(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (13) (51) T3 Int.Cl. C12Q 1/68 ( ) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2010/44 EP B1 (54) Tytuł wynalazku: Test diagnostyczny w kierunku anomalii oczu collie (30) Pierwszeństwo: US P (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2006/18 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 2011/04 (73) Uprawniony z patentu: CORNELL RESEARCH FOUNDATION, INC., Ithaca, US (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 GREGORY M. ACLAND, Unionville, US ANNA V. KUKEKOVA, Ithaca, US GUSTAVO D. AGUIRRE, Philadelphia, US ELAINE OSTRANDER, Potomac, US DAYNA AKEY, Seattle, US ORLY GOLDSTEIN, Ithaca, US (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Dorota Rzążewska JAN WIERZCHOŃ & PARTNERZY BIURO PATENTÓW I ZNAKÓW TOWAROWYCH ul. Żurawia 47/ Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 11450/10/P-RO/DR/MA EP TEST DIAGNOSTYCZNY W KIERUNKU ANOMALII OCZU COLLIE DZIEDZINA WYNALAZKU Niniejszy wynalazek dotyczy w ogólnym ujęciu dziedzicznego zaburzenia oczu anomalii oczu collie (CEA) wpływającej na rozwój naczyniówki i twardówki u psów. W bardziej szczegółowym ujęciu wynalazek dotyczy metody identyfikowania psów jako posiadających normalny genotyp oraz heterozygotycznych lub homozygotycznych względem allelu odpowiedzialnego za występowanie CEA. TŁO WYNALAZKU Anomalia oczu collie (CEA) jest dziedzicznym zaburzeniem oczu, wpływającym na rozwój naczyniówki i twardówki u psów. Schorzenie to wyróżnia się u kilku ras psów, w tym owczarków szkockich Rough Collie i Smooth Collie, Border Collie, owczarków australijskich, owczarków rasy Lancashire Heeler oraz owczarków szetlandzkich. Fenotyp kliniczny chorych psów wszystkich ras charakteryzuje się znacznym zróżnicowaniem. Podstawowy fenotyp CEA niedorozwój naczyniówki (CH) charakteryzuje się regionalnym niedorozwojem naczyniówki, która jest silnie unaczynioną podstawą gałki ocznej, występującą pod siatkówką. Zmiana zazwyczaj prowadzi do oftalmoskopowo wykrywalnych wad o typie objawu okienkowego, występujących w dnie oka skroniowo względem nerwu wzrokowego. U większości psów dotkniętych schorzeniem w stopniu lekkim CH jest jedyna widoczną zmianą; u wielu psów z tej grupy nie występują oczywiste następstwa kliniczne, a zwierzęta wydają się zachowywać normalny wzrok przez całe życie. U psów dotkniętych schorzeniem w stopniu ciężkim możliwe jest również występowanie kolobomatycznych zmian tarczy nerwu wzrokowego lub tkanek okalających. Kolobomy są szczelinowymi zagłębieniami w ścianie gałki ocznej, w których występują miejscowe zwężenia twardówki. W najcięższych przypadkach może dojść do miejscowego lub całkowitego odwarstwienia siatkówki i/lub neowaskularyzacji wewnątrzocznej oraz krwotoków; wszystkie te procesy mogą prowadzić do ślepoty. Powyższe ciężkie oznaki CEA obserwuje się wyłącznie u psów dotkniętych również podstawową niedorozwojową zmianą naczyniówki. Ustalono, że podstawowy fenotyp CEA dziedziczony jest poprzez gen mapowany w regionie 3.9-cM chromosomu 37 psa i wyróżnia się jako autosomalna cecha recesywna z penetracją genu sięgającą niemal 100% (Lowe JK, et al. Genomics 2003 Jul;82(1):86-95). Ponieważ jednak nie zidentyfikowano zmian genetycznych związanych z CEA, nie było dotąd możliwe wykonywanie badań przesiewowych w kierunku tego schorzenia. W związku z powyższym wśród hodowców psów istniała ciągła potrzeba opracowania testu genetycznego, który pozwalałby na bezpośrednią identyfikację psów o normalnym genotypie, psów-nosicieli oraz psów dotkniętych CEA.

3 2 SKRÓCONY OPIS WYNALAZKU Niniejszy wynalazek dotyczy metody identyfikowania psów jako posiadających normalny genotyp oraz heterozygotycznych lub homozygotycznych względem allelu odpowiedzialnego za występowanie CEA. Sposób ten obejmuje etapy pobrania od psa próbki biologicznej zawierającej genomowe DNA oraz zbadania tej próbki biologicznej pod kątem obecności lub braku delecji nukleotydów odpowiadających nukleotydom w pozycjach od 9302 do sekwencji SEQ ID NO:1 w chromosomie 37. Obecność delecji w obu allelach oznacza psa homozygotycznego względem allelu odpowiedzialnego za występowanie CEA. Obecność delecji tylko w jednym allelu oznacza psa heterozygotycznego pod względem allelu odpowiedzialnego za występowanie CEA, zaś brak delecji w obu allelach oznacza psa posiadającego normalny genotyp pod względem CEA. Obecność lub brak delecji może być badana metodą amplifikacji DNA z następczą identyfikacją produktów amplifikacji. Niniejszy wynalazek dotyczy również zestawów do diagnozowania psów jako posiadających normalny genotyp oraz heterozygotycznych lub homozygotycznych względem allelu odpowiedzialnego za występowanie CEA. Tego rodzaju narzędzia i/lub zestawy pomagają hodowcom w identyfikacji psów zdrowych, nosicieli mutacji i psów homozygotycznych względem zmutowanego genu. Psy zidentyfikowane jako heterozygotyczne lub homozygotyczne względem allelu odpowiedzialnego za schorzenie można eliminować z inwentarza hodowlanego lub krzyżować z psami o normalnym genotypie. SKRÓCONY OPIS RYSUNKÓW Rycina 1 przedstawia sekwencję SEQ ID NO:1, odpowiadającą regionowi chromosomu 37 u psów. Sekwencja SEQ ID NO:1 jest kontigiem (konsensusową sekwencją pochodzącą z wielu nakładających się sekwencji) z genomu zdrowych psów. Obszar ulegający delecji u psów dotkniętych schorzeniem oraz w jednym chromosomie psów heterozygotycznych względem allelu odpowiedzialnego za CEA odpowiada nukleotydom od 9302 do w sekwencji SEQ ID NO:1; nukleotydy te oznaczono małymi literami. Sekwencja SEQ ID NO:1 odpowiada nukleotydom od do (włącznie, rozmiar pz) ogłoszonej w domenie publicznej złożonej sekwencji genomu psa (lipiec 2004 r.), dostępnego w bazie GenBank lub na stronie internetowej Grupy ds. Bioinformatyki Genomu UCSC pod adresem Sekwencja SEQ ID NO:1 odpowiada nukleotydom od do przedziału niezrównoważenia sprzężeń dla anomalii oczu collie (ang. Defined Collie Eye Anomaly Linkage Disequilibrium Interval). Przedział niezrównoważenia sprzężeń dla anomalii oczu collie odpowiada nukleotydom od do (włącznie, rozmiar pz) ogłoszonej w domenie publicznej złożonej sekwencji genomu psa (lipiec 2004 r.). Miejsca wiązania starterów PCR zostały wytłuszczone i odpowiadają nazwom i pozycjom starterów wymienionych w Tabelach 3-5. Sekwencje podane małymi literami odpowiadają nukleotydom deletowanym w zmutowanym allelu; sekwencje podane wielkimi literami odpowiadają zasadom obecnym zarówno w normalnym, jak i zmutowanym genotypie.

4 3 Rycina 2 jest graficznym przedstawieniem względnych pozycji delecji CEA, sekwencji SEQ ID NO:1 oraz starterów wykorzystywanych do badań pod kątem delecji CAE względem przedziału niezrównoważenia sprzężeń dla CAE oraz względem pozycji w złożonej sekwencji genomu psa (lipiec 2004 r.). Zarówno sekwencja delecji CEA, jak i sekwencja SEQ ID NO:1 są odwrotne względem koordynat sekwencji genomu psa. Rycina 3A przedstawia sekwencję nukleotydową (SEQ ID NO:10) odpowiadającą jednemu z łańcuchów produktu amplifikacji otrzymanego przy użyciu startera CEAF21a i startera CEAR17d. Sekwencja odpowiadająca starterowi CEAF21a została wytłuszczona; sekwencja odpowiadająca starterowi CEAR17d została podkreślona. Rycina 3B przedstawia sekwencję nukleotydową (SEQ ID NO:11) odwrotnego łańcucha komplementarnego względem SEQ ID NO:10. Sekwencja odpowiadająca starterowi CEAF21a została wytłuszczona; sekwencja odpowiadająca starterowi CEAR17d została podkreślona. Zakreślona ramką para nukleotydów GC graniczy z początkowym miejscem złamania delecji CEA. Rycina 4A przedstawia sekwencję nukleotydową (SEQ ID NO:12) odpowiadającą jednemu z łańcuchów produktu amplifikacji otrzymanego przy użyciu startera CEAF22a i startera CEAR22c. Sekwencja nukleotydowa odpowiadająca starterowi CEAF22a została wytłuszczona; sekwencja odpowiadająca starterowi CEAR22c została podkreślona. Rycina 4B przedstawia sekwencję nukleotydową (SEQ ID NO:13) odwrotnego łańcucha komplementarnego względem SEQ ID NO:12. Sekwencja nukleotydowa odpowiadająca starterowi CEAF22a została wytłuszczona; sekwencja nukleotydowa odpowiadająca starterowi CEAR22c została podkreślona. Zakreślona ramką para nukleotydów GC graniczy z końcowym miejscem złamania delecji CEA. Rycina 5 przedstawia elektroforetyczny rozdział produktów amplifikacji PCR uzyskanych przy użyciu czterech starterów PCR ujawnionych w Tabeli 6. Pierwsza, położona najbardziej po lewej stronie ścieżka zawiera drabinkę porównawczą. Pozostałe ścieżki podzielono na cztery zestawy amplifikacji PCR (1-4) genomowego DNA pochodzącego od psów o normalnym genotypie (N), nosicieli mutacji (ang. carriers, C) i psów dotkniętych schorzeniem (ang. affected, A) Zestaw 1 wykonano przy użyciu starterów CEAF22a i CEAR22c Zestaw 2 wykonano przy użyciu starterów CEAF21a i CEAR22c Zestaw 3 wykonano przy użyciu starterów CEAF21a i CEAR17d Zestaw 4 wykonano przy użyciu kombinacji wszystkich starterów Rycina 6 przedstawia sekwencję nukleotydową (SEQ ID NO:14) jednego z łańcuchów produktu amplifikacji o długości 430 pz, otrzymanego przy użyciu startera CEAF21a i startera CEAR22c. Sekwencja odpowiadająca starterowi CEAF21a została wytłuszczona; sekwencja odpowiadająca starterowi CEAR22c została podkreślona. Zakreślona ramką para nukleotydów GC graniczy z miejscem delecji.

