Choroby kwarantannowe

Transkrypt

1 Ziemniak Polski 2007 nr 1 25 Choroby kwarantannowe METODY WYKRYWANIA I IDENTYFIKACJI CLAVIBACTER MICHIGANENSIS SUBSP. SEPEDONICUS, SPRAWCY BAKTERIOZY PIERŚCIENIOWEJ ZIEMNIAKA STAN OBECNY I PERSPEKTYWY NA PRZYSZŁOŚĆ mgr inż. Sebastian Brzozowski IHAR Radzików, Błonie, Zakład Fitopatologii, Pracownia Hodowli Odpornościowej s.brzozowski@ihar.edu.pl B akteria Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (Spieckermann i Kotthoff) Davis i in. jest sprawcą bakteriozy pierścieniowej ziemniaka, która ma status choroby kwarantannowej. W krajach należących do Unii Europejskiej obowiązują odpowiednie regulacje prawne, szczegółowo określające procedury zwalczania i zapobiegania rozprzestrzenianiu się choroby (Dyrektywa 93/98/EEC). Aktem prawnym obowiązującym w Polsce i kompatybilnym z Dyrektywą UE jest Rozporządzenie Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi z dnia 13 kwietnia 2005 roku w sprawie szczegółowych sposobów postępowania przy zwalczaniu i zapobieganiu rozprzestrzenianiu się C. michiganensis subsp. sepedonicus. Bakterioza pierścieniowa ziemniaka jest notowana w wielu krajach świata, także w Polsce. W ostatnich latach w naszym kraju jej występowanie nasiliło się i jest realnym zagrożeniem dla produkcji nasiennej. Utrudnia także krajowy obrót ziemniakami i w ramach UE, a także w eksporcie do krajów trzecich. Wieloletnie programy zwalczania patogenu, wdrażane w Europie Zachodniej, przyniosły bardzo dobry efekt, ale niestety nie doprowadziły do całkowitej likwidacji choroby (EPPO/CABI 1997). Mimo usilnych starań i rygorystycznego przestrzegania przepisów fitosanitarnych w krajach UE nadal pojawiają się sporadyczne doniesienia o jej wystąpieniu. Należy zatem podkreślić, że bakterioza pierścieniowa ziemniaka stwarza ogromne problemy nie tylko Polsce, gdzie występuje w dużym nasileniu, ale także w krajach UE, w których od dawna prowadzi się walkę z tym nad wyraz kłopotliwym agrofagiem kwarantannowym. Problemy z C. michiganensis subsp. sepedonicus wynikają między innymi z braku dostatecznie czułych metod jej wykrywania i identyfikacji. Poszukiwanie nowych, a także doskonalenie już znanych metod jest sprawą priorytetową. Metody stosowane obecnