(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) (13) T3 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (13) T3 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (1) Int. Cl. C12Q1/68 (06.01) (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej Europejski Biuletyn Patentowy 07/38 EP B1 (4) Tytuł wynalazku: Identyfikacja genu i mutacji dla postępującej degeneracji czopków i pręcików u psów oraz sposób jej testowania (30) Pierwszeństwo: US P (43) Zgłoszenie ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 0/2 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 04/08 (73) Uprawniony z patentu: CORNELL RESEARCH FOUNDATION, INC., Ithaca, US (72) Twórca (y) wynalazku: PL/EP T3 Aguirre Gustavo, Philadelphia, US Acland Gregory M., Unionville, US Zangerl Barbara, Philadelphia, US Goldstein Orly, Ithaca, US Pearce-Kelling Susan, Berkshire, US Felix Jeanette S., Horseheads, US Sidjanin Duska J., Brookfield, US (74) Pełnomocnik: Polservice Kancelaria Rzeczników Patentowych Sp. z o.o. rzecz. pat. Pietruszyńska-Dajewska Elżbieta Warszawa skr. poczt. 33 Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 2 Opis Dziedzina techniki Niniejszy wynalazek dotyczy ogólnie klasy chorób genetycznych, obserwowanej u psów, nazywanej postępującą degeneracją czopków i pręcików ("prcd"). Dokładniej wynalazek dotyczy genu i mutacji pojedynczego nukleotydu w genie związanym z postępującą degeneracją czopków i pręcików u psów. Stan techniki Postępująca atrofia siatkówki (PRA) jest heterogenną klasą zaburzeń siatkówki, które w szerokim zakresie charakteryzują się podobnym fenotypem klinicznym choroby i dotykają psy (Canis familiaris) (Aguirre, 1976). Cechy kliniczne obejmują: początkową 1 ślepotę nocną, po której następuje zmniejszenie widzenia dziennego prowadzące do całkowitej ślepoty; ograniczenie naczyń siatkówki i pocienienie siatkówki; nieprawidłowości w elektroretinogramie ("ERG"); i rozwój zaćmy. Choroby z tej grupy są zazwyczaj dziedziczone w postaci autosomalnego recesywnego defektu genu, chociaż rozpoznaje się również postaci PRA dominujące i sprzężone z X (Kijas i wsp., 02; Zhang i wsp., 02). PRA można zaklasyfikować do chorób rozwojowych i degeneracyjnych. Klasa rozwojowa obejmuje 2 kilka genetycznie odmiennych chorób wyrażanych cytologicznie w bezpośrednim okresie pourodzeniowym,

3 3 gdy komórki wzrokowe w siatkówce psów zaczynają się różnicować (Acland i wsp. 1989). Przeciwnie, klasa degeneracyjna dotyczy defektów, w których komórki fotoreceptorowe ulegają degeneracji po prawidłowym zróżnicowaniu klasa ta obejmuje specyficzną chorobę nazywaną postępującą degeneracją pręcików i czopków (ang. progressive rod-cone degeneration (prcd)). Ta specyficzna postać PRA oznacza degeneracje dziedziczone autosomalnie recesywnie, występujące w późniejszym okresie życia i dotyczy różnych ras psów (Aguirre and Acland, 1988). Mutacje w lokus prcd przyczyniają się do wszystkich do tej pory rozpoznanych występujących u psów dziedzicznych autosomalnych recesywnych 1 degeneracji siatkówki, występujących w późniejszym okresie życia. W doświadczeniach z krzyżówkami wykazano, że lokus genu prcd jest odpowiedzialny za postępującą atrofię siatkówki u ras: pudel (toy i miniatura), cocker spaniel (amerykański i angielski), labrador retriever i portugalskich psów wodnych (zobacz, np. Aguirre and Acland, 1988, Aguirre and Acland, 1991; Pearce-Kelling i wsp., 02). Doświadczenia z krzyżówkami sugerują, że taka sama mutacja w genie F04 (który jest genem odpowiedzialnym 2 za prcd) jest również obecna u kilku innych ras, zarówno u psów dotkniętych chorobą, jak i nosicieli

4 4 zaburzenia. Jednakże w oparciu o parametry kliniczne i genetyczne pozostające w zgodzie z chorobą powodowaną przez mutacje w lokus genu prcd inne rasy psów podejrzewane o występowanie prcd w postaci obserwowanej postępującej atrofii siatkówki obejmują rasy: akita, basenji, border collie, angielski mastiff, angielski springer spaniel, hawańczyk, lwi piesek, samoyed, standardowy jamnik szorstkowłosy, teriery tybetańskie, berneński pies pasterski, i sznaucer miniaturowy. W zależności od rasy psa, różne mutacje odpowiedzialne za odmiany alleliczne lokus genu prcd mogą regulować szybkość postępowania, ale nie fenotyp, degeneracji fotoreceptorowej. Rozpoznanie kliniczne choroby prcd jest 1 skomplikowane ze względu na potrzebę wykorzystania wyrafinowanych metod testowania, takich jak ERG, oraz ze względu na późne wystąpienie choroby. Wiek, w którym chorobę można rozpoznać obecnie dostępnymi metodami, może być już po okresie reprodukcyjnym psa. Przykładowo, u angielskich cocker spanieli postępującą atrofię siatkówki można rozpoznać przy użyciu ERG w wieku trzech lat, a przy użyciu oftalmoskopii w wieku -8 lat. Ten późny wiek rozpoznania skutkuje rozsianiem niepożądanej cechy w populacji oraz wzrostem 2 częstotliwości występowania choroby.

5 Szacowana częstotliwość występowania postępującej degeneracji czopków i pręcików różni się u różnych dotkniętych nią ras. Uważa się, że w przybliżeniu 2% psów rasy labrador retriever w wieku 2 do 3 lat jest dotkniętych postępującą degeneracją czopków i pręcików; a jeżeli tak, to proporcja psów rasy labrador retriever, które jak się oczekuje są heterozygotyczne w lokus prcd może wynosić aż 24%. U pudli i cocker spanieli, wskaźnik choroby jest wyższy niż wskaźnik obserwowany u psów rasy labrador retriever, a zatem oczekuje się, że wskaźnik nosicielstwa jest wyższy. Na podstawie badań u portugalskich psów wodnych obliczona częstotliwość nosicielstwa wynosi w przybliżeniu 40%. Tradycyjne środki kontrolowania chorób 1 dziedzicznych w populacji obejmowały przeprowadzanie kojarzeń testowych w celu identyfikacji psów nosicieli w programach hodowlanych, zmniejszając w tren sposób częstotliwość choroby genetycznej u rasy. W kojarzeniu testowym psa ocenianego jako potencjalnego nosiciela choroby genetycznej kojarzy się z psem, o którym wiadomo, że jest dotknięty chorobą. Następnie obserwuje się potomstwo pod kątem występowania lub braku występowania choroby, przy czym miot równy lub większy niż 6, w którym wszystkie szczenięta stanowią 2 potomstwo niedotknięte chorobą, zazwyczaj oczyszcza psa z bycia nosicielem. Podczas gdy kojarzenia testowe

6 6 były skutecznie stosowane w przypadku ras z liczebnymi miotami oraz w przypadku chorób ujawniających się wcześnie, to taka procedura nie jest praktyczna do redukcji częstotliwości występowania prcd. Oprócz wad kojarzeń testowych, takich jak wysokie nakłady czasu i wysiłku podejmowanego aby oczyścić psa oraz to, że jeżeli oceniany pies jest nosicielem to urodzą się dotknięte chorobą psy, to kojarzenia testowe nie są szczególnie dostosowane do wykrywania nosicieli prcd, ze względu na późne wystąpienie klinicznych objawów związanych z chorobą oraz ze względu na to, że pewne rasy dotknięte tą chorobą mają małe mioty (zbyt małe do określenia istotności statystycznej). Chociaż gen przenoszący mutację lub mutacje, które 1 powodują prcd nie był uprzednio znany, to badania genetyczne w rodzinach z prcd wykazały, że gen, który powoduje chorobę u psów występuje na końcu centromerowym psiego chromosomu 9, przy czym obszar ten jest homologiczny do końca telomerowego długiego ramienia ludzkiego chromosomu 17 (Acland i wsp., 1999; Sidjanin i wsp., 03). Pomimo intensywnych wysiłków w dziedzinie mających na celu znalezienie genu odpowiedzialnego za prcd, aż do tego czasu gen ten pozostawał nieuchwytny. 2 Identyfikacja, izolacja, klonowanie i sekwencjonowanie genu prcd umożliwiłoby zaprojektowanie i wytwarzanie

7 7 produktów użytecznych w rozpoznawaniu i skriningu prcd. Zatem w przemyśle związanym z hodowlą psów istnieje rosnące zapotrzebowanie na test genetyczny, który pozwala na bezpośrednie zidentyfikowanie psów, które mają postać prcd postępującej atrofii siatkówki (np. przed wystąpieniem wykrywalnych objawów klinicznych), jak również pozwalający na genotypowanie psów zagrożonych prcd, w celu ustalenia czy są one dotknięte chorobą, czy są nosicielami czy też są genetycznie zdrowe. Casse C. i wsp., ARVO Annual Meeting Abstract Search and Program planner Vol. 03, 03, Abstract No. 2318, XP , opisuje gen potencjalnie zaangażowany w postępującą degenerację czopków i 1 pręcików (PRCD). Publikacja WO 99/02731 opisuje markery genetyczne i oznaczenia dla chromosomu 9 i postępującej choroby degeneracji czopków i pręcików. Niniejszy wynalazek dostarcza sposobu identyfikacji czy pies jest nosicielem, lub czy jest predysponowany do degeneracji czopków i pręcików, obejmującego: testowanie próbki biologicznej obejmującej kwasy nukleinowe uzyskane od psa pod kątem transwersji G do A w genie F04 w pozycji 2 korespondującej z pozycją nukleotydową 1298 sekwencji SEQ ID NO: 1, przy czym transwersja G do A w jednym

8 8 allelu wskazuje nosiciela postępującej degeneracji czopków i pręcików, transwersja G do A w obydwu allelach wskazuje psa dotkniętego chorobą lub predysponowanego do wystąpienia postępującej degeneracji czopków i pręcików, a brak transwersji G do A wskazuje psa, który nie jest ani nosicielem, ani nie jest predysponowany do wystąpienia postępującej degeneracji czopków i pręcików. Zatem niniejszy wynalazek dostarcza wyizolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej nowy, związany z chorobą psi gen, przywoływany tutaj jako gen F04. Wynalazek ponadto dostarcza genu F04 posiadającego mutację G do A w pozycji 1298 sekwencji SEQ ID NO: 1I. Ta transwersja związana jest z prcd i jest jej 1 wskaźnikiem. Niniejszy wynalazek dotyczy również sposobu identyfikacji psów, które są genetycznie zdrowe, są nosicielami lub są dotknięte chorobą prcd. Genetycznie zdrowe psy to takie, u których obydwa allele genu F04 posiadają G jako nukleotyd w pozycji korespondującej z pozycją 1298 sekwencji SEQ ID NO: 1. Psy dotknięte chorobą lub do niej predysponowane to takie, u których obydwa allele genu F04 posiadają A jako nukleotyd w pozycji korespondującej z pozycją nukleotydową sekwencji SEQ ID NO: 1. Psy nosiciele to takie, u których jeden allel genu F04 posiada G, a drugi allel

9 9 posiada A jako nukleotyd w pozycji korespondującej z pozycją nukleotydową 1298 sekwencji SEQ ID NO: 1. Zmiana G do A w genie F04 w pozycji korespondującej z pozycją nukleotydową 1298 sekwencji SEQ ID NO: 1 jest tutaj określana jako mutacja prcd. Pozycja nukleotydowa 1298 w sekwencji SEQ ID NO: 1 koresponduje również z pozycją nukleotydową 11 w sekwencji cdna pokazanej na sekwencji SEQ ID NO: 3. Sposób ten obejmuje etapy uzyskiwania próbki biologicznej od psa i testowanie próbki biologicznej w celu zidentyfikowania czy G występuje, czy nie, w pozycji korespondującej z pozycją nukleotydową 1298 genu F04. W jednej postaci realizacji wynalazku, sposób obejmuje wykrywanie mutacji G do A w pozycji 1 korespondującej z pozycją nukleotydową 1298 sekwencji SEQ ID NO: 1 w jednym lub obydwu allelach, co wskazuje psa, który jest nosicielem lub psa, który jest dotknięty chorobą (lub do niej predysponowany), odpowiednio. Niniejszy wynalazek dostarcza również sposobu selekcji psów do hodowli. Sposób ten obejmuje uzyskiwanie próbki biologicznej od psa, testowanie próbki biologicznej pod kątem genu F04 posiadającego mutację prcd w jednym lub obydwu allelach, i 2 eliminowanie psów z mutacją prcd ze stada hodowlanego,

10 lub krzyżowanie psów z mutacją prcd z genetycznie zdrowymi psami. Krótki opis figur Figura 1 przedstawia sekwencję genomową genu F04 psa. Figura 2 przedstawia sekwencję cdna z genu F04 psa. Figura 3 przedstawia trawienie endonukleazą restrykcyjną amplifikowanych produktów od genetycznie zdrowych psów, psów nosicieli lub psów dotkniętych prcd. Figura 3A przedstawia trawienie endonukleazą restrykcyjną RsaI a Figura 3B przedstawia trawienie endonukleazą restrykcyjną ApaLI. Figura 4 stanowi ilustrację struktury 1 doświadczalnej stosowanej do identyfikacji czy pies jest nosicielem, czy jest dotknięty chorobą lub czy jest zdrowy pod względem mutacji prcd, z użyciem Pyrosequencing. Opis wynalazku Niniejszy wynalazek dostarcza cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującego nowy gen F04, zlokalizowany na chromosomie 9 u psów. Sekwencja dzikiego typu genu F04 jest przedstawiona na Figurze 1, a szczegóły dotyczące tej 2 sekwencji są następujące.

11 11 Wyjaśnienie sekwencji genomowej Sekwencja genomowa genu F04 ma 1892 pz długości. Sekwencja wymieniona w sekwencji SEQ ID NO: 1 obejmuje wszystkie dotąd zidentyfikowane polimorfizmy. Zamiany nukleotydowe pokazano kursywą, jak następuje: W=A/T; M=A/C; R=A/G; Y=C/T; S=C/G; K=G/T. Insercje/delecje pokazano kursywą i podkreśleniem. Sekwencję dla dotkniętego i alternatywnego allelu dla polimorfizmów pokazanych na sekwencji przedstawiono w oddzielnej tabeli polimorfizmów (Przykład 2). Mikrosatelitę w pozycji 13,146-13,278 pz również pokazano kursywą i umieszczono w ramce. W zgrupowaniu psiej sekwencji genomowej z domeny publicznej (canfam1) z daty Jul. 04 (http: // 1 genome.ucsc.edu/cgi- bin/hgtracks?org=dog&db=canfam1&hgsid= ), sekwencja genomowa F04 (SEQ ID NO: 1) jest zlokalizowana nieprawidłowo na chromosomie chr18: 26,68,308-26,86,788. Uważamy, że jest to nieprawidłowe, ponieważ ustaliliśmy przy użyciu techniki BAC contig, i FISH oraz mapowania sprzężeń mejotycznych, że, jak oczekiwano na podstawie porównania regionów homologicznych genomów ludzkiego i mysiego, ten psi region genomowy jest prawidłowo 2 zlokalizowany na CFA9. Ta rozbieżność nie wpływa na dokładność lub użyteczność testów tu opisanych.

12 12 W całej tej sekwencji proponowane egzony i regiony UTR pokazano dużymi literami a zdefiniowane egzony pogrubieniem. Regiony intronowe pokazano małymi literami. Egzon 1: pz 1-1,367 Obejmuje kasetę TATA w pozycji , trzy miejsca wiążące CRX w pozycjach 1,122-1,128; 1,19-1,16; 1,177-1,183 i sygnał ATG wskazujący początek ORF w pozycji 1,294-1,296, przy czym wszystkie podkreślono i umieszczono w ramce. Mutację prcd w pozycji 1,298 pokazano kursywą, pogrubieniem i umieszczono w ramce. Mutacją jest zmiana G do A i pokazano ją jako "R". Egzon 2: pz 1,60-1,718 1 Egzon 3: pz 3,746-3,826 Obejmuje kodon stop w pozycji 3,76-3,767, który pokazano przez podkreślenie i umieszczono w ramce. Egzon 4: pz 4,161-4,26 3 UTR: pz 4,27-18,92 W obrębie tego regionu występuje kilka potencjalnych miejsc adenylacji, które wskazano przez podkreślenie i umieszczono w ramce. Wykazano również, że region zatytułowany 3 UTR zawiera regiony alternatywnego składania (wskazane 2 pogrubieniem), co ponadto definiuje w obrębie tego regionu:

13 13 Egzon a: pz 4,806-,399 Egzon b: pz 4,839-,399 Egzon c: pz,093-,399 Egzon 6: pz 6,8-6,66 Egzon 7: pz 6,927-7,164 Egzon 8: pz 7,47-7,7 Egzon 9: pz 12,27-18,92 Dedukowana sekwencja aminokwasowa przypuszczalnego białka kodowanego przez gen F04, oparta na sekwencji SEQ ID NO: 1, przy założeniu, że miejsce start występuje w pozycji 1294, jest pokazana poniżej jako sekwencja SEQ ID NO: 2: 1 W tym przypadku, mutacja prcd skutkowałaby zastąpieniem cysteiny (2 aminokwas) tyrozyną. Sekwencja cdna F04 (zobacz SEQ ID NO: 3) Zidentyfikowano kilka wariantów składania genu F04, przy czym wszystkie z nich zawierają taką samą ORF. Najkrótszy pełnej długości wariant składania ma długość 69 pz; cdna (SEQ ID NO: 3) dla tego wariantu genu F04 pokazano na Figurze 2. Specjalista w dziedzinie będzie wiedział, że potencjalna przyszła 2 identyfikacja dodatkowych egzonów, które nie zmieniają

14 14 ORF F04 jak tutaj opisano (takich jak niekodujący egzon względem egzonu 1, lub 3 względem egzonu 3), nie będzie wpływać na demonstrowany związek mutacji prcd z PRA lub detekcję mutacji prcd jak tutaj opisano. Wyjaśnienie sekwencji cdna: Sekwencja cdna zawiera ORF długości 16 pz, zlokalizowaną w pozycji (zarówno kodon start, jak i stop zaznaczono pogrubieniem). Mutacja jest zlokalizowana w obrębie w pozycji 11 i pokazano ją kursywą, pogrubieniem, i umieszczono w ramce (Normalny allel = G; zmutowany allel = A). Inne polimorfizmy (na przykład: Y = C/T, nt 312 SEQ ID NO: 3, polimorfizm #, Tabela 1; i R = G/A, nt 633 SEQ ID NO: 3, polimorfizm # 7, Tabela 1) w 3 UTR nie są związane z 1 chorobą, ponieważ obydwa allele zostały zidentyfikowane na normalnych chromosomach. Wszystkie cdna, które zawierają ORF F04 zawierają Egzon 1 (pz 1-184), Egzon 2 (pz 18-23), Egzon 3 (pz ) i Egzon 4 (pz 33-69), jednakże częściowe cdna uzyskane z użyciem różnych zestawów starterów dowodzą, że różne warianty składania w 3 UTR mogą zawierać co najmniej Egzony i 8, jak zdefiniowano w sekwencji genomowej. Inne cechy są takie same jak w genomowym DNA. Wykrywanie mutacji prcd w genie F04 można 2 przeprowadzić w dowolnej odpowiedniej próbce biologicznej uzyskanej od psa. W korzystnej postaci

15 1 realizacji wynalazku próbką biologiczną jest dowolna tkanka zawierająca genomowy DNA. Odpowiednie źródła próbki biologicznej obejmują krew, sierść, wyskrobiny śluzówkowe, spermę, biopsję tkanek, lub ślinę. W jednej postaci realizacji wynalazku próbkę biologiczną stanowi krew. Psy będące nosicielami mutacji prcd w genie F04 mogą zostać wykryte poprzez testowanie albo DNA, albo RNA, przy użyciu różnorodnych technik, które są dobrze znane w dziedzinie. Genomowy DNA stosowany do rozpoznania może być uzyskany z próbki biologicznej jak opisano powyżej. DNA może być stosowany bezpośrednio lub przed analizą mutacji może być amplifikowany enzymatycznie in vitro poprzez zastosowanie PCR (Saiki 1 i wsp., Science, 239: (1988)) lub innych sposobów amplifikacji in vitro, takich jak łańcuchowa reakcja ligazy (LCR) (Wu and Wallace, Genomics, 4: (1989) ), amplifikacja z przemieszczeniem nici (SDA) (Walker i wsp., PNAS USA, 89: (1992)), replikacja sekwencji typu self-sustained (ang. self- sustained sequence replication) (3SR) (Fahy i wsp., PCR Methods Appl., 1: 2-33 (1992) ),. Metodologia do wytwarzania kwasów nukleinowych w postaci, która jest odpowiednia do wykrywania mutacji jest dobrze znana w 2 dziedzinie.

16 16 Wykrywanie mutacji sekwencji DNA, takich jak mutacja prcd w genie F04, można przeprowadzić różnorodnymi sposobami, włącznie z, ale bez ograniczenia, wykrywaniem polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych w opraciu o allelospecyficzne cięcie endonukleazą restrykcyjną (Kan and Dozy Lancet, 2 (8096): (1978) ), hybrydyzacją z allelospecyficznymi sondami oligonukleotydowymi (Wallace i wsp., Nucl Acids Res., 6: (1978) ) włącznie z immobilizowanymi oligonukleotydami (Saiki i wsp., PNAS USA, 86: (1989)) lub macierzami oligonukleotydowymi (Maskos and Southern, Nucl Acids Res., 21: (1993) ), PCR specyficzną dla allelu (Newton i wsp., Nucl Acids Res., 17: (1989)), wykrywaniem źle dopasowanych nukleotydów (MRD) (Faham and Cox, Genome Res., : (199) ), denaturującą gradientową elektroforezą żelową (DGGE) (Fisher and Lerman i wsp., PNAS USA., 80: (1983) ), wykrywaniem polimorfizmu konformacji pojedynczej nici (Orita i wsp., Genomics, : (1983) ), cięciem RNazą w miejscach źle dopasowanych zasad (Myers i wsp., Science, 230: 1242 (198)), chemicznym (Cotton i wsp., PNAS USA, 8: (1988)) lub enzymatycznym (Youil i wsp., PNAS USA, 92: (199)) cięciem heterodupleksu DNA metodami opartymi na allelospecyficznym wydłużaniu startera

17 17 (Syvanen i wsp., Genomics 8: (1990) ), genetyczną analizą fragmentu (ang. genetic bit analysis) (GBA) (Nikiforov i wsp., Nuci Acids Res., 22: (1994) ), oznaczeniem ligacji oligonukleotydów (OLA) (Landegren i wsp., Science, 241: 77 (1988)), allelospecyficzną reakcją łańcuchową ligazy (LCR) (Barrany, PNAS USA, 88: (1991)), gap- LCR (Abravaya i wsp., Nucl Acids Res., 23: (199) ), i sekwencjonowaniem radioaktywnym i/lub fluorescencyjnym z użyciem standardowych procedur dobrze znanych w dziedzinie. Ponadto, opisano kilka nowych technik, włącznie z dynamiczną hybrydyzacją allelospecyficzną (DASH), diagonalną elektroforezą żelową macierzy mikropłytkowej 1 (ang. microplate array diagonal gel electrophoresis) (MADGE), pirosekwencjonowaniem, systemem TaqMan, jak również różnymi technologiami chipów DNA, takich jak chipy dla polimorfizmów Affymetrix. Metody te wymagają amplifikacji docelowego regionu genetycznego, zazwyczaj poprzez PCR. Jeszcze inne nowo opracowane sposoby, które mogą nie wymagać zastosowania PCR są oparte na wytwarzaniu małych cząsteczek sygnałowych poprzez inwazyjne cięcie, a następnie spektrometrię masową lub immobilizowane sondy typu padlock i amplifikację typu 2 rolling circle. Kilka sposobów znanych w dziedzinie do wykrywania specyficznych polimorfizmów pojedynczych

18 18 nukleotydów jest opisanych w patencie U.S. nr 6,7,141 a opis tych metod załączony jest tutaj przez odesłanie. Należy rozumieć, że analiza mutacji może być również przeprowadzona na próbkach RNA poprzez odwrotną transkrypcję do cdna. Dowolną technikę lub dowolną kombinację takich technik można zastosować zgodnie z wynalazkiem do opracowania urządzenia diagnostycznego i sposobu skriningu próbek DNA lub RNA pod kątem mutacji genowej prcd G do A w pozycji korespondującej z pozycją nukleotydową 1298 sekwencji SEQ ID NO: 1 genu F04. Zatem, zgodnie z wynalazkiem dostarczono test oparty na kwasie nukleinowym dla mutacji genu prcd, który obejmuje dostarczanie próbki DNA lub RNA psa i 1 ocenianie DNA lub RNA pod kątem obecności mutacji prcd. Próbki DNA lub RNA psa (lub genomowe, transkrybowane, transkrybowane przez odwrotną transkryptazę, i/lub sekwencje komplementarne do genu prcd) można łatwo uzyskać. Poprzez identyfikację i charakteryzację genu F04 jak to opisano i ujawniono w niniejszym wynalazku, przeciętny specjalista w dziedzinie może łatwo zidentyfikować sekwencje genomowe transkrybowane, poddane odwrotnej transkrypcji i/lub komplementarne dla genu prcd w próbie i łatwo zidentyfikować w nich 2 różnice.

19 19 Zgodnie z powyższym, w jednej postaci realizacji wynalazku, niniejszy wynalazek dostarcza fragmentów kwasu nukleinowego do wykrywania kwasów nukleinowych, w których występuje mutacja. Ogólnie, sposoby wykrywania są oparte na technikach hybrydyzacji DNA, w których hybrydyzacja do sekwencji DNA jest przeprowadzana w surowych warunkach, takich, że można wykryć zmianę jednego nukleotydu. Optymalna surowość uzyskiwana jest zazwyczaj poprzez dostosowanie temperatury reakcji i/lub stężenia soli w taki sposób, że sonda hybrydyzuje tylko ze specyficznym celem, chociaż specjaliści w dziedzinie dostrzegą, że dostępne są również alternatywne sposoby optymalizacji hybrydyzacji specyficznej dla celu. 1 Zatem, allelospecyficzne sondy mogą być hybrydyzowane w warunkach, które są wystarczająco surowe, żeby była znacząca różnica w intensywności dwóch alleli. Korzystnie, warunki hybrydyzacji są wystarczająco surowe, aby wytworzyć zasadniczo binarną odpowiedź (tzn. sonda hybrydyzuje tylko z jednym, ale nie z innym allelem). Ponadto, startery mogą być zaprojektowane w taki sposób, że hybrydyzują z sekwencją docelową tak, że po amplifikacji wytwarzane są produkty, które zawierają 2 miejsce mutacji prcd. Te startery powinny być wystarczająco długie, aby były użyteczne w reakcjach,

20 takich jak proces łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) lub jako sondy w procedurze łańcuchowej reakcji ligazy (LCR). Ogólnie, fragmenty, które mają co najmniej dwanaście zasad długości są uważane za odpowiednie do reakcji amplifikacji. Produkty amplifikacji mogą być poddane traktowaniu endonukleazą restrykcyjną i identyfikowane poprzez denaturującą gradientową elektroforezę żelową, w celu rozróżnienia produktów amplifikacji tych dwóch alleli. Odpowiednie fragmenty użyteczne do hybrydyzacji mogą być zidentyfikowane z sekwencji genu F04 tutaj przedstawionej lub mogą być zidentyfikowane poprzez hybrydyzację do sekwencji kwasu nukleinowego genu F04 (SEQ. ID. NO: 1) lub cdna (SEQ ID N0: 3) w surowych 1 warunkach jak opisano powyżej. Poprzez użycie narzędzi i sposobów tutaj opisanych można zidentyfikować psy, które są genetycznie zdrowe pod względem choroby postępującej degeneracji czopków i pręcików (G w obydwu allelach), są nosicielami prcd (transwersja G do A w jednym allelu) i psy, które są dotknięte chorobą (lub predysponowane do niej) (transewersja G do A w obydwu allelach). Po zidentyfikowaniu takie dotknięte chorobą psy (lub predysponowane do niej), lub psy nosiciele mogą być 2 eliminowane ze stada hodowlanego. Ewentualnie, psy dotknięte chorobą prcd (lub predysponowane do niej),

21 21 lub nosiciele choroby prcd mogą być kojarzone z genetycznie zdrowymi psami (bez transwersji G do A), aby zapewnić brak w miocie psów dotkniętych prcd. Niniejszy wynalazek może być zastosowany w przypadku dowolnej rasy, włącznie z rasami, ale bez ograniczenia: akita, amerykański cocker spaniel, amerykański Eskimos, australijski pies pasterski, Australian stumpy tailed cattle dog, basenji, berneński pies pasterski, border collie, Chesapeake bay retriever, Chinese crested, angielski cocker spaniel, angielski mastiff, angielski springer spaniel, Entlebucher mountain dog, fiński lapphund, niemiecki wyżeł krótkowłosy, sznaucer olbrzymi, hawańczyk, Labrador retriever, lwi piesek, pudel miniatura, 1 sznaucer miniaturowy, Nova scotia duck tolling retriever, portugalski pies wodny, samoyed, terier jedwabisty, szpic, pudel standardowy, standardowy jamnik szorstkowłosy, teriery tybetańskie, pudel toy. Ze względu na to, że wykazano, że identyczna mutacja prcd w genie F04 występuje i wywołuje PRA u tak wielu różnych ras, to wydaje się, że mutacja ta powstała na długo przed dyferencjacją populacji psów na te różne rasy. Oczekuje się zatem, że występowanie takiej samej mutacji zostanie udowodnione u innych ras psów, u 2 których obecnie jeszcze tego nie rozpoznano.

22 22 Zgodnie z korzystną postacią realizacji niniejszego wynalazku opisane sposoby są przeprowadzane in vitro. Zatem, zgodnie z korzystną postacią realizacji niniejszego wynalazku, opisane sposoby przeprowadzane są na wyizolowanych próbkach i nie są zatem praktykowane (bezpośrednio) na ludzkim organizmie. Zgodnie z korzystną postacią realizacji niniejszego wynalazku testowanie próbki biologicznej przeprowadza się poprzez pirosekwencjonowanie. Pirosekwencjonowanie korzystnie dostarcza szybko informację dotyczącą sekwencji, zazwyczaj w przeciągu minut. Pirosekwencjonowanie może, w jednej postaci realizacji wynalazku, obejmować jeden lub więcej z 1 następujących etapów: inkubację matrycy kwasu nukleinowego (korzystnie jednoniciowego DNA, ewentualnie amplifikowanego przez PCR) z enzymami pirosekwencyjnymi, takimi jak polimeraza DNA, sulfurylaza ATP, lucyferaza i apiraza, oraz substratami pirosekwencyjnymi takimi jak adenozyno- -siarczan (APS) i lucyferyna; kolejne dodawanie i katalityczną inkorporację dntp do nici DNA poprzez parowanie komplementarnych zasad, któremu towarzyszy uwalnianie pirofosforanu (PPi), korzystnie w ilości równomolarnej 2 z ilością inkorporowanego nukleotydu; detekcja ilości uwolnionego PPi. Detekcja PPi może być przeprowadzona,

23 23 w jednej postaci realizacji wynalazku, poprzez konwertowanie PPi do ATP (na przykład, poprzez sulfurylazę ATP w obecności APS), a następnie wykrywanie ilości wytworzonego ATP. Etap wykrywania może być zależny od światła. Przykładowo, w jednej postaci realizacji wynalazku, ATP może kierować konwersją lucyferyny do oksylucyferyny wytwarzając w ten sposób światło widzialne w ilościach proporcjonalnych do ilości ATP. Światło może być wykrywane i widziane jako pik na wykresie, którego wysokość jest proporcjonalna do liczby inkorporowanych nukleotydów. Reakcja pirosekwencjonowania może obejmować etap regenerowania, w którym roztwór reakcyjny jest regenerowany przed dodaniem następnego 1 dntp. Na zasadzie przykładu, etap ten może być przeprowadzony poprzez enzym apirazę, który degraduje ATP i dntp, które nie uległy inkorporacji. Po dodaniu dntp do reakcji pirosekwencjonowania, komplementarna nić DNA jest budowana i sekwencja nukleotydowa może być określana przykładowo z pików sygnałów świetlnych. W jednej postaci realizacji wynalazku w reakcji pirosekwencjonowania datp jest zastępowany poprzez datpas, który nie jest rozpoznawany przez lucyferazę. Wynalazek stanie się bardziej zrozumiały w świetle 2 następujących przykładów, które mają być ilustratywne, a nie ograniczające w jakikolwiek sposób.

24 24 Przykład 1 Wytworzono bibliotekę psich EST specyficznych dla siatkówki, od psów rasy beagle w wieku 16 tygodni. Jeden zestaw indywidualnych, nakładających się klonów EST utworzył ciąg, który zmapowano do uprzednio wyszczególnionego obszaru CFA9 (Sidjanin i wsp., 03) i dlatego był dalej badany. Sekwencja ta zawierała ostatni zdefiniowany Egzon 8 F04 (zobacz poniżej, ciąg klonu EST (EST clone contig), 8 pz). Na podstawie informacji dotyczącej sekwencji z powyższego ciągłego EST i hipotetycznych ludzkich genów zlokalizowanych w obrębie korespondującego regionu sekwencji ludzkiego genomu jak zdeponowano w GenBank, zaprojektowano dwa startery do RT-PCR: zgodny: - 1 caccttggccatgctctggc- 3 (zlokalizowany na końcu Egzonu 1) - SEQ ID NO: 4 Odwrotny: - aatgcatataaataaagcacttggc- 3 (zlokalizowany w Egzonie 8) - SEQ ID NO: RT- PCR przeprowadzono z użyciem materiału od zdrowego psa w wieku 3,3 tygodnia, który w wyniku skutkował produktem 707 pz (klon 9), obejmującym koniec Egzonu 1, Egzon 2, Egzon 3, Egzon 4 i Egzon 8. Porównawcza analiza in silico psiej sekwencji genomowej z ciągłego BAC (zobacz Przykład 2, poniżej), 2 z ludzką i mysią sekwencją genomową z domeny publicznej, zidentyfikowała wysoce konserwowany region,

25 2 rozciągający się od końca klonu 9, który zawierał potencjalne miejsca wiązania dla CRX, a po nich kodon inicjacji translacji ATG, bezpośrednio powyżej sekwencji klonu 9, i przewidywaną ORF rozpoczynającą się tym ATG i kończącą się kodonem stop w Egzonie 3. Ta sekwencja ORF nie korespondowała z żadną sekwencją znanego genu w Genbank, a przypuszczalna translacja także nie obejmowała możliwych do rozpoznania domen lub podobieństwa sekwencji z żadnym innym znanym białkiem w Genbank. Ze względu na to, że klon F04 został zidentyfikowany z biblioteki specyficznej dla siatkówki, należącej do twórców wynalazku, to dane te wzięte pod uwagę łącznie wskazywały, że ORF 1 korespondująca z F04 odzwierciedla nowy, uprzednio nieznany, eksprymowany w siatkówce gen. Obecność miejsc wiązania dla czynnika transkrypcyjnego specyficznego dla fotoreceptorów CRX, i wysoce konserwowana struktura regionu względem zidentyfikowanego kodonu start, zidentyfikowała przypuszczalny Egzon 1 jako pierwszy egzon kodujący gen ulegający ekspresji w siatkówce. W oparciu o tę informację zaprojektowano nowy zestaw starterów tak, aby zawierał potencjalny kodon start i obejmował Egzony 1-4: 2 Zgodny: -ccagtggcagcaggaacc-3 ( względem Egzonu 1) - SEQ ID NO: 6

26 26 Odwrotny: -ccaagccagggcatgagc -3 (3 względem Egzonu 4) - SEQ ID NO: 7 RT- PCR przeprowadzono zarówno na zdrowym zwierzęciu w wieku,4 tygodnia i osobniku dotkniętym chorobą prcd w wieku 8,6 tygodnia, co skutkowało powstaniem produktu 62 pz u obydwu zwierząt (zobacz poniżej, RT-PCR Egzon 1-4). Jedyną obserwowaną różnicą była zmiana G do A u osobnika dotkniętego chorobą, którą w konsekwencji zidentyfikowano jako mutację prcd. W celu zidentyfikowania końców i 3 tego genu twórcy wynalazku stworzyli siatkówkową bibliotekę RACE od zdrowego psa w wieku tygodni i psa dotkniętego chorobą, w wieku 8 tygodni. Amplifikację końców przeprowadzono z użyciem różnych starterów 1 zlokalizowanych w Egzonie 1 (CCAAGGTGCTGAGTAGGAAGAGGGTGGTG - SEQ ID NO: 8) lub Egzonie 3 (AGTCCCTGGGGCCGAGCTCCGCCTGAC - SEQ ID NO: 9). Amplifikację końców 3 przeprowadzono z użyciem specyficznego statera zlokalizowanego na Egonie 1 (CACCACCCTCTTCCTACTCAGCACCTTGG - SEQ ID NO: ), który jest dokładną sekwencją komplementarną specyficznego startera, który stosowany jest do przeprowadzania RACE. W celu weryfikacji specyficzności produktu przeprowadzono semizagnieżdżony PCR z użyciem startera 2 zlokalizowanego na Egzonie 3 (AGGGACTGGGATCAGCTGGCAGAGGCAG - SEQ ID NO: 11).

