml Optimem i 1 ml otrzymanej w rezultacie mieszaniny dodawano do każdej z dwóch studzienek z komórkami. Komórki gospodarza umieszczano z powrotem w inkubatorze i pozostawiano w spokoju na godzin, w którym to momencie mieszaninę Lipofectin /wektor usuwano i zastępowano standardowymi pożywkami do utrzymywania komórek. [02] 18 do 24 godzin po zmianie pożywek, od 0 do 0 µl pożywek do utrzymywania komórek pobierano z płytek do hodowli tkankowych i analizowano pod kątem ekspresji antygenu poprzez umieszczenie próbek w naczyniach reakcyjnych dostarczonych w zestawie AUSZYME Monoc Ional Diagnostic Kit (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL). Objętość badanych próbek doprowadzano do 0 µl przy użyciu PBS, a następnie do każdej próbki dodawano 0 µl koniugatu i kulek reakcyjnych. Naczynie inkubowano przez 80 minut w 40 C, po czym studzienki przemyto oczyszczając ze wszystkich ciekłych składników reakcji. Kulki następnie

104 3 1 przenoszono do nowych probówek, po czym dodawano 0 µl buforu do wywoływania koloru. Po minutach, reakcję wywoływania koloru zatrzymywano poprzez dodanie 1 M kwasu siarkowego i absorbancję mieszaniny reakcyjnej mierzono przy 490 nm. Dane pokazane na Fig. 1 są średnimi odczytami absorbancji z dwóch studzienek z dwóch doświadczeń. [0231] Jak pokazano na Fig. 1, dodanie RIA, 3'UTR HBV lub obydwu elementów do wektora podstawowego (promotor CMV, ekson i region poliadenylacji) zwiększało ekspresję HBsAg w komórkach SCC1. Jak pokazano na Fig. 2, dodanie bądź intronu kurzej keratyny, bądź aktyny mięśnia sercowego do wektora podstawowego (promotor CMV, ekson, 3'UTR HBV i region poliadenylacji) zwiększało ekspresję HBsAg w komórkach SCC1. Przykład. Analiza in-vitro ekspresji antygenu dla zestawów wektorów z Beta-gal 2 [0232] Komórki gospodarza SSC1 lub B16 transfekowano jak opisano w Przykładzie 9. [0233] Osiemnaście do czterdziestu godzin po zmianie pożywek, pożywki nasącza usuwano i komórki przemywano przy użyciu PBS. Po usunięciu cieczy do przemywania, komórki poddano lizie poprzez inkubowanie komórek w 00 µl buforu do lizy (0 mm NaPO 4, 0,1 %Triton X-0, ph 7) przez minut, a następnie fizycznie zdrapano komórki z plastykowej płytki. Lizaty poddano mikrowirowaniu przez dwie minuty, aby usunąć resztki komórkowe i do 2 µl klarowanych lizatów dodawano do 00 µl buforu reakcyjnego (80 g/ml o-

105 4 1 nitrofenylogalaktopiranozyd, 0 mm NaPO 4, ph 7) i inkubowano w 37 C przez do minut. Reakcję zatrzymywano poprzez dodanie 00 µl 1 M Na 2 CO 3 i odczytywano przy 40 nm. Dane są przedstawione jako stosunek ekspresji wzmocnionego wektora (zawierającego intron, HBVenh lub obydwa) do wektora podstawowego. [0234] Dodanie RIA, 3'UTR HBV lub obydwu elementów do wektora podstawowego (promotor CMV, ekson i region poliadenylacji) zwiększało ekspresję beta-gal w obydwu liniach komórkowych. Wyniki dla komórek SCC1 są pokazane na Fig. 3. Dodanie bądź intronu kurzej keratyny, bądź aktyny mięśnia sercowego do wektora podstawowego (promotor CMV, ekson, 3'UTR HBV i region poliadenylacji) zwiększało ekspresję ekspresję beta-gal w obydwu liniach komórkowych. Wyniki dla komórek B16 są pokazane na Fig Przykład 11. Analiza in-vitro ekspresji antygenu dla zestawów wektorowych z gd HSV [023] Komórki gospodarza SSC1 lub B16 transfekowano jak opisano w Przykładzie 9. Osiemnaście godzin po transfekcji płytki umieszczano na lodzie na 1 minut. Każdą studzienkę przemywano następnie przy użyciu 2 ml PBS (Biowhittaker, Walkerville, MD). Komórki utrwalano 0,0% gluteraldehydem (Polysciences Inc, Warrington, PA) rozcieńczonym w PBS i inkubowano przez minut w temperaturze pokojowej. Wszystkie następne inkubacje trwały 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a płukania między każdą inkubacją były jak podano powyżej. Płytki blokowano 2 ml % mleka w proszku (Bio Rad

106 1 Laboratories, Melville, NY) w PBS. Potem następowały kolejne inkubacje z 1 ml rozcieńczenia 1:00 przeciwciała monoklonalnego anty-gd (ABI, Columbia, MD) w 2% mleku w proszku/pbs/0,0% Tween- (Sigma, St. Louis, MO) i 1 ml rozcieńczenia 1:0 koziego przeciwciała anty-mysiego z HRP (KPL, Gaithersburg, MD) w PBS/0,1,% Tween-. Kolor wywołano przy użyciu 1 ml substratu do mikrostudzienek TMB (BioFX, Owings Mills, MD). Reakcje zatrzymywano przy użyciu 1 M H 2 SO 4, ciecz przenoszono do plastykowych kuwet i gęstość optyczną odczytywano przy 40 nm. Dane są przedstawione jako stosunek ekspresji wzmocnionego wektora (zawierającego intron, HBVenh lub obydwa) względem wektora podstawowego. [0236] Dodanie RIA z lub bez 3'UTR HBV do wektora podstawowego (promotor CMV, ekson i region poliadenylacji) zwiększało ekspresję HSVgD w obydwu liniach komórkowych. Wyniki dla komórek SCC1 są pokazane na Fig. 4. Przykład 12. Analiza in-vitro ekspresji antygenu dla zestawów wektorów z SEAP 2 [0237] Komórki gospodarza SSC1 lub B16 transfekowano jak opisano w Przykładzie 9. Osiemnaście do czterdziestu godzin po zmianie pożywek, pożywki nasącza usuwano i ogrzewano w 70 C przez minut. do 2 µl inaktywowanych termicznie nadsączy inkubowano przez minut z 1/ objętości 0 mm 1-homoargininy. Do lizatów dodawano 00 µl buforu reakcyjnego dla alkalicznej fosfatazy (#kat , Bio-Rad,

107 6 1 przygotowanego zgodnie z instrukcjami producenta) i inkubowano w 37 C przez do minut. Reakcję zatrzymywano poprzez dodanie 00 µl 1 M NaOH i odczytywano przy 40 nm. Dane są przedstawione jako stosunek ekspresji wzmocnionego wektora (zawierającego intron, HBVenh lub obydwa) do wektora podstawowego lub stosunek ekspresji doświadczalnych peptydów sygnałowych do wektora z ludzkim peptydem sygnałowym TPA. [0238] Jak pokazano na Fig. 8, dodanie RIA, 3'UTR HBV lub obydwu elementów do wektora podstawowego (promotor CMV, ekson i region poliadenylacji) zwiększało ekspresję SEAP w komórkach SCC1. Nieoczekiwanie, dodanie jedynie 3'UTR HBV do wektora podstawowego (promotor CMV, ekson i region poliadenylacji) zwiększało ekspresję SEAP w komórkach SCC1. [0239] Dodanie peptydów sygnałowych bądź z bydlęcej aprotyniny, kurzego lizozymu, bądź ekstensyny tytoniu do końca N dojrzałej SEAP umożliwiało wydajną sekrecję SEAP do pożywek nasdączy w obydwu liniach komórkowych. Wyniki dla komórek B16 są pokazane na Fig Przykład 13. Analiza in-vitro ekspresji antygenu dla zestawu wektorów z peptydem sygnałowym fragmentu Fc ludzkiej IgG [0240] Komórki gospodarza SSC1 lub B16 transfekowano jak opisano w Przykładzie 9. Pożywki nasdącza pobierano osiemnaście do czterdziestu godzin po zmianie pożywki. [0241] Płytki ELISA (Costar) inkubowano przez noc w 4 C z 0 µl koziego przeciwciała anty-ludzka IgG (Sigma #13382, rozcieńczenie 1/00 w buforze

108 7 1 węglanowym do powlekania) na studzienkę. Wszystkie następne inkubacje trwały 1 godzinę w temperaturze pokojowej z płukaniami ( mm Tris, mm NaCl, 0,1% Brij-3, ph 8,0) między każdą inkubacją. Studzienki blokowano następnie 0 µl % mleka w proszku, a potem nastąpiła inkubacja przy użyciu serii rozcieńczeń pożywek-nasączy w buforze do rozcieńczania (2% mleko w proszku, PBS, 0,0% Tween-). Potem nastąpiła inkubacja ze 0 µl na studzienkę koziego przeciwciała anty-ludzka IgG/HRP (Sigma #A6029, rozcieńczenie 1/000 w buforze do rozcieńczania), a następnie wywołanie koloru przy użyciu 0 µl substratu do mikrostudzienek TMB. Reakcje zatrzymywano przy użyciu 0 µl 1 M H 2 SO 4, i odczytywano przy 40 nm. Dane są przedstawione jako stosunek ekspresji doświadczalnych peptydów sygnałowych względem wektora z ludzkim peptydem sygnałowym TPA. [0242] Dodanie peptydów sygnałowych bądź z bydlęcej aprotyniny, bądź kurzego lizozymu, bądź ekstensyny tytoniu do N-końca fragmentu ludzkiego Fc umożliwiało wydajną sekrecję hfc do pożywek nasdączy w obydwu liniach komórkowych. Wyniki dla komórek B16 są pokazane na Fig Przykład 14. Zastosowanie plazmidowych wektorów ekspresyjnych z HBsAg, HSVgD i flu-m2 do immunizacji myszy a. Wytwarzanie wkładek do immunizacji [0243] Dla każdego plazmidu, który ma być badany, 2 mg 2-mikronowego złotego proszku zważono do probówki do

109 8 1 2 mikrowirówki. Po dodaniu µl porcji 0 mm spermidyny (Aldrich Chemical, Inc., Milwaukee, WI), probówkę zamieszano na wotreksie i poddano krótkiej sonikacji. Złoto zwirowano na mikrowirówce i spermidynę zastąpiono świeżą 0 µl porcją. Złoto ponownie zawieszono na worteksie, po czym do probówki dodano 2 µg DNA i zamieszano. W trakcie delikatnego mieszania na worteksie, dodano 0 µl % CaCl (Fujisawa USA, Inc, Deerfield, IL), aby wytrącić DNA na złotych kulkach. Reakcję wytrącania prowadzono przez minut na stole laboratoryjnym, po czym złoto zebrano poprzez krótkie odwirowanie na mikrowirówce i przepłukano trzy razy etanolem absolutnym (Spectrum Quality Products, Inc, Gardena, CA) w celu usunięcia nadmiaru odczynników do wytrącania. Przepłukany kompleks złoto/dna zawieszono następnie w 3,6 ml 0,0 mg/ml poliwinylopirolidonu (360 KD, Spectrum Quality Products, Inc, Gardena, CA) w etanolu absolutnym. Tą zawiesinę wstrzyknięto następnie do rurki Tefzelâ (McMaster-Carr, Chicago, IL) umieszczonej w urządzeniu do obracania rurki (PowderJect Vaccines), które powleka wnętrze rurki Tefzelâ kompleksem złoto/dna. Po zakończeniu procedury obracania rurki, rurkę pocięto na 0," pociski szczepionki, które załadowano do urządzenia XR1 (PowderJect Vaccines) do dostarczania myszom. b. Procedura szczepienia [0244] Myszy w wieku czterech do sześciu tygodni poddano narkozie mieszaniną Ketasetâ (Fort Dodge) i Rompunâ (Bayer). Brzuchy wygolono przy użyciu

110 9 elektrycznej maszynki do strzyżenia w celu usunięcia włosów i do wygolonego obszaru dostarczono dwa niezachodzące na siebie pociski szczepionki przy zastosowaniu urządzenia XR1 (40psi). Zwierzęta umieszczono z powrotem w ich klatkach i skrwawiono sześć tygodni po szczepieniu. Myszy Balb/c użyto do oceny wektorów ekspresyjnych dla HBsAg, a myszy Swiss Webster użyto do oceny wektorów ekspresyjnych dla HSVgD i flu-m2. Analiza surowic pod kątem przeciwciał anty-hbsag 1 2 [024] Po sześciu tygodniach z zaszczepionych zwierząt zebrano próbki krwi. Pewną objętość surowicy izolowanej z tych próbek umieszczano w studzienkach naczyń reakcyjnych dostarczonych z zestawem diagnostycznym AUSAB EIA Diagnostic Kit (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL). Objętość dodawanych surowic zależała od miana przeciwciała w próbce i próbkę rozcieńczano buforem do rozcieńczania próbek tak, aby utrafić w wartości, które można otrzymać przy użyciu zestawów do oceny ilościowej. 0 µl z każdej fiolki AUSAB Quantification Panel (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) dodawano do studzienek naczynia reakcyjnego. Do każdej studzienki dodawano kulki, po czym naczynie szczelnie zamykano i inkubowano przez dwie godziny w 40 C. Ze studzienek wypłukano następnie wszystkie ciekłe składniki reakcji. Do każdej przepłukanej studzienki dodawano 0 µl mieszaniny koniugatu, po czym naczynie szczelnie zamykano i inkubowano przez dwie godziny w 40 C. Ze studzienek wypłukano następnie

111 1 1 wszystkie ciekłe składniki reakcji. Kulki przenoszono do nowych probówek, po czym dodawano 0 µl buforu do wywoływania koloru. Po minutach, reakcję wywoływania koloru zatrzymywano poprzez dodanie 1 M kwasu siarkowego i absorbancję mieszaniny reakcyjnej mierzono przy 490 nm w spektrofotometrze Quantum II (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL). Ten spektrofotometr oblicza poziomy przeciwciała w próbce poprzez porównanie absorbancji próbki z krzywą standardową wytworzoną z zestawem do oceny ilościowej. Te poziomy przeciwciał koryguje się następnie, uwzględniając stopnie rozcieńczenia. Dane pokazane na Fig. 7 to średnia geometryczna dla mian dla wszystkich zwierząt zaszczepionych konkretnym wektorem. Analiza surowic pod kątem przeciwciał przeciwko antygenowi flu-m2 2 [0246] 96-studzienkowe płytki Costar do testów ELISA o średnim wiązaniu (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) powlekano syntetycznym peptydem Flu M2 (QCB/Biosource, Hopkinton, MA) w stężeniu 1 g/ml w PBS (Biowhittaker, Walkerville, MD) i inkubowano przez noc w 4 C. Płytki płukano trzykrotnie przy użyciu mm Tris (Sigma, St. Louis, MO)/ mm NaCl (Fisher Scientific)/0,1% Brij-3 (Sigma), następnie blokowano % mlekiem w proszku (Bio Rad Laboratories, Melville, NY) w PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Wszystkie następne inkubacje były w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę, a płukania między każdą inkubacją były takie, jak powiedziano powyżej. Próbki mysich surowic, standard

112 111 1 (mysie surowice anty-m2 o wysokim mianie) i kontrola ujemna (mysie surowice anty-hbsag) rozcieńczano w 2% mleku w proszku/pbs 0,0% Tween- (Sigma) i inkubowano w płytkach ELISA. Potem przeprowadzano inkubację, kolejno, z kozim przeciwciałem anty-msia IgG (H + L) sprzężonym z biotyną (Southern Biotechnology Associate, Birmingham, AL) rozcieńczonym 1:8000 w 2% mleku w proszku/pbs/0,0% Tween- i koniugatem streptawidynaperoksydaza chrzanowa (Southern Biotechnology) rozcieńczonym 1:8000 w PBS/0,1% Tween-. Kolor wywoływano przy zastosowaniu substratu TMB (BioFX, Owings Mills, MD). Reakcje zatrzymywano poprzez dodanie 1 M H 2 SO 4 i płytki sczytywano przy 40 nm przy użyciu precyzyjnego czytnika do mikropłytek Emax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Oprogramowanie SoftMax Pro 4.1 (Molecular Devices) zastosowano do obliczenia mian końcowych, stosując analizę czteroparametrową. Miana znormalizowano do standardowej surowicy, która miała ustalone uprzednio miano, w celu zminimalizowania zmienności pomiędzy testami i pomiędzy płytkami. Wyniki są pokazane na Fig Analiza surowic pod kątem przeciwciał anty-antygen HSVgD [0248] 96-studzienkowe płytki Costar do testów ELISA o średnim wiązaniu (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) powlekano białkiem gd HSV (Viral Therapeutics, Ithaca, NY) w stężeniu 1 g/ml w PBS (Biowhittaker, Walkerville, MD) i inkubowano przez noc w 4 C. Płytki płukano trzykrotnie przy użyciu mm Tris (Sigma, St.

113 Louis, MO)/ mm NaCl (Fisher Scientific)/0,1% Brij-3 (Sigma), następnie blokowano % mlekiem w proszku (Bio Rad Laboratories, Melville, NY) w PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Wszystkie następne inkubacje były w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę, a płukania między każdą inkubacją były takie, jak powiedziano powyżej. Próbki mysich surowic, standard (mysie surowice anty-gd o wysokim mianie) i kontrola ujemna (mysie surowice anty-hbsag) rozcieńczano w 2% mleku w proszku/pbs 0,0% Tween- (Sigma) i inkubowano w płytkach ELISA. Potem przeprowadzano inkubację, kolejno, z kozim przeciwciałem anty-msia IgG (H + L) sprzężonym z biotyną (Southern Biotechnology Associate, Birmingham, AL) rozcieńczonym 1:8000 w 2% mleku w proszku/pbs/0,0% Tween- i koniugatem streptawidynaperoksydaza chrzanowa (Southern Biotechnology) rozcieńczonym 1:8000 w PBS/0,1% Tween-. Kolor wywoływano przy zastosowaniu substratu TMB (BioFX, Owings Mills, MD). Reakcje zatrzymywano poprzez dodanie 1 M H 2 SO 4 i płytki sczytywano przy 40 nm przy użyciu precyzyjnego czytnika do mikropłytek Emax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Oprogramowanie SoftMax Pro 4.1 (Molecular Devices) zastosowano do obliczenia mian końcowych, stosując analizę czteroparametrową. Miana znormalizowano do standardowej surowicy, która miała ustalone uprzednio miano w celu zminimalizowania zmienności pomiędzy testami i pomiędzy płytkami. Wyniki są pokazane na Fig. 7. [0248] A zatem, opisano nowe konstrukty kwasu nukleinowego, kompozycje zawierające te konstrukty i techniki immunizacji kwasem nukleinowym przy

114 113 zastosowaniu tych konstruktów. Jakkolwiek korzystne wykonania niniejszego wynalazku zostały opisane szczegółowo, jest zrozumiałe, że można dokonać oczywistych zmian nie odchodząc od ducha i zakresu wynalazku zdefiniowanego przez załączone zastrzeżenia.

115 114 [0249] Lista sekwencji <1> JAMES FULLER <1> KONSTRUKTY KWASU NUKLEINOWEGO <1> APF 33 (X GCW) <160> 3 <170> PatentIn wersja 3.1 <2> 1 <211> 68 <212> DNA <213> Ludzki cytomegalowirus <400> 1 1 <2> 2 <211> 131 <212> DNA <213> Ludzki cytomegalowirus <400> 2

116 11 <2> 3 <211> 13 <212> DNA <213> Rattus rattus <400> 3 <2> 4 <211> 9 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> Sekwencja chimerowego promotora <400> 4 1 <2> <211> 121 <212> DNA <213> Wirus zapalenia wątroby typu B

117 116 <400> <2> 6 <211> 7 <212> DNA <213> Wirus opryszczki pospolitej <400> 6 <2> 7 <211> 48 <212> DNA <213> Wirus zapalenia wątroby typu B 1 <400> 7 <2> 8 <211> 33 <212> DNA <213> Wirus zapalenia wątroby typu B <400> 8

118 117 <2> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Małpi cytomegalowirus <400> 9 <2> <211> 131 <212> DNA <213> oryctolagus cuniculus <400> 1 <2> 11 <211> 4 <212> DNA <213> Małpi cytomegalowirus <400> 11 <2> 12 <211> 163 <212> DNA <213> Wirus opryszczki pospolitej 2

119 118 <400> 12 <2> 13 <211> 191 <212> DNA <213> Ludzki wirus brodawczaka typu 16 <400> 13 <2> 14 <211> 379 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> Wektor ekspresyjny pjv 1 <2> <221> Intron <222> (172)..(187) <223> IntA szczurzej ins <2> <221> misc_feature <222> (1).. (44) <223> Tn903, Pozostałości puc4k <2> <221>" misc_feature

120 119 <222> (861).. (896) <223> Tn903, Pozostałości puc4k <2> <221> misc_feature <222> (897).. (902) <223> puc19 MCS <2> <221> sygnał polia <222> (26).. (2686) <223> rglob pa <2> <221> miejsce polia <222> (2647)..(2647) <223>Miejsce PoliA <2> <221> promotor <222> (903)..(187) <223> CMV Pro <2> <221> 3'UTR <222> (12)..(244) <223> HBVenh <2> <221> 'UTR <222> (1864)..(1984) <223> '-UTR z pre-s2 HBV <2> <221> misc_feature

121 1 <222> (1719)..(1724) <223> Fuzja Bam/Bgl <2> <221> misc_feature <222> (198)..(1987) <223> ATG-Nhe <2> <221> misc_feature <222> (1988)..(11) <223> Miejsce wstawienia CDS <2> <221> misc_feature <222> (24)..(2) <223> nieznane 1 2 <2> <221> ekson <222> (188).. (1718) <223> Ekson 1/2 CMV <2> <221> misc_feature <222> (2693)..(379) <223> puc19 <2> <221> misc_feature <222> (4)..(860) <223> Dopełnienie KanR (Tn903)

