(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2013/13 EP B1 (13) (51) T3 Int.Cl. C07K 16/04 ( ) A61K 39/395 ( ) C07K 16/00 ( ) (54) Tytuł wynalazku: Przeciwciała o wzmocnionej aktywności zależnej od przeciwciał cytotoksyczności komórkowej, sposoby ich wytwarzania i zastosowanie (30) Pierwszeństwo: US P (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2008/30 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 2013/09 (73) Uprawniony z patentu: GTC Biotherapeutics, Inc., Framingham, US Genzyme Corporation, Cambridge, US (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 DANIEL SCHINDLER, Newton Upper Falls, US HARRY M. MEADE, Newton, US TIMOTHY EDMUNDS, Bolton, US JOHN MCPHERSON, Hopkinton, US (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Dorota Rzążewska JWP RZECZNICY PATENTOWI DOROTA RZĄŻEWSKA SP. J. ul. Żelazna 28/30 Sienna Center Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 16809/13/P-RO/DR EP Opis Przeciwciała o wzmocnionej aktywności zależnej od przeciwciał cytotoksyczności komórkowej, sposoby ich wytwarzania i zastosowanie POWIĄZANE ZGŁOSZENIA [0001] Niniejsze zgłoszenie zastrzega pierwszeństwo na mocy 35 U.S.C. 119 z tymczasowego zgłoszenia US numer seryjny 60/729054, zgłoszony 21 października WSPARCIE RZĄDOWE [0002] Aspekty wynalazku mogły być wykonane przy użyciu środków z National Cancer Institute SBIR numer Grantu 5R43CA W związku z powyższym, rząd może mieć prawa do wynalazku. DZIEDZINA WYNALAZKU [0003] Opisujemy przeciwciała o wzmocnionej aktywności zależnej od przeciwciał cytotoksyczności komórkowej (ADCC), sposoby ich wytwarzania, a także sposoby ich zastosowania. TŁO WYNALAZKU [0004] Przeciwciała monoklonalne są ważną bronią w arsenale terapii chorób. Na przykład, w ADCC jest głównym czynnikiem przyczyniającym się do skuteczności przeciwciał przeciwrakowych. Kluczowym receptorem mediującym ADCC jest receptor FcγIIIa (CD16), receptor o niskim powinowactwie do IgG eksprymowanym na komórkach naturalnych zabójców (NK). Myszy pozbawione tego receptora mają znacznie mniejszą odpowiedź przeciwnowotworową na rytuksymab (Clynes i wsp., 2000, Nat. Med 6: ). Receptor FcγIIIa odgrywa rolę mediowania cytotoksyczności wobec komórek nowotworowych myszy (Clynes et al, 1998, PNAS 95: ). Polimorfizm genu FCGR3A kodującego receptor FcγIIIa, który ma resztę waliny w pozycji 158 zamiast fenyloalaniny, wiąże IgG mocniej i daje zwiększoną aktywność ADCC na komórkach NK (Wu i wsp., 1997, J Clin Invest 100: ). Ten genotyp genu FCGR3A, FCGR3A-158V/V, ma pozytywny wpływ na odpowiedź pacjenta na rytuksymab w przypadku chłoniaka nieziarniczego (Cartron i wsp., 2002, Blood 99: ), makroglobulinemia Waldenstroma (Treon i wsp., 2005, J Clin Oncol 23: ) i WO2004/ podaje wytwarzanie IgG w mleku transgenicznych ssaków. WO2004/ zapewnia sposób wytwarzania mieszaniny przeciwciał z jednego klonu komórek gospodarza. Choroby autoimmunologiczne, toczeń rumieniowaty układowy (SLE) (Anolik i wsp., 2003, Arthritis Rheum 48, ). Ten sam polimorfizm jest również powiązany z lepszą odpowiedzią biologiczną w chorobie Crohna w stosunku do innego przeciwciała, infliksymabu (Louis i wsp., 2004, A Phar Ther 19: ). Wyniki te ilustrują, że ADCC odgrywa znaczącą rolę w działaniu terapeutycznym przeciwciał monoklonalnych u ludzi. Zwiększenie zdolności przeciwciał terapeutycznych w celu ułatwienia aktywność ADCC, w związku z tym ma potencjalną wartość terapeutyczną.

3 2 [0005] Przeciwciała ludzkie mają dwa miejsca glikozylacji, jedno na każdym z identycznych łańcuchów ciężkich. Wczesne doświadczenia z użyciem inhibitorów glikozylacji i przetwarzania węglowodanów dowiodły, że przeciwciała wytwarzane w hamowanych klonach hybrydom wykazywały wzmocnioną aktywność ADCC (Rothman, 1989). Dodatkowe badania wykazały, że zarówno na stan glikozylacji, jak i aktywność ADCC przeciwciała wpływa linia komórkowa, w której wytwarzano przeciwciało (Lifely, 1995). Kilka grup badawczych pokazało, że przeciwciała pozbawione 1,6-fukzoy na ich glikozylacji ciężkiego łańcucha, mają wzmocnione powinowactwo do receptora FcγRIII i zwiększoną aktywność ADCC (Shields i wsp., 2002; Shinkawa et al, 2002). Ponadto ustalono korelację pomiędzy powinowactwem wiązania do receptora FcγRIII i aktywnością ADCC (Okazaki, 2004; Dall'Ozzo, 2004). [0006] Wygenerowano linie komórkowe, które wykazują niedobór 'FUT8', alfa-1,6 fukozylotransferazy, która katalizuje przeniesienie tej fukozy. Te komórki z nokautem mogą być wykorzystane do wytwarzania przeciwciał o wyższej aktywności ADCC. Na przykład otrzymano komórki jajnika chomika chińskiego (CHO) z niedoborem FUT8 (Yamane- Ohnuki i wsp., 2004). Mały interferujący RNA (sirna) została również wykorzystany do zablokowania ekspresji genu FUT8 (Mori i wsp., 2004). Linia komórkowa szczura zostały wykorzystane do wytworzenia przeciwciał o zwiększonej aktywności ADCC (Niwa i wsp., 2004, 2005). Obok swojej wysokiej aktywności, IgG1 o niskiej zawartości fukozy nie zależy od polimorfizmu FcγRIII, tym samym nie występuje różnica widziana dla trastuzumabu lub rytuksymabu w komórce typu dzikiego (Niwa i wsp., 2004b, Vol 10 Clin Canc Res). [0007] Mimo, że przeciwciała zostały wytworzone wcześniej w różnych układach ekspresyjnych, nie została wcześniej rozpoznana wzmocniona aktywność ADCC przeciwciała wytwarzanego w ssaczych komórkach nabłonkowych gruczołu sutkowego takich, jak w ssaczych komórkach nabłonkowych gruczołu sutkowego transgenicznego zwierzęcia zaprojektowanego metodami inżynierii genetycznej do wydzielania przeciwciała w jego mleku. STRESZCZENIE WYNALAZKU [0008] Stwierdzono, że przeciwciała wytwarzane w ssaczych komórkach nabłonkowych gruczołu sutkowego tak, jak w ssaczych komórkach nabłonkowych gruczołu sutkowego transgenicznego zwierzęcia zaprojektowanego metodami inżynierii genetycznej do wydzielania przeciwciała w jego mleku, mają wzmocnioną aktywność ADCC i zwiększone wiązanie do CD16 w porównaniu do materiału pochodzącego z hodowli komórkowej. Badania nad glikozylacją przeciwciał pochodzących z mleka ujawniły niższą zawartość fukozy przeciwciał pochodzących z mleka. W związku z tym przeciwciała i ich kompozycje są tu opisane. Przeciwciała opisują te wytworzone w komórkach nabłonka gruczołu sutkowego ssaków. Opisane są również sposoby wytwarzania przeciwciał, jak również sposoby ich zastosowania. [0009] Przeciwciała o wzmocnionej aktywności ADCC są wytwarzane poprzez ekspresję przeciwciał w komórkach nabłonkowych gruczołu sutkowego ssaków. W jednym przykładzie

4 3 wykonania komórki nabłonka gruczołu sutkowego ssaków są tym należącymi do transgenicznego, niebędącego człowiekiem ssaka, zaprojektowanego metodami inżynierii genetycznej w celu ekspresji przeciwciał w jego mleku. W innym przykładzie wykonania komórki nabłonka gruczołu sutkowego są komórkami w hodowli transfekowanymi konstruktem kwasu nukleinowego (np. DNA) kodującym sekwencję dla przeciwciała i mogą powodować ekspresję przeciwciała w komórkach nabłonka gruczołu sutkowego. [0010] Wynalazek odnosi się do zastrzeżenia 1. [0011] Opisujemy również, kompozycję zawierającą przeciwciała pochodzące z komórek nabłonkowych gruczołu sutkowego (lub przeciwciało), przy czym zapewnione są przeciwciała wykazujące wzmocnioną aktywność zależnej od przeciwciał cytotoksyczności komórkowej (ADCC). Opisujemy również kompozycję zawierającą przeciwciała pochodzące z mleka (lub przeciwciało), przy czym przeciwciała pochodzące z mleka wykazują wzmocnioną aktywność zależnej od przeciwciał cytotoksyczności komórkowej (ADCC). W jednym przykładzie wykonania aktywność ADCC przeciwciał jest przynajmniej dwa razy wyższa niż aktywność ADCC przeciwciał pochodzących z hodowli komórkowej. W innym przykładzie wykonania aktywność ADCC przeciwciał jest przynajmniej trójkrotnie, czterokrotnie, pięciokrotnie, siedmiokrotnie lub dziesięciokrotnie wyższa niż aktywność ADCC przeciwciał pochodzących z hodowli komórkowej. W jednym przykładzie wykonania mleko, z którego otrzymuje się przeciwciała pochodzące z mleka, jest mlekiem od niebędącego człowiekiem, transgenicznego ssaka zaprojektowanego metodami inżynierii genetycznej do ekspresji przeciwciała. [0012] Zgodnie z jednym z aspektów tego wynalazku, wiązanie regionu Fc przeciwciał IgG1 jest wzmacniane, jeśli przeciwciało pozbawione jest fukozy rdzenia przyłączonej do miejsca glikozylacji Asn297 w regionie Fc (np. fukoza przyłączona do podstawy struktury biannetarnej). Opisane tu przeciwciała w niektórych aspektach są pozbawione fukozy rdzenia. Przeciwciała monoklonalne wytworzone w mleku w innych aspektach są w przewadze strukturami z wysoką zawartością mannozy i strukturami hybrydowymi. Ogólnie rzecz biorąc, opisane tu przeciwciała mogą wiązać się mocniej do receptora FcRIII i mogą prowadzić do wzmocnionej ADCC. [0013] Opisujemy również przeciwciała, które zostały zmodyfikowane, aby mieć przewidziany tu wzór glikozylacji i w związku z tym wzmocniona aktywność ADCC. Modyfikacja jest wynikiem wytwarzania przeciwciała, które jest eksprymowane w komórkach nabłonka gruczołu sutkowego zapewnionych tu ssaków. [0014] Przeciwciała zapewnionych kompozycji mogą być jednorodne lub niejednorodne pod względem ich glikozylacji. [0015] W jednym przykładzie wykonania przynajmniej jeden łańcuch przeciwciał zmodyfikowano tak, aby nie zawierał on fukozy. W innym przykładzie wykonania jeden łańcuch przeciwciał zmodyfikowano tak, aby nie zawierał on fukozy. W jeszcze innym przykładzie wykonania fukozą, której przynajmniej jeden łańcuch przeciwciał nie zawiera jest 1,6-fukoza. W innym przykładzie wykonania jeden lub przynajmniej jeden łańcuch

5 4 przeciwciał zmodyfikowano aby nie zawierał fukozy, ale przeciwciała również zmodyfikowano aby zawierały oligomannozę lub dodatkową oligomannozę. Łańcuch, który zawiera oligomannozę może być tym samym łańcuchem, który nie zawiera fukozy, ale nie musi być tak. W innym przykładzie wykonania sekwencję aminokwasową przeciwciał zmodyfikowano i następnie wyeksprymowano w komórkach nabłonka gruczołu sutkowego ssaków. W jednym przykładzie wykonania zmodyfikowano sekwencję aminokwasową przeciwciał. W innym przykładzie wykonania sekwencja aminokwasowa przeciwciał takich, jak przeciwciała anty-cd137, wykazuje substytucję aminokwasową Asn297. W dalszym przykładzie wykonania substytucja odbywa się aminokwasem, który nie będzie fukozylowany. W innym przykładzie wykonania Asn297 podstawia się Gln. [0016] W innym przykładzie wykonania zapewnione przeciwciała zmodyfikowano aby zawierały oligomannozę lub dodatkową oligomannozę. W innym przykładzie wykonania przeciwciała zmodyfikowano tak, że przynajmniej 30% przeciwciał zawiera przynajmniej jedną oligomannozę. W innym przykładzie wykonania przeciwciała zmodyfikowano tak, że przynajmniej 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% lub więcej przeciwciał zawiera przynajmniej jedną oligomannozę. W dalszym przykładzie wykonania przeciwciała zmodyfikowano tak, że mniej niż 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, lub mniej przeciwciał nie zawiera fukozy na jednym lub przynajmniej jednym łańcuchu. W jeszcze dalszym przykładzie wykonania przeciwciała zmodyfikowano tak, że przynajmniej 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% lub więcej przeciwciał zawiera przynajmniej jedną oligomannozę i mniej niż 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, lub mniej przeciwciał zawiera fukozę na jednym lub przynajmniej jednym łańcuchu. [0017] W innym przykładzie wykonania węglowodany przeciwciał zmodyfikowano celem wykazywania wysokomannozowego wzoru glikozylacji. W jeszcze dalszym przykładzie wykonania przeciwciała zmodyfikowano tak, że przynajmniej jeden łańcuch przeciwciał zawiera oligomannozę i jest niefukozylowany. W jeszcze innym przykładzie wykonania przeciwciała zmodyfikowano tak, że główny węglowodan przeciwciał jest niefukozylowany. W jednym przykładzie wykonania główny węglowodan jest niefukozylowaną oligomannozą. W innym przykładzie wykonania główny węglowodan jest niefukozylowaną Man5. W jeszcze innym przykładzie wykonania przeciwciała zmodyfikowano tak, że mniej niż 40% węglowodanów przeciwciał zawiera fukozę. W jeszcze innym przykładzie wykonania przeciwciała zmodyfikowano tak, że mniej niż 30%, 20%, 10% lub mniej węglowodanów przeciwciał zawiera fukozę. W jednym przykładzie wykonania fukozą jest 1,6-fukoza. W innym przykładzie wykonania przeciwciała zmodyfikowano tak, że przynajmniej 60% węglowodanów przeciwciał jest niefukozylowaną oligomannozą i mniej niż 40% węglowodanów przeciwciał zawiera fukozę. W dalszym przykładzie wykonania przeciwciała zmodyfikowano tak, że 63% węglowodanów przeciwciał jest niefukozylowaną oligomannozą, 16% węglowodanów przeciwciał zawiera fukozę rdzenia G1F i 21% węglowodanów przeciwciał zawiera fukozę rdzenia G2F. [0018] W innym aspekcie tego wynalazku przeciwciała o wzmocnionej aktywności ADCC nie są w rzeczywistości modyfikowane za pomocą zapewnionych tu środków, ale są przeciwciałami wybranymi dla powyższych wzorów glikozylacji

6 5 [0019] W jednym przykładzie wykonania przeciwciała są przeciwciałami monoklonalnymi. W innym przykładzie wykonania przeciwciała są przeciwciałami poliklonalnymi. W dalszym przykładzie wykonania przeciwciała są przeciwciałami chimerycznymi, przeciwciałami humanizowanymi lub całkowicie ludzkimi przeciwciałami. W innym przykładzie wykonania przeciwciała są przeciwciała pełnej długości. W jeszcze innym przykładzie wykonania przeciwciała są pełnej długości przeciwciałami jednołańcuchowymi. W jeszcze innym przykładzie wykonania pełnej długości przeciwciało zawiera łańcuch ciężki i łańcuch lekki. W dalszych przykładach wykonania przeciwciała są fragmentami przeciwciał. W jeszcze dalszym przykładzie wykonania fragmenty przeciwciał są częścią polipeptydów fuzyjnych Fc. [0020] W innym aspekcie tego wynalazku przeciwciała są kodowane przez konstrukt DNA transgenu obejmujący region Fc zawierający N-połączone oligosacharydy. W jednym przykładzie wykonania przeciwciała są wytwarzane w mleku zwierzęcia transgenicznego niebędącego człowiekiem. W jeszcze innym przykładzie wykonania przeciwciała mają opisany tu wzór glikozylacji. [0021] Przeciwciała są izotypu IgG. W jednym przykładzie wykonania przeciwciała są izotypu IgG1 lub IgG2. W dalszym przykładzie wykonania przeciwciała są fragmentami przeciwciał. W innym aspekcie tego wynalazku zapewnione są przeciwciała będące humanizowanymi wersjami przeciwciał o ulepszonych właściwościach (np. właściwości ADCC). [0022] Przeciwciała mogą być skierowane przeciwko antygenowi. W jednym przykładzie wykonania przeciwciała są skierowane przeciwko CD3, CD4, CD5, CD8, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD32B, CD30, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD46, CD52, CD54, CD59, CD74, CD80, CD126, CD138, CD137 lub GPIIbIIIa. W innym przykładzie wykonania przeciwciała skierowane przeciw HM1.24, HLA- DR, MUC1, tenascynie, PIGF, VEGF, onkogenowi, produktowi onkogenu, antygenowi martwicy, antygenowi 17-A1, IL-2, T101, TAC, IL-6, TRAIL-R1, gangliozydowi GD3 lub TRAIL-R2. W jednym przykładzie wykonania przeciwciała są przeciwciałami anty-cd137. [0023] W jakiejkolwiek z zapewnionych tu kompozycji lub sposobów przeciwciałami są przeciwciała anty-cd137. [0024] W jednym przykładzie wykonania kompozycje zawierające zapewnione przeciwciała mogą dalej zawierać farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. W innym przykładzie wykonania zapewnione kompozycje mogą dalej zawierać dodatkowy środek terapeutyczny. W jednym przykładzie wykonania dodatkowy środek terapeutyczny jest środkiem przeciwrakowym lub środkiem immunomodulującym. [0025] Należy zauważyć, że niektóre przykłady wykonania tego wynalazku obejmują kompozycje farmaceutyczne, które zawierają pewną ilość białka transgenicznego będącego przedmiotem zainteresowania, jego proleku, lub farmaceutycznie dopuszczalną sól tego związku lub tego proleku i farmaceutycznie dopuszczalne vehiculum, rozcieńczalnik lub nośnik.

7 6 [0026] Zapewnione kompozycje mogą być stosowane w wielu sposobach leczenia. Opisujemy również sposób leczenia osobnika, obejmujący podawanie osobnikowi, który tego wymaga, zapewnionej tu kompozycji w ilości skutecznej do wzmocnienia ADCC u osobnika. Opisujemy również zapewniony sposób leczenia pacjenta, obejmujący podawanie osobnikowi zapewnionej kompozycji w ilości skutecznej do leczenia choroby, na którą osobnik cierpi lub występuje u niego jej ryzyko. W jednym przykładzie wykonania chorobą jest rak. Szczególne wskazania, przeciwko którym przeciwciała według tego wynalazku mogą zapewnić korzystne efekty terapeutyczne, w niektórych przykładach wykonania, obejmują leczenie guzów litych; czerniaków; jak również raków piersi, jelita grubego, jajnika, nerki, prostaty i płuc. Uważa się, bez ograniczania, że leczenie mogłoby być skutecznie, ponieważ przeciwciała pomogą zapewnić skuteczne leczenie immunomodulujące. [0027] Konkretne cele mogą tym samym obejmować przeciwciała anty-cd3 (np. chłoniak nieziarniczy; choroba autoimmunologiczna - SLE), przeciwciała anty-cd16 (np. FcRIII), przeciwciała anty-cd19 (np. chłoniak nieziarniczy), anty-cd20, anty-cd32b (np. FcRIIB i alergia), anty-cd30 (np. ziarnica złośliwa), anty-gpiibiiia (np. zakrzepica), anty-tnf-a (np. dla reumatoidalnego zapalenia stawów i choroby Crohna), przeciwciała anty-tem dla markerów nowotworowych śródbłonka, (np. do zwalczania angiogenezy - przeciwrakowy), itd. [0028] W innym przykładzie wykonania choroba jest chorobą limfoproliferacyjną. W dalszym przykładzie wykonania chorobą jest choroba autoimmunologiczna. W innym przykładzie wykonania przeciwciała ADCC są skuteczne w leczeniu zapalenia mózgu i rdzenia o podłożu autoimmunologicznym, toczeń rumieniowaty układowy, jak również inne stany chorobowe, w których anty-cd137 może nadawać pewne korzyści. [0029] W jednym przykładzie wykonania ilość podanego przeciwciała osobnikowi wynosi około 0.01 mg/kg/dobę do około 50 mg/kg/dobę. [0030] W innym przykładzie wykonania osobnikowi podaje się dalej dodatkowy środek terapeutyczny. W jednym przykładzie wykonania dodatkowy środek terapeutyczny jest środkiem przeciwrakowym. W innym przykładzie wykonania dodatkowy środek terapeutyczny jest immunomodulatorem. W jednym przykładzie wykonania immunomodulator jest IL-1, IL-2, IL-3, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, IL-21, interferonem, paklitakselem, TNF-α lub ich kombinacją. W innym przykładzie wykonania osobnikowi podaje się dalej IL-2. W innym przykładzie wykonania osobnikowi podaje się dalej IL-12. W dalszym przykładzie wykonania osobnikowi podaje się dalej środek przeciwrakowy i immunomodulator. W jednym przykładzie wykonania osobnikowi podaje się dalej immunomodulator i trastuzumab. W jeszcze innym przykładzie wykonania osobnikowi podaje się dalej IL-21 i trastuzumab. W jednym przykładzie wykonania przeciwciało anty- CD137 pochodzące z komórek nabłonka gruczołu sutkowego jest stosowane w połączeniu z IL-21 i trastuzumabem. W innym przykładzie wykonania przeciwciało anty-cd 137 jest wysokomannozowym przeciwciałem pozbawionym fukozy rdzenia. Dlatego, przeciwciała w niektórych przykładach wykonania stosuje się z modulatorem immunologicznym, który jest skuteczny w zmniejszaniu guzów litych i zapobieganiu ich ponownemu. W innych