27 27 Sekwencja konsensusowa z tych eksperymentów jest klonem, który twórcy wynalazku uważają za cdna dla genu F04 (zobacz Seq ID NO: 3), któy jest pokazany na Figurze 2. Szczegóły dotyczące sekwencji cdna dostarczono powyżej. W celu oceny sekwencji konsensusowej przewidywanej na podstawie i 3 RACE zastosowano dwa startery do amplifikacji sekwencji konsensusowej cdna z chorej i zdrowej siatkówki. - AGTGGCAGCAGGAACCTCAGG- 3 SEQ ID NO: 29 - GGATTATATTAGGGATGAATGAGAAG- 3 SEQ ID NO: 30 Ze względu na to, że wyniki RACE i 3 RACE stanowią niezależne wyniki to etap ten jest konieczny do udowodnienia, że ten transkrypt występuje w chorej i 1 zdrowej siatkówce. RT- PCR potwierdził obecność takiego transkryptu. Przy użyciu powyżej opisanego sposobu uzyskano następujące sekwencje. Ciąg klon EST: Klony oryginalnie zawarte w bibliotece EST wytworzone zgodnie z sekwencją konsensusową z klonów; 8 pz:

28 28 Klon 9: Wytworzony poprzez RT- PCR z użyciem starterów z Egzonu 8 i końca Egzonu 1 (707 pz):

29 29 RT-PCR Egzony 1-4 Sekwencję tę stworzono z RT- PCR w celu porównania ORF chorych i zdrowych zwierząt (62 pz):

30 30 Mutacja F04 jest pogrubiona i przedstawiona jako G u psów zdrowych, a jako A u psów dotkniętych prcd. Odmiany składania Oprócz alternatywnego składania obserwowanego w pewnych sekwencjach uzyskanych w procesie klonowania genu F04 (opisano powyżej), zidentyfikowano różne odmiany składania przy użyciu RT-PCR stosując startery zlokalizowane w Egzonach 2 i 3, i stosując startery zlokalizowane poniżej przewidywanych Egzonów (zobacz poniżej). Klon 1: RT-PCR przeprowadzono z użyciem startera z Egzonu 3 (CAGTCGTGGGCAGCAGGTCGG - SEQ ID NO: 1) i jednego z Egzonu 8 (AATGCATATAAATAAAGCACTTGGC - SEQ ID NO: 16), 1 tworząc produkt 316 pz: Startery z Egzonu 2 (GCAGCAGGTCGGAGAGAGAC - SEQ ID NO: 18) i Egzonu (CTTCCCTCAGATGTGGAGTCAG - SEQ ID NO: 19) stosowano do amplifikacji cdna uzyskanego ze

31 31 zdrowej i chorej siatkówki. Jak pokazano poniżej uzyskano trzy różne produkty. Produkt numer 1: Produkt numer 2:

32 32 Produkt numer 3: RT-PCR przeprowadzono na zdrowej i chorej siatkówce z użyciem następujących starterów:

33 33 - TTAATCAGTCTGCACAAGGTCG- 3 SEQ ID NO: 31 - GGGTCATTGCAAGGATTATATTAGG- 3 SEQ ID NO: 32 Zaobserwowano dwie odmiany składania: Produkt numer 1: Produkt numer 2:

34 34 Powyższe wyniki wskazują, że istnieje kilka odmian składania siatkówkowego F04. W oparciu o te odmiany i analizę porównawczą scharakteryzowano organizację genomową F04. Jednakże, wszystkie odmiany składania istotne dla prcd zawierają Egzony 1-4, a najkrótszym i najczęściej ekspresjonowanym transkryptem istotnym dla tej choroby jest cdna zidentyfikowany jako SEQ ID NO: 3. Przykład 2 Ze względu na mapowanie lokus prcd na psim chromosomie 9 (CFA9), twórcy wynalazku zmapowali 1 interwał dla choroby w wyższej rozdzielczości, zawęzili zidentyfikowany psi region genomowy, w którym

35 3 zlokalizowany jest gen prcd, i testowali wszystkie geny kandydujące w obrębie tego regionu. Początkowo twórcy wynalazku stworzyli mapę fizyczną regionu z użyciem psich BAC (Sidjanin, 03) oraz zidentyfikowali złożone markery polimorficzne w obrębie i flankujące ten region. Badanie genotypów psów dotkniętych chorobą prcd różnych ras pod kątem różnych markerów polimorficznych wykazało, że w obrębie ras haplotyp, który związany jest z mutacją rozciąga się w szerokim regionie, włącznie z fizycznie zmapowanym interwałem (Sidjanin i wsp., 03). Jednakże porównaie tych genotypów ujawniło, że specyficzne dla rasy haplotypy różniły się wśród ras w obrębie obszaru wstępnie opublikowanego (Sidjanin i wsp., 03), ale były zgodne 1 dla wszystkich ras pod względem zestawu markerów fizycznie zlokalizowanych obrębie pojedynczego klonu BAC (BAC #M13; Li i WSP., 1999) zlokalizowanego w sąsiedztwie obszaru wstępnie opublikowanego. Ten klon BAC zawierał kilka genów. Zidentyfikowano polimorfizmy pojedynczych nukleotydów dla każdego z tych genów i skonstruowano poszczególny haplotyp, który różnicował CFA9 przenoszący prcd od tego od wszystkich zdrowych psów testowanych (Tabela 1) we wszystkich rasach, o których wiadomo, że dotknięte są prcd. 2 Tabela 1: Nierównowaga sprzężeń (LD) regionu flankującego psi gen prcd/ F04 na psim chromosomie 9

36 36 (CFA9). Wszystkie geny w tym regionie są zlokalizowane w psim BAC # 1OM13. "Dotknięty allel" dla każdego polimorfizmu to ten, który jest znajdowany na wszystkich badanych chromosomach przenoszących prcd od psów różnorodnych ras; alternatywny allel oznacza allel, który występuje, na przykład, w BAC # 1OM13. W miejscach gdzie polimorfizm jest pokazany pogrubieniem, nazwa polimorfizmu wskazuje pozycję (numer zasady) w sekwencji genomowej F04 (tzn. SEQ ID NO: 1). lokalizacja polimorfizmu wskazuje gen w sekwencji genomowej, w której zlokalizowany jest polimorfizm. Numer Nazwa Dotknięty Alternatywny Lokalizacja polimorfizmu polimorfizmu allel allel polimorfizmu 1 A G FLJ p43 G T FLJ C T FLJ C T FLJ22341 b712 A C FLJ b817 Delecja CTG FLJ b1149 T C FLJ p49 C T FLJ T G FLJ22341 SINE Bez SINE SINE FLJ p48 G A FLJ22341

37 37 12 A G FLJ A G FLJ T C FLJ C T FLJ p4 T C FLJ p41 C T FLJ C T FLJ b682 C G FLJ22341 b937 A G FLJ b1130 A G FLJ b127 G Delecja FLJ b131 G A FLJ p38 T C CYGB 2 G A CYGB 26 A G CYGB 27 CYGB T C CYGB CYGB 28 -b31-28 T C CYGB 29 b3133 T C CYGB 30 b360 C G CYGB 31 b3769 C G CYGB Delecja TGCC CYGB 33 p40 A G CYGB 34 G A CYGB 3 A G CYGB 36 31F A C CYGB 37 31F A G CYGB