5 4 OPIS WYNALAZKU Niniejszy wynalazek opiera się na identyfikacji mutacji związanej ze schorzeniem CEA. Krytyczny region, w którym znajduje się gen odpowiedzialny za CEA, ograniczyliśmy metodą mapowania niezrównoważenia sprzężeń do przedziału chromosomu 37 o długości około 100 kilozasad. W ramach tego przedziału zidentyfikowano delecję długości 7,8 kilozasad ( kz ) występującą u psów heterozygotycznych względem delecji (nosicieli) lub homozygotycznych względem delecji (prawdopodobnie dotkniętych CEA). Rzeczony region o długości 7,8 kz określany jest tu jako delecja CEA. Bez ograniczania się do jakiejkolwiek szczegółowej teorii uważa się, że delecja CEA skutkuje usunięciem lub zakłóceniem działania domniemanego elementu wzmacniającego związanego z ekspresją genu CEA. Na Rycinie 1 ujawniono sekwencję SEQ ID NO:1, złożoną z sekwencji uzyskanych z bazy danych Instytutu Badań Genetycznych (TIGR), obejmującej uprzednio złożone 1,5x sekwencje genomu psa typu Survey Database oraz z sekwencji zamplifikowanych i zsekwencjonowanych w laboratorium Elaine Ostrander przez Daynę Akey. Kontig utworzony na podstawie powyższych danych stanowi sekwencję konsensusową SEQ ID NO:1 W bardziej szczegółowym ujęciu sekwencja SEQ ID NO:1 została złożona jako ciągła sekwencja 5' 3' w kierunku transkrypcji domniemanego genu FLJ12610 w ramach prób zidentyfikowania całej sekwencji rzeczonego genu. Część genu FLJ12610 reprezentowana przez sekwencję SEQ ID NO:1, wraz ze zidentyfikowanymi intronami i egzonami, przedstawiono w Tabeli 1. Tabela Koniec intronu 1 genu FLJ Egzon 2 genu FLJ Intron 3 genu FLJ Egzon 3 genu FLJ Intron 3 genu FLJ Egzon 4 genu FLJ Początek intronu 4 genu FLJ Sekwencja usunięta w mutacji CEA allelu Gen FLT12610 jest transkrybowany z odwrotnego łańcucha chromosomu 37 psa, podobnie jak w przypadku homologicznego chromosomu ludzkiego (HSA2). Tak więc sekwencja SEQ ID NO:1 biegnie w tym samym kierunku, co transkrypcja genu FLJ12610 i odwrotnie niż w przypadku składania genomu psa.

6 5 W Tabeli 2 przedstawiono pozycje obszaru niezrównoważenia sprzężeń dla anomalii oczu collie, SEQ ID NO:1 oraz delecji CEA. Nukleotyd nr 1 w sekwencji SEQ ID NO:1 jest odwrotnie komplementarny względem nukleotydu nr w sekwencji genomu psa, zaś ostatni nukleotyd sekwencji SEQ ID NO:1 jest odwrotnie komplementarny względem nukleotydu nr w sekwencji genomu psa. Sekwencja SEQ ID NO:1 jest więc odwrotną sekwencją komplementarną względem przedziału sekwencji genomu psa od nukleotydu do nukleotydu Tabela 2 Cecha Pozycja w chromosomie 37 psa Początek LD Koniec SEQ ID NO: Koniec CEA Del Początek CEA Del Początek SEQ ID NO: Koniec LD Zidentyfikowano również miejsca złamań delecji CEA. Region delecji CEA rozpoczyna się od nukleotydu 9302 w sekwencji SEQ ID NO:1, odpowiadającego nukleotydowi chromosomu 37 psa w ogłoszonej w domenie publicznej złożonej sekwencji genomu psa (lipiec 2004 r.). W związku z powyższym początkowe miejsce złamania delecji (oznaczane tu również jako miejsce delecji 5') znajduje się pomiędzy nukleotydami 9301 a 9302 sekwencji SEQ ID NO:1. Region podlegający delecji kończy się na nukleotydzie sekwencji SEQ ID NO:1, w związku z czym końcowe miejsce złamania delecji (oznaczane tu również jako miejsce delecji 3') znajduje się pomiędzy nukleotydami a sekwencji SEQ ID NO:1. W przypadku, gdy region CEA ulega delecji, w sekwencji 5' 3' regionu odpowiadającego SEQ ID NO:1 po nukleotydzie 9301 (G) następuje nukleotyd (T). W oparciu o powyższe obserwacje dostarcza się testów wykrywających obecność lub brak delecji CEA. Psy nieposiadające delecji CEA w którymkolwiek allelu określane są jako posiadające normalny genotyp względem CEA. Psy posiadające delecję CEA w jedynie jednym allelu określane są jako nosiciele CEA. Psy homozygotyczne względem delecji CEA określane są dotknięte CEA. Test na obecność delecji CEA można przeprowadzić na dowolnej próbce zawierającej genomowe DNA. Na przykład możliwe jest pobranie próbki krwi, włosów, żółci, zeskrobin błony śluzowej, nasienia, biopsji tkankowej, śliny lub podobnych. W jednym z wariantów wynalazku próbkę biologiczną stanowi krew.