8 7 przykładach wykonania przeciwciała są stosowane z innymi terapeutycznych środkami antyrakowymi takimi, jak IL-21, IL-12 i/lub trastuzumab. [0031] Osobnik może być dowolnym osobnikiem, w którym pożądana jest aktywność ADCC. W jednym przykładzie wykonania osobnik jest człowiekiem. W innym przykładzie wykonania osobnik jest psem, kotem, koniem, krową, świnią, owcą, kozą, albo naczelnym. [0032] Pokazane są również sposoby wytwarzania przeciwciał o wzmocnionej aktywności ADCC przez zmodyfikowanie przeciwciała. Sposoby te obejmują modyfikowanie glikozylacji przeciwciał przez wytwarzanie przeciwciała w komórkach nabłonka gruczołu sutkowego ssaków. W jednym przykładzie wykonania komórki nabłonka gruczołu sutkowego ssaków należą do niebędącego człowiekiem ssaka zaprojektowanego metodami inżynierii genetycznej do ekspresji przeciwciała w jego mleku. W jeszcze innym przykładzie wykonania komórki nabłonka gruczołu sutkowego ssaków są komórki nabłonka gruczołu sutkowego ssaków w hodowli. [0033] Opisujemy również sposób wytwarzania transgenicznego przeciwciała, oraz jego wariantów i fragmentów, przy czym proces obejmuje ekspresję, w mleku transgenicznego ssaka niebędącego człowiekiem transgenicznej, przeciwciała kodowanego konstruktem kwasu nukleinowego. W jednym przykładzie wykonania sposób wytwarzania przeciwciał według tego wynalazku obejmuje: (a) transfekowanie komórek ssaka niebędącego człowiekiem konstruktem DNA transgenu kodującym pożądane przeciwciało transgeniczne; (b) wybranie komórek, w których ten konstrukt DNA transgenu został wstawiony do genomu komórek; oraz (c) wykonanie pierwszej procedury jądrowego transferu celem wytworzenia heterozygoty transgenicznego ssaka niebędącego człowiekiem dla pożądanego przeciwciała transgenicznej i który może eksprymować je w jego mleku. [0034] W innym przykładzie wykonania sposób obejmuje: (a) zapewnienie niebędącego człowiekiem transgenicznego ssaka zaprojektowanego metodami inżynierii genetycznej celem ekspresji przeciwciała, (b) eksprymowanie przeciwciała w mleku transgenicznego ssaka niebędącego człowiekiem; oraz (c) izolowanie przeciwciała eksprymowanego w mleku. [0035] W innych przykładach wykonania sposoby te obejmują dalej etapy wywoływania laktacji i/lub etapy określania aktywności ADCC otrzymanych przeciwciał. W jeszcze dalszych przykładach wykonania sposoby te obejmują dalej dodatkowe etapy izolowania i/lub oczyszczania. W jeszcze innych przykładach wykonania sposoby te obejmują dalej etapy porównywania aktywności ADCC otrzymanych przeciwciał z przeciwciałami wytworzonymi w hodowli komórkowej. W dalszych przykładach wykonania sposoby te obejmują dalej etapy porównywania aktywności ADCC otrzymanych przeciwciał do przeciwciał wytworzonych

9 8 przez komórki niebędące nabłonkiem gruczołu sutkowego. Takie komórki mogą być komórkami w hodowli komórkowej. [0036] Przeciwciała można otrzymać, w niektórych przykładach wykonania, przez zebranie przeciwciał z mleka, wytworzonego tu transgenicznego zwierzęcia, lub od potomstwa tego transgenicznego zwierzęcia. [0037] W niektórych przykładach wykonania konstrukt kodujący pożądane przeciwciało (lub polipeptyd fuzji przeciwciała) jest uruchamiany przez przynajmniej jeden promotor betakazeiny. W innych przykładach wykonania transgenicznym ssakiem niebędącym człowiekiem jest kopytny. W jeszcze dalszych przykładach wykonania transgenicznym ssakiem niebędącym człowiekiem jest koza. [0038] W niektórych przykładach wykonania przeciwciała wytworzone przez transgenicznego ssaka są wytwarzane na poziomie przynajmniej 1 gram na litr wytworzonego mleka. [0039] W innym aspekcie opisany jest sposób wzmacniania aktywności ADCC przeciwciała, obejmujący modyfikowanie glikozylacji przeciwciała za pomocą zapewnionych tu sposobów. W jednym przykładzie wykonania przeciwciało modyfikuje się tak, że przynajmniej jeden łańcuch przeciwciała nie zawiera fukozy. W innym przykładzie wykonania przeciwciało modyfikuje się tak, że jeden łańcuch przeciwciała nie zawiera fukozy. W jeszcze innym przykładzie wykonania przeciwciało modyfikuje się tak, że zawiera ono oligomannozę lub dodatkową oligomannozę. W jeszcze innym przykładzie wykonania przeciwciało modyfikuje się tak, że zawiera ono oligomannozę lub dodatkową oligomannozę. [0040] W jeszcze innym przykładzie wykonania przeciwciała modyfikuje się tak, że węglowodany przeciwciał wykazują wysokomannozowy wzór glikozylacji. W jednym przykładzie wykonania przeciwciała modyfikuje się tak, że przynajmniej jeden łańcuch przeciwciał zawiera oligomannozę i jest niefukozylowany. W innym przykładzie wykonania przeciwciała modyfikuje się tak, że jeden łańcuch przeciwciał zawiera oligomannozę i jest niefukozylowany. W dalszym przykładzie wykonania przeciwciała modyfikuje się tak, że główny węglowodan przeciwciał nie jest fukozylowany. W jednym przykładzie wykonania główny węglowodan jest niefukozylowaną oligomannozą. W innym przykładzie wykonania główny węglowodan jest niefukozylowaną Man5. W jeszcze innym przykładzie wykonania przeciwciała modyfikuje się tak, że mniej niż 40% węglowodanów przeciwciał zawiera fukozę. W jednym przykładzie wykonania przeciwciała modyfikuje się tak, że mniej niż 30%, 20%, 10% lub mniej węglowodanów przeciwciał zawiera fukozę. W jeszcze dalszym przykładzie wykonania przeciwciała modyfikuje się tak, że przynajmniej 30% przeciwciał ma przynajmniej jedną oligomannozę. W jednym przykładzie wykonania przeciwciała modyfikuje się tak, że przynajmniej 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% lub więcej przeciwciał have przynajmniej jedną oligomannozę. W jeszcze innym przykładzie wykonania przeciwciała modyfikuje się tak, że przynajmniej 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% lub więcej przeciwciał zawiera przynajmniej jedną oligomannozę i mniej niż 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, lub mniej przeciwciał zawiera fukozę na jednym lub przynajmniej jednym

10 9 łańcuchu. W innym przykładzie wykonania przeciwciała modyfikuje się tak, że przynajmniej 60% węglowodanów przeciwciał jest niefukozylowaną oligomannozą i mniej niż 40% węglowodanów przeciwciał zawiera fukozę. W dalszym przykładzie wykonania przeciwciała modyfikuje się tak, że 63% węglowodanów przeciwciał jest niefukozylowaną oligomannozą, 16% węglowodanów przeciwciał zawiera fukozę rdzenia G1F i 21% węglowodanów przeciwciał zawiera fukozę rdzenia. [0041] Opisujemy również sposób wytwarzania przeciwciała, obejmujący zbieranie przeciwciała z mleka transgenicznego, niebędącego człowiekiem ssaka zaprojektowanego metodami inżynierii genetycznej do ekspresji przeciwciała w jego mleku i zapewnione jest określenie aktywności ADCC przeciwciała. W jednym przykładzie wykonania sposób ten obejmuje dalej porównywanie aktywności ADCC zebranego przeciwciała z aktywnością ADCC przeciwciała wyeksprymowanego w hodowli komórkowej. W innym przykładzie wykonania transgenicznym, niebędącym człowiekiem ssakiem jest koza, owca, bizon, wielbłąd, krowa, świnia, królik, bawół, koń, szczur, mysz lub lama. [0042] Opisujemy również sposób wytwarzania przeciwciała, obejmujący zbieranie przeciwciała z nabłonkowych komórek gruczołu sutkowego zaprojektowanych metodami inżynierii genetycznej do ekspresji przeciwciała i zapewnione jest określenie aktywności ADCC przeciwciała. W jednym przykładzie wykonania sposób ten obejmuje dalej porównywanie aktywności ADCC zebranego przeciwciała z aktywnością ADCC przeciwciała wyeksprymowanego w komórkach nabłonka nie będących komórkami gruczołu sutkowego. [0043] Opisujemy również, zapewniony jest sposób obejmujący otrzymywanie przeciwciał jak w zapewnionych tu sposobach i porównywanie aktywności ADCC przeciwciał do innego zestawu przeciwciał. W jednym przykładzie wykonania innym zestawem przeciwciał są przeciwciała otrzymane z hodowli komórkowej. W innym przykładzie wykonania innym zestawem przeciwciał są przeciwciała otrzymane z komórek nabłonka nie gruczołu sutkowego w hodowli. W dalszym przykładzie wykonania innym zestawem przeciwciał są przeciwciała otrzymane z nabłonkowych komórek gruczołu sutkowego w hodowli. W jeszcze innym przykładzie wykonania innym zestawem przeciwciał są przeciwciała otrzymane z płynu ustrojowego lub tkanki. W jeszcze dalszym przykładzie wykonania innym zestawem przeciwciał są przeciwciała otrzymane z mleka ssaka. W jednym przykładzie wykonania ssak jest niebędącym człowiekiem transgenicznym ssakiem zaprojektowanym metodami inżynierii genetycznej w celu ekspresji innego zestawu przeciwciał w jego mleku. [0044] Każde z ograniczeń tego wynalazku może obejmować różne przykłady wykonania tego wynalazku. Tak więc, w związku z tym, oczekuje się, że każde z ograniczeń tego wynalazku dotyczących jakiejkolwiek jednego elementu lub kombinacji elementów można zawrzeć w każdym aspekcie tego wynalazku. KRÓTKI OPIS RYSUNKÓW [0045] Fig. 1 dostarcza widma MALDI-TOF N-połączonych oligosacharydów z glikozylowanego przeciwciała anty-cd137. Glikany uwolniono PNGazą F. Fig. 1A

11 10 dostarcza widmo dla przeciwciała pochodzącego z mysiego mleka; Fig. 1B dostarcza widmo przeciwciała pochodzącego z hodowli komórkowej; Fig. 1C dostarcza widmo przeciwciała pochodzącego z mleka koziego. Fig. 2 dostarcza porównania map oligosacharydów otrzymanych za pomocą HPLCC z detekcją fluorescencyjną (znakowane 2-AA) uwolnionych oligosacharydów z glikozylowanych przeciwciał. Fig. 2A dostarcza porównania z przeciwciałem pochodzącym z mleka mysiego; Fig. 2B dostarcza porównania z przeciwciałem pochodzącym z mleka mysiego traktowanego Endo H; Fig. 2C dostarcza porównania z przeciwciałem pochodzącym z hodowli komórkowej; Fig. 2D dostarcza porównania z przeciwciałem pochodzącym z hodowli komórkowej traktowanego Endo H; Fig. 2E dostarcza porównania z przeciwciałem pochodzącym z mleka koziego; Fig. 2F dostarcza porównania z przeciwciałem pochodzącym z mleka koziego traktowanego Endo H. Fig. 3 ilustruje wrażliwość na Endo H głównych oligosacharydów uwolnionych z przeciwciała anty-cd137 pochodzącego z mleka mysiego. Próbkę z Fig. 2 poddano działaniu przez noc Endo H. Fig. 3A dostarcza wyniki dla przeciwciała pochodzącego z mysiego mleka; Fig. 3B dostarcza wyniki dla przeciwciała pochodzącego z mysiego mleka traktowanego Endo H; Fig. 3C dostarcza wyniki przeciwciała pochodzącego z hodowli komórkowej; Fig. 3D dostarcza wyniki przeciwciała pochodzącego z hodowli komórkowej traktowanego Endo H. Fig. 4 pokazuje wiązanie konkanawaliny A (Con A) przeciwciał. Przeciwciało z oczyszczonym białkiem A załadowano na kolumnę Con A i eluowano buforem zawierającym alfa metylomannozydazę. Frakcje monitorowano przez pomiar absorbancji przy długości fali 280 nm. Fig. 4A przedstawia wyniki dla glikozylowanego przeciwciała anty-cd137 na kolumnie Con A; Fig. 4B przedstawia wyniki dla nieglikozylowanego przeciwciała anty-cd137 na kolumnie Con A. Fig. 5 przedstawia wiązanie przeciwciał do komórek 786-O. Wiązanie każdego przeciwciała zmierzono analizą FACS i nałożono na przeciwciało będące kontrolą negatywną (anty-2,4-dinitrofenol (DNP)) i anty-her2. Fig. 5A przedstawia wyniki z aglikozylowanym przeciwciałem pochodzącym z mleka mysiego; Fig. 5B przedstawia wyniki z glikozylowanym przeciwciałem pochodzącym z mleka mysiego; Fig. 5C przedstawia wyniki z glikozylowanym przeciwciałem pochodzącym z hodowli komórkowej; Fig. 5D przedstawia wyniki z glikozylowanym przeciwciałem pochodzącym z mleka koziego. Fig. 6 ilustruje wzmocnione zabijanie komórek 786-O przez przeciwciało pochodzące z mleka w teście ADCC. Kwadraty: pochodzące z mleka myszy; odwrócone trójkąty: pochodzące z kozy; romby: pochodzące z hodowli komórkowej; kółka: aglikozylowane pochodzące z mleka myszy; niewypełnione kwadraty: trastazumab; trójkąty: przeciwciało anty-dnp.

12 11 Fig. 7 zawiera ogólny schemat konstrukcji transgenu dla ekspresji mleka przeciwciał. Gen będący przedmiotem zainteresowania zastępuje region kodujący z beta-kazeinę kozy, specyficzny gen mleka. 6.2 kb region promotora jest połączony do regionów kodujących łańcuchów IgG albo H, albo L IgG, a następnie przez nieulegające translacji kozie sekwencje 3 beta kazeiny i leżące poniżej elementy. Czarne pola: eksony H i L; Zakreskowane pola: genomowe introny; strzałki: kierunek transkrypcji. Fig. 8 przedstawia podział węglowodanów obecnych lub nieobecnych na przeciwciałach wytworzonych przez zwierzęta transgeniczne. Fig. 9 stanowi ogólny schemat na przykład sposobu produkcji. Fig. 10 przedstawia model wypełnienia przestrzeni przeciwciała pokazujący fizyczne położenie fukozy rdzenia. Fig. 11 przedstawia wiązanie przeciwciał do komórek CHO eksprymujących CD137. Fig. 11A dostarcza wyniki dla komórek CHO bez CD137 (kontrola negatywna); Fig. 11B dostarcza wyniki dla komórek CHO eksprymujących CD137. Linia ciągła na każdym wykresie jest dla barwienia nieistotnym przeciwciałem anty-dnp. Fig. 12 ilustruje zwiększone zabijanie komórek CHO eksprymujących CD137 przez przeciwciało pochodzące z mleka w teście ADCC. Fig. 13 zapewnia wyniki dla analizy biosensorycznej wiązania IgG1-sFcgRIIIa. Fig. 13A przedstawia wyniki z przeciwciałem z mleka koziego; Fig. 13B przedstawia wyniki z przeciwciałem z mleka mysiego; Fig.13C przedstawia wyniki z przeciwciałem z hodowli komórkowej; Fig. 13D przedstawia wyniki z aglikozylownaym przeciwciałem z mleka mysiego. Fig. 14 przedstawia zestaw zawierający przeciwciało o wzmocnionej aktywności ADCC. SZCZEGÓŁOWY OPIS [0046] Odkryto, że przeciwciała wytworzone w mleku transgenicznych zwierząt mają wzmocnioną aktywność ADCC względem rekombinowanego przeciwciała wytworzonego przez hodowlę komórkową in vitro. Wzór glikozylacji przeciwciał, które mają wzmocnioną aktywność ADCC również został oceniony. Zapewniono kompozycje przeciwciał wytworzonych komórkach nabłonkowych gruczołu sutkowego, jak i sposoby ich wytwarzania oraz zastosowanie. Wynalazek odnosi się do zastrzeżenia 1. [0047] Przeciwciała mają wzmocnioną aktywność ADCC. W stosowanym tu kontekście, wzmocniona aktywność ADCC ma odnosić się do przeciwciała lub jego kompozycji, które wykazują wyższą aktywność ADCC, gdy jest wytwarzane sposobem, który zmienia wzór glikozylacji, niż gdy jest wytwarzane sposobem, który nie zmienia wzoru glikozylacji lub niż posiada ono poziom aktywności ADCC przed zmianą zapewnionego tu wzoru glikozylacji. Przeciwciała o wzmocnionej aktywności ADCC obejmują te, które przed zmianą nie wykazywały żadnej aktywności ADCC. W stosowanym tu kontekście, wzór glikozylacji odnosi się do zestawu węglowodanów, który jest obecny na indywidualnym przeciwciele lub

13 12 na grupie przeciwciał. Zmiany wzoru glikozylacji można przeprowadzić przez zmianę glikozylacji jednego przeciwciała lub grupy przeciwciał. Zmiana wzoru glikozylacji kompozycji przeciwciał ma obejmować przypadki, w których zmieniona została glikozylacja indywidualnego przeciwciała, zestawu przeciwciał w kompozycji lub wszystkich przeciwciał w kompozycji. Wzór glikozylacji można określić wieloma sposobami znanymi w tej dziedzinie. Na przykład, sposoby analizy węglowodanów na białka opisano w zgłoszeniu patentowym US numer seryjny 11/ i numer seryjny 11/ [0048] Glikozylacja jest ważna dla prawidłowego fałdowania, ukierunkowania, bioaktywności i klirensu terapeutycznych glikoprotein. Wraz z rozwojem, na przykład, zwierząt transgenicznych jako układów ekspresyjnych, zauważono, że różne tła genetyczne skutkują różnymi poziomach glikozylacji i ekspresji wytworzonych białek. Glikozylacja białek pochodzenia transgenicznego, wyizolowanych z mleka koziego jest inna niż w przypadku białek zebranych z hodowli komórkowej (Denman i wsp., 1991). W transgenicznie produkowanej antytrombinie ludzkiej, typ glikozylacji jest zależny od miejsca. Fukozylowane, sialowane oligosacharydy występują w pozycjach Asn96 i Asn192, podczas gdy Asn155 miał oligosacharyd oligomannozę (Edmunds i wsp., 1998). Zależna od miejsca glikozylacja występowała również w interferonie gamma wytworzonym w mleku mysim (James i wsp., 1995). [0049] Glikozylowanie jest post-translacyjną modyfikacją, która można wytwarzać wiele finalnych postaci białka w stanie naturalnym. Cząsteczki IgG są glikozylowane przy reszcie Asn 297 domeny CH2, w regionie Fc. Określone zmiany struktury węglowodanowej mogą również wpływać na funkcję przeciwciała lub skuteczność terapeutyczną. Na przykład, w chorobach takich, jak reumatoidalne zapalenie stawów, udokumentowano wyższą niż normalna częstość występowania struktur agalaktozylowych (co wydaje się być specyficzne dla węglowodanu Ig związanego z Fc) (Parekh i wsp. 1985; Rademacher i wsp. 1988a). Uważa się, że ta aglykozylowana struktura jest bardziej ruchliwa od struktury zwykle widocznej w tym regionie i tym samym może ona wywołać zmiany w czwartorzędowej strukturze glikoproteiny, przyczyniając się do immunogenności przeciwciała lub może sama przyczynić się do nieprawidłowej funkcji przeciwciał (Rademacher i wsp. 1988b; Axford i wsp. 1992). W stanie chorobowym jednakże struktura ta jest tylko jedną z wielu obserwowanych postaci cukrowych. [0050] W niektórych przykładach wykonania zapewnione tu przeciwciała mają przynajmniej dwukrotnie wyższą aktywność ADCC niż aktywność ADCC przeciwciał pochodzących z hodowli komórkowej komórek nie nabłonka gruczołu sutkowego. W innych przykładach wykonania glikozylację przeciwciał modyfikuje się za pomocą zapewnionych sposobów, a aktywność ADCC zmodyfikowanych przeciwciał jest przynajmniej dwa razy wyższa niż aktywność ADCC niezmodyfikowanej wersji tego samego przeciwciała. W niektórych przykładach wykonania przeciwciała mają przynajmniej 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 10-, 15-, 20-, 25- lub 30-krotnie wyższą aktywność ADCC. Zapewnione przeciwciała otrzymuje się z ekspresji w komórkach nabłonka gruczołu sutkowego ssaków. Takie przeciwciała są również tu określane jako przeciwciała pochodzące z komórek nabłonkowych gruczołu sutkowego. W

14 13 niektórych przykładach wykonania przeciwciała otrzymuje się z ekspresji w mleku zwierzęcia transgenicznego niebędącego człowiekiem. Takie przeciwciała są również tu określane jako przeciwciała pochodzące z mleka. W stosowanym tu kontekście, transgeniczny odnosi się do komórki, która zawiera cząsteczkę kwasu nukleinowego, który został stawiony sztucznie do komórki, lub jej przodka i staje się częścią genomu zwierzęcia, które rozwija się z tej komórki. Określenie to jest również stosowane w odniesieniu do zwierząt, które miały cząsteczki kwasu nukleinowego, który został wstawiony sztucznie do ich komórek lub genomu. [0051] Generalnie, w niektórych przykładach wykonania glikozylacja wykazuje wysokomannozowy wzór glikozylacji. W stosowanym tu kontekście, wysokomannozowy wzór glikozylacji ma odnosić się do przeciwciała, które zawiera przynajmniej jedną oligomannozę lub kompozycji przeciwciał, przy czym przynajmniej 30% przeciwciał zawiera przynajmniej jedną oligomannozę. W niektórych przykładach wykonania przynajmniej 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% lub więcej węglowodanów przeciwciał są oligomannozą. W niektórych przykładach wykonania przynajmniej 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% lub więcej węglowodanów przeciwciał są niefukozylowaną oligomannozą. W innych przykładach wykonania mniej niż 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% lub mniej węglowodanów przeciwciał zawiera fukozę. W jeszcze dalszych przykładach wykonania przeciwciała mają niską zawartość fukozy i wysoką oligomannozy. Dlatego, w dalszych przykładach wykonania przynajmniej 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% lub 90% lub więcej węglowodanów przeciwciał jest oligomannozą i mniej niż 50%, 40%, 30%, 20%, 10% lub 5% węglowodanów przeciwciał zawiera fukozę. Dlatego, w jeszcze innym przykładzie wykonania przynajmniej 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% lub 90% lub więcej węglowodanów przeciwciał jest niefukozylowaną oligomannozą i mniej niż 50%, 40%, 30%, 20%, 10% lub 5% węglowodanów przeciwciał zawiera fukozę. Jeden przykład wykonania tego wynalazku odnosi się do przeciwciał o zwiększonej aktywności ADCC, które nie ma cukry 1,6-fukozy na łańcuchu ciężkim. W jednym przykładzie wykonania, wiązanie regionu Fc przeciwciał do receptora FcγRIII występującego na monocytach, makrofagach i komórkach naturalnych zabójców, wzmacnia się, jeśli przeciwciało pozbawione jest fukozy rdzenia występującej przyłączonej do miejsca glikozylacji Asn297 w regionie Fc (np. fukoza przyłączona do podstawy struktury biantenarnej). [0052] Inne przeciwciała o specyficznych wzorach glikozylacji są tu opisane w Przykładach. W stosowanym tu kontekście, gdy omawia się kompozycje przeciwciał, kompozycje te mogą być jednorodne lub niejednorodne pod względem glikozylacji. [0053] Przeciwciała mogą być wybrane pod względem zdolności do wiązania receptorów lub innych białek, takich, jak te biorące udział w procesie chorobowym i/lub ADCC. Przeciwciała mogą być skierowane do każdego markera komórkowego, w którym dostarczenie przeciwciała skierowanego na ten marker i mającego aktywność ADCC zapewniałoby korzyści terapeutyczne. Przeciwciała obejmują te, które mogą wiązać antygeny docelowe takie, jak markery komórek nowotworowych. Przykłady markerów komórkowych i przykładowe rozważane tu choroby obejmują CD3, CD4, CD5, CD8, CD14, CD15, CD16,

15 14 CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD32B, CD30, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD46, CD52, CD54, CD59, CD74, CD80, CD126, CD138, CD137 lub GPIIbIIIa. W niektórych przykładach wykonania przeciwciała mogą być skierowane na HM1.24, HLA-DR, MUC1, tenascynę, PIGF, VEGF, onkogen, produkt onkogenu, antygen martwiczy, antygen 17-A1, IL-2, T101, TAC, IL-6, TRAIL-R1, gangliozyd GD3 lub TRAIL-R2. Inne cele obejmują: przeciwciała anty-cd3 (np. chłoniak nieziarniczy; choroba autoimmunologiczna - SLE), przeciwciała anty-cd16 (np. FcRIII), anty-cd19 (np. chłoniak nieziarniczy), anty- CD20, anty-cd32b (np. FcRIIB i alergia), anty-cd30 (np. ziarnica złośliwa), anty-gpiibiiia (np. Thrombosis), anty-tnf-α (np. dla reumatoidalnego zapalenia stawów i choroby Crohna), przeciwciała anty-tem dla markerów nowotworowych śródbłonka, (np. do zwalczania angiogenezy - przeciwrakowy). Po związaniu do markerów komórek nowotworowych przeciwciała według tego wynalazku mogą rekrutować monocyty, makrofagi i komórki naturalnych zabójców do ataku na komórki nowotworowe. Dlatego przeciwciała o wzmocnionej ADCC, można uznać za modulatory immunologiczne, które mogą być skuteczne do zmniejszania guzów litych i zapobiegania ich nawrotowi. [0054] Szczegółowe badania wykazały, że stymulacja CD 137 przez jego naturalny ligand lub agonistyczne przeciwciała nasilały odpowiedź przeciwnowotworową, która doprowadziła do regresji ustalonych nowotworów myszy w różnych modelach. CD137 (zwany również 4-1BB) jest błonową glikoproteiną, która jest eksprymowana w wielu rodzajach komórek limfoidalnych. Opisano, że agonistyczne przeciwciało monoklonalne przeciwko mysiemu CD137 zmniejsza guzy myszy in vivo i zapobiega ich nawrotowi. Stymulacja CD137 przez jego naturalny ligand lub przeciwciał agonistyczne nasila przeciwnowotworową odpowiedź immunologiczną in vivo poprzez stymulację reaktywnych wobec nowotworu efektorowych komórek T i wzmocnioną aktywność regulacyjną NK. Podawanie ogólnoustrojowe przeciwciał monoklonalnych przeciwmysich CD 137 indukowało całkowitą regresję dużych guzów u myszy takich, jak słabo immunogenny mięsak AGF104A i bardzo rakotwórcza mastocytoma P815, jak i grasiczak EL4, czerniak K1735, mięsak B10.2 i 87, rak nerki RENCA, plazmacytoma J558, mięsak MCA205, rak piersi JC, rak jelita grubego MCA26 i glejak GL261, samodzielnie lub w kombinacji w kombinacji z innymi metodami terapeutycznymi. [0055] Przeciwciało anty-cd137 w jednym przykładzie wykonania tego wynalazku można klonować i wyeksprymować w mleku kilku linii transgenicznych myszy i kóz w postaci genomowego mini-genu. Ekspresja tego genu jest pod kontrolą elementów regulatorowych koziej β-kazeiny. Została ustalona znaczna ekspresja wariantów przeciwciała u zarówno myszy, jak i kozy. W jednym przykładzie wykonania wynalazek zapewnia przeciwciało anty- CD137 o wzmocnionej aktywności ADCC i tym samym zwiększonych właściwościach terapeutycznych. Zgodnie z obecnym wynalazkiem, i wykorzystując przeciwciało anty- CD137 wytworzone przez zwierzęta transgeniczne jako przykład tego wynalazku, opracowano agonistę anty-cd137 chimeryczne nieludzkie:ludzkie przeciwciało monoklonalne (tj. mysie:ludzkie). Oczekuje się, że humanizacja przeciwciała anty-cd137 zwiększy jego wykorzystanie dla pacjentów poddanych immunoterapii lub dla innych wskazań. Na podstawie obserwowanej tożsamości sekwencji aminokwasowej, regiony

16 15 określające komplementarność (CDRs) regionów VL i VH szczepiono na ludzkim idiotypowym klonie immunoglobuliny związanym z anty-dna. Zaobserwowano za pomocą konkurencyjnego testu ELISA, że rekombinowane przeciwciało chimeryczne według tego wynalazku wykazywało podobny profil bioaktywności w porównaniu z mysim przeciwciałem monoklonalnym. Przeciwciało anty-cd137 było skuteczne w mediowaniu zarówno komórkowej zależnej od przeciwciał cytotoksyczności i cytotoksyczności mediowanej dopełniaczem podczas badania. Oczekuje się, że humanizowanie sekwencji przeciwciała według tego wynalazku wyeliminuje jakąkolwiek niepożądaną odpowiedź przeciwciała ludzkiego antymysią, co pozwala na wielokrotne podawanie i.v. ludziom. [0056] W stosowanym tu kontekście, określenie przeciwciało odnosi się do glikoproteiny zawierającej przynajmniej dwa ciężkie (H) łańcuchy i dwa lekkie (L) łańcuchy wzajemnie połączone wiązaniami disiarczkowymi, tj. kowalencyjne heterotetramery obejmujące dwa identyczne łańcuchy Ig H i dwa identyczne łańcuchy L, które są kodowane przez różne geny. Każdy łańcuch ciężki składa się z regionu zmiennego łańcucha ciężkiego (oznaczonego tu jako HCVR lub V H ) oraz regionu stałego łańcucha ciężkiego. Region stały łańcucha ciężkiego składa się z trzech domen, C H 1, C H 2 i C H 3. Każdy łańcuch lekki składa się z regionu zmiennego łańcucha lekkiego (oznaczonego tu jako LCVR lub V L ) i region stały łańcucha lekkiego. Region stały łańcucha lekkiego składa się z jednej domeny, CL. Regiony V H i V L można dalej podzielić na regiony hiperzmienności, nazywane regionami determinującymi komplementarność (CDR), przeplatane regionami, które są konserwatywne, zwane regionami zrębowymi (FR). Każdy V H i V L składa się z trzech CDR i czterech FR, ułożonych od końca aminowego do końca karboksylowego w następującej kolejności: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Regiony zmienne łańcuchów ciężkich i lekkich zawierają domenę wiążącą, która oddziałuje z antygenem. Regiony stałe przeciwciał mogą mediować w wiązaniu immunoglobuliny do tkanek gospodarza lub czynników, w tym różnych komórek systemu immunologicznego (np. komórki efektorowe) i pierwszego składnika (Clq) klasycznej ścieżki dopełniacza. Tworzenie dojrzałej cząsteczki przeciwciała można przeprowadzić, gdy białka są wyeksprymowane w stechiometrycznych ilościach i samoorganizują się w odpowiedniej konfiguracji. [0057] Określenie przeciwciała ma obejmować jego fragmenty wiążące antygen. W stosowanym tu kontekście, fragment wiążący antygen przeciwciała odnosi się do jednej lub większej liczby części przeciwciała, które zachowują zdolność do swoistego wiązania się z antygenem. Wykazano, że funkcja wiązania antygenu przeciwciała może być pełniona przez fragmenty przeciwciała pełnej długości. Przykłady fragmentów wiążących objętych określeniem fragment wiążący antygen przeciwciała obejmują (i) fragment Fab, jednowartościowy fragment składający się z domen V L, V H, C L i C H 1; (ii) fragment F(ab') 2, dwuwartościowy fragment zawierający dwa fragmenty Fab połączone mostkiem dwusiarczkowym w regionie zawiasowym; (iii) fragment Fd składający się z domen V H i CH1; (iv) fragment Fv składający się z domen V L i V H jednego ramienia przeciwciała, (v) fragment dab (Ward i wsp., (1989) Nature 341: ), który składa się z domeny V H ; oraz (vi) wyizolowany region determinujący komplementarność (CDR). Ponadto, jakkolwiek dwie domeny fragmentów Fv, V i V H, są kodowane przez oddzielne geny, mogą one być

17 16 połączone, za pomocą metod rekombinacji, przez syntetyczny łącznik, który umożliwia wytworzenie ich jako pojedynczego łańcucha białkowego, w którym regiony V L i V H parują się z wytworzeniem cząsteczek jednowartościowych (znany jako jednołańcuchowy Fv (scfv); patrz np. Bird i wsp. (1988) Science 242: ; oraz Huston i wsp. (1988) Proc. Natl. Acad Sci. USA 85: ). Takie przeciwciała jednołańcuchowe mają również być objęte określeniem część wiążąca antygen przeciwciała. Te fragmenty przeciwciał uzyskuje się stosując konwencjonalne procedury takie, jak procedury proteolitycznej fragmentacji, jak opisano w J. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp (N.Y. Academic Press 1983), a także innych technik znanych znawcom w tej dziedzinie. Fragmenty te przesiewa się pod kątem użyteczności w taki sam sposób, jak są nienaruszone przeciwciała. [0058] Korzystny fragment wiążący antygeny obejmuje fragment Fab, fragment F(ab') 2, i fragment Fv CDR3. W jednym przykładzie wykonania fragment przeciwciała to część polipeptydu fuzyjnego Fc. Jako przykład, fragment przeciwciała jest regionem Fc zawierającym N-połączone oligosacharydy. [0059] Izolowane przeciwciało, w stosowanym tu kontekście, ma odnosić się do przeciwciała, które zasadniczo wolne jest od innych przeciwciał, mających odmienne swoistości antygenowe. Izolowane przeciwciało, które specyficznie wiąże się z epitopem, izoformą lub wariantem antygenu, może wykazywać jednak reaktywność krzyżową z innymi pokrewnymi antygenami, np. z innych gatunków. Ponadto, wyizolowane przeciwciało może być zasadniczo wolne od innego materiału komórkowego i/lub chemikaliów. W stosowanym tu kontekście, specyficzne wiązanie odnosi się do przeciwciała wiążącego się z określonym antygenem. Typowo, przeciwciało wiąże się z powinowactwem, które jest przynajmniej dwukrotnie wyższe niż jego powinowactwo do wiązania do niespecyficznego antygenu innego niż wcześniej określony antygen lub blisko spokrewniony antygen. W związku z tym, zapewnione tu przeciwciała w niektórych przykładach wykonania specyficznie wiążą się do antygenu docelowego. [0060] Przeciwciała są izotypu IgG. W dalszych przykładach wykonania, przeciwciała są wybrane z grupy składającej się z IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 lub ma domenę immunoglobuliny stałą i/lub zmienną IgG1, IgG2, IgG3, IgG4. W innych przykładach wykonania, przeciwciała są bispecyficzne lub są przeciwciałami multispecyficznymi. W jeszcze dalszych przykładach wykonania, przeciwciała są rekombinowanymi przeciwciałami, przeciwciałami poliklonalnymi, przeciwciałami monoklonalnymi, humanizowanymi przeciwciałami i przeciwciałami chimerycznymi, lub ich mieszaninami. W niektórych przykładach wykonania chmieryczne przeciwciało jest zaprojektowaną metodami inżynierii genetycznej fuzją części przeciwciała nieludzkiego (np. mysz, szczur, królik) z częściami ludzkiego przeciwciała. Chimeryczne przeciwciała, w niektórych przykładach wykonania, mogą zawierać w przybliżeniu 33% białka nieludzkiego i 67% białka ludzkiego. Szczególnie w odniesieniu do chimer myszy, mogą być opracowane w celu zmniejszenia odpowiedzi HAMA wywoływanej przez mysie przeciwciała, ponieważ mogą one łączyć specyficzność przeciwciała mysiego z efektywną interakcją układu odpornościowego ludzkiego przeciwciała.