(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 21 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 13/27 EP 21 B1 (13) (1) T3 Int.Cl. C12N 1/09 (06.01) C12N 1/11 (06.01) C12N 1/67 (06.01) (4) Tytuł wynalazku: Nowe elementy regulatorowe () Pierwszeństwo: EP (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 11/16 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 13/12 (73) Uprawniony z patentu: Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG, Ingelheim am Rhein, DE PL/EP 21 T3 (72) Twórca(y) wynalazku: BARBARA ENENKEL, Ingelheim Am Rhein, DE (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Marek Łazewski LDS ŁAZEWSKI DEPO I WSPÓLNICY SP. K. ul. Okopowa 8/ Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 1 Z-829 EP B1 Nowe elementy regulatorowe Opis Dziedzina techniki wynalazku [0001] Wynalazek dotyczy dziedziny hodowli komórkowej. Wynalazek odnosi się do nowych elementów regulatorowych, jak również sposobu zwiększania ekspresji polipeptydów z kwasów nukleinowych, takich jak klonowane geny i wytwarzania różnych polipeptydów w eukariotycznych komórkach gospodarza przy użyciu nowych elementów regulatorowych Tło wynalazku [0002] Rynek biofarmaceutyków stosowanych w leczeniu ludzi wciąż rośnie w szybkim tempie z ponad 900 biofarmaceutykami ocenianymi w badaniach klinicznych i szacowaną sprzedażą 0 miliardów w roku. Obecnie wzrasta liczba biofarmaceutyków wytwarzanych z komórek ssaków, ze względu na ich zdolność do prawidłowego przetwarzania i modyfikacji białek ludzkich. Rekombinowane białka są zatem kompatybilne dla ludzi pod względem funkcjonalnym i farmakokinetycznym. Wadą w porównaniu do prokariotycznych systemów ekspresyjnych jest często znacznie niższy poziom ekspresji białka. Udana i wysokowydajna produkcja biofarmaceutyków z komórek ssaków jest więc kluczowa i jest regulowana przez wiele czynników, w tym linię komórkową gospodarza, system ekspresyjny, wzrost komórek i produktywność, pożywki do hodowli i zasilające, proces produkcji i oczyszczania, struktury i sekwencje białek, stabilność i preparaty białek. Ekspresja rekombinowanego białka wymaga wektora ekspresyjnego kodującego pożądany gen będący przedmiotem zainteresowania. Stosowano wiele metod w celu optymalizacji wektorów ekspresyjnych dla wydajnego wytwarzania białek. Ekspresja genów jest regulowana na poziomie transkrypcji i translacji. Stąd wiele metod dotyczy identyfikacji i optymalizacji silnych promotorów i wzmacniaczy, z których geny kodujące białka są transkrybowane, w celu poprawy wydajności. Przykładami są bezpośredni wczesny promotor i wzmacniacz wirusa CMV, promotor i wzmacniacz wirusa SV40, promotor czynnika elongacji (EF), wzmacniacz wirusa polioma i promotor [beta]-aktyny

3 1 2 2 kurcząt. Podobnie, sekwencje silnego sygnału poliadenylacji stabilizujące mrna i wzmacniające terminację transkrypcji stosuje się również w celu zwiększenia ekspresji białka z genów kodowanych przez wektory ekspresyjne. Wśród metod poprawy efektywności translacji otrzymywanego mrna można wymienić zastosowanie miejsc inicjacji translacji (AUG), optymalnych miejsc wiązania rybosomu, takich jak sekwencja Kozak (GCCGCCACCAUGG; gdzie AUG stanowi kodon start) lub wewnętrznych miejsc wiązania rybosomu (IRES). [0003] Jeden ze sposobów stosowanych do optymalizacji wektorów ekspresyjnych w celu uzyskania wyższego poziomu ekspresji genów rekombinowanych w komórkach eukariotycznych, odnosi się do zastosowania i selekcji sygnałów poliadenylacji. Różne sygnały poliadenylacji stosuje się w wektorach do ekspresji rekombinowanych białek. Najczęściej stosowane sygnały obejmują, na przykład, sygnały poliadenylacji bydlęcego hormonu wzrostu (BGH) (US 12248, EP 01732), wczesny i późny region małpiego wirusa 40, beta-globinę królika, immunoglobuliny mysie lub ludzkie, późny region wirusa polioma. W eukariotycznym informacyjnym RNA (mrna) nieulegający translacji region 3' (3'UTR) jest ważnym elementem regulatorowym. W wielu przypadkach decyduje o stabilności mrna i może również regulować wydajność translacji. Sygnały poliadenylacji to sekwencje nukleotydowe w obrębie 3'UTR, które kierują wiązaniem białkowego kompleksu poliadenylacji z sekwencją AAUAAA w obrębie sekwencji sygnałowej. Kompleks zawiera endonukleazę, która tnie mrna, około 14 do nukleotydów za sekwencją UAAA i polimerazę, która wprowadza potranskrypcyjnie ciąg około 0 do 0 nukleotydów adeniny (ogon polia) do odszczepianego końca 3'. Uważa się, że ogon polia wpływa na wiele aspektów metabolizmu mrna oraz stabilność, wydajność translacji i transport z jądra do cytoplazmy. Zwykle sygnał poliadenylacji składa się z dwóch elementów rozpoznawania flankujących miejsce cięcia i poliadenylacji: wysoce konserwatywnych sekwencji AAUAAA około 14 do nukleotydów przed miejscem cięcia i słabo konserwatywnego regionu bogatego w reszty G/U lub U, w przybliżeniu do 0 nukleotydów za sekwencją AAUAAA. Rozszczepienia pomiędzy tymi dwoma elementami zwykle znajdują się po stronie 3' reszty A. W warunkach in vivo, skuteczność, z jaką różne miejsca poliadenylacji są przetwarzane znacznie się różni. Prędkość składania kompleksu białkowego poliadenylacji jest procesem wieloetapowym i koreluje z siłą sekwencji sygnału poliadenylacji. Na przykład, ze względu na szybsze składanie, rozszczepianie w przypadku silnego późnego sygnału poliadenylacji SV40 następuje

4 szybciej niż dla słabszego wczesnego sygnału poliadenylacji SV40 (Chao i wsp., Molecular and Cellular Biology, t.19 (8), , 1999). [0004] Istnieje potrzeba identyfikacji alternatywnych silnych lub bardzo silnych sygnałów poliadenylacji w celu przyspieszenia wytwarzania wysokoprodukcyjnych linii komórkowych do syntezy rekombinowanych białek. Zastosowanie silnych, a nawet bardzo silnych sygnałów poliadenylacji wzmacnia terminację transkrypcji, co z kolei powoduje zwiększenie produkcji, stabilności, eksportu jądrowego i/lub translacji mrna kodowanego przez wektor. Powinno to prowadzić do wyższych poziomów mrna, a tym samym do zwiększenia produktywności komórek producentów. Streszczenie wynalazku/rozwiązanie [000] Poniżej opisano nowy sygnał poliadenylacji izolowany z hormonu wzrostu chomika chińskiego (Cricetus griseus). Nieoczekiwanie stwierdzono, że ten nowo zidentyfikowany sygnał poliadenylacji, nazwany HGH, przewyższa silne sygnały poliadenylacji BGH i późne sygnały poliadenylacji SV40. Przy użyciu wektorów zawierających HGH jako sekwencję sygnału poliadenylacji, miana białek w przejściowych transfekcjach komórek CHO-DG44 zwiększono do 3% w porównaniu z komórkami zawierającymi BGH. W stabilnych komórkach otrzymano wysoką produktywność właściwą do 4 pg/komórkę/dzień i miana w hodowlach okresowych z zasilaniem do 6,3 g/l. Jednym z wykonań niniejszego wynalazku jest sekwencja polinukleotydowa zawierająca co najmniej jeden sygnał poliadenylacji HGH i co najmniej jedną heterologiczną sekwencję nukleotydową kodującą żądany produkt. Sygnał poliadenylacji HGH znajduje się za i jest funkcjonalnie połączony z heterologiczną(ymi) sekwencją(ami) nukleotydową(ymi). Innym przykładem wykonania niniejszego wynalazku jest nowy wektor zawierający co najmniej jedną heterologiczną sekwencję nukleotydową kodującą produkt będący przedmiotem zainteresowania i co najmniej jeden sygnał poliadenylacji HGH. Sygnał poliadenylacji HGH znajduje się za i jest funkcjonalnie połączony z heterologiczną(ymi) sekwencją(ami) nukleotydową(ymi). Kolejnym wykonaniem niniejszego wynalazku jest nowy wektor lub sekwencja polinukleotydowa zawierające co najmniej jeden sygnał poliadenylacji HGH funkcjonalnie połączony ze znajdującym się wcześniej miejscem wielokrotnego klonowania, które umożliwia klonowanie genu będącego przedmiotem zainteresowania za pomocą sekwencji rozpoznawanych przez endonukleazy restrykcyjne. Jeszcze innym przykładem wykonania niniejszego wynalazku jest komórka eukariotyczna, zwłaszcza komórka ssaka, zawierająca sygnał poliadenylacji

5 HGH. Jeszcze innym przykładem wykonania niniejszego wynalazku jest sposób wytwarzania produktu będącego przedmiotem zainteresowania obejmujący hodowlę komórek eukariotycznych, korzystnie komórek ssaków transfekowanych wektorami lub sekwencjami polinukleotydowymi zawierającymi sygnał poliadenylacji HGH. W korzystnym wykonaniu produktem będącym przedmiotem zainteresowania jest polipeptyd i żądany polipeptyd odzyskuje się z pożywki hodowlanej. [0006] Dane z niniejszego wynalazku wykazują wpływ sekwencji sygnału poliadenylacji HGH na przejściową ekspresję sicam (figura 6). Nieoczekiwanie, najwyższą ekspresję sicam otrzymuje się dla sekwencji sygnału poliadenylacji pochodzącej od genu hormonu wzrostu chomika. Miano wzrasta do 21% (seria transfekcji #1) w porównaniu z komórkami transfekowanymi wektorem pjr1 zawierającym sygnał poliadenylacji BGH i wzrasta do 40% (seria transfekcji #1) w porównaniu z komórkami transfekowanymi wektorem pjr6 zawierającym późny sygnał poliadenylacji SV40. Dane z niniejszego wynalazku wykazują ponadto wpływ sygnału poliadenylacji HGH na przejściową ekspresję przeciwciała IgG4. Nieoczekiwanie, miana otrzymane dla sekwencji sygnału poliadenylacji HGH są średnio 3% większe niż dla sygnału poliadenylacji BGH (figura 7). Dane z niniejszego wynalazku dodatkowo przedstawiają badanie różnych wariantów HGH (figura 8). Najkrótsza sekwencja HGH 113 pz znajdująca się w wektorze ekspresyjnym pjr13 prowadzi do zmniejszonej ekspresji sicam do 78% w porównaniu z sekwencją HGH 324 pz znajdującą się w wektorze ekspresyjnym pjr131. Natomiast sekwencja HGH 189 pz znajdująca się w wektorze ekspresyjnym pjr134 skutkuje bardzo dobrą ekspresją sicam porównywalną z poziomem ekspresji osiąganym dla BGH (figura 7). Najlepsze wyniki pod względem ekspresji osiąga się dla sekwencji HGH 324 pz znajdującej się w wektorze ekspresyjnym pjr131 (figura 8), która jest znacznie wyższa (3%) niż ekspresja osiągana dla sygnału poliadenylacji BGH (figura 7). Wskazuje to, że między regionem HGH pz 190 do 324 sekwencji SEQ ID NO:8, umieszczone są sekwencje, które wpływają na skuteczną ekspresję genu będącego przedmiotem zainteresowania. Dane z niniejszego wynalazku wykazują ponadto stabilną ekspresję białek na wysokim poziomie przy użyciu sygnału poliadenylacji HGH. Otrzymuje się pule komórek i klony komórek o produktywności właściwej w zakresie - 4 pg/komórkę/dzień i miana w hodowlach okresowych z zasilaniem do 6,3 g/l (figura 9). [0007] W szczególnym wykonaniu wynalazek dotyczy sygnału poliadenylacji zawierającego kwas nukleinowy zawierający sekwencję w co najmniej 7% identyczną z sekwencją SEQ ID NO:8. Wynalazek dotyczy zwłaszcza sygnału poliadenylacji

6 1 2 zawierającego kwas nukleinowy składający się zasadniczo z sekwencji w co najmniej 7% identycznej z sekwencją SEQ ID NO:8. Wynalazek korzystnie dotyczy sygnału poliadenylacji zawierającego kwas nukleinowy składający się z sekwencji w co najmniej 7% identycznej z sekwencją SEQ ID NO:8. Wynalazek ponadto dotyczy sygnału poliadenylacji zawierającego kwas nukleinowy zawierający sekwencję SEQ ID NO:8. [0008] W kolejnym wykonaniu niniejszego wynalazku sygnał poliadenylacji zawiera sekwencję w co najmniej 80%, 8%, 90%, 9% lub 98% identyczną z sekwencją SEQ ID NO:8. W szczególnym wykonaniu wynalazek dotyczy sygnału poliadenylacji zawierającego kwas nukleinowy zawierający sekwencję w co najmniej 8% identyczną z sekwencją SEQ ID NO:8. W innym szczególnym wykonaniu wynalazek dotyczy sygnału poliadenylacji zawierającego kwas nukleinowy zawierający sekwencję w co najmniej 9% identyczną z sekwencją SEQ ID NO:8. [0009] W kolejnym korzystnym wykonaniu wynalazek dotyczy izolowanego sygnału poliadenylacji zawierającego kwas nukleinowy zawierający sekwencję w co najmniej 7% identyczną z sekwencją SEQ ID NO:8. W innym korzystnym wykonaniu wynalazek dotyczy izolowanego sygnału poliadenylacji zawierającego kwas nukleinowy zawierający sekwencję w co najmniej 9% identyczną z sekwencją SEQ ID NO:8. W jeszcze innym korzystnym wykonaniu wynalazek dotyczy izolowanego sygnału poliadenylacji zawierającego kwas nukleinowy zawierający sekwencję SEQ ID NO:8. Korzystnie, wynalazek dotyczy izolowanej sekwencji kwasu nukleinowego zawierającej SEQ ID NO:8. [00] W korzystnym wykonaniu wymieniony sygnał poliadenylacji jest funkcjonalnie połączony z heterologiczną sekwencją kodującą. W szczególnie korzystnym wykonaniu wymieniony sygnał poliadenylacji charakteryzuje się tym, że miana/poziomy ekspresji otrzymane dla wymienionego sygnału poliadenylacji są w co najmniej %, korzystnie % i najkorzystniej % większe niż te otrzymane dla sygnału poliadenylacji BGH. W najkorzystniejszym wykonaniu są w co najmniej i/lub średnio 3% większe niż te otrzymane dla sygnału poliadenylacji BGH. Wynalazek ponadto dotyczy sekwencji kwasu nukleinowego składającej się z sekwencji SEQ ID NO:8 funkcjonalnie połączonej z heterologiczną sekwencją kodującą. Alternatywnie, sekwencja składa się zasadniczo z sekwencji SEQ ID NO:8 funkcjonalnie połączonej z heterologiczną sekwencją kodującą. Korzystnie, sekwencja składa się z sekwencji SEQ ID NO:8 funkcjonalnie połączonej z heterologiczną sekwencją kodującą.

7 1 2 6 Sekwencja kwasu nukleinowego składa się z sekwencji SEQ ID NO: 8 i pełni funkcję terminatora. Korzystnie wymieniony kwas nukleinowy pełni funkcję terminatora i jest funkcjonalnie połączony z heterologiczną sekwencją kodującą. [0011] Wynalazek ponadto dotyczy wektora zawierającego dowolne sygnały poliadenylacji lub sekwencje kwasu nukleinowego opisane powyżej. W szczególnym wykonaniu wymienione sygnały poliadenylacji są funkcjonalnie połączone z jednostką ekspresyjną/kasetą ekspresyjną. W innym wykonaniu wynalazku wektor zawiera marker selekcji i/lub amplifikacji - reduktazę dyhydrofolanową (DHFR), syntetazę glutaminową lub fosfatazę neomycyny (neo). W korzystnym wykonaniu niniejszego wynalazku wektor zawiera gen heterologiczny będący przedmiotem zainteresowania kodujący heterologiczny produkt będący przedmiotem zainteresowania. Korzystnie wymieniony produkt jest polipeptydem. Korzystnie wymieniony polipeptyd jest przeciwciałem, fragmentem przeciwciała lub białkiem fuzyjnym. [0012] Wynalazek dodatkowo dotyczy komórki zawierającej dowolny z wektorów opisanych powyżej. Korzystnie, komórka zawiera dowolne sygnały poliadenylacji opisane powyżej funkcjonalnie połączone z jednostką transkrypcyjną kodującą produkt będący przedmiotem zainteresowania. Korzystnie wymieniony produkt będący przedmiotem zainteresowania jest nukleotydem/kwasem nukleinowym będącym przedmiotem zainteresowania. W innym wykonaniu komórki wymieniony produkt będący przedmiotem zainteresowania jest polipeptydem będącym przedmiotem zainteresowania kodowanym przez gen będący przedmiotem zainteresowania. Korzystnie wymieniony polipeptyd jest przeciwciałem, fragmentem przeciwciała lub białkiem fuzyjnym. W szczególnym wykonaniu wymieniona komórka jest komórką eukariotyczną, komórką ssaczą, komórką chomika lub komórką mysią. Korzystnie wymieniona komórka jest komórką chomika. Korzystniej, wymieniona komórka jest komórką jajnika chomika chińskiego (CHO). Najkorzystniej wymieniona komórka jest komórką CHO DG44, CHO- K1 lub DUKX-B11. W innym korzystnym wykonaniu wymieniona komórka jest komórką NSO. W korzystnym wykonaniu wymienione opisane komórki są komórkami hodowanymi. Korzystnie, wymienione komórki hoduje się w pożywce bez surowicy. Korzystnie wymienione komórki hoduje się w hodowli zawiesinowej. W innym korzystnym wykonaniu niniejszego wynalazku komórka charakteryzuje się tym, że miana/poziomy ekspresji otrzymane dla wymienionego sygnału poliadenylacji są w co najmniej %, korzystnie % i najkorzystniej % większe niż te otrzymane dla sygnału poliadenylacji BGH. W najkorzystniejszym wykonaniu są w co najmniej i/lub średnio 3%

8 1 2 7 większe niż te otrzymane dla sygnału poliadenylacji BGH. Korzystnie, wymieniona komórka wykazuje o 3% wyższe poziomy ekspresji. [0013] Wynalazek dodatkowo dotyczy sposobu wytwarzania polipeptydu będącego przedmiotem zainteresowania kodowanego przez gen będący przedmiotem zainteresowania, obejmującego: (a) Dostarczanie komórki gospodarza zawierającej wektor opisany powyżej lub dostarczanie komórki opisanej powyżej, (b) Hodowlę wymienionej komórki, w warunkach umożliwiających proliferację komórek i ekspresję genu będącego przedmiotem zainteresowania, (c) Zbieranie polipeptydu będącego przedmiotem zainteresowania i (d) Oczyszczanie polipeptydu będącego przedmiotem zainteresowania. W szczególnym wykonaniu wymienionego sposobu komórka jest komórką eukariotyczną, komórką ssaczą, komórką chomika lub komórką mysią. Korzystnie wymieniona komórka jest komórką CHO, najkorzystniej komórką CHO DG44, CHO-K1 lub DUKX-B11. Ponadto korzystna jest komórka NSO. W korzystnym wykonaniu wymienionego sposobu polipeptyd będący przedmiotem zainteresowania jest rekombinowanym białkiem, korzystnie wydzielonym polipeptydem, korzystniej terapeutycznym białkiem. Najkorzystniej polipeptyd będący przedmiotem zainteresowania jest przeciwciałem, takim jak monoklonalne, poliklonalne, wielospecyficzne lub jednołańcuchowe przeciwciało, lub jego fragmentem, na przykład fragmentem Fab, Fab, F(ab ) 2, Fc i Fc, ciężkim i lekkim łańcuchem immunoglobuliny oraz ich stałym, zmiennym lub hiperzmiennym regionem, a także fragmentami Fv i Fd. W innym korzystnym wykonaniu wymienionego sposobu polipeptyd będący przedmiotem zainteresowania jest białkiem fuzyjnym lub białkiem szkieletowym. [0014] Wynalazek ponadto dotyczy zastosowania komórki opisanej powyżej do wytwarzania białek. Wynalazek ponadto dotyczy zastosowania dowolnych sygnałów poliadenylacji opisanych powyżej jako izolatora. [001] Ponadto, wynalazek dotyczy zastosowania dowolnych sygnałów poliadenylacji opisanych powyżej do wytwarzania ulepszonych linii komórek gospodarza. Wynalazek dotyczy zwłaszcza zastosowania dowolnych sygnałów poliadenylacji opisanych powyżej w terapii genowej. Wynalazek ponadto dotyczy zestawu zawierającego dowolne sygnały poliadenylacji opisane powyżej, wektor, komórkę i pożywkę do hodowli komórkowych do hodowli wymienionej komórki. 3

9 1 2 8 Opis figur [0016] Figura 1: Podstawowe wektory ekspresyjne Figura 1 schematycznie przedstawia ekspresję konstruktów ekspresyjnych stosowanych do transfekcji komórek CHO-DG44. P/E oznacza złożoną jednostkę zawierającą zarówno element wzmacniacza, jak i promotora wirusa CMV, P element promotora i T sygnał terminacji transkrypcji, wymagany do poliadenylacji transkrybowanego informacyjnego RNA. Sygnały poliadenylacji BGH, SV40L i HGH są sygnałami terminacji transkrypcji pochodzącymi od, odpowiednio, nieulegającego translacji regionu 3 bydlęcego hormonu wzrostu (SEQ ID NO:12), regionu późnego genu SV40 (SEQ ID NO:11) i nieulegającego translacji regionu 3 hormonu wzrostu chomika chińskiego (SEQ ID NO:8). Te sygnały poliadenylacji są flankowane przez miejsca dla enzymów restrykcyjnych dla Sfil i Xbal. Pozycję i kierunek inicjacji transkrypcji w obrębie każdej jednostki transkrypcyjnej wskazano strzałką. Do klonowania genu będącego przedmiotem zainteresowania region sekwencji z wieloma miejscami cięcia dla endonukleaz restrykcyjnych (miejsce wielokrotnego klonowania, ang. multiple cloning sites - mcs ) wstawia się za elementem promotora/wzmacniacza. Amplifikowany marker selekcyjny reduktaza dyhydrofolanowa jest oznaczana skrótem dhfr i marker selekcyjny fosfotransferaza neomycyny jest oznaczany skrótem npt. Figura 2: Region genu izolowanego hormonu wzrostu Cricetus griseus Figura 2 przedstawia sekwencję nukleotydową regionu genu hormonu wzrostu amplifikowanego z genomowego DNA CHO-DG44 (linia komórek jajników chomika chińskiego; Cricetus griseus) techniką nested PCR z w sumie 362 pz (SEQ ID NO:7). Strzałka wskazuje kierunek, długość i pozycję startera specyficznego dla genu GH for2 stosowanego w reakcji amplifikacji, samą sekwencję startera zaznaczono kursywą (SEQ ID NO:2). Kodon stop TAG sekwencji genu hormonu wzrostu oznaczono podkreśloną czcionką pogrubioną i z dalszymi 324 pz nieulegającego translacji regionu 3. Figura 3: Dopasowanie nieulegających translacji regionów 3 genów hormonu wzrostu. W tym dopasowaniu izolowany nieulegający translacji region 3 hormonu wzrostu Cricetus griseus (SEQ ID NO:8) porównuje się z nieulegającym translacji regionem 3 hormonu wzrostu chomika syryjskiego Mesocricetus auratus (Genbank S66299), Mus musculus (Genbank Z46663), Rattus norvegicus (Genbank V01239) i Bos taurus (Genbank J00008). Zacienienie wskazuje nukleotydy różniące się od sekwencji C. griseus.

10 1 2 9 Figura 4: Pochodne delecyjne HGH nieulegającego translacji regionu 3 hormonu wzrostu Cricetus griseus W tym dopasowaniu przedstawiono pochodne delecyjne sekwencji o 362 nukleotydach hormonu wzrostu Cricetus griseus (HGH) (SEQ ID NO:7) zawierające właśnie nieulegający translacji region 3. Wszystkie pochodne mają identyczny koniec i różnią się końcem 3. Najdłuższa pochodna z sekwencją SEQ ID NO:8 składa się z 324 nukleotydów. SEQ ID NO:9 składa się z 189 nukleotydów i SEQ ID NO: z 113 nukleotydów. Kodon stop TAG sekwencji genu hormonu wzrostu oznaczono podkreśloną czcionką pogrubioną i potencjalne miejsce wiązania dla kompleksu białkowego poliadenylacji AATAAA zaznaczono kursywą. Figura : Rekombinacyjne wektory ekspresyjne do oceny wydajności HGH Wszystkie rekombinacyjne wektory ekspresyjne kodują gen będący przedmiotem zainteresowania sicam pod kontrolą elementu wzmacniacza i promotora wirusa CMV ( P/E ). Transkrypcja sicam jest albo terminowana przez nieulegający translacji region 3 bydlęcego hormonu wzrostu BGH (SEQ ID NO:12), region genu późnego SV40 SV40L (SEQ ID NO:11) lub nieulegający translacji region 3 hormonu wzrostu chomika chińskiego HGH (SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:). Wskazano rozmiar tego ostatniego w parach zasad. Te sygnały poliadenylacji flankują miejsca dla enzymów restrykcyjnych Sfil i XbaI. P wskazuje element promotora, a T sygnał terminacji transkrypcji. Pozycję i kierunek inicjacji transkrypcji w obrębie każdej jednostki transkrypcyjnej wskazano strzałką. Amplifikowany marker selekcyjny - reduktaza dyhydrofolanowa jest oznaczana skrótem dhfr. Figura 6: Ocena działania HGH w przejściowych transfekcjach W dwóch niezależnych seriach komórki CHO-DG44 transfekuje się wektorami ekspresyjnymi pjr6, pjr1 i pjr131, z których wszystkie kodują sicam pod kontrolą wzmacniacza/promotora wirusa CMV. Do terminacji transkrypcji stosuje się późny sygnał poliadenylacji SV40 (SEQ ID NO:11), nieulegający translacji region 3 bydlęcego hormonu wzrostu BGH (SEQ ID NO: 12) albo nieulegający translacji region 3 hormonu wzrostu chomika chińskiego HGH (SEQ ID NO:8). Po okresie 48 godzin miana sicam w supernatantach wyznacza się stosując test ELISA. W celu korekty na wydajność transfekcji komórki kotransfekuje się plazmidem pcmv-seap i mierzy się aktywność SEAP. Używając HGH jako sygnału poliadenylacji miano wzrasta do 21% w porównaniu do terminacji z użyciem BGH i do 40% w porównaniu do terminacji z użyciem późnego SV40.

11 1 2 3 Figura 7: Ocena działania HGH w przejściowej ekspresji przeciwciała IgG4/kappa Komórki CHO-DG44 kotransfekuje się kombinacją wektorów pbid/igg4 i pbin/kappa (n=6), w których transkrypcja ciężkiego (IgG4) i lekkiego łańcucha (kappa) przeciwciała jest terminowana przez nieulegający translacji region pz hormonu wzrostu chomika chińskiego HGH (SEQ ID NO:8). Jako kontrolę komórki CHO-DG44 kotransfekuje się kombinacją wektorów pbid-b/igg4 i pbin-b/kappa (n=6), które zawierają sygnał poliadenylacji BGH (SEQ ID NO:12). Oprócz różnych sekwencji poliadenylacji genetyczna konfiguracja różnych wektorów jest identyczna. Po okresie 48 godzin miana przeciwciał w supernatantach wyznacza się stosując test ELISA. W celu korekty na wydajność transfekcji komórki kotransfekuje się plazmidem pcmv-seap i mierzy aktywność SEAP. Używając HGH jako sygnału poliadenylacji miana są średnio 3% większe niż dla sygnału poliadenylacji BGH. Figura 8: Badanie różnych wariantów delecyjnych HGH w przejściowych transfekcjach W dwóch niezależnych seriach komórki CHO-DG44 transfekuje się wektorami ekspresyjnymi pjr131, pjr134 i pjr13, z których wszystkie kodują sicam pod kontrolą wzmacniacza/promotora wirusa CMV. Do terminacji transkrypcji stosuje się 324 pz (SEQ ID NO:8), 189 pz (SEQ ID NO:9) lub 113 pz (SEQ ID NO:) nieulegającego translacji regionu 3 hormonu wzrostu chomika chińskiego HGH. Wszystkie warianty mają identyczny koniec, ale różnią się końcem 3. Oprócz różnych sekwencji poliadenylacji genetyczna konfiguracja różnych wektorów jest identyczna. 48 godzin po transfekcjach miana sicam w supernatantach wyznacza się stosując test ELISA. W celu korekty na wydajność transfekcji komórki kotransfekuje się plazmidem pcmv-seap i mierzy się aktywność SEAP. W porównaniu do komórek transfekowanych wektorami zawierającymi sekwencję HGH324 pz, komórki transfekowane wektorami zawierającymi warianty delecyjne HGH 189 pz i 113 pz wykazują zmniejszenie poziomów ekspresji sicam o, odpowiednio, 23% i 78%. Figura 9: Wysoki poziom ekspresji białek w stabilnie transfekowanych komórkach z użyciem HGH Na figurze 9 zebrano produktywność właściwą i miana stabilnie transfekowanych klonów komórek CHO-DG44 lub puli komórek wykazujących ekspresję przeciwciał IgG1, IgG2 i IgG4 lub białek fuzyjnych IgG1 i IgG2 Fc w hodowlach okresowych z zasilaniem przeprowadzanych w bioreaktorach lub wytrząsanych kolbach. Produktywność właściwa

12 11 mieści się w zakresie - 4 pg/komórkę/dzień i miana mieszczą się w zakresie 2,1 6,3 g/l. Genetyczna konfiguracja wektorów stosowanych do ekspresji różnych białek jest identyczna. Wszystkie zawierają nieulegający translacji region pz hormonu wzrostu chomika chińskiego (SEQ ID NO:8) jako sygnał poliadenylacji do terminacji transkrypcji genu będącego przedmiotem zainteresowania. 2 dni po transfekcji stabilne pule komórek poddaje się selekcji stosując selekcję na bazie DHFR i NPT, a następnie przeprowadza się dwa kolejne etapy amplifikacji genów z udziałem DHFR dodając 0 nm i 800 nm MTX do pożywki hodowlanej. Pojedyncze klony komórek otrzymuje się albo poprzez klonowanie metodą ograniczonych rozcieńczeń lub osadzenie techniką FACS pojedynczych komórek w dołkach 96-dołkowej płytki Szczegółowy opis wynalazku [0017] Ogólne wykonania zawierający lub obejmujący obejmują bardziej szczegółowe wykonania składający się z. Ponadto, formy liczby pojedynczej i mnogiej nie są stosowane w sposób ograniczający. [0018] Niniejszy wynalazek dostarcza nowych elementów regulatorowych i sposobów otrzymywania oraz selekcji ssaczych linii komórkowych, które umożliwiają ekspresję na wysokim poziomie heterologicznych produktów genowych, korzystnie biofarmaceutycznie odpowiednich polipeptydów lub białek. Sposoby według wynalazku są oparte przede wszystkim na zastosowaniu nowych sygnałów poliadenylacji izolowanych z hormonu wzrostu chińskiego chomika (Cricetus griseus). Nieoczekiwanie stwierdzono, że ten nowo zidentyfikowany sygnał poliadenylacji, nazwany HGH (SEQ ID nr: 8), przewyższa silne sygnały poliadenylacji - BGH i późny SV40 prowadząc do zwiększenia produktywności komórek producentów. [0019] Terminy stosowane w zakresie niniejszego wynalazku mają następujące znaczenie. [00] Terminy sygnał poliadenylacji, miejsce poliadenylacji, sygnał polia, miejsce polia lub sygnał terminacji, lub terminator odnoszą się do sekwencji nukleotydowych w obrębie 3'UTR, które kierują wiązaniem kompleksu białkowego poliadenylacji z sekwencją AAUAAA w obrębie sekwencji sygnałowej. Kompleks zawiera endonukleazę, która tnie mrna, około 14 do nukleotydów za sekwencją AAUAAA i polimerazę, która zawiera potranskrypcyjny ciąg około 0 do 0 nukleotydów adeninowych (ogon polia) w celu odcięcia końca 3'. Uważa się, że ogon polia wpływa na wiele aspektów metabolizmu mrna, włączając stabilność, wydajność translacji i transportu z jądra do cytoplazmy. Zwykle sygnał poliadenylacji składa się z

13 dwóch elementów rozpoznania flankujących miejsce cięcia i poliadenylacji: wysoce konserwatywnej sekwencji AAUAAA około 14 do nukleotydów przed miejscem rozszczepienia i słabo konserwatywnego regionu bogatego w G/U lub U, w przybliżeniu do 0 nukleotydów za sekwencją AAUAAA. Rozszczepienie pomiędzy tymi dwoma elementami zachodzi zwykle po stronie 3' reszty A. Znane są różne sygnały poliadenylacji, takie jak polia (Cole i wsp., Mol. Cell Biol.,, , 198), późny SV40 (Schek i wsp., Mol. Cell Biol. 12, , 1992) i wczesny polia lub BGH polia (opisane na przykład w patencie Stanów Zjednoczonych nr 12248). [0021] Podczas gdy w sygnale poliadenylacji sekwencja AAUAAA opisana powyżej jest korzystna, może być podstawiona innymi sześcionukleotydowymi sekwencjami homologicznymi do AAUAAA, dopóki są one zdolne do sygnalizacji poliadenylacji mrna. Przykłady homologicznych sześcionukleotydowych sekwencji obejmują AAAAAA, AUUAAA, AAUAUA, AAUAAU, UAUAAA, AAUUAA, AAUAAG, AGUAAA, GAUAAA, AAUGAA, AAUAGA, AAGAAA, ACUAAA, CAUAAA, AAUCAA, AACAAA, AAUCAA i AAUAAC. W związku z tym, w jednej postaci sygnał poliadenylacji HGH zawiera sekwencję sześcionukleotydową wybraną z grupy składającej się z AAAAAA, AUUAAA, AAUAUA, AAUAAU, UAUAAA, AAUUAA, AAUAAG, AGUAAA, GAUAAA, AAUGAA, AAUAGA, AAGAAA, ACUAAA, CAUAAA, AAUCAA, AACAAA, AAUCAA i AAUAAC, raczej niż AAUAAA, dopóki te sekwencje sześcionukleotydowe są zdolne do sygnalizacji poliadenylacji mrna. [0022] Sygnały poliadenylacji mogą być również stosowane jako izolatory lub sekwencje izolujące. Sekwencje izolujące to segmenty DNA, które blokują oddziaływania lub interferencję sąsiednich sekwencji genów. Na przykład, izolatory mogą zmniejszać transkrypcyjny odczyt od promotora sąsiedniego genu lub promotorów fałszywych w sąsiednich sekwencjach nukleotydowych. Mogą one również blokować oddziaływanie wzmacniacza po jednej stronie sekwencji izolującej z promotorem genu sąsiadującego z drugiej strony sekwencji izolującej. Cechą charakterystyczną sekwencję izolującej w rozumieniu niniejszego wynalazku jest jej zdolność do izolacji lub ochrony określonej jednostki transkrypcyjnej, która jest funkcjonalnie połączona z elementem regulatorowym, od wpływu elementu genetycznego występującego przed nią lub za nią. W tym celu sekwencja izolująca jest umieszczona pomiędzy (potencjalne) interferującymi sekwencjami genetycznymi i sekwencją regulatorową jednostki transkrypcyjnej do izolacji. Sekwencja izolująca może być umieszczona po jednej lub obu stronach jednostki transkrypcyjnej, w jednej lub większej liczbie kopii. W korzystnym wykonaniu niniejszego

14 wynalazku sekwencja izolująca jest sygnałem poliadenylacji. W korzystnym wykonaniu niniejszego wynalazku sekwencja poliadenylacji jest sekwencję poliadenylacji HGH. [0023] Możliwe jest również zastosowanie pochodnych funkcjonalnych sekwencji poliadenylacji HGH, takich jak subfragmenty lub subsekwencje, jak również funkcjonalnych mutantów/wariantów pełnej sekwencji lub ich subfragmentów, które zostały zmodyfikowane, na przykład przez substytucję, insercję, addycję i/lub delecję. Odpowiadające subfragmenty lub subsekwencje, mutanty lub warianty są dalej również określane jako zmodyfikowane terminatory lub pochodne. [0024] Zmodyfikowanym terminatorem lub pochodną jest funkcjonalna pochodna sekwencji SEQ ID NO: 8, która obejmuje subfragmenty lub subsekwencje i funkcjonalne mutacje/warianty, a korzystnie prowadzi do poziomów ekspresji żądanego produktu porównywalnych z poziomami ekspresji uzyskiwanymi dla sekwencji nukleotydowych podanych w SEQ ID NO:8. Zmodyfikowany terminator okazuje się przydatny dla celów wynalazku, jeśli poziom ekspresji funkcjonalnie połączonego genu reporterowego stanowi co najmniej 60%, korzystnie co najmniej 7%, korzystniej co najmniej 90%, a najkorzystniej co najmniej 0% poziomu ekspresji uzyskanego dla SEQ ID NO: 8 w porównawczym teście genu reporterowego. Szczególnie korzystne są zmodyfikowane terminatory, które wykazują minimalną homologię sekwencji z sekwencją typu dzikiego SEQ ID NO: 8 sygnału poliadenylacji hormonu wzrostu chomika lub sekwencją do niej komplementarną wynoszącą co najmniej 7%, korzystnie co najmniej 80%, korzystnie co najmniej 8%, korzystniej co najmniej 9%, a najkorzystniej co najmniej 97% i prowadzą do odpowiednich poziomów ekspresji w porównawczym teście genu reporterowego. [002] W odpowiednim porównawczym teście genu reporterowego testowane fragmenty terminatora włączając sekwencję odniesienia SEQ ID NO: 8 klonuje się za genem reporterowym. Ten gen reporterowy koduje, na przykład lucyferazę, wydzielaną fosfatazę alkaliczną lub zielone białko fluorescencyjne (GFP). Alternatywnie, inne polipeptydy lub białka, na przykład przeciwciało lub sicam, mogą być stosowane jako geny reporterowe. Konstrukty te są następnie wprowadzane do komórek testowych, na przykład CHO-DG44, przez transfekcję i wpływ zmodyfikowanego terminatora będącego przedmiotem zainteresowania na poziom ekspresji genu reporterowego określa się, na przykład, poprzez pomiar zawartości białka genu reporterowego. Odpowiedni test opisano w przykładach 2, 3 i 4 według wynalazku. [0026] Korzystny sygnał poliadenylacji HGH jest sekwencją nukleotydową zawierającą sekwencję SEQ ID NO: 8 lub jej subsekwencją zawierającą sekwencję SEQ

15 ID NO: 9. W innych przykładach wykonania, sygnał poliadenylacji jest sekwencją nukleotydową, która zawiera lub składa się z sekwencji nukleotydowej identycznej lub homologicznej z sekwencją SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 i SEQ ID NO:. W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie, dwie sekwencje wykazują identyczność sekwencji lub homologię, gdy sekwencje nukleotydowe są homologiczne albo identyczne w co najmniej 7%, korzystnie 80%, korzystnie 8%, korzystniej 90%, a jeszcze korzystniej 9% lub więcej. Zasadnicza identyczność występuje również wtedy, gdy sekwencja kwasu nukleinowego będzie hybrydyzować w ostrych warunkach z sekwencją komplementarną do nici. [0027] W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie, termin hybrydyzuje w ostrych/rygorystycznych warunkach opisuje warunki hybrydyzacji i przemywania, które są znane osobom biegłym w tej dziedzinie. Ogólnie, ostre warunki wybiera się tak, aby temperatura była około - C niższa niż temperatura topnienia (T m ) dla specyficznej sekwencji przy określonej sile jonowej i ph. T m jest temperaturą (przy określonej sile jonowej, ph i stężeniu kwasu nukleinowego), w której 0% sond komplementarnych do celu hybrydyzuje z sekwencją docelową w równowadze. Ostre warunki to te, w których stężenie soli jest mniejsze niż około 1,0 M jonów sodu, typowo około 0,01 do 1,0 M jonów sodu (lub innych soli) przy ph od 7,0 do 8,3, a temperatura wynosi co najmniej około C dla krótkich sond (na przykład od do około 0 nukleotydów) i co najmniej około 60 C dla długich sond (na przykład dłuższych niż około 0 nukleotydów). Przykładowe ostre warunki obejmują hybrydyzację w 60 do 6 C w buforze do hybrydyzacji z xssc i przemywanie w temperaturze 42 C za pomocą 0,2xSSC/0,1% SDS. Dodatni sygnał hybrydyzacji jest co najmniej 2 razy wyższy niż sygnał hybrydyzacji tła. [0028] Sekwencja poliadenylacji hormonu wzrostu chomika i zmodyfikowane terminatory, które mogą obejmować, na przykład, naturalne występujące sekwencje nukleotydowe dodatkowo przed lub za izolowaną sekwencją HGH z SEQ ID NO: 7 lub wybrane fragmenty, może otrzymać osoba biegłą w dziedzinie na podstawie wiedzy na temat sekwencji lub sekwencji homologicznych przy użyciu różnych standardowych metod znanych w tej dziedzinie i odpowiednich metod opisanych również w niniejszym wynalazku w przykładzie 1. Wychodząc z sekwencji opisanej w SEQ ID NO: 7, można wybrać odpowiedni fragment i, na przykład, sondę oligonukleotydową zawierającą sekwencje tej frakcji można zsyntetyzować chemicznie. Sondę tego rodzaju można wykorzystywać, na przykład, do klonowania genu hormonu wzrostu chomika lub nieulegającego translacji regionu 3' lub innych fragmentów, na przykład przez hybrydyzację z biblioteki genomu chomika. Stosując test genu reporterowego opisany

16 powyżej osoba biegłą w dziedzinie jest w stanie określić funkcjonalne fragmenty terminatora bez większego wysiłku i wykorzystać je do celów niniejszego wynalazku. Nieulegający translacji region 3 lub jego szczególne fragmenty można łatwo otrzymać przez amplifikację PCR z użyciem odpowiednich starterów z genomowego DNA albo z biblioteki genomowej. Fragmenty nieulegającego translacji regionu 3' można również otrzymać przez ograniczone trawienie egzonukleazą III dużych fragmentów DNA. Takie cząsteczki DNA mogą być chemicznie syntetyzowane lub wytwarzane z chemicznie zsyntezowanych fragmentów przez ligację. Mutanty delecyjne, insercyjne, addycyjne i substytucyjne mogą być wytwarzane poprzez specyficzną dla miejsca mutagenezę, technikami mutagenezy bazującymi na PCR i/lub metodami syntezy chemicznej znanymi osobom biegłym w dziedzinie. Korzystnie, mutant zawiera modyfikacje w 3, 6,, lub 0 pozycjach pz. Korzystnie mutant jest zmodyfikowany w 6 pozycjach pz. [0029] Podobne podejścia, jak te opisane w niniejszym wynalazku w przykładzie 1, mogą być stosowane do izolowania, na przykład, sygnałów poliadenylacji hormonu wzrostu myszy, szczura lub chomika syryjskiego lub hormonów wzrostu innych gatunków. Ich wydajność można testować w badaniach genu reporterowego, opisanych w przykładach 2, 3 lub 4 niniejszego wynalazku. Poprzez hybrydyzację krzyżową z sondami pochodzącymi od sekwencji hormonu wzrostu chomika, korzystnie od nieulegającego translacji regionu 3, możliwa jest również identyfikacja i izolacja odpowiednich sekwencji terminatora z odpowiednich homologicznych genów innych gatunków, korzystnie ssaka. Odpowiednie sposoby są znane osobom biegłym w dziedzinie. [00] Terminy homologia, homologiczne, identyczność, identyczne, identyczność sekwencji lub homologiczna sekwencja są używane zamiennie. Metody obliczania homologii lub identyczności są dobrze znane w tej dziedzinie. W przypadku porównywania sekwencji zazwyczaj jedna sekwencja stanowi sekwencję odniesienia, z którą badane sekwencje są porównywane. Sekwencje dopasowuje się do maksymalnej odpowiedniości. Przerwy można wprowadzać w jednej z porównywanych sekwencji kwasu nukleinowego w celu optymalnego dopasowania. Procent identyczności między dwiema sekwencjami jest funkcją liczby identycznych pozycji wspólnych dla sekwencji, uwzględniając liczbę przerw i długość każdej przerwy, które należy wprowadzić dla optymalnego dopasowania dwóch sekwencji. Porównanie sekwencji i określanie procentu identyczności między dwiema sekwencjami można realizować przy użyciu algorytmów matematycznych. Można stosować domyślne parametry programu lub można wyznaczać alternatywne parametry. Algorytm porównywania sekwencji oblicza następnie procent identyczności badanej(ych) sekwencji w stosunku do sekwencji

17 odniesienia w oparciu o wyznaczone lub domyślne parametry programu. Jednym z przykładów algorytmu, który jest odpowiedni dla określenia identyczności jest algorytm BLAST (Altschul i wsp., J. Mol. Biol. 21, 403-4, 1990; Gish i wsp., Nature Genetics 3, , 1993; Madden i wsp., Meth. Enzymol. 266, , 1996; Zhang i wsp., Genome Res. 7, , 1997; Altschul i wsp., Nucleic Acids Res. 2, , 1997). Inne komputerowe implementacje algorytmów dopasowywania to GAP, PILEUP, BESTFIT, FASTA i TFASTA w pakiecie Genetics Software Package. Jednak procent identyczności można również wyznaczyć poprzez manualne porównywanie, oględziny i obliczenia. [0031] Określenie wektor w znaczeniu stosowanym w niniejszym dokumencie odnosi się do naturalnie lub syntetycznie wytwarzanego konstruktu do pobierania, proliferacji lub przekazywania kwasów nukleinowych w komórce, na przykład plazmidów, minichromosomów, fagmidów, kosmidów, sztucznych chromosomów/minichromosomów, bakteriofagów, wirusów, takich jak bakulowirusowy, retrowirusy, adenowirusy, wirusy związane z adenowirusem, wirus opryszczki, bakteriofagi. Metody stosowane do konstrukcji wektorów są dobrze znane osobom biegłym w dziedzinie i opisane w różnych publikacjach. W szczególności techniki konstruowania odpowiednich wektorów, w tym funkcjonalnych i regulatorowych składników, takich jak promotory, wzmacniacze, sygnały poliadenylacji i terminacji, markery selekcyjne, miejsca początku replikacji, sygnały splicingu, są znane osobom biegłym w dziedzinie. Eukariotyczne wektory ekspresyjne typowo zawierają również sekwencje prokariotyczne, ułatwiające propagację wektora w bakteriach, takie jak miejsca początku replikacji i geny oporności na antybiotyki do selekcji w bakteriach. Różne eukariotyczne wektory ekspresyjne, zawierające miejsce klonowania, do którego polinukleotyd może być funkcjonalnie przyłączony, są dobrze znane w dziedzinie, a niektóre są dostępne w handlu z takich firm jak Stratagene, La Jolla, CA; Invitrogen, Carlsbad, CA; Promega, Madison, WI lub BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA. [0032] Korzystne wykonanie wynalazku stanowią wektory i sekwencje polinukleotydowe zawierające jedną lub więcej jednostek transkrypcyjnych kodujących geny będące przedmiotem zainteresowania, które zawierają co najmniej jeden sygnał poliadenylacji HGH dla zakończenia transkrypcji i stabilizacji i/lub jako sekwencję izolującą. Także korzystne według wynalazku są wektory i sekwencje polinukleotydowe zawierające sygnały poliadenylacji HGH dla zakończenia transkrypcji i stabilizacji i/lub jako sekwencje izolujące, które zamiast genów będących przedmiotem zainteresowania mają tylko miejsce wielokrotnego klonowania, umożliwiające klonowanie genu będącego

18 przedmiotem zainteresowania poprzez sekwencje rozpoznawane przez endonukleazy restrykcyjne. [0033] Określenie promotor oznacza sekwencję polinukleotydową, która umożliwia i kontroluje transkrypcję genów lub sekwencji funkcjonalnie z nim związanych. Promotor zawiera sekwencje rozpoznania dla wiązania polimerazy RNA i miejsce inicjacji transkrypcji. W celu ekspresji żądanej sekwencji w określonym typie komórki lub komórce gospodarza należy wybrać odpowiedni funkcjonalny promotor. Wiele promotorów, włączając promotory konstytutywne, indukowane, reprymowalne z wielu różnych źródeł, jest dobrze znanych w dziedzinie (i zidentyfikowanych w bazach danych, takich jak GenBank) i dostępnych w postaci oddzielnych elementów lub elementów w sklonowanych sekwencjach polinukleotydowych z komercyjnych (na przykład depozyty, takie jak ATCC, jak również inne źródła komercyjne) lub indywidualnych źródeł. W promotorach indukowalnych aktywność promotora można zwiększyć lub zmniejszyć w zależności od sygnału. Na przykład, promotor tetracykliny (tet) zawierający sekwencję operatora tetracykliny (teto) może być indukowany przez regulowane przez tetracykliny białko transaktywatora (tta). Wiązanie tta tz teto jest hamowane w obecności tet. Przykłady innych promotorów indukowanych to promotory jun, fos, metalotioneina i promotory szoku cieplnego. Promotory, które są szczególnie korzystne dla silnej ekspresji w komórkach eukariotycznych, to, na przykład, promotor ubikwityna/s27a chomika (WO 97/1664), wczesny promotor SV40, główny późny promotor adenowirusa, promotor mysiej metalotioneiny-i, promotor regionu długich powtórzeń terminalnych wirusa mięsaka Rousa, wczesny promotor ludzkiego wirusa cytomegalii (CMV). Przykłady innych heterologicznych promotorów ssaczych to promotory aktyny lub immunoglobuliny lub szoku cieplnego. [0034] Wyżej wymienione promotory są dobrze znane w dziedzinie. Odpowiedni promotor heterologiczny może być funkcjonalnie połączony z innymi sekwencjami regulatorowymi, w celu zwiększenia/regulacji aktywności transkrypcji w kasecie ekspresyjnej. Przykładowo, promotor może być funkcjonalnie połączony z sekwencjami wzmacniacza w celu zwiększenia aktywności transkrypcyjnej. W tym celu, można zastosować jeden lub więcej wzmacniaczy i/lub wiele kopii sekwencji wzmacniacza, na przykład wzmacniacz wirusa CMV lub SV40. W związku z powyższym, wektor ekspresyjny według wynalazku, w innym przykładzie wykonania, zawiera jeden lub więcej wzmacniaczy/sekwencji wzmacniacza, korzystnie wzmacniacz wirusa CMV lub wirusa SV40.

19 [003] Określenie wzmacniacz oznacza sekwencję polinukleotydową, która w położeniu cis wpływa na aktywność promotora, a zatem stymuluje transkrypcję genu lub sekwencji kodującej funkcjonalnie połączonej z tym promotorem. W przeciwieństwie do promotorów efekt wzmacniania jest niezależny od pozycji i orientacji, a zatem wzmacniacze mogą być umieszczone z przodu lub z tyłu jednostki transkrypcyjnej, w obrębie intronu lub nawet w obrębie regionu kodującego. Wzmacniacz może być umieszczony zarówno w bezpośrednim sąsiedztwie jednostki transkrypcyjnej, jak i w znacznej odległości od promotora. Możliwe jest również fizyczne i funkcjonalne nakrywanie z promotorem. Osoby biegłe w dziedzinie znają wiele wzmacniaczy z różnych źródeł (i zdeponowanych w bankach danych, takich jak GenBank, na przykład wzmacniacze wirusa SV40, wzmacniacze wirusa CMV, wzmacniacze wirusa polioma, wzmacniacze adenowirusa), które są dostępne jako niezależne elementy lub elementy w sklonowanych sekwencjach polinukleotydowych (na przykład zdeponowane w ATCC lub ze źródeł komercyjnych i indywidualnych). Wiele sekwencji promotora zawiera również sekwencje wzmacniające, takie jak często używany promotor CMV. Ludzki wzmacniacz wirusa CMV jest jednym z najsilniejszych wzmacniaczy zidentyfikowanych dotychczas. Przykładem indukowalnego wzmacniacza jest wzmacniacz metalotioneiny, który może być stymulowany przez glikokortykosteroidy lub metale ciężkie. [0036] Elementy regulatorowe transkrypcji zwykle zawierają promotor przed sekwencją genu poddawanego ekspresji, miejsce inicjacji transkrypcji i miejsce terminacji oraz sygnał poliadenylacji. [0037] Określenie miejsce inicjacji transkrypcji odnosi się do kwasu nukleinowego w konstrukcie odpowiadającemu pierwszemu kwasowi nukleinowemu włączanemu do pierwotnego transkryptu, tj. prekursora mrna. Miejsca inicjacji transkrypcji może pokrywać się z sekwencjami promotora. [0038] Określenie miejsce terminacji transkrypcji odnosi się do sekwencji nukleotydowej zwykle reprezentowanej na końcu 3' genu będącego przedmiotem zainteresowania lub w odcinku sekwencji poddawanej transkrypcji, która powoduje, że polimeraza RNA zakańcza transkrypcję. [0039] Jednostka transkrypcyjna, jednostka ekspresyjna albo kaseta ekspresyjna definiują region w obrębie wektora, konstruktu lub sekwencji polinukleotydowej, który zawiera jeden lub więcej genów, które mają być poddane transkrypcji, przy czym geny zawarte w segmencie są funkcjonalnie ze sobą połączone. Są transkrybowane z jednego promotora i transkrypcja jest zakańczana przez co najmniej jeden sygnał poliadenylacji. W rezultacie, różne geny są co najmniej transkrypcyjnie

20 połączone. Więcej niż jedno białko lub produkt mogą ulegać transkrypcji i ekspresji z każdej jednostki transkrypcyjnej (jednostka transkrypcyjna multicistronowa). Każda jednostka transkrypcyjna będzie zawierała elementy regulatorowe konieczne do transkrypcji i translacji dowolnej z wybranych sekwencji, zawartych w jednostce. Ponadto, każda jednostka transkrypcyjna może zawierać takie same lub różne elementy regulatorowe. Na przykład, każda jednostka transkrypcyjna może zawierać ten sam terminator. Element IRES lub introny mogą być stosowane do funkcjonalnego łączenia genów w obrębie jednostki transkrypcyjnej. Wektor lub sekwencja polinukleotydowa mogą zawierać więcej niż jedną jednostkę transkrypcyjną. [0040] Elementy regulatorowe transkrypcji zawierają miejsce inicjacji translacji (AUG), kodon stop i sygnał polia dla każdego polipeptydu poddawanego ekspresji. W niektórych konstrukcjach może być obecne wewnętrzne miejsce wiązania rybosomu (IRES). IRES zdefiniowano poniżej. W celu optymalizacji ekspresji wskazane może być usunięcie, dodanie lub zmiana nieulegających translacji regionów ' i/lub 3' sekwencji kwasu nukleinowego, które mają być podawane ekspresji w celu eliminacji jakichkolwiek potencjalnie dodatkowych nieodpowiednich alternatywnych kodonów inicjacji translacji lub innych sekwencji, które mogą zakłócać lub zmniejszać ekspresję, na poziomie transkrypcji lub translacji. Konsensusowe miejsca wiązania rybosomów (sekwencja Kozak: GCCGCCACCAUGG (SEQ ID NO: 13); AUG stanowi kodon start), można wstawić bezpośrednio przed kodonem start w celu wzmocnienia translacji, a tym samym ekspresji. Zwiększona zawartość A/U wokół tego miejsca wiązania rybosomu dalej zwiększa wydajność wiązania rybosomu. W celu uzyskania sekrecji polipeptydu gen będący przedmiotem zainteresowania zazwyczaj zawiera sekwencję sygnałową kodującą peptyd liderowy lub sygnał, który kieruje nowo syntetyzowany polipeptyd do i przez błonę ER, gdzie polipeptyd może być kierowany do wydzielania. Peptyd liderowy lub sygnałowy znajduje się często, lecz nie powszechnie, na N-końcu wydzielanego białka i jest odszczepiany przez peptydazy sygnałowe po przejściu białka przez błonę ER. Sekwencja genu zazwyczaj, ale niekoniecznie, zawiera swoją własną sekwencję peptydu sygnałowego. Gdy natywna sekwencja peptydu sygnałowego jest nieobecna, heterologiczna sekwencja peptydu sygnałowego może być połączona z wybraną sekwencją. Ewentualnie natywną sekwencję peptydu sygnałowego można zastąpić sekwencją heterologiczną. Liczne sekwencje peptydu sygnałowego są znane osobom biegłym w dziedzinie i zdeponowane w bazach danych sekwencji, takich jak GenBank i EMBL.

21 1 2 [0041] Wewnętrzne miejsce wiązania rybosomu lub IRES opisują sekwencję, która funkcjonalnie promuje inicjację translacji niezależne od genu ' IRES i umożliwia translację dwóch cistronów (otwarte ramki odczytu) z jednego transkryptu w komórce zwierzęcej. IRES zapewnia niezależne miejsce wiązania rybosomu do translacji otwartej ramki odczytu bezpośrednio za nim. W przeciwieństwie do bakteryjnego mrna, które może być policistronowe, tj. może kodować kilka różnych polipeptydów, które są poddawane translacji kolejno z mrna, większość mrna z komórek zwierzęcych to mrna monocistronowe kodujące syntezę tylko jednego polipeptydu. W przypadku policistronowej transkrypcji w komórkach eukariotycznych, translacja będzie zaczynała się od najbardziej ' miejsca inicjacji translacji, kończyła przy pierwszym kodonie stop, a transkrypt zostanie uwolniony z rybosomu, powodując translację tylko pierwszego polipeptydu kodowanego przez mrna. W komórce eukariotycznej, transkrypt policystronowy mający IRES funkcjonalnie połączone z drugą lub kolejną otwartą ramką odczytu w transkrypcji umożliwia translację sekwencji tej dolnej otwartej ramki odczytu w celu wytworzenia dwóch lub większej liczby polipeptydów kodowanych przez ten sam transkrypt. IRES może być różnej długości i może pochodzić z różnych źródeł, na przykład od wirusa zapalenia mózgu (EMCV), pikornawirusa (na przykład pryszczycy), wirusa polio (PV) lub wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV). Opisano różne sekwencje IRES i ich zastosowanie do konstrukcji wektora i są one dobrze znane w dziedzinie. Położona dalej sekwencja kodująca jest funkcjonalnie połączona z końcem 3' IRES w dowolnej odległości i nie będzie miała negatywnego wpływu na ekspresję położonego dalej genu. Optymalną lub dopuszczalną odległość pomiędzy IRES i początkiem położonego dalej genu można łatwo określić przez zmianę odległości i pomiar ekspresji w funkcji odległości. [0042] Termin intron w znaczeniu stosowanym w niniejszym dokumencie, odnosi się do niekodującej sekwencji kwasu nukleinowego o różnej długości, zwykle obecnej w wielu eukariotycznych genach, która jest usuwana z nowo transkrybowanego prekursora mrna w procesie splicingu, dla którego wysoce konserwatywne sekwencje na lub w pobliżu końca intronu są konieczne. Na ogół, proces splicingu wymaga, aby końce ' i 3' intronu zostały poprawnie przecięte i otrzymane końce mrna dokładnie połączone tak, aby otrzymać dojrzałe mrna o odpowiedniej ramce odczytu dla syntezy białka. Wiele miejsc splicingowych donorowych i akceptorowych, czyli sekwencji bezpośrednio otaczających granice ekson-intron i intron-ekson, scharakteryzowano i opisano oraz są one znane osobom biegłym w dziedzinie.