122 <400>

123 122 <2> 1 <211> 42

124 123 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> Starter <400> 1 <2> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> Starter <400> 16 1 <2> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> Starter <400> 17 2 <2> 18 <211> 33 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna

125 124 <2> <223> Starter <400> 18 <2> 19 <211> 29 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> Starter <400> 19 1 <2> <211> 26 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> Starter <400> <2> 21 <211> 33 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna 2 <2> <223> Starter

126 12 <400> 21 <2> 22 <211> 37 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> Starter <400> 22 <2> 23 <211> 2 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna 1 <2> <223> Starter <400> 23 <2> 24 <211> <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> Starter 2 <400> 24

127 126 <2> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> Starter <400> 2 <2> 26 <211> 43 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> Starter 1 <400> 26 <2> 27 <211> 31 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> Starter <400> 27 2 <2> 28 <211> 36

128 127 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> Starter <400> 28 <2> 29 <211> 29 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> Starter <400> 29 1 <2> <211> 26 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> Starter <400> 2 <2> 31 <211> <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna

129 128 <2> <223> Starter <400> 31 <2> 32 <211> 47 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> Starter <400> 32 1 <2> 33 <211> 12 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> Starter <400> 33 <2> 34 <211> 12 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna 2 <2> <223> Starter

130 129 <400> 34 <2> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> Starter <400> 3 <2> 36 <211> 28 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna 1 <2> <223> Starter <400> 36 <2> 37 <211> 29 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> Starter 2 <400> 37

131 1 <2> 38 <211> 4 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> Starter <400> 38 <2> 39 <211> 7 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> Oligonukleotyd 1 <400> 39 <2> 40 <211> 24 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> Starter <400> 40 2 <2> 41 <211> 2

132 131 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> Starter <400> 41 <2> 42 <211> 7 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> Oligonukleotyd <400> 42 1 <2> 43 <211> 24 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> Starter <400> 43 2 <2> 44 <211> 26 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna

133 132 <2> <223> Starter <400> 44 <2> 4 <211> 1 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> Oligonukleotyd <400> 4 1 <2> 46 <211> 24 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> Starter <400> 46 <2> 47 <211> 2 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna 2 <2> <223> Starter

134 133 <400> 47 <2> 48 <211> 31 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> Starter <400> 48 <2> 49 <211> 2 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna 1 <2> <223> Starter <400> 49 <2> 0 <211> 32 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> Starter 2 <400> 0

135 134 <2> 1 <211> 29 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> Starter <400> 1 <2> 2 <211> 490 <212> DNA <213> Wirus pseudowścieklizny <400> 1 1 <2> 3 <211> 49 <212> DNA <213> Wirus mięsaka Rousa

136 13 <400> 2 PowderJect Vaccines, Inc. Pełnomocnik:

137 136 Zastrzeżenia patentowe 1 1. Konstrukt kwasu nukleinowego zawierający: (i) sekwencję chimerowego promotora, która zawiera: (a) sekwencję najwcześniejszego promotora hcmv; (b) ekson 1 i co najmniej część eksonu 2 z głównego najwcześniejszego genu hcmv, przy czym ten ekson 1 i co najmniej część eksonu 2 przylegają do siebie; i (c) intron heterologiczny, który zastępuje całkowicie albo częściowo natywny intron A głównego najwcześniejszego genu hcmv; (ii) sekwencję kodującą przyłączoną w sposób umożliwiający działanie do sekwencji promotora (i); i (iii) sekwencję wzmacniacza 3' połączoną w sposób umożliwiający działanie z sekwencją kodującą (ii); przy czym sekwencja wzmacniacza pochodzi z 3'UTR sekwencji HBsAg, a sekwencja kodująca (ii) jest heterologiczna względem sekwencji wzmacniacza Konstrukt kwasu nukleinowego według zastrz. 1 zawierający ponadto niepodlegającą translacji sekwencję liderową pochodzącą z sekwencji antygenu pres2 HBV, sekwencji antygenu e HBV i sekwencji antygenu gd HSV typu 2, przy czym sekwencja liderowa jest połączona w sposób umożliwiający działanie z promotorem i sekwencją kodującą, a sekwencja kodująca jest heterologiczna