38 38 38 A G C T F C G F C T F A G F CTT Delecja F Delecja C F C G F A G F T C F Delecja TCC F A G F ATGAGAA Delecja F C T F G A F C T F G A F C T F G C F G A F G A F G T F A C F Delecja G F T C F T A F04

39 A C F G A F A G F C T F G Delecja F G A F A G F A C F A T F A G F A G F C T F G A F A T F T C F T C F Delecja C F GGG Delecja F T Delecja F A G F04 84 b1409 C T STHM 8 p2 A C STHM 86 STHM-Nael A G STHM 87 STHM-Aval C T STHM 88 base 326 C T STHM 89 base 36 G A STHM

40 G A STHM G G STHM 92 b2263 Delecja T STHM 93 b T C STHM 94 b242 Delecja C STHM 9 b2748 G Delecja STHM 96 z RT-PCR A G STHM Dla każdego z tych genów zsekwencjonowano i zbadano Egzony, a związaną z chorobą zmianę (tzn. mutację) stwierdzono tylko w jednym genie. Gen ten, przywoływany tutaj jako F04, jest zlokalizowany w obrębie interwału opisanego w opisie patentowym U.S. nr,804,388. Szczegóły dotyczące psiego cdna i genomowej sekwencji DNA dla F04 dostarczono powyżej. Mutacja ta, w nukleotydzie 1298 sekwencji SEQ ID NO: 1 odzwierciedla tranzycję G do A, z normalnej sekwencji do sekwencji dotkniętej. Twórcy wynalazku przywołują tutaj zmianę sekwencji jako mutację prcd w genie F04 i pokazują jako polimorfizm nr 42 w tabeli powyżej. Przykład 3 1 Przykład ten opisuje test oparty na PCR z trawieniem enzymem restrykcyjnym, opracowany w celu identyfikacji zmiany sekwencji w genie F04. Zastosowano następujące startery: starter 1: ccagtggcagcaggaacc - SEQ ID NO: 27

41 41 starter 2: ccgacctgctgcccacgactg - SEQ ID NO: 28 PCR przeprowadza się w standardowych warunkach (temperatura przyłączania 8 stopni C, 1, MgC1 2 ) w 2 mikrolitrach, 3 cykli. Produkt amplifikacji ma wielkość 12 pz (odpowiadając pz 1182 do 1693 w sekwencji SEQ ID NO: 1. Enzym restrykcyjny RsaI trawi produkt amplifikacji niosący allel A, ale nie allel G. Odwrotnie, ApaLI trawi allel G, ale nie allel A. Obydwa trawienia przeprowadzano w 37 C przez 2 godziny. Trawienie restrykcyjne skutkuje zatem powstaniem wyników diagnostycznych pokazanych w Tabeli 2: Enzym (miejsce restrykcyjne) Allel Wielkość fragmentu(fragmentów) (pz) RsaI (GT AC) G 12 A 116; 396 ApaLI (G TGCAC) G 11; 397 A 12 Zbadano dużą populację psów dotkniętych prcd. 1 Twórcy wynalazku przebadali ponad 0 psów dotkniętych chorobą z 13 różnych ras lub odmian ras. Objęły one: 36 psów rasy Australian cattle dog, 2 psy rasy Chinese crested, angielskich cocker spanieli, psów rasy Finish Laphund, 48 psów rasy Labrador retriever, 4 psów rasy pudel toy lub miniatura, 1 psa rasy Nova

42 42 Scotia duck tolling retriever, 3 psy rasy portugalski pies wodny, 1 psa rasy terier jedwabisty, 2 psów rasy amerykański eskimos, i 14 psów rasy Entlebucher mountain dog. Przykład identyfikacji allelu G (zdrowego) i allelu A (dotkniętego allelu) po trawieniu RsaI pokazano na Figurze 3A, a następne trawienie ApaLI pokazano na Figurze 3B. W przypadku trawienia RsaI (Figura 3A), u zdrowego psa (GG) wykazano produkt 12 pz, u psa dotkniętego chorobą (AA) produkt 396 pz i 116 pz, a u psa nosiciela (GA) produkt 116 pz, 396 pz i 116 bp. W przypadku trawienia ApaLI (Figura 3B), u zdrowego psa (GG) wykazano produkty 397 pz i 11 bp, u psa dotkniętego chorobą (AA) wykazano produkt 12 pz, a u 1 psa nosiciela (AG) wykazano produkty 12 pz, 397 pz i 11 pz. Zatem, sposób ten może być stosowany do identyfikacji zdrowych psów (tzn. psów, u których obydwa allele genu F04 mają G jako nukleotyd w pozycji korespondującej z pozycją nukleotydową 1298 sekwencji SEQ ID NO: 1), psów nosicieli (tzn. psów, u których jeden allel ma G a drugi allel ma A jako nukleotyd w pozycji korespondującej z pozycją nukleotydową 1298 sekwencji SEQ ID NO: 1) i psów dotkniętych chorobą lub predysponowanych do niej (tzn. psów, u których obydwa 2 allele genu F04 mają A jako nukleotyd w pozycji

43 43 korespondującej z pozycją nukleotydową 1298 sekwencji SEQ ID NO: 1). Przykład 4 W celu potwierdzenia wykluczenia dotkniętego allelu z ogólnej populacji psów twórcy wynalazku przetestowali 00 zwierząt z 67 ras, o których nie wiadomo było czy mają postać prcd PRA, w celu ustalenia nieobecności allelu A. Psy te były testowane poprzez Pyrosequencing (Biotage, Charlottesville, VA; <http: // w następujący sposób. Technika ta oparta jest na amplifikacji docelowej sekwencji przy użyciu nieznakowanego startera zgodnego i znakowanego biotyną ( Bio) startera odwrotnego, które są stosowane do izolacji 1 jednoniciowego produktu. Starter sekwencjonujący stosowany jest do zapoczątkowania następnego wydłużania przez starter, specyficznego dla nukleotydu, a obecność lub nieobecność nukleotydu jest zapisywana w sposób zależny od częstotliwości występowania allelu w oparciu na reakcji lucyferazy. Starter zgodny: TTGTGAGAGCCGGCAGG3 - SEQ ID NO: 23 Starter odwrotny: Bio/ATGGCCAAGGTGCTGAGTAG3 - SEQ ID NO: 24 Starter sekwencjonujący: GGGGCAGCTGAGCCA3 - SEQ ID 2 NO: 2

44 44 P rodukt: 113 pz (sekwencja startera jest pokazana dużymi literami, polimorfizm G/A jest pokazany pogrubieniem, a Bio wskazuje znacznik biotytowy: TTGTGAGAGCCGGCAGGggccattttggcctttctcctgcagactctgtccggga ggggatggggca GCTGAGCCAtgtg/acaccaccctcttcCTACTCAGCACCTTGGCCAT - Bio - SEQ ID NO: 26. Figura 4 ilustruje układ testu dla procedur według tego przykładu. W oparciu na sekwencji testowej serię nukleotydów wstrzykuje się jeden za jednym razem podczas wydłużania startera (sekwencja jest pokazana na dole każdego panelu) i powstała reakcja świetlna jest rejestrowana (wskazana przez kreskę dla każdego nukleotydu, bezpośrednio proporcjonalna do ilości obecnych alleli). Nukleotydy 1 jeden (C) i 7 (G) sekwencji stanowią kontrole negatywne i nie powinny wytwarzać reakcji świetlnej. Pozycje 2, 3, 4, 8 i 9 stanowią kontrole dodatnie i reagują tak samo we wszystkich próbkach opartych na testowanej sekwencji. Badana mutacja koresponduje z nukleotydami i 6. U zdrowych zwierząt występuje tylko allel G i wytwarza reakcję o takiej samej sile jak kontrole dodatnie. U zwierząt dotkniętych chorobą jest to tak samo prawdziwe dla allelu A, podczas gdy u zwierząt nosicieli obydwa allele występują w stosunku 2 0/ 0 i dlatego wytwarzają sygnał o połowie intensywności w każdej pozycji. We wszystkich