22 [0043] Terminy gen będący przedmiotem zainteresowania, pożądana sekwencja, polinukleotyd będący przedmiotem zainteresowania lub pożądany gen w znaczeniu stosowanym w niniejszym dokumencie mają takie samo znaczenie i odnoszą się do sekwencji polinukleotydowej o dowolnej długości, który koduje produkt będący przedmiotem zainteresowania. Wybrana sekwencja może być pełnej długości lub obciętym genem fuzyjnym lub znakowanym genem, i może być cdna, genomowym DNA lub fragmentem DNA. Może to być natywna sekwencja, tj. naturalnie występująca(e) forma(y), lub może być zmutowana lub w inny sposób zmodyfikowana tak, jak jest to pożądane. Modyfikacje te obejmują optymalizację kodonów do optymalizacji wykorzystania kodonów w wybranej komórce gospodarza, humanizacji lub znakowania. Ponadto mogą one obejmować usuwanie lub wprowadzenie miejsc działających w pozycji cis, takich jak, między innymi jako nieograniczające przykłady, (tajne) splicingowe miejsca donorowe, akceptorowe i miejsca rozgałęzień, sygnały poliadenylacji, kasety TATA, miejsca chi, miejsca wiązania rybosomu, sekwencje powtórzeń, struktury drugorzędowe (na przykład pętle), miejsca wiązania dla czynników transkrypcyjnych lub innych czynników regulatorowych, miejsca dla enzymów restrykcyjnych itp. Wybrana sekwencja może kodować polipeptyd wydzielany, cytoplazmatyczny, jądrowy, związany z błoną lub powierzchniowy. [0044] W zakresie niniejszego opisu terminy funkcjonalne połączenie, funkcjonalnie połączony lub operacyjnie połączony oznacza, że dwie lub więcej sekwencji kwasów nukleinowych lub elementów sekwencji jest ustawionych w taki sposób, że pozwala im na działanie w zamierzony sposób. Na przykład, promotor/wzmacniacz lub terminator są funkcjonalnie połączone z sekwencją kodującą genu, jeśli są w stanie kontrolować lub modulować transkrypcję połączonej sekwencji genu w pozycji cis. Na ogół, ale niekoniecznie, sekwencje DNA, które są funkcjonalnie połączone sąsiadują ze sobą oraz, jeśli jest to konieczne do połączenia dwóch regionów kodujących polipeptyd, lub w przypadku wydzielania peptydu sygnałowego, są sąsiadujące i w ramce odczytu. Jednakże, choć funkcjonalnie połączony promotor na ogół znajduje się przed lub funkcjonalnie połączony terminator zwykle znajduje się za sekwencją kodującą, niekoniecznie znajdują się w pozycji sąsiadującej z nią. Wzmacniacze nie muszą znajdować się w pozycji sąsiadującej, o ile zwiększają transkrypcję sekwencji kodującej. W tym celu mogą one być umieszczone przed lub za sekwencją kodującą, a nawet w pewnej odległości. Miejsce poliadenylacji jest funkcjonalnie połączone z sekwencją kodującą, jeśli znajduje się na końcu 3' sekwencji kodującej w ten sposób, że transkrypcja przebiega przez sekwencję kodującą do sygnału poliadenylacji. Łączenie przeprowadza się

23 za pomocą metod rekombinacji znanych w tej dziedzinie, na przykład stosując metodę PCR, przez ligację w dogodnych miejscach restrykcyjnych lub poprzez annealing. Syntetyczne linkery oligonukleotydowe lub adaptery mogą być stosowane zgodnie z konwencjonalną praktyką, jeśli odpowiednie miejsca restrykcyjne nie są obecne. [004] Określenie kwas nukleinowy, sekwencja kwasu nukleinowego, sekwencja nukleotydów, polinukleotyd, sekwencja polinukleotydowa lub sekwencja DNA w znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie odnosi się do oligonukleotydu, nukleotydu lub polinukleotydu i fragmentów i ich części oraz DNA lub RNA pochodzenia genomowego lub syntetycznego, które mogą być jedno- lub dwuniciowe i stanowią nić sensowną lub antysensowną. Sekwencja może być sekwencją niekodującą, sekwencją kodującą lub ich mieszaniną. Sekwencje kwasów nukleinowych według niniejszego wynalazku można otrzymywać przy użyciu standardowych technik dobrze znanych osobom biegłym w dziedzinie. [0046] Określenia kodowanie lub kodująca odnoszą się do naturalnej właściwości specyficznych sekwencji nukleotydów w kwasie nukleinowym, na przykład genu w chromosomie lub mrna, służących jako matryce do syntezy innych polimerów i makrocząsteczek w procesach biologicznych o określonej sekwencji nukleotydów (na przykład rrna, trna, inne cząsteczki RNA) lub aminokwasów i właściwości biologicznych z tego wynikających. Zgodnie z tym, gen koduje białko, jeśli żądane białko jest wytwarzane w komórce lub innym układzie biologicznym przez transkrypcję i następującą po niej translację mrna. Obie nici kodujące, których sekwencja nukleotydowa jest identyczna z sekwencją mrna i jest zazwyczaj dostarczana na liście sekwencji baz danych, na przykład EMBL lub GenBank, i nić niekodująca, stosowana jako matryca do transkrypcji genu lub cdna, mogą być określane dalej jako kodujące białko lub inny produkt tego genu lub cdna. Kwas nukleinowy, który koduje białko obejmuje wszelkie kwasy nukleinowe, które mają różne sekwencje nukleotydowe, ale kodują tę samą sekwencję aminokwasową białka z powodu degeneracji kodu genetycznego. Kwasy nukleinowe i sekwencje nukleotydowe, które kodują białka mogą zawierać introny. Na liście sekwencji, sekwencje przedstawiono jako DNA zamiast sekwencji RNA. Na przykład, gdy występują jako DNA, wówczas kodon start jest przedstawiony jako ATG raczej niż AUG. [0047] Określenie cdna w kontekście niniejszego wynalazku odnosi się do kwasów dezoksyrybonukleinowych wytwarzanych poprzez odwrotną transkrypcję i typowo syntezę drugiej nici mrna lub innych RNA wytworzonych przez gen. Jeśli

24 dwuniciowa, cząsteczka cdna zawiera zarówno nić kodującą lub sensowną, jak i niekodującą lub antysensowaną. [0048] Określenie ekspresja w znaczeniu stosowanym w niniejszym dokumencie odnosi się do transkrypcji i/lub translacji sekwencji heterologicznego kwasu nukleinowego w komórce gospodarza. Poziom ekspresji pożądanego produktu w komórce gospodarza można określić na podstawie odpowiednich ilości RNA lub mrna, które są obecne w komórce, lub ilości żądanego polipeptydu kodowanego przez wybraną sekwencję. Na przykład, mrna transkrybowane z wybranej sekwencji można kwantyfikować za pomocą hybrydyzacji Northern blot, zabezpieczania rybonukleazą RNA, hybrydyzacji in situ z komórkowym RNA lub techniką PCR. Białka kodowane przez wybraną sekwencję można oznaczać ilościowo za pomocą różnych metod, na przykład ELISA, Western blot, za pomocą testów radioimmunologicznych, poprzez immunoprecypitację, oznaczając aktywność biologiczną białka lub techniką wybarwiania immunologicznego białka z dalszą analizą FACS z reakcją PCR. [0049] Termin polipeptyd jest stosowany zamiennie z sekwencją reszt aminokwasowych lub terminem białko i odnosi się do polimerów aminokwasów o dowolnej długości. Terminy te obejmują również białka, które są potranslacyjnie zmodyfikowane poprzez reakcje obejmujące, ale bez ograniczania do, glikozylowanie, glikację, acetylowanie, fosforylowanie, utlenianie, amidowanie lub przetwarzania białka. Modyfikacje i zmiany, takie jak fuzja z innymi białkami, substytucje, delecje lub insercje sekwencji aminokwasowych, mogą być wytwarzane w strukturze polipeptydu, podczas gdy cząsteczka zachowuje biologiczną aktywność funkcjonalną. Na przykład, pewne substytucje aminokwasów w sekwencjach aminokwasów można przeprowadzać w polipeptydzie lub jego podstawowej kodującej sekwencji kwasu nukleinowego i można otrzymać białko o podobnych właściwościach. Modyfikacje aminokwasowe mogą być wprowadzane, na przykład, przez przeprowadzenie mutagenezy specyficznej dla miejsca lub mutagenezy, w której pośredniczy łańcuchowa reakcja polimerazy z zaangażowaniem podstawowej sekwencji kwasu nukleinowego. Termin polipeptyd obejmuje zatem również, na przykład, białka fuzyjne składające się ze składnika immunoglobulinowego, na przykład składnika Fc, oraz czynnika wzrostu, na przykład interleukiny. [000] Stosowany w mniejszym dokumencie termin przeciwciało obejmuje przeciwciała poliklonalne, monoklonalne, bi-specyficzne, wielo-specyficzne, ludzkie, humanizowane lub chimeryczne, jednołańcuchowe, fragment wiążący antygen przeciwciała (na przykład fragment Fab lub F(ab') 2 ), połączony mostkiem dwusiarczkowym Fv, itp. Takie przeciwciała mogą być wytwarzane na drodze syntezy

25 chemicznej, technikami rekombinacji lub transgenicznymi, w hodowlach komórkowych (na przykład hybrydomy) lub za pomocą innych środków. [001] Fragmenty Fab (fragment wiążący antygen = Fab) składają się z regionów zmiennych obu łańcuchów, które są utrzymywane razem za pomocą sąsiadującego regionu stałego. Mogą one być wytwarzane przez trawienie proteazą, na przykład papainą, z konwencjonalnych przeciwciał, ale podobne fragmenty Fab można jednocześnie wytworzyć technikami inżynierii genetycznej. Kolejne fragmenty przeciwciał obejmują fragmenty F(ab') 2, które można otrzymać przez trawienie proteolityczne pepsyną. [002] Za pomocą metod inżynierii genetycznej, możliwe jest wytworzenie skróconych fragmentów przeciwciał, które składają się wyłącznie z regionów zmiennych łańcucha ciężkiego (VH) i łańcucha lekkiego (VL). Są one określane jako fragmenty Fv (fragment zmienny = fragment części zmiennej). Ponieważ fragmenty Fv nie mają wiązania kowalencyjnego dwóch łańcuchów tworzonych przez cysteiny ze stałych łańcuchów, fragmenty Fv często są stabilizowane. Korzystne jest połączenie regionów zmiennych łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego przez krótki fragment peptydowy, na przykład od do aminokwasów, korzystniej co najmniej 1 aminokwasów. W ten sposób otrzymuje się pojedynczą nić peptydową składającą się z VH i VL połączonych łącznikiem peptydowym. Białko tego typu jest znane jako jednołańcuchowy Fv (scfv). Przykłady białek przeciwciał typu scfv tego typu są znane ze stanu techniki. [003] W ostatnich latach opracowano różne strategie wytwarzania scfv w postaci multimerycznej pochodnej. Celem tego jest, w szczególności, otrzymanie rekombinowanych przeciwciał o ulepszonych właściwościach farmakokinetycznych i biodystrybucji oraz o zwiększonej zachłanności wiązania. W celu osiągnięcia multimeryzacji scfv, scfv wytworzą się jako białka fuzyjne z domenami multimeryzacji. Domenami multimeryzacji mogą być, na przykład region CH3 IgG, lub struktura spiralnego zwoju (helisa), taka jak domena zamka leucynowego. Jednakże, istnieją również strategie, w których oddziaływania między regionami VHNL fragmentu scfv wykorzystuje się do multimeryzacji (na przykład dia-, tria- i pentabody). Jako diabody osoba biegła w dziedzinie rozumie dwuwartościową pochodną homodimerycznego scfv. Skrócenie łącznika cząsteczki scfv do - aminokwasów prowadzi do tworzenia homodimerów, w których zachodzi międzyłańcuchowe nakładanie się VH/VL. Diabody można dodatkowo stabilizować przez wprowadzenie mostków dwusiarczkowych. Przykłady białek przeciwciał typu diabody są znane ze stanu techniki. [004] Poprzez minibody osoba biegła w dziedzinie rozumie dwuwartościową homodimeryczną pochodną scfv. Składa się on z białka fuzyjnego zawierającego region

26 1 2 2 CH3 immunoglobuliny, korzystnie IgG, najkorzystniej IgG1, jako region dimeryzacji, który jest połączony z scfv poprzez region zawiasowy (na przykład także z IgG1) i region łącznika. Przykłady białek przeciwciał typu miniciało są znane ze stanu techniki. [00] Poprzez triabody osoba biegła w dziedzinie rozumie trójwartościową homotrimeryczną pochodną scfv. Pochodne ScFv, w których VH-VL są połączone bezpośrednio, bez sekwencji łącznika, prowadzą do wytworzenia trimerów. [006] Osobie biegłej w dziedzinie również znane są tzw. miniprzeciwciała, które mają dwu-, trój- lub czterowartościową strukturę i wywodzą się z scfv. Multimeryzację przeprowadza się przez di-, tri- lub tetrameryczne struktury spiralnych zwojów. W korzystnym przykładzie wykonania niniejszego wynalazku, gen będący przedmiotem zainteresowania koduje dowolny z tych pożądanych polipeptydów wymienionych powyżej, korzystnie przeciwciało monoklonalne, pochodną lub fragment. [007] Polipeptyd, białko lub produkt będący przedmiotem zainteresowania obejmują białka, polipeptydy, ich fragmenty, peptydy, białka fuzyjne, z których wszystkie mogą być poddawane ekspresji w wybranej komórce gospodarza. Żądane białka mogą być na przykład przeciwciałami, enzymami, cytokinami, limfokinami, cząsteczkami adhezyjnymi, receptorami i ich pochodnymi lub ich fragmentami, a także wszelkimi innymi polipeptydami, które mogą służyć jako agoniści lub antagoniści receptora i/lub mają zastosowanie terapeutyczne lub diagnostyczne. Szczególnie pożądane białka/polipeptydy lub białka będące przedmiotem zainteresowania to, na przykład, ale nie wyłącznie, insulina, insulinopodobny czynnik wzrostu, hgh, tpa, cytokiny, takie jak interleukiny (IL), na przykład IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-1, IL-16, IL-17, IL-18, interferon (IFN) alfa, IFN beta, IFN gamma, IFN omega albo IFN tau, czynnik martwicy nowotworu (TNF), taki jak TNF alfa i TNF beta, TNF gamma, TRAIL; G-CSF, GM-CSF, M-CSF, MCP-1, VEGF i nano-ciała. Również w zakresie mieści się wytwarzanie erytropoetyny lub innych czynników wzrostu hormonów, i innych polipeptydów, które mogą służyć jako agoniści lub antagoniści i/lub mają zastosowanie terapeutyczne lub diagnostyczne. Sposób według wynalazku można także korzystnie stosować do wytwarzania przeciwciał, takich jak przeciwciała monoklonalne, przeciwciała poliklonalne, przeciwciała wielospecyficzne i przeciwciała jednołańcuchowe lub ich fragmenty, na przykład fragmenty Fab, Fab ', F(ab') 2, Fc i Fc', ciężkie i lekkie łańcuchy immunoglobulin i ich stałe, zmienne lub hiperzmienne regiony oraz fragmenty Fv i Fd.