138 137 względem niepodlegającej translacji sekwencji liderowej Konstrukt kwasu nukleinowego zawierający: (i) sekwencję chimerowego promotora, która zawiera: (a) sekwencję najwcześniejszego promotora hcmv; (b) ekson 1 i co najmniej część eksonu 2 z głównego najwcześniejszego genu hcmv, przy czym ten ekson 1 i co najmniej część eksonu 2 przylegają do siebie; i (c) intron heterologiczny, który zastępuje całkowicie albo częściowo natywny intron A głównego najwcześniejszego genu hcmv; (ii) sekwencję kodującą połączoną w sposób umożliwiający działanie z chimerowym promotorem; (iii) niepodlegającą translacji sekwencję liderową, która jest wybrana spośród sekwencji antygenu pres2 HBV, sekwencji antygenu e HBV i sekwencji antygenu gd HSV typu 2 i która jest połączona w sposób umożliwiający działanie z chimerowym promotorem; i (iv) sekwencję wzmacniacza, która pochodzi z niepodlegającego translacji regionu 3' (UTR) sekwencji HBsAg, która jest połączona w sposób umożliwiający działanie z chimerowym promotorem i która jest poniżej sekwencji kodującej.

139 Konstrukt kwasu nukleinowego według dowolnego z poprzednich zastrzeżeń, w którym: (i) sekwencja najwcześniejszego promotora hcmv (a) zawiera NR ID. SEKW.: 1, jej funkcjonalny wariant z co najmniej 80% identyczności albo funkcjonalny fragment dowolnej z nich; i/lub (ii) sekwencja eksonowa (b) zawiera NR ID. SEKW.: 2, jej funkcjonalny wariant z co najmniej 80% identyczności albo funkcjonalny fragment dowolnej z nich. 1. Konstrukt kwasu nukleinowego według dowolnego z poprzednich zastrzeżeń, w którym: heterologiczny intron (c) zawiera sekwencję wybraną spośród sekwencji intronu A szczurzego genu insuliny, sekwencji intronu A kurzego genu keratyny, sekwencji intronu A kurzego genu aktyny mięśnia sercowego, jej funkcjonalnego wariantu z co najmniej 80% identycznością z taką sekwencją intronu A albo jej funkcjonalnego fragmentu Konstrukt kwasu nukleinowego według zastrz., w którym sekwencja intronu A szczurzego genu insuliny zawiera sekwencję NR ID. SEKW.: 3, jej funkcjonalny wariant z co najmniej 80% identycznością albo funkcjonalny fragment dowolnej z nich. 7. Konstrukt kwasu nukleinowego według dowolnego z poprzednich zastrzeżeń, w którym: (i) niepodlegająca translacji sekwencja liderowa jest wybrana spośród NR ID. SEKW.:,

140 139 NR ID. SEKW.: 6, NR ID. SEKW.: 7, funkcjonalnego wariantu z co najmniej 80% identyczności z dowolną z NR ID. SEKW.: do NR ID. SEKW.: 7, albo funkcjonalnego fragmentu dowolnej sekwencji spośród NR ID. SEKW.: do NR ID. SEKW.: 7 lub takiego ich wariantu; i/lub (ii) sekwencja wzmacniacza jest wybrana spośród NR ID. SEKW.: 8, funkcjonalnego wariantu z co najmniej 80% identyczności z NR ID. SEKW.: 8 albo funkcjonalnego fragmentu NR ID. SEKW.: 8 albo takiego jej wariantu Konstrukt kwasu nukleinowego według dowolnego z poprzednich zastrzeżeń, który zawiera: (i) sekwencję poliadenylacji; i/lub (ii) sekwencję kodującą peptyd sygnałowy Konstrukt kwasu nukleinowego według dowolnego z poprzednich zastrzeżeń, w którym: (i) sekwencją poliadenylacji jest sekwencja poliadenylacji genu wybranego spośród króliczego genu β-globiny, wczesnego lub późnego genu ludzkiego wirusa brodawczaka (HPV), genu HSV-2gB, najwcześniejszego genu małpiego CMV i późnego genu HSVgD, funkcjonalnego wariantu z co najmniej 80% identyczności z dowolną z tych sekwencji lub funkcjonalnego fragmentu dowolnej z tych sekwencji poliadenylacji albo tych ich funkcjonalnych wariantów; i/lub