7 6 Obecność lub brak delecji CEA można oznaczyć przy użyciu szeregu technik dobrze znanych w stanie techniki. Istnieje na przykład możliwość amplifikacji genomowego DNA do użycia w teście enzymatycznym poprzez zastosowanie reakcji PCR (Saiki i in., Science 239: (1988)) lub innych metod amplifikacji in vitro, takich jak na przykład łańcuchowa reakcja ligazy (LCR) (Wu i Wallace, Genomics 4: (1989)), amplifikacja z przesunięciem łańcucha (SDA) (Walker i in., PNAS USA 89: (1992)), samopodtrzymująca replikacja sekwencji (3SR) (Fahy i in., PCR Methods Appl. 1:25-33 (1992)), przed analiza pod kątem obecności delecji CEA. Techniki przygotowywania kwasów nukleinowych w postaci odpowiedniej do badania pod kątem obecności delecji CEA są dobrze znane w stanie techniki. Wykrycie obecności lub braku delecji CEA w DNA można osiągnąć przy użyciu szeregu metod, w tym między innymi łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR), hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ (FISH), hybrydyzacji z właściwymi dla danych alleli sondami oligonukleotydowymi (Wallace i in., Nucl Acids Res 6: (1978)), w tym z oligonukleotydami unieruchomionymi na podłożu (Saiki i in., PNAS USA 86: (1989)) lub matrycami oligonukleotydów (Maskos i Southern, Nucl Acids Res 21: (1993)), allelospecyficznej amplifikacji PCR (Newton i in., Nucl Acids Res 17: (1989)), analizy procesów naprawy błędnie sparowanych zasad (MRD) (Faham i Cox, Genome Res 5: (1995)), elektroforezy w gradientowych żelach denaturujących (DGGE) (Fisher, Lerman i in., PNAS USA 80: (1983)), analizy polimorfizmu konformacji pojedynczego łańcucha (Orita i in., Genomics 5: (1983)), chemicznego (Cotton i in., PNAS USA 85: (1988)) lub enzymatycznego (Youil i in., PNAS USA 92:87-91 (1995)) cięcia heterodupleksowego DNA, metod opartych na wydłużaniu startera specyficznego względem allelu (Syvanen i in., Genomics 8: (1990)), analizy bitów genetycznych (GBA) (Nikiforov i in., Nucl Acids Res 22: (1994)), badania ligacji nukleotydów (OLA) (Landegren i in., Science 241:1077 (1988)), allelospecyficznej łańcuchowej reakcji ligazy (LCR) (Barrany, PNAS USA 88: (1991)), gap-lcr (Abravaya i in., Nucl Acids Res 23: (1995)), oraz sekwencjonowania DNA ze znakowaniem radioaktywnym i/lub fluorescencyjnym przy użyciu standardowych procedur znanych w stanie techniki. W jednym z wariantów amplifikację genomowego DNA do celu badania pod kątem delecji CEA wykonuje się przy użyciu reakcji PCR. Na potrzeby tego wariantu dostarczane są startery oraz metoda użycia starterów w reakcji amplifikacji w taki sposób, aby w wyniku amplifikacji DNA pochodzącego od psów z CEA, nosicieli lub psów o normalnym genomie otrzymywane były różne kombinacje produktów amplifikacji. W jednym z wariantów badania pod kątem obecności delecji dokonuje się w reakcji PCR przy użyciu zestawu czterech starterów, Startery zaprojektowane są w taki sposób, że w przypadku użycia pierwszego i drugiego startera do amplifikacji DNA normalnego allelu chromosomu 37 wytwarzany jest produkt amplifikacji obejmujący początkowe miejsce złamania (miejsce złamania 5') delecji CEA. Startery trzeci i czwarty zaprojektowane są w taki sposób, że w

8 7 przypadku ich użycia do amplifikacji DNA normalnego allelu chromosomu 37 wytwarzany jest produkt amplifikacji obejmujący końcowe miejsce złamania (miejsce złamania 3') delecji CEA. Startery pierwszy i czwarty zostały zaprojektowane tak, by wiązać miejsca przylegające do deletowanego obszaru chorego chromosomu. Startery drugi i trzeci zostały zaprojektowane tak, by wiązać miejsca znajdujące się w deletowanym obszarze chorego chromosomu. Ani zestaw złożony ze starterów pierwszego i drugiego, ani zestaw złożony ze starterów trzeciego i czwartego nie jest w stanie amplifikować sekwencji chromosomu 37 z delecją CEA, ponieważ w sekwencji takiej nie występuje miejsce wiązania drugiego lub trzeciego startera. Zestaw złożony ze starterów pierwszego i czwartego nie jest w stanie amplifikować sekwencji zdrowego chromosomu 37, ponieważ amplifikacja i detekcja obecnej w zdrowym chromosomie (niezawierającej delecji) sekwencji o długości 7,8kz przekracza ograniczenia techniczne stosowanych metod amplifikacji. Kiedy jednak delecja CEA ma miejsce, miejsca wiązania pierwszego i czwartego startera znajdują się wystarczająco blisko siebie na chromosomie(-ach) z delecją CEA, aby powstał trzeci produkt amplifikacji. Trzeci produkt amplifikacji nie zawiera więc choćby fragmentu delecji CEA. Wynalazek dostarcza przykładowego zestawu starterów, w którym pierwszy starter lokuje się powyżej, w kierunku 5' względem początkowego miejsca złamania delecji CEA, zaś drugi starter lokuje się z obrębie delecji CEA, jednak wystarczająco blisko miejsca wiązania pierwszego startera, aby możliwe było wytworzenie produktu amplifikacji obejmującego początkowe miejsce złamania delecji CEA. Trzeci starter lokuje się w obrębie delecji CEA, zaś czwarty poniżej, w kierunku 3' względem końcowego miejsca złamania delecji CEA. Trzeci i czwarty starter znajdują się wystarczająco blisko, aby możliwe było wytworzenie produktu amplifikacji obejmującego początkowe miejsce złamania delecji CEA. Miejsca wiązania pierwszego i czwartego startera znajdują się wystarczająco daleko od siebie, aby w przypadku, gdy nie zachodzi delecja regionu CEA startery te nie mogły wytworzyć produktu amplifikacji. Dla osób biegłych w dziedzinie będzie zrozumiałe, że oznaczenia starterów jako pierwszy, drugi, trzeci i czwarty jest arbitralne i stosowane tu dla jasności w odniesieniu do produktów wytwarzanych przy użyciu poszczególnych par starterów. Zrozumiałe będzie również, że choć wynalazek dostarcza konkretnych sekwencji starterów reakcji PCR, osoby biegłe w dziedzinie będą w stanie zaprojektować inne sekwencje starterów pozwalających na wykrycie obecności lub braku delecji CEA. Startery mogą być ponadto projektowane tak, by amplifikować którykolwiek z łańcuchów chromosomu 37 w regionie delecji CEA. Reakcje amplifikacji można prowadzić przy użyciu wszystkich czterech starterów w tej samej reakcji lub oddzielnie dla każdego zestawu starterów. Możliwe jest więc również równoczesne lub sekwencyjne prowadzenie oddzielnych reakcji amplifikacji genomowego DNA przy użyciu starterów pierwszego i drugiego, trzeciego i czwartego oraz pierwszego i