27 1 26 [008] Produkt będący przedmiotem zainteresowania może być również antysensownym RNA, trna, rrna lub innym RNA wchodzącym w skład ryboprotein lub innych regulatorowych RNA. [009] Sposób według niniejszego wynalazku może być realizowany we wszystkich komórkach eukariotycznych. Komórki i linie komórkowe mogą być obecne, na przykład w hodowli komórkowej i obejmują, ale nie są ograniczone do następujących, komórki eukariotyczne, takie jak komórki drożdży, roślin, owadów lub komórki ssaków. Na przykład, komórki mogą stanowić oocyty, za wyjątkiem ludzkich komórek jajowych, zarodkowe komórki macierzyste, komórki krwiotwórcze lub dowolny typ zróżnicowanych komórek. Korzystna jest metoda, w której komórka eukariotyczna jest komórką ssaka. Korzystniejszy jest sposób, w którym komórka ssaka jest komórką człowieka, małpy, myszy, szczura, królika, chomika, kozy, wołu, owcy lub świni. Korzystne linie komórkowe lub komórki gospodarza do produkcji biofarmaceutyków to komórki człowieka, myszy, szczura, małpy lub linie komórek gryzoni. Bardziej korzystne są komórki chomika, korzystnie BHK21, BHK TK -, CHO, CHO-K1, CHO-DUKX, CHO-DUKX B1, CHO-S i CHO-DG44 i komórki CHO-DG44 lub pochodne/potomne każdej z tych linii komórkowych. Szczególnie korzystne są komórki CHO-DG44, CHO-DUKX, CHO-K1, CHO-S i BHK21, a nawet korzystniej komórki CHO-DG44 i CHO-DUKX. Ponadto, mysie komórki szpiczaka, korzystnie NS0 i SP2/0, komórki lub pochodne/potomne każdej z tych linii komórkowych są znane również jako linie komórek produkcyjnych dla białek biofarmaceutycznych. Przykłady komórek mysich i chomika komórek, które mogą być stosowane w rozumieniu niniejszego wynalazku zestawiono w tabeli 1. Tabela 1: Linie eukariotycznych komórek produkcyjnych Linia komórkowa Numer porządkowy NS0 ECACC nr 8103 Sp2/0-Ag14 ATCC CRL-181 BHK21 ATCC CCL- BHK TK - ECACC nr HaK ATCC CCL (pochodna BHK-21) ATCC CRL-844 CHO ECACC nr 802 CHO typu dzikiego ECACC 0027 CHO-K1 ATCC CCL-61

28 27 Linia komórkowa Numer porządkowy CHO-DUKX (= CHO duk -, CHO/dhfr - ) ATCC CRL-9096 CHO-DUKX B11 ATCC CRL-90 CHO-DG44 Urlaub i wsp., Cell 33 (2), , 1983 CHO Pro- ATCC CRL-1781 CHO-S Invitrogen nr kat Lec13 Stanley P. i wsp., Ann. Rev. Genetics 18, 2-2, 1984 V79 ATCC CCC-93 B14AF28-G3 ATCC CCL-14 HEK 293 ATCC CRL-173 COS-7 ATCC CRL-161 U266 ATCC TIB-196 HuNS1 ATCC CRL-8644 Per.C6 Fallaux, F.J. i wsp., Human Gene Therapy 9 (13), , 1998 CHL ECACC nr [0060] Najkorzystniejsze są komórki gospodarza, opracowane, dostosowane i całkowicie wyhodowane w warunkach bezsurowiczych i ewentualnie w środowisku, które jest wolne od białek/peptydów pochodzenia zwierzęcego. Przykładowe odpowiednie pożywki to dostępne w handlu pożywki, takie jak F12 Ham (Sigma, Deisenhofen, Niemcy), RPMI-1640 (Sigma), pożywka Eagle a w modyfikacji Dulbecco (DMEM, Sigma), pożywka Minimal Essential Medium (MEM, Sigma), pożywka Dulbecco w modyfikacji Iscove'a (IMDM, Sigma), pożywka CD-CHO (Invitrogen, Carlsbad, CA), pożywka CHO-S-SFMII (Invtirogen), wolna od surowicy pożywka CHO (Sigma), bezbiałkowa pożywka CHO (Sigma), pożywka EX-CELL (SAFC) oraz pożywki CDM4CHO i SFM4CHO (HyClone). Każda pożywka może być wzbogacona, w zależności od potrzeb, w różne związki, na przykład hormony i/lub inne czynniki wzrostu (takie jak insulina, transferyna, naskórkowy czynnik wzrostu, insulinopodobny czynnik wzrostu), sole (takie jak chlorek sodu, fosforan wapnia, magnezu), bufory (takie jak HEPES), nukleozydy (takie jak adenozyna, tymidyna), glutaminę, glukozę lub inne równoważne źródła energii, antybiotyki, pierwiastki śladowe. Wszelkie inne dodatki można również włączyć w odpowiednich stężeniach, które powinny być znane osobom biegłym w dziedzinie. W niniejszym wynalazku korzystne jest stosowanie pożywki bez

29 surowicy, ale pożywki z dodatkiem odpowiedniej ilości surowicy również mogą być stosowane do hodowli komórek gospodarza. Do wzrostu i selekcji genetycznie modyfikowanych komórek wykazujących ekspresję genu selekcyjnego dodaje się odpowiedni środek selekcyjny do pożywki hodowlanej. [0061] Transfekcję eukariotycznych komórek gospodarza sekwencjami polinukleotydowymi lub wektorami ekspresyjnymi, w wyniku czego otrzymuje się genetycznie modyfikowane komórki, komórki rekombinowane lub transgeniczne, można przeprowadzić dowolnym sposobem znanym osobom biegłym w dziedzinie. Metody transfekcji obejmują, ale nie ograniczają się do, transfekcję z udziałem liposomów, transfekcję ze współstrącaniem fosforanem wapnia, elektroporację, transfekcję z udziałem polikationu (na przykład dekstranu DEAE), fuzję protoplastów, mikroiniekcję i infekcje wirusowe. Korzystnie, transfekcja jest stabilną transfekcją. Korzystna jest metoda transfekcji, która zapewnia optymalną częstość transfekcji i ekspresji genów heterologicznych lub polinukleotydów w szczególnej linii komórek gospodarza i typie. Odpowiednie metody można określić za pomocą rutynowych procedur. W przypadku stabilnych transfektantów konstrukty integruje się z genomem komórki gospodarza lub sztucznym chromosomem/mini-chromosomem, albo umieszcza episomalnie tak, aby stabilnie utrzymywać w komórce gospodarza. Do wytwarzania zmodyfikowanych genetycznie komórek wykazujących ekspresję produktu(ów) będących przedmiotem zainteresowania wszystkie wymagane geny heterologiczne mogą znajdować się na jednym wektorze lub sekwencji polinukleotydowej w mono- lub multicistronowych jednostkach transkrypcyjnych. W tym przypadku komórki gospodarza kotransfekuje się pojedynczymi wektorami lub sekwencjami polinukleotydowymi. Heterologiczne geny mogą być również umieszczone na różnych wektorach lub sekwencjach polinukleotydowych. W tym przypadku komórki gospodarza kotransfekuje się wszystkimi wektorami albo sekwencjami polinukleotydowymi i/lub transfekuje w kolejnych rundach wektorami lub sekwencjami polinukleotydowymi kodującymi geny będące przedmiotem zainteresowania. [0062] Z definicji, każdą sekwencję polinukleotydową lub każdy gen wstawiony do komórki gospodarza i odpowiednie kodowane białko lub RNA określa się jako heterologiczny(ą), heterologiczną sekwencję, gen heterologiczny, heterologiczną sekwencję kodującą, transgen lub białko heterologiczne w odniesieniu do komórki gospodarza. Dotyczy to także przypadku, w którym sekwencja, która ma być wprowadzona lub gen, który ma być wprowadzony, są identyczne z endogenną sekwencją lub endogennym genem w komórce gospodarza. Przykładowo, gen aktyny chomika wprowadzony do komórki gospodarza chomika jest z definicji genem heterologicznym.

30 [0063] Termin endogenny oznacza naturalnie występujący w komórce lub organizmie. Endogenny gen jest odpowiednio genem, który znajduje się w genomie niepoddanej manipulacji komórce typu dzikiego. [0064] Określenie gen markera selekcyjnego/gen będący markerem selekcyjnym odnosi się do genu, który dopuszcza specyficzną selekcję tylko komórek zawierających gen w obecności odpowiedniego czynnika selekcyjnego. W celu ilustracji, gen oporności na antybiotyk może być stosowany jako pozytywny gen markera selekcyjnego, który pozwala komórce gospodarza transformowanej genem na pozytywną selekcję w obecności odpowiedniego antybiotyku; nietransformowana komórka gospodarza nie będzie w stanie rosnąć i przeżyć w warunkach hodowli selekcyjnej. Markery selekcyjne mogą być pozytywne, negatywne lub dwufunkcyjne. Pozytywne markery selekcyjne umożliwiają selekcję komórek z markerem poprzez nadanie oporności na lek lub kompensację metabolicznego lub katabolicznego defektu w komórce gospodarza. Natomiast, negatywne markery selekcyjne pozwalają na selektywną eliminację komórek z markerem. Na przykład, stosując gen HSV-tk jako marker uwrażliwia się komórki na środki, takie jak acyklowir i gancyklowir. Te geny markerów selekcyjnych stosowane w niniejszym dokumencie, w tym amplifikowane geny selekcyjne, obejmują wytworzone technikami rekombinacji mutanty i warianty, fragmenty, funkcjonalne odpowiedniki, pochodne, homologi i fuzje natywnego genu markera selekcyjnego, dopóki kodowany produkt zachowuje właściwości selekcyjne. Korzystne pochodne zwykle wykazują znaczne podobieństwo sekwencji (na poziomie aminokwasowym) w regionach lub domenach markera selekcyjnego związanego z właściwościami selekcji. Opisano różne geny markerów, dobrze znane osobom biegłym w dziedzinie, w tym dwufunkcyjne (tj. pozytywne/negatywne) markery (patrz na przykład WO 92/08796 i WO 94/28143), które włącza się do niniejszego dokumentu przez odniesienie. Na przykład, geny selekcyjne stosowane zwykle do komórek eukariotycznych obejmują geny dla fosfotransferazy aminoglikozydowej (APH), fosfotransferazy higromycyny (HYG), reduktazy dihydrofolianowej (DHFR), kinazy tymidynowej (TK), syntetazy glutaminowej, syntetazy asparaginowej i geny kodujące odporność na neomycynę (G418), puromycynę, histydynol D, bleomycynę i fleomycynę. [006] Gen będący amplifikowanym markerem selekcyjnym zazwyczaj koduje enzym, który jest wymagany do wzrostu w komórkach eukariotycznych w tych warunkach. Na przykład, gen będący amplifikowanym markerem selekcyjnym może kodować gen DHFR, przy czym ten gen jest amplifikowany, gdy komórkę gospodarza transfekowaną nim hoduje się w obecności środka selekcyjnego, metotreksatu (MTX). W

31 1 2 związku z powyższym, genetycznie zmodyfikowane komórki gospodarza według dowolnego sposobu opisanego w niniejszym wynalazku, mieszczą się w zakresie niniejszego wynalazku, przy czym gen będący amplifikowanym markerem selekcyjnym koduje, na przykład, polipeptyd mający funkcję reduktazy dihydrofolianowej (DHFR), syntetazy glutaminowej, CAD, deaminazy adenozynowej, deaminazy cyklazy, syntetazy UMP, '-dehydrogenazy IMP, fosforybozylotransferazy guaninoksantyny, HGPRTazy, kinazy tymidynowej, syntetazy tymidylanowej, glikoproteiny P 170, reduktazy rybonukleotydu, syntetazy asparaginowej, syntetazy argininobursztynianowej, dekarboksylazy ornitynowej, inhibitorów reduktazy HMG-CoA, transferazy acetyloglukozaminylowej, syntetazy treonylowo-trna lub Na + K + -ATP-azy. Przegląd przykładowych genów będących amplifikowanymi markerami selekcyjnymi wymienionych w tabeli 2 znajduje się w Kaufman, Methods in Enzymology, 18, 37-66, [0066] Jednym szczególnym genem - amplifikowanym markerem selekcyjnym jest gen kodujący reduktazę dihydrofolianową (DHFR), która jest konieczna do biosyntezy puryn. Komórki pozbawione genu DHFR nie będą rosły na pożywce bez puryn. Gen DHFR jest zatem przydatny jako dominujący marker selekcyjny do selekcji i amplifikacji genów w tych komórkach hodowanych w pożywce bez puryn. Środkiem selekcyjnym stosowanym w połączeniu z genem DHFR jest metotreksat (MTX). [0067] Innym markerem selekcyjnym i/lub amplifikowanym jest gen syntetazy glutaminy (GS). Gen GS koduje syntetazę glutaminy, które jest wymagana do syntezy aminokwasu glutaminy. Komórki pozbawione genu GS lub wykazujące ekspresję niskich poziomów endogennego GS nie będą rosnąć w pożywce bez glutaminy. Gen GS jest więc przydatny jako dominujący marker selekcyjny, do selekcji i amplifikacji genów w tych komórkach rosnących w pożywce bez glutaminy. Czynnik selekcyjnym stosowanym w połączeniu z genem GS jest sulfoksymina metioniny (MSX). Tabela 2: Geny będące amplifikacyjnymi markerami selekcyjnymi Gen - amplifikowany Numer dostępu Środek selekcyjny marker selekcyjny Reduktaza dihydrofolianowa M19869 (chomik) Metotreksat (MTX) E00236 (mysz) Metalotioneina D1 (chomik) M103 (człowiek) M11794 (szczur) Kadm