141 140 1 (ii) peptyd sygnałowy jest wybrany spośród peptydu sygnałowego ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu (htpasp), peptydu sygnałowego aprotyniny, peptydu sygnałowego ekstensyny tytoniu, peptydu sygnałowego kurzego lizozymu, funkcjonalnego wariantu z co najmniej 80% identyczności z dowolną z tych sekwencji kodujących peptyd sygnałowy lub tego ich funkcjonalnego fragmentu.. Konstrukt kwasu nukleinowego według zastrz. 9, w którym: sekwencja poliadenylacji jest wybrana spośród NR ID. SEKW.:, NR ID. SEKW.: 11, NR ID. SEKW.: 12, NR ID. SEKW.: 13, funkcjonalnego wariantu z co najmniej 80% identyczności z dowolną sekwencją spośród NR ID. SEKW.: do NR ID. SEKW.: 13 albo funkcjonalnego fragmentu dowolnej sekwencji spośród NR ID. SEKW.: do NR ID. SEKW.: 13 lub tego ich wariantu. 11. Konstrukt kwasu nukleinowego według dowolnego z poprzednich zastrzeżeń, w którym sekwencja kodująca koduje antygen Konstrukt kwasu nukleinowego według zastrz. 11, w którym antygenem jest patogen wirusowy, bakteryjny, pasożyta lub grzybowy, antygen alergiczny lub antygen nowotworowy. 13. Konstrukt kwasu nukleinowego według zastrz. 12, w którym antygenem wirusowym jest antygen HPV, HIV,

142 141 HSV1, HSV2, wirusa grypy, wirusa zapalenia wątroby typu A lub wirusa zapalenia wątroby typu B. 14. Konstrukt kwasu nukleinowego według zastrz. 13, w którym antygenem jest HBsAg Konstrukt kwasu nukleinowego według dowolnego z zastrzeżeń 1 do, w którym sekwencja kodująca koduje rybozylującą ADP bakteryjną podjednostkę A i/lub podjednostkę B, aktywny homolog jednej albo obydwu tych podjednostek, przy czym każdy homolog ma co najmniej 80% identyczności z odpowiednią taką podjednostką lub aktywnym fragmentem tej podjednostki lub jej tym aktywnym homologiem. 16. Konstrukt kwasu nukleinowego według zastrz. 1, w którym bakteryjna podjednostka jest wybrana spośród podjednostki A toksyny cholery, podjednostki B toksyny cholery, podjednostki A termolabilnej toksyny E. coli, podjednostki B termolabilnej toksyny E. coli, aktywnego homologa mającego co najmniej 80% identyczności z dowolną z tych podjednostek lub aktywnego fragmentu dowolnej z tych podjednostek lub tych aktywnych homologów. 17. Konstrukt kwasu nukleinowego według dowolnego z poprzednich zastrzeżeń, którym jest DNA plazmidowy. 18. Powlekane cząstki, odpowiednie do dostarczania z urządzenia do dostarczania za pośrednictwem cząstek, które to cząstki zawierają

143 142 cząstki nośnika powlekane konstruktem kwasu nukleinowego według dowolnego z poprzednich zastrzeżeń. 19. Powlekane cząstki według zastrz. 18, gdzie cząstkami nośnika jest złoto lub wolfram.. Zbiornik do dawkowania do urządzenia do dostarczania za pośrednictwem cząstek zawierający powlekane cząstki według zastrz. 18 albo Urządzenie do dostarczania za pośrednictwem cząstek załadowane powlekanymi cząstkami według zastrz. 18 albo Urządzenie do dostarczania za pośrednictwem cząstek według zastrz. 21, którym jest bezigłowa strzykawka. 23. Preparat farmaceutyczny zawierający konstrukt kwasu nukleinowego według dowolnego z zastrzeżeń 1 do 17 i farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę Szczepionka zawierająca konstrukt kwasu nukleinowego według dowolnego z zastrzeżeń 11 do Szczepionka według zastrz. 24, zawierająca ponadto konstrukt adiuwantowy według zastrz. 1 albo Sposób in vitro otrzymywania ekspresji w komórkach ssaczych polipeptydu będącego przedmiotem

144 143 zainteresowania, który to sposób obejmuje przenoszenie do takich komórek konstruktu kwasu nukleinowego według dowolnego z zastrzeżeń 1 do 17 lub powlekanych cząstek według zastrz. 18 albo Konstrukt kwasu nukleinowego według dowolnego z zastrzeżeń 11 do 14 do zastosowania w immunizacji. 28. Konstrukt kwasu nukleinowego według zastrz. 27, gdzie immunizacja jest przeciwko zakażeniu patogenem, alergii lub nowotworowi Kwas nukleinowy według zastrz. 27 albo 28, gdzie dostarczanie ma być poprzez wstrzyknięcie, dostarczanie przy użyciu cząstek przeskórnych, inhalację, miejscowe, doustne, donosowe lub przezśluzówkowe. PowderJect Vaccines, Inc. Pełnomocnik:

145 144

146 14

147 146

148 147

149 148

150 149

151

152 11

153 12

154 13

155 14

156 1

157 16