9 8 czwartego. Niezależnie od tego, czy reakcje amplifikacji wykonywane są oddzielnie, czy łącznie, połączone wyniki reakcji amplifikacji prowadzonych z zastosowaniem trzech wyżej wymienionych par starterów interpretuje się w następujący sposób: 1. Obecność jedynie pierwszego i drugiego produktu amplifikacji oznacza psa o normalnym genotypie. 2. Obecność pierwszego, drugiego i trzeciego produktu amplifikacji oznacza psanosiciela. 3. Obecność jedynie trzeciego produktu amplifikacji oznacza psa dotkniętego schorzeniem. Tak więc, dzięki zastosowaniu kombinacji opisanych tu par starterów, profil produktów amplifikacji PCR uzyskanych z próbki biologicznej wskazuje na status psa jako posiadacza normalnego genotypu, nosiciela lub zwierzęcia dotkniętego CEA. Przy zastosowaniu takich starterów PCR, aby produkty amplifikacji były różnej wielkości, możliwa jest analiza produktów amplifikacji standardowymi metodami takimi, jak rozdział elektroforetyczny i detekcja bromkiem etydyny lub światłem ultrafioletowym lub inną odpowiednią metodą detekcji. Ewentualnie, produkty PCR mogą zostać wyodrębnione i poddane sekwencjonowaniu. Sposób będący przedmiotem niniejszego wynalazku może być zastosowany w przypadku każdej rasy psów. Z reguły wiadomo, że CEA dotknięte mogą być psy następujących ras: owczarki szkockie Rough Collie i Smooth Collie, Border Collie, owczarki australijskie, owczarki rasy Lancashire Heeler oraz owczarki szetlandzkie. Niniejszy wynalazek dostarcza również zestawów do wykrywania obecności delecji CEA w próbce biologicznej pobranej od psa lub w próbce kwasu nukleinowego pobrany z próbki biologicznej. Zestawy będące przedmiotem niniejszego badania zawierają odczynniki do wykrywania kwasów nukleinowych w oparciu o obecność delecji CEA. W jednym z wariantów zastawy obejmują odczynniki do ekstrakcji/przygotowania próbek kwasu nukleinowego, pary starterów do amplifikacji regionów obejmujących początkowe miejsce złamania i końcowe miejsce złamania delecji CEA oraz pary starterów do amplifikacji regionu utworzonego w wyniku delecji regionu CEA. Przy użyciu opisanych tu narzędzi i metod możliwa jest identyfikacja psów o normalnym genotypie, heterozygotycznych (delecja w jednym allelu) lub homozygotycznych (delecja względem obu alleli) pod względem mutacji zasadniczo odpowiedzialnej za anomalię oczu collie (CEA). Zidentyfikowane psy mogą być usuwane z inwentarza hodowlanego. Ewentualnie, psy heterozygotyczne względem allelu CEA można kojarzyć z psami o

10 9 normalnym genotypie w celu uniknięcia miotów, w których znalazłyby się psy dotknięte CEA. Wynalazek zostanie dalej objaśniony przy użyciu następujących przykładów, które mają charakter ilustracyjny i w żaden sposób nie ograniczają zakresu wynalazku. PRZYKŁAD 1 Niniejszy przykład przedstawia możliwy sposób rozróżniania psów o normalnym genotypie, heterozygotycznych lub homozygotycznych pod względem mutacji zasadniczo odpowiedzialnej za CEA w oparciu o sposób będący przedmiotem niniejszego wynalazku. W szczególności, reakcje PCR prowadzone w oparciu o kombinację czterech starterów dostarczają produktów amplifikacji charakterystycznych dla psów o normalnym genotypie, heterozygotycznych lub homozygotycznych pod względem mutacji zasadniczo odpowiedzialnej za CEA. Miejsca wiązania starterów względem sekwencji SEQ ID NO:1, delecji CEA i przedziału niezrównoważenia sprzężeń CEA (ang. linkage disequilibrium, LD) przedstawiono na Rycinie 2. Sekwencję nukleotydową (SEQ ID NO:10) odpowiadającą jednemu z łańcuchów produktu amplifikacji otrzymanego przy użyciu startera CEAF21a i startera CEAR17d przedstawiono na Rycinie 3A. Sekwencję nukleotydową (SEQ ID NO:11) odwrotnego łańcucha komplementarnego względem SEQ ID NO:10 przedstawiono na Rycinie 3B. Zakreślona ramką para nukleotydów GC w odwróconym łańcuchu komplementarnym graniczy z początkowym miejscem złamania delecji CEA. Oznacza to, że w odwrotnym łańcuchu chromosomu CFA (Canis familiaris) 37, G nie ulega delecji, zaś C jest pierwszym deletowanym nukleotydem w zmutowanym allelu. Dodatkowe informacje na temat względnych pozycji wiązania starterów CEAF21a i CEAR17d zawiera Tabela 3. Tabela 3 Starter CEAF21a CEAR17d Sekwencja GGAGGAGTCATCATGACTTGC (SEQ ID NO:2) Odwrotna GCAAGTCATGATGACTCCTCC sekwencja (SEQ ID NO:3) komplementarna Sekwencja GGAGGAGTCATCATGACTTGC miejsca (SEQ ID NO:2) wiązania w SEQ ID NO:1 GACTGGTATTATCAAAGGTCAC (SEQ ID NO:4) GTGACCTTTGATAATACCAGTC (SEQ ID NO:.5) gtgacctttgataataccagtc (SEQ ID NO:5)

11 10 Lokalizacja względem SEQ ID NO:1 Lokalizacja względem POCZĄTKU delecji CEA Lokalizacja względem złożonej sekwencji genomu psa -89 do do +173 chr37: chr37: Rycina 4A przedstawia sekwencję nukleotydową (SEQ ID NO:12) odpowiadającą jednemu z łańcuchów produktu amplifikacji otrzymanego przy użyciu startera CEAF22a i startera CEAR22c. Rycina 4B (SEQ ID NO:13) przedstawia sekwencję odwrotnego łańcucha komplementarnego względem SEQ ID NO:12. Zakreślona ramką para nukleotydów GT w odwróconym łańcuchu komplementarnym graniczy z końcowym miejscem złamania delecji CEA. Oznacza to, że w odwrotnym łańcuchu chromosomu CFA 37, G jest ostatnim deletowanym nukleotydem, zaś T nie podlega delecji w zmutowanym allelu. Dodatkowe informacje na temat względnych pozycji wiązania starterów CEAF22a i CEAR22c zawiera Tabela 4. Tabela 4 Starter CEAF22a CEAR22c Sekwencja (wiodąca) TGTCCTCCGTACCATCGTGT (SEQ ID NO:6) Odwrotna ACACGATGGTACGGAGGACA sekwencja (SEQ ID NO:7) komplementarna Sekwencja TGTCCTCCGTACCATCGTGT miejsca (SEQ ID NO:6) wiązania w SEQ ID NO:1 Lokalizacja względem SEQ ID NO:1 CTAGTCTGTCAATAGCACCACTA (SEQ ID NO:8) TAGTGGTGCTATTGACAGACTAG (SEQ ID NO:9) TAGTGGTGCTATTGACAGACTAG (SEQ ID NO:9)

12 11 Lokalizacja względem -363 do do +319 KOŃCA delecji CEA Lokalizacja względem złożonej sekwencji genomu psa chr37: chr37: W celu rozróżnienia psów dotkniętych CEA, nosicieli i psów zdrowych, startery ujawnione w Tabelach 3 i 4 (i objęte podsumowaniem w Tabeli 5) zastosowano w opisany poniżej sposób. Tabela 5 Starter Sekwencja Miejsce wiązania Lokalizacja CEAF21a GGAGGAGTCATCATGACTT GC (SEQ ID NO:2) CEAR17d GACTGGTATTATCAAAGGT CAC (SEQ ID NO:4) CEAF22a TGTCCTCCGTACCATCGTGT (SEQ ID NO:6) CEAR22c CTAGTCTGTCAATAGCACCA CTA (SEQ ID NO:8) GGAGGAGTCATCATGACTT GC (SEQ ID NO:2) gtgacctttgataataccagt (SEQ ID NO:5) tgtcctccgtaccatcgtgt (SEQ ID NO:6) TAGTGGTGCTATTGACAGA CTAG (SEQ ID NO:9) CEAF21a jest starterem wiodącym, oznaczanym tu jako pierwszy starter; CEAR17d jest starterem odwrotnym, oznaczanym tu jako drugi starter. CEAF22a jest starterem wiodącym, oznaczanym tu jako trzeci starter; CEAR22c jest starterem odwrotnym, oznaczanym tu jako czwarty starter. Wykonano trzy zestawy starterów do badań PCR opisanych w Tabeli 6 (kolumny Nr badania PCR i Startery ). Zestawy te użyto do amplifikacji genomowego DNA wyekstrahowanego z próbek krwi psów metodą fenolowo-chloroformową (Sambrook i in., 1989). We wstępnych badaniach użyto DNA pochodzącego od trzech psów, których status CEA (psa dotkniętego schorzeniem, psa o normalnym genotypie i nosiciela; kolumna Status CEA ) był uprzednio oznaczony przy użyciu eksperymentalnych metod hodowlanych. W dalszych badaniach stosowano DNA z szerszej gamy próbek, reprezentujących ponad 20 psów każdego genotypu (psów dotkniętych schorzeniem, psów o normalnych genotypach i nosicieli), oznaczonego uprzednio przy użyciu eksperymentalnych metod hodowlanych. We wszystkich reakcjach amplifikacji stosowano ten sam program PCR: 96 C przez 2 minuty; 30 cykli 96 C (20 sekund), 58 C (20 sekund), i 72 C (40 sekund); oraz

13 12 końcowy etap wydłużania w temperaturze 72 C przez 5 minut. Produkty PCR analizowano metodą elektroforezy na żelu agarozowym 1,5% (Rycina 5). Fenotypy przypisano w oparciu o obecność lub brak produktów PCR o określonym rozmiarze, zgodnie z kolumną Oczekiwany produkt PCR. W badaniu PCR nr 4 wykorzystano wszystkie startery równocześnie. Tabela 6 Nr badania PCR Startery Status CEA Oczekiwany produkt 1 CEAF22a CEAR22c 2 CEAF21a CEAR22c 3 CEAF21a CEAR17d 4 CEAF22a CEAR17d CEAF21a CEAR22c Chory Normalny Nosiciel Chory Normalny Nosiciel Chory Normalny Nosiciel Chory Normalny Nosiciel Brak 704 pz 704 pz 430 pz Brak 430 pz Brak 283 pz 283 pz 430 pz 283 pz 704 pz 283 pz 430 pz 704 pz Jak przedstawiono w Tabeli 6 i na Rycinie 5, w badaniu CEA nr 1 (startery CEAF22a i CEAR22c) nie amplifikowano produktu w przypadku psów dotkniętych schorzeniem (A), natomiast w przypadku psów o normalnym genotypie (N) i nosicieli (C) amplifikowano produkt o długości 704 pz. Wynik taki uzyskano dlatego, że w próbkach N i C znajduje się co najmniej jedna kopia allelu CEA, w którym miejsca wiązania starterów CAEF22a i CEAR22c są rozdzielone 704 parami zasad (pz). Miejsce wiązania startera CEAF22a znajduje się jednak w regionie DNA ulegającemu delecji w obu allelach zwierząt dotkniętych schorzeniem, w związku z czym na zmutowanym chromosomie nie ma miejsca wiązania startera CEAF22a i niemożliwe jest wykrycie produktu amplifikacji. Sekwencje obu łańcuchów produktu o długości 704 pz, utworzonego w reakcji PCR przy użyciu starterów CEAF22a i CEAR22c ujawniono na Rycinach 4A i 4B.

14 13 Jak przedstawiono na Rycinie 5, w przypadku badania CEA nr 2 (startery CEAF21a i CEAR22c), z próbek pochodzących od zwierząt dotkniętych schorzeniem (A) oraz nosicieli (C) amplifikuje się produkt o długości 430 pz, natomiast w przypadku zwierząt o normalnym genotypie nie zachodzi amplifikacja produktu. Dzieje się tak dlatego, że zarówno u psów dotkniętych schorzeniem, jak i u nosicieli, w co najmniej jednym allelu występuje delecja CEA. Delecja ta zbliża do siebie miejsca wiązania starterów CEAF21a i CEAR22c tak, że znajdują się od siebie w odległości 430 pz na zmutowanym allelu. Natomiast w normalnym allelu (produkt PCR nieobserwowany), miejsca wiązania starterów CEAF21a i CEAR22c są oddzielone o ponad 7800 zasad. Tak więc teoretyczny produkt normalnego DNA jest zbyt duży, by go amplifikować i/lub zaobserwować w opisanych warunkach badania przy zastosowaniu starterów CEAF21a i CEAR22c. Sekwencja jednego łańcucha produktu o długości 430 pz (SEQ ID NO:14), wytworzonego przy użyciu starterów PCR CEAF21a i CEAR22c została przedstawiona na Rycinie 6; Otoczone ramką nukleotydy GT znajdują się obok siebie w wyniku delecji. Jak przedstawiono na Rycinie 5, w badaniu CEA nr 3 (startery CEAF21a i CEAR17d) nie amplifikowano produktu w przypadku psów dotkniętych schorzeniem (A), natomiast w przypadku psów o normalnym genotypie (N) i nosicieli (C) amplifikowano produkt o długości 283 pz. Wynik taki uzyskano dlatego, że w próbkach N i C znajduje się co najmniej jedna kopia normalnego allelu CEA, zaś w normalnym allelu miejsca wiązania starterów CAEF21a i CEAR17d są rozdzielone 283 pz. Miejsce wiązania startera CEAR17d znajduje się jednak w regionie DNA ulegającemu delecji w obu allelach zwierząt dotkniętych schorzeniem, w związku z czym na zmutowanym chromosomie nie ma miejsca wiązania startera CEAR17d i niemożliwe jest wykrycie produktu amplifikacji. Sekwencje obu łańcuchów produktu o długości 283 pz, utworzonego w reakcji PCR przy użyciu starterów CEAF21a i CEAR17d ujawniono na Rycinach 3A i 3B. Dalsze badania potwierdziły, że podana długość 283 pz jest prawidłowa, pomimo pozornej migracji typowej dla dłuższego produktu (patrz Rycina 5). W badaniu CEA nr 4 stosuje się jednocześnie wszystkie startery do badań 1-3, z wytworzeniem wszystkich produktów jak w przypadku pojedynczych badań 1-3. Jak widać w badaniu 4, przy zastosowaniu wszystkich czterech starterów w przypadku zwierząt dotkniętych schorzeniem amplifikowany jest tylko jeden produkt (430 pz), w przypadku zwierząt o normalnym genotypie (N) amplifikowane są produkty o długości 283 pz i 704 pz, zaś w przypadku nosicieli (C) amplifikowane są wszystkie trzy produkty (283, 430 i 704 pz). Powyższy Przykład pokazuje więc, że dzięki sposobowi będącemu przedmiotem niniejszego wynalazku, możliwa jest identyfikacja psów o normalnym genotypie w miejscu CEA oraz psów heterozygotycznych lub homozygotycznych pod względem mutacji CEA. Choć niniejszy wynalazek został przedstawiony w szczególnych wariantach, dla osób biegłych w dziedzinie wynalazku oczywiste będą ich rutynowe modyfikacje; modyfikacje takie leżą w zakresie wynalazku oraz poniższych zastrzeżeń

15 14

16 15

17 16

18 17

19 18

20 19

21 20

22 21

23 22

24 23 Dorota Rzążewska Rzecznik patentowy

25 24 Zastrzeżenia 1. Sposób identyfikacji psa jako posiadającego normalny genotyp, heterozygotycznego lub homozygotycznego pod względem mutacji odpowiedzialnej za anomalię oczu collie (CEA), obejmujący etap badania zawierającej DNA pobranej od psa próbki biologicznej pod kątem mutacji w regionie chromosomu 37, przy czym rzeczoną mutacją jest delecja nukleotydów odpowiadających pozycjom od 9302 do sekwencji SEQ ID NO:1, znamienny tym, że identyfikacja delecji tylko w jednym allelu oznacza psa heterozygotycznego pod względem mutacji CEA, identyfikacja delecji w obu allelach oznacza psa homozygotycznego pod względem mutacji CEA, zaś brak delecji w obu allelach oznacza psa posiadającego normalny genotyp. 2. Sposób według zastrz. 1 znamienny tym, że obecność lub brak delecji bada się metodą amplifikacji DNA z następczą identyfikacją produktów amplifikacji. 3. Sposób według zastrz. 2 znamienny tym, że amplifikacji dokonuje się przy użyciu zestawu czterech starterów, znamiennych tym, że pod nieobecność delecji amplifikacja przy użyciu pierwszego i drugiego startera prowadzi do otrzymania pierwszego produktu amplifikacji obejmującego początkowe miejsce złamania delecji, amplifikacja przy użyciu trzeciego i czwartego startera prowadzi do otrzymania drugiego produktu amplifikacji obejmującego końcowe miejsce złamania delecji, zaś amplifikacja przy użyciu pierwszego i czwartego startera nie prowadzi do otrzymania wykrywalnego produktu amplifikacji; oraz tym, że w obecności delecji amplifikacja przy użyciu pierwszego i czwartego startera prowadzi do otrzymania trzeciego produktu amplifikacji, nie zawierającego regionu podlegającego delecji. 4. Sposób według zastrz. 3 znamienny tym, że pierwszy, drugi i trzeci produkt amplifikacji różnią się między sobą rozmiarem. 5. Sposób według zastrz. 2 znamienny tym, że pierwszy starter odpowiada sekwencji położonej powyżej początkowego miejsca złamania delecji, czwarty starter odpowiada sekwencji położonej poniżej końcowego miejsca złamania delecji, zaś drugi i trzeci starter odpowiadają sekwencjom w regionie podlegającym delecji. 6. Sposób według zastrz. 3 znamienny tym, że amplifikacja przy użyciu pierwszego i drugiego startera, amplifikacja przy użyciu trzeciego i czwartego startera oraz amplifikacja przy użyciu pierwszego i czwartego startera prowadzone są w oddzielnych reakcjach. 7. Sposób według zastrz. 3 znamienny tym, że amplifikacja przy użyciu pierwszego i drugiego startera, amplifikacja przy użyciu trzeciego i czwartego startera oraz amplifikacja przy użyciu pierwszego i czwartego startera prowadzone są w tej samej reakcji. 8. Sposób według zastrz. 3 znamienny tym, że pierwszy starter posiada sekwencję SEQ ID NO:2, drugi starter posiada sekwencję SEQ ID NO:4, trzeci starter posiada sekwencję SEQ ID NO:6, zaś czwarty starter posiada sekwencję SEQ ID NO:8.

26 25 9. Sposób według zastrz. 3 znamienny tym, że pierwszy produkt amplifikacji zawiera sekwencję SEQ ID NO: Sposób według zastrz. 3 znamienny tym, że drugi produkt amplifikacji zawiera sekwencję SEQ ID NO: Metoda określona w zastrzeżeniu 3 znamienna tym, że trzeci produkt amplifikacji zawiera sekwencję SEQ ID NO: Metoda określona w zastrzeżeniu 1 znamienna tym, że próbka biologiczna pochodzi z grupy obejmującej krew, włosy, zeskrobiny błony śluzowej, nasienie, biopsję tkanki i ślinę. 13. Sposób według zastrz. 12 znamienny tym, że próbkę biologiczną stanowi krew. 14. Sposób według zastrz. 1 znamienny tym, że pies pochodzi z grupy obejmującej owczarki szkockie Rough Collie i Smooth Collie, Border Collie, owczarki australijskie, owczarki rasy Lancashire Heeler oraz owczarki szetlandzkie. 15. Zestaw do identyfikacji psa jako posiadającego normalny genotyp, heterozygotycznego lub homozygotycznego pod względem mutacji w regionie chromosomu 37, odpowiedzialnej za anomalię oczu collie, przy czym rzeczoną mutacją jest delecja nukleotydów odpowiadających pozycjom od 9302 do sekwencji SEQ ID NO:1, zawierający: zestaw starterów złożony z pierwszego startera, drugiego startera, trzeciego startera i czwartego startera przy czym pierwszy starter odpowiada sekwencji położonej powyżej pozycji 9301 w sekwencji SEQ ID NO:1, czwarty starter odpowiada sekwencji położonej poniżej pozycji w sekwencji SEQ ID NO:1, zaś drugi i trzeci starter odpowiadają sekwencji pomiędzy nukleotydami 9302 i w sekwencji SEQ ID NO:1, gdzie amplifikacja normalnego allelu przy użyciu pierwszego i drugiego startera prowadzi do otrzymania pierwszego produktu amplifikacji obejmującego początkowe miejsce złamania delecji, amplifikacja przy użyciu trzeciego i czwartego startera prowadzi do otrzymania drugiego produktu amplifikacji obejmującego końcowe miejsce złamania delecji, zaś amplifikacja przy użyciu pierwszego i czwartego startera prowadzi do otrzymania trzeciego produktu amplifikacji tylko w przypadku allelu z delecją. 16. Zestaw określony w zastrzeżeniu 15 znamienny tym, że pierwszy starter posiada sekwencję SEQ ID NO:2, drugi starter posiada sekwencję SEQ ID NO:4, trzeci starter posiada sekwencję SEQ ID NO:6, zaś czwarty starter posiada sekwencję SEQ ID NO:8. Dorota Rzążewska Rzecznik patentowy

27 26 Fig. 1A

28 27 Fig. 1B

29 28 Fig. 1C

30 29 Fig. 1D

31 30 Fig. 1E

32 31 Fig. 1F

33 32 Delecja CEA Przedział niezrównoważenia sprzężeń dla CEA Fig. 2

34 33 Fig. 3A Fig. 3B

35 34 Fig. 4A Fig. 4B

36 35 Test CEA Fig. 5

37 36 Fig. 6