32 31 Gen - amplifikowany Numer dostępu Środek selekcyjny marker selekcyjny CAD (syntetaza karbamoliloforforanowa: M2362 (chomik) D7886 (człowiek) L-asparaginian N- fosfoacetylu transkarbamylaza asparaginowa: dihydroorotaza) Deaminaza adenozynowa K0267 (człowiek) M319 (mysz) Xyl-A lub adenozyna, 2 - deoksykoformycyna Deaminaza AMP (adenylan) D1277 (człowiek) J02811 (szczur) Adenina, azaseryna, koformycyna Syntaza UMP J03626 (człowiek) 6-Azaurydyna, pirazofuran -Dehydrogenaza IMP J049 (chomik) Kwas mykofenolowy J048 (człowiek) M33934 (mysz) Fosforybozylotransferaza ksantynowo-guaninowa X00221 (E. coli) Kwas mykofenolowy z limitowaną ksantyną Zmutowana HGPRTaza lub zmutowana kinaza tymidynowa J00060 (chomik) M 1342, K0281(człowiek) Hipoksantyna, aminopteryna i tymidyna (HAT) J00423 M68489 (mysz) M63983 (szczur) M36160 (herpeswirus) Syntetaza tymidylanowa D0096 (człowiek) -Fluorodeoksyurydyna M119 (mysz) L12138 (szczur) Glikoproteina P 170 (MDR1) AF0163 (człowiek) J03398 (mysz) Wiele leków, na przykład adriamycyna, winkrystyna, kolchicyna Reduktaza rybonukleotydowa Syntetaza glutaminowa M124223, K02927 (mysz) AF961 (chomik) U09114, M60803 (mysz) M2979 (szczur) Afidykolina Sulfoksymina metioniny (MSX)

33 Gen - amplifikowany marker selekcyjny Syntetaza asparaginowa Syntetaza arginiobursztynianowa Dekarboksylaza ornitynowa Reduktaza HMG-CoA N- Acetyloglukozaminylotransferaza 32 Numer dostępu M27838 (chomik) M27396 (człowiek) U38940 (mysz) U072 (szczur) X016 (człowiek) M31690 (mysz) M26198 (bydło) M3418 (człowiek) J03733 (mysz) M (szczur) L00183, M1270 (chomik) M18 (człowiek) M621 (człowiek) Środek selekcyjny Hydroksamian β- aspartylu, albicyna, - azacytydyna Kanawanina α-difluorometylomityna Kompaktyna Tunikamycyna Syntetaza treonylowa-trna M63180 (człowiek) Borelidyna ATPaza Na + K + J0096 (człowiek) Ouabaina M1411 (szczur) [0068] Selekcję można również przeprowadzić poprzez sortowanie komórek aktywowanych fluorescencyjnie (FACS), stosując na przykład marker na powierzchni komórki, bakteryjną β-galaktozydazę lub białka fluorescencyjne (na przykład zielone białko fluorescencyjne (GFP) i ich warianty z Aequorea victoria i Renilla reniformis lub innych gatunków; czerwone białka fluorescencyjne, białka fluorescencyjne oraz ich warianty z gatunków nie-bioluminescencyjnych (na przykład Discosoma sp, Anemonia sp, Clavularia sp, Zoanthus sp.), w celu selekcji rekombinowanych komórek. [0069] Określenie środek selekcyjny odnosi się do substancji, która zakłóca wzrost lub przeżycie komórki gospodarza, która nie zawiera danego genu selekcyjnego. Na przykład, w celu selekcji pod względem obecności genu oporności na antybiotyk, takiego jak fosfotransferaza aminoglikozydowa (APH) w transfekowanej komórce stosuje się antybiotyk genetycynę (G418). Środek selekcyjny może także obejmować środek amplifikujący, który jest zdefiniowany dla celów niniejszego wynalazku jako środek do

34 amplifikacji kopii amplifikowanego genu, jeśli gen markera selekcyjnego jest amplifikowanym markerem selekcyjnym. Na przykład, MTX jest środkiem selekcyjnym przydatnym do amplifikacji genu DHFR. [0070] Kolejne wykonanie powyższych metod odnosi się sposobu, w którym polipeptyd(y)/produkt(y), który jest/są kodowane przez gen(y) będący(e) przedmiotem zainteresowania i poddawany(e) ekspresji w komórce gospodarza, izoluje się z komórek lub z supernatantu hodowli komórek, w przypadku sekrecji do podłoża hodowlanego. [0071] Wymienione komórki produkcyjne korzystnie hoduje w pożywce bez surowicy i w hodowli w zawiesinie w warunkach, które są korzystne dla ekspresji pożądanego genu(ów) i izolacji białka będącego przedmiotem zainteresowania z komórek i/lub z supernatantu hodowli komórek. Korzystnie białko będące przedmiotem zainteresowania odzyskuje się z pożywki hodowlanej jako wydzielony polipeptyd lub można go odzyskać z lizatów komórek gospodarza, jeśli poddawane są ekspresji bez sygnału sekrecyjnego. Konieczne jest oczyszczenie białka będącego przedmiotem zainteresowania z innych rekombinowanych białek, białek komórek gospodarza i zanieczyszczeń w sposób w jaki zasadniczo jednorodne preparaty białka będącego przedmiotem zainteresowania są otrzymywane. W pierwszym etapie często komórki i/lub resztki poszczególnych komórek usuwa się z pożywki hodowlanej lub lizatu. Żądany produkt następnie oczyszcza się z zanieczyszczających rozpuszczalnych białek, polipeptydów i kwasów nukleinowych, na przykład, przez frakcjonowanie na kolumnach immunopowinowactwa lub kolumnach jonowymiennych, za pomocą wytrącania etanolem, techniką chromatografii HPLC w układzie faz odwróconych, techniką chromatografii Sephadex, techniką chromatografii na krzemionce lub na żywicy kationowymiennej, takiej jak DEAE. Na ogół, metody oczyszczania heterologicznego białka poddawanego ekspresji przez komórki gospodarza, są dobrze znane w tej dziedzinie. [0072] W praktyce niniejszego wynalazku wykorzystuje się, o ile nie wskazano inaczej, konwencjonalne techniki biologii komórki, biologii molekularnej, hodowli komórkowych, immunologii i podobne, które mieszczą się w zakresie umiejętności osób biegłych w dziedzinie. Techniki te w pełni ujawniono we współczesnej literaturze. [0073] Poniższe przykłady nie są ograniczające. Wskazują one jedynie możliwe przykłady wykonania wynalazku. Osoba biegła w dziedzinie może z łatwością dostosować warunki tak, aby można je było zastosować do innych przykładów wykonania. 3

35 Przykłady Skróty [0074] AP: fosfataza alkaliczna BGH: bydlęcy hormon wzrostu pz: pary zasad CHO: komórka jajnika chomika chińskiego DHFR: reduktaza dihydrofolanowa ELISA: test immunoenzymatyczny FACS: sortowanie komórek aktywowanych fluorescencyjnie HGH: hormon wzrostu chomika HT: hipoksantyna/tymidyna HRPO: peroksydaza chrzanowa IgG: immunoglobulina IRES: wewnętrzne miejsce wiązania rybosomu kb: kilozasada mab: przeciwciało monoklonalne MTX: metotreksat NPT: fosfotransferaza neomycyny nt: nukleotydy PBS: roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanami PCR: reakcja łańcuchowa polimerazy SEAP: wydzielana fosfataza alkaliczna sicam: rozpuszczalna cząsteczka adhezji wewnątrzkomórkowej UTR: region nieulegający translacji Materiały i metody Hodowla komórkowa [007] Komórki CHO-DG44/dhfr -/- poddaje się stałej hodowli w zawiesinie w pożywce bez surowicy CHO-S-SFMII (lnvitrogen) z dodatkiem hipoksantyny i tymidyny (HT). Komórki inkubuje się w kolbach do hodowli komórkowych w temperaturze 37 C w wilgotnej atmosferze zawierającej % CO 2. Liczbę komórek oraz żywotność komórek określa się za pomocą licznika komórek CASY1 (Schaerfe System, Niemcy), Cedex (Innovatis AG, Niemcy) lub za pomocą testu wykluczania z użyciem niebieskiego

36 3 barwnika trypanowego. Komórki wysiewa się w stężeniu 1-3x komórek/ml w świeżej pożywce co dwa do trzech dni. 1 Transfekcje [0076] Transfekcje komórek CHO-DG44 przeprowadza są przy użyciu odczynnika Lipofectamine Plus (Invitrogen). Na transfekcję, 6x komórek w fazie wzrostu wykładniczego w 0,8 ml pożywki CHO-S-SFMII wzbogaconej hipoksantyną/tymidyną (HT), wysiewa się w dołku 6-dołkowej komory. Dla każdej transfekcji wytwarza się mieszaninę plazmidowego DNA, 4 µl lipofektaminy, 6 µl odczynnika Plus w objętości 0 µl i dodaje do komórek, zgodnie z protokołem producenta. Po inkubacji w ciągu 3 godzin dodaje się 2 ml pożywki CHO-S-SFMII z dodatkiem HT. [0077] Przejściowe transfekcje przeprowadza się w trzech powtórzeniach i supernatant oraz komórki zbiera 2 dni po transfekcji. W przypadku selekcji na bazie DHRF stabilnie transfekowanych komórek CHO-DG44 pożywkę zastępuje się pożywką CHOS- SFMII bez HT 48 godzin po transfekcji. Amplifikację genów na bazie DHFR uzyskuje się dodając MTX w zakresie - 00 nm (Sigma) jako amplifikujący środek selekcyjny do pożywki. W przypadku kotransfekcji, przeprowadza się selekcję na bazie DHFR i NPT stabilnie transfekowanych komórek CHO-DG44 poprzez przeniesienie komórek 48 godzin po transfekcji do pożywki CHO-S-SFMII bez HT z dodatkiem G418 (Invitrogen) w stężeniu µg/ml. 2 Wektory ekspresyjne [0078] Eukariotyczne wektory ekspresyjne pochodzą od wektora PAD-CMV1 (WO 9) i pośredniczą w konstytutywnej ekspresji genów heterologicznych napędzanej przez promotor/wzmacniacz wirusa CMV. W celu terminacji i poliadenylacji transkryptu genu będącego przedmiotem zainteresowania, wektory zawierają albo późny sygnał poliadenylacji SV40 (SEQ ID NO: 11), albo sygnał poliadenylacji BGH (SEQ ID NO: 12). Wektory pbid kodują mini gen DHFR jako amplifikowany marker selekcyjny (patrz na przykład EP ), natomiast wektory pbin kodują gen NPT jako marker selekcyjny pod kontrolą wczesnego promotora SV40 i sygnału poliadenylacji kinazy tymidyny (figura 1). Geny będące przedmiotem zainteresowania kodujące ludzki sicam, łańcuch ciężki i lekki przeciwciał monoklonalnych (izotyp IgG1, IgG2 lub IgG4) lub białka fuzyjne

37 36 Fc wklonowuje się do wektorów z wykorzystaniem miejsc wielokrotnego klonowania znajdujących się pomiędzy promotorem a sygnałem poliadenylacji. 1 Test ELISA [0079] Miana sicam się ocenia się ilościowo za pomocą testu ELISA z wykorzystaniem standardowych protokołów stosując dwa opracowane we własnym laboratorium przeciwciała monoklonalne sicam (jak opisano, na przykład, w patentach Stanów Zjednoczonych nr i 47091), przy czym jedno z tych przeciwciał jest przeciwciałem sprzężonym z HRPO. Oczyszczone białko sicam jest stosowane jako wzorzec. Miana mab określa się ilościowo za pomocą testu ELISA stosując standardowe protokoły przy użyciu koziego anty-ludzkiego fragmentu Fc IgG (Dianova) i sprzężonego z AP koziego anty-ludzkiego przeciwciała zawierającego łańcuch lekki kappa (Sigma). Oczyszczone monoklonalne przeciwciało tego samego izotypu co poddawane ekspresji przeciwciało monoklonalne stosuje się jako wzorzec. Próbki analizuje się za pomocą czytnika Spectra Fluor Plus Reader (TECAN, Crailsheim, Niemcy). Produktywność komórek (pg/komórka/dzień) oblicza się ze wzoru pg/((ct-co) t /In (Ct-Co)), gdzie Co oznacza liczbę komórek w czasie posiewania, Ct oznacza liczbę komórek w czasie zbioru i t oznacza okres hodowli. 2 3 Test SEAP [0080] Aktywność SEAP określa się za pomocą testu genu reporterowego SEAP zgodnie z protokołem producenta (Roche Diagnostics). Przykład 1: Izolacja i klonowanie transkrypcyjnego regionu terminacyjnego hormonu wzrostu chomika (HGH) [0081] W celu wyizolowania pełnego regionu sygnału poliadenylacji genu hormonu wzrostu z genomu CHO-DG44 (chomik chiński, Cricetus griseus), poddane ligacji z adapterem genomowe DNA CHO-DG44 służy jako matryca w reakcji nested PCR. Podstawową reakcję PCR przeprowadza się z kombinacją starterów komplementarnych, odpowiednio, do sekwencji adaptera i sekwencji genu hormonu wzrostu. Starter specyficzny dla genu GH for1 ( -GAGACCTACCTGCGGGTCA TGA- 3 ; SEQ ID NO: 1) konstruuje się w oparciu o sekwencję cdna hormonu wzrostu chomika syryjskiego (Mesocricetus auratus; Genbank S66299) i znajduje się on 3 pz