45 4 przypadkach zwierzęta testowane poprzez Pyrosequencing były "GG", tzn. miały G w obydwu allelach genu FO4 w pozycji korespondującej z pozycją 1298 sekwencji SEQ ID NO: 1. Specjaliści w dziedzinie dostrzegą, że można dokonać rutynowych modyfikacji różnych postaci realizacji niniejszego wynalazku opisanych powyżej. Zamiarem jest aby takie modyfikacje były objęte zakresem niniejszego wynalazku. Odesłania 1. Aguirre, G.D.: Inherited Retinal Degenerations in the Dog Trans. Amer. Acad. Ophth. and Otol. 81: 667, Aguirre GD, Acland GM. Variation in Retinal Degeneration Phenotype Inherited at the prcd Locus. Exp. Eye Res. 46: 663, Acland G, Fletcher RT, Gentleman S, Chader, G. and Aguirre, G: Non-allelism of Three Genes (rcd1, rcd2 and erd) for Early-Onset Hereditary Retinal Degeneration. Exp. Eye Res. 49 : 983, Aguirre, G. and Acland, G.: Inherited Retinal Degeneration in the Labrador Retriever Dog. A New Animal Model of RP? Invest. Ophthalmol. Vis Sci. 2 (Supp). 32 (4), 1991;

46 46. Acland, G., Ray, K., Mellersh, C., Gu, W., Langston, A., Rine, J., Ostrander, E., and Aguirre, G. Linkage analysis and comparative mapping of canine progressive rod- cone degeneration (prcd) establishes potential locus homology with retinitis pigmentosa (RP17) in humans. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 9: , Kijas, J.W., Cideciyan, A.V., Aleman, T.S., Pianta, M.J., Pearce- Kelling, S.E., Miller, B.J., Jacobson, S, G., Aguirre, G.D., and Acland, G.M. Naturally- occurring rhodopsin mutation in the dog causes retinal dysfunction and degeneration mimicking human dominant retinitis pigmentosa Proc. Natl. Acad. Sciences USA 99: , Li, R., Mignot, E., Faraco, J., Kadotani, H., Cantanese, J., Zhao, B., Lin, X., Hinton, L., Ostrander, E.A., Patterson, D.F., i wsp Construction and characterization of an eightfold redundant dog genomic bacterial artificial chromosome library. Genomics 8: Pearce- Kelling, S.E., Nickle, A., Kijas, J.W., Sidjanin, D.J., Miller, B.J., Aguirre, G.D. and Acland, G.M Sidjanin, D.J., Miller, B., Kijas, J.K., 2 McElwee, J., Pillardy, J., Malek, J., Pai, G., Feldblyum, T., Fraser, C., Acland, G. and Aguirre, G.

47 47 Radiation Hybrid Map, Physical Map and Low- Pass Genomic Sequence of the Canine prcd Region on CFA9, and Comparative Mapping with the Syntenic Region on Human Chromosome 17. Genomics 81: , 03.. Zhang, Q., Acland, G.M., Wu, W.X., Johnson, J.L. Pearce- Kelling, S., Tulloch, B., Vervoort, R., Wright, A.F., Aguirre, G.D. Different RPGR Egzon ORF1 Mutations in Canids Provide Insights into Photoreceptor Cell Degeneration Hum. Molec. Genet. 11: , Fakhrai- Rad, H., Pourmand, N., Ronaghi, M. Pyrosequencing: An accurate detection platform for single nucleotide polymorphisms. Human Mutation, 02; 19 () Ronagi M, Elahi E. Discovery of Single Nucleotide Polymorphisms and mutations by Pyrosequencing. Comp Funct Gemon. 02; 3: Shendure J, Mitra RD, Varma C, Church GM. Advanced sequencing technologies: methods and goals. Nature Reviews Genetics, May 04; (),

48 48 Lista sekwencji <1> Aguirre, Gus <1> Identyfikacja genu i mutacji dla postępującej degeneracji czopków i pręcików u psów oraz sposób do jej testowania <130> <> US 60/81,499 <11> <160> 34 <2> 1 <211> 1892 <212> DNA <213> canis familiaris <400> 1

49 49

50 0

51 1

52 2

53 3

54 4

55 <2> 2 <211> 4 <212> PRT <213> canis familiaris <400> 2

56 6 <2> 3 <211> 69 <212> DNA <213> canis familiaris <400> 3 <2> 4 <211> <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <2> <223> starter zgodny RT-PCR 1 <400> 4 caccttggcc atgctctggc <2> <211> 2 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna

57 7 <2> <223> starter odwrotny RT-PCR <400> aatgcatata aataaagcac ttggc 2 <2> 6 <211> 18 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <2> <223> starter zgodny RT-PCR <400> 6 ccagtggcag caggaacc 18 <2> 7 <211> 18 1 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <2> <223> Starter odwrotny RT-PCR <400> 7 ccaagccagg gcatgagc 18 <2> 8 <211> 29 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna 2 <2> <223> starter odwrotny zlokalizowany w Egzonie 1

58 8 <400> 8 ccaaggtgct gagtaggaag agggtggtg 29 <2> 9 <211> 27 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <2> <223> starter odwrotny zlokalizowany w Egzonie 3 <400> 9 agtccctggg gccgagctcc gcctgac 27 <2> <211> 29 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna 1 <2> <223> starter zgodny zlokalizowany w Egzonie 1 <400> caccaccctc ttcctactca gcaccttgg 29 <2> 11 <211> 28 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <2> <223> starter zgodny zlokalizowany w Egzonie 3 2 <400> 11 agggactggg atcagctggc agaggcag 28

59 9 <2> 12 <211> 84 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <2> <223> ciąg klonu EST <400> 12 <2> 13 <211> 707 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna 1 <2> <221> niepewna

60 60 <222> 98, 602 <223> sekwencja klonu 9; produkt RT-PCR <400> 13 <2> 14 <211> 62 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <2> <223> RT-PCR Egzony 1-4 <400> 14

61 61 <2> 1 <211> 21 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <2> <223> starter zgodny RT-PCT z Egzonu 3 <400> 1 cagtcgtggg cagcaggtcg g 21 <2> 16 <211> 2 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <2> 1 <223> Starter odwrotny RT-PCR z Egzonu 8 <400> 16 aatgcatata aataaagcac ttggc 2 <2> 17 <211> 316 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna

62 62 <2> <223> produkt RT-PCR <400> 17 <2> 18 <211> <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <2> <223> starter zgodny RT-PCR z Egzonu 2 <400> 18 gcagcaggtc ggagagagac 1 <2> 19 <211> 22 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <2> <223> Starter odwrotny RT-PCR z Egzonu <400> 19 cttccctcag atgtggagtc ag 22 <2>

63 63 <211> 796 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <2> <223> produkt RT-PCR nr 1 <400> <2> 21 <211> 763 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <2> <223> produkt RT-PCR nr 2 1 <400> 21