38 przed kodonem stop. Wtórną reakcję PCR przeprowadza się na produktach podstawowej reakcji PCR stosując kombinację wewnętrznego startera adaptora i drugiego startera specyficznego dla genu nested Gh for2; ( -AGTGCCGTCGCTTTGTGGAAA G-3 ; SEQ ID NO: 2), umieszczonego bezpośrednio za pozycją startera GH for1. Powstałe fragmenty DNA subklonuje się do wektora do klonowania TA (Invitrogen) i dalej analizuje poprzez analizę sekwencji. Najdłuższy fragment DNA zawiera, oprócz sekwencji startera GH for2, kolejne13 par zasad końca 3' regionu kodującego, a następuje kodon stop i 324 par zasad nieulegającego translacji regionu 3' hormonu wzrostu Cricetus griseus (figura 2, SEQ NR ID: 7). Aby uzyskać tylko nieulegający translacji region 3 z łącznie 324 para zasad (SEQ ID NO: 8), przeprowadza się kolejną reakcję PCR używając starterów GH Sfi for1 (SEQ ID NO: 3) i GH Xba rev1 (SEQ ID NO: 4). Tym sposobem wyżej wymieniony fragment DNA 362 pz (SEQ ID NO: 7) subklonowany w wektorze TA, służy jako matryca w reakcji PCR. Amplifikowana sekwencja (SEQ ID NO: 8) wykazuje następujące homologie z nieulegającym translacji regionem 3 hormonu wzrostu różnych gatunków: 72,1% z sekwencją chomika syryjskiego Mesocricetus auratus (Genbank S66299), 71,6% z sekwencją Mus musculus (Genbank Z46663), 61% z sekwencją Rattus norvegicus (Genbank V01239) i 0,4% z sekwencją BGH Bos taurus (Genbank J00008) (figura 3). Podejście na bazie reakcji PCR jest także stosowane do wytwarzania subklonów z różnymi delecjami na końcu 3, izolowanego nieulegającego translacji regionu 3'. Używając kombinacji starterów GH Sfi for1 (SEQ ID NO: 3) i GH Xba rev2 (SEQ ID NO: ) wytwarza się fragment 189 pz nieulegającego translacji regionu 3 (SEQ ID NO: 9), a używając kombinacji starterów GH Sfi for1 (SEQ ID NO: 3) i GH Xba rev3 (SEQ ID NO: 6) wytwarza się subfragment 113 pz (SEQ ID NO: ). W ten sposób, wszystkie powielone fragmenty nieulegającego translacji regionu 3 mają identyczny koniec ', który odpowiada pierwszemu nukleotydowi za kodonem stop i zmienny koniec 3 (figura 4). Produkty PCR trawi się SFIL oraz Xbal i otrzymane fragmenty restrykcyjne stosuje do zastępowania sekwencji późnego sygnału poliadenylacji SV40 w wektorze pjr6, który koduje ludzki sicam (figura ). Powstałe wektory, pjr131, pjr134 i pjr13 zawierają obecnie sekwencję sygnałową poliadenylacji pochodzącą od hormonu wzrostu Cricetus griseus, nazywaną w skrócie HGH, o wielkości, odpowiednio, 324 pz (SEQ ID NO: 8), 189 pz (SEQ ID NO: 9) i 113 pz (SEQ ID NO: ) (figura ).

39 1 38 Przykład 2: Wpływ sekwencji silnego sygnału poliadenylacji HGH na przejściową ekspresję sicam [0082] W celu oceny wpływu sekwencji sygnału poliadenylacji pochodzącego z hormonu wzrostu Cricetus griseus (hgh) na ekspresję genu będącego przedmiotem zainteresowania, sicam, przeprowadza się przejściową transfekcję niezależną od chromosomalnych miejsc integracji. Komórki CHO-DG44 transfekuje się plazmidem pjr131 zawierającym 3 UTR 324 pz hormonu wzrostu chomika (=HGH, SEQ ID NO: 8) (figura ). Wektory zawierające albo sekwencję późnego sygnału poliadenylacji SV40 (pjr6), albo sekwencję sygnału poliadenylacji BGH (pjr1) służą jako kontrola (figura ). Oprócz różnych sekwencji terminacyjnych, genetyczna konfiguracja różnych wektorów do ekspresji sicam jest identyczna. Supernatanty zbiera się 2 dni po transfekcji i miana sicam oznacza przy użyciu testu ELISA. W celu korekty na skuteczność transfekcji komórki są kotransfekowane plazmidem pcmv-seap (0 ng DNA/reakcję transfekcji), który koduje wydzielaną fosfatazę alkaliczną i mierzy się aktywność SEAP. Figura 6 przedstawia dane z 2 niezależnych serii przejściowej transfekcji przeprowadzonej w dwóch powtórzeniach. Nieoczekiwanie, najwyższą ekspresję sicam uzyskuje się dla sekwencji sygnału poliadenylacji pochodzącej z genu hormonu wzrostu chomików. Miano jest zwiększone do 21% (seria transfekcji 1) w porównaniu do komórek transfekowanych wektorem pjr1 zawierającym sygnał poliadenylacji BGH i wzrasta do 40% (seria transfekcji 1) w porównaniu do komórek transfekowanych wektorem pjr6 zawierającym późny sygnał poliadenylacji SV40. 2 Przykład 3: Wpływ silnego sygnału poliadenylacji HGH na przejściową ekspresję przeciwciała IgG4 [0083] W celu oceny wpływu sekwencji sygnału poliadenylacji pochodzącego z hormonu wzrostu Cricetus griseus (hgh) na ekspresję genu będącego przedmiotem zainteresowania, humanizowanego IgG4/kappa mab, przeprowadza się przejściową transfekcję niezależną od chromosomalnych miejsc integracji. Komórki CHO-DG44 kotransfekuje się kombinacją wektorów pbid/igg4 i pbin/kappa. Oba wektory zawierają 324 pz nieulegającego translacji regionu 3 hormonu wzrostu chomika (=HGH; SEQ ID NO: 8) jako sekwencję sygnałową poliadenylacji. Jako kontrolę kotransfekuje się komórki CHO-DG44 kombinacją wektorów pbidb/igg4 i pbin-b/kappa z sekwencją sygnałową poliadenylacji BGH (zob. figura 1 dla wektorów podstawowych). Oprócz różnych

40 sekwencji terminacyjnych, genetyczna konfiguracja różnych wektorów do ekspresji IgG4/kappa mab jest identyczna. Supernatanty zbiera się 2 dni po transfekcji i miana IgG4 oznacza przy użyciu testu ELISA. Na kombinację wektorów transfekuje się 6 puli komórek. W celu korekty na skuteczność transfekcji komórki są kotransfekowane plazmidem pcmv-seap (0 ng DNA/reakcję transfekcji), który koduje wydzielaną fosfatazę alkaliczną i mierzy się aktywność SEAP. Nieoczekiwanie, uzyskane miana sekwencji sygnału poliadenylacji HGH są średnio o 3% wyższe niż w przypadku sygnału poliadenylacji BGH (figura 7). Przykład 4: Badanie rożnych wariantów HGH [0084] Dwa klony z delecją 3 w sekwencji HGH 324 pz pochodzące z hormonu wzrostu Cricetus griseus (SEQ ID NO: 8) wytwarza się w reakcji PCR i umieszcza jako sekwencję sygnału poliadenylacji za genem sicam. Otrzymane wektory pjr134 i pjr13 (figura ) zawierają krótszy odcinek sekwencji HGH, odpowiednio, 189 pz (SEQ ID NO: 9) i 113 pz (SEQ ID NO: ), które mają wspólny koniec (figura 4). W celu oceny wpływu wariantów delecyjnych HGH na ekspresję genu, sicam, przeprowadza się przejściową transfekcję niezależną od chromosomalnych miejsc integracji. Komórki CHO-DG44 transfekuje się wektorami pjr134 i pjr13. Wektor pjr131 zawierający 324 par zasad jest stosowany jako kontrola (figura ). Oprócz różnych sekwencji terminacyjnych, genetyczna konfiguracja różnych wektorów do ekspresji sicam jest identyczna. Supernatanty zbiera się 2 dni po transfekcji i miana sicam oznacza przy użyciu testu ELISA. W celu korekty na skuteczność transfekcji komórki są kotransfekowane plazmidem pcmv-seap (0 ng DNA/reakcję transfekcji), który koduje wydzielaną fosfatazę alkaliczną i mierzy się aktywność SEAP. Figura 8 przedstawia dane z 2 niezależnych serii przejściowej transfekcji przeprowadzonej w dwóch powtórzeniach. Oba warianty delecyjne HGH prowadzą do obniżenia poziomu ekspresji sicam. Sekwencja HGH 189 pz zawarta w wektorze ekspresyjnym pjr134 powoduje bardziej umiarkowane zmniejszenie nawet do 23%. Zatem fragment 189 pz wykazuje wydajność porównywalną z sygnałem poliadenylacji BGH i późnym sygnałem poliadenylacji SV40 (patrz przykład 2 i 3). Jednakże, najkrótsza sekwencja HGH 113 pz zawarta w wektorze ekspresyjnym pjr13 prowadzi do maksymalnie 78% zmniejszenia ekspresji sicam. Pokazuje to, że między regionem HGH

41 pz do 324 sekwencji SEQ ID NO: 8 znajdują się sekwencje, które przyczyniają się do skutecznej ekspresji genów będących przedmiotem zainteresowania. 1 Przykład : Stabilna ekspresja białek na wysokim poziomie z wykorzystaniem sygnału poliadenylacji HGH [008] Komórki CHO-DG44 kotransfekuje się kombinacjami wektorów kodujących lekki i ciężki łańcuch różnych izotypów przeciwciał monoklonalnych mab (IgG1, IgG2, IgG4) lub białka fuzyjne Fc, w których część Fc pochodzi z IgG1 lub IgG2. Podstawowe wektory pbid i pbin (figura 1) stosowane do ekspresji zawierają sekwencję HGH 324 pz (SEQ ID NO: 8) jako sekwencję sygnałową poliadenylacji umieszczoną za genem będącym przedmiotem zainteresowania. Stabilne pule komórek poddaje się selekcji na bazie DHFR i NPT 2 dni po transfekcji. Po pierwszej selekcji stabilnych transfektantów przeprowadza się dwa kolejne etapy amplifikacji genów z zastosowaniem DHFR dodając do hodowli 0 nm MTX w pierwszej rundzie, a następnie 800 nm MTX. Pojedyncze klony komórkowe uzyskuje się albo przez klonowanie metodą ograniczonych rozcieńczeń lub opartym na FACS osadzaniu pojedynczych komórek w dołkach 96-dołkowej płytki. Dane doświadczalne wskazują, że wysoką ekspresję białka będącego przedmiotem zainteresowania w stabilnych transfektantach można osiągnąć za pomocą sygnału poliadenylacji HGH z Cricetus griseus. Otrzymuje się pule komórek i klony komórkowe o produktywności właściwej zakresie - 4 pg/komórkę/dzień i mianach w hodowlach okresowych z zasilaniem do 6,3 g/l (figura 9). Tabela sekwencji: [0086] SEQ ID NO:1 SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO:4 SEQ ID NO: SEQ ID NO:6 SEQ ID NO:7 Starter GH for1 Starter GH for2 Starter GH Sfi for1 Starter GH Xba rev1 Starter GH Xba rev2 Starter GH Xba rev3 Cricetus griseus, sekwencja hormonu wzrostu, część regionu kodującego 3 i nieulegającego translacji regionu 3 (362 nukleotydy)

42 SEQ ID NO:8 SEQ ID NO:9 SEQ ID NO: SEQ ID NO:11 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:13 41 Cricetus griseus, nieulegający translacji region 3 hormonu wzrostu (324 nukleotydy) Cricetus griseus, nieulegający translacji region 3 hormonu wzrostu (189 nukleotydów) Cricetus griseus, nieulegający translacji regionu 3 hormonu wzrostu (113 nukleotydów) SV40, późna sekwencja terminacji i poliadenylacji (222 nukleotydów) Bos taurus, sekwencja terminacji i poliadenylacji hormonu wzrostu (8 nukleotydów) Sekwencja Kozak, konsensusowe miejsce wiązania rybosomów (13 nukleotydów) Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG, Niemcy Pełnomocnik:

43 42 Z-829 EP B1 Zastrzeżenia patentowe 1. Sygnał poliadenylacji zawierający kwas nukleinowy zawierający sekwencję w co najmniej 7% identyczną z sekwencją SEQ ID NO:8. 2. Sygnał poliadenylacji według zastrzeżenia 1 zawierający sekwencję w co najmniej 80%, 8%, 90%, 9% albo 98% identyczną z sekwencją SEQ ID NO:8. 3. Sygnał poliadenylacji według zastrzeżenia 1 albo 2 zawierający sekwencję SEQ ID NO:8. 4. Sygnał poliadenylacji według zastrzeżenia od 1 do 3, gdzie wymieniony sygnał poliadenylacji jest funkcjonalnie połączony z heterologiczną sekwencją kodującą.. Wektor zawierający dowolny z wymienionych sygnałów poliadenylacji określonych w zastrzeżeniach od 1 do Wektor według zastrzeżenia zawierający gen heterologiczny będący przedmiotem zainteresowania kodujący heterologiczny produkt będący przedmiotem zainteresowania. 7. Wektor według zastrzeżenia 6, gdzie produkt będący przedmiotem zainteresowania jest polipeptydem będącym przedmiotem zainteresowania i wymieniony polipeptyd będący przedmiotem zainteresowania jest przeciwciałem, fragmentem przeciwciała albo białkiem fuzyjnym. 8. Komórka zawierająca wektor określony w dowolnym z zastrzeżeń od do Komórka według zastrzeżenia 8, gdzie sygnał poliadenylacji określony w zastrzeżeniach od 1 do 4 jest funkcjonalnie połączony z jednostką transkrypcyjną kodującą produkt będący przedmiotem zainteresowania i gdzie produkt będący przedmiotem zainteresowania jest polipeptydem będącym przedmiotem zainteresowania kodowanym przez gen będący przedmiotem zainteresowania.. Komórka według zastrzeżenia 8 albo 9, gdzie wymieniona komórka jest komórką chomika. 11. Komórka według zastrzeżenia, gdzie komórka chomika jest komórką jajnika chomika chińskiego (CHO) korzystnie komórką CHO DG44.

44 Sposób wytwarzania polipeptydu będącego przedmiotem zainteresowania kodowanego przez gen będący przedmiotem zainteresowania, obejmujący: (a) Dostarczanie komórki gospodarza zawierającej wektor określony w dowolnym z zastrzeżeń od do 7 albo dostarczanie komórki określonej w dowolnym z zastrzeżeń od 8 do, (b) Hodowlę wymienionej komórki, w warunkach umożliwiających proliferację komórki i ekspresję genu będącego przedmiotem zainteresowania, (c) Zbieranie polipeptydu będący przedmiotem zainteresowania i (d) Oczyszczanie polipeptydu będącego przedmiotem zainteresowania. 13. Zastosowanie dowolnych sygnałów poliadenylacji określonych w zastrzeżeniach od 1 do 4 jako sekwencji izolującej. 14. Zestaw zawierający dowolne sygnały poliadenylacji określone w zastrzeżeniach od 1 do 4, wektor, komórkę i pożywkę do hodowli komórkowych do hodowli wymienionej komórki. Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG, Niemcy Pełnomocnik:

45 44 Z-829 EP B1 Figura 1

46 4 Z-829 EP B1 Figura 2

47 46 Z-829 EP B1 Figura 3

48 47 Z-829 EP B1 Figura 4

49 48 Z-829 EP B1 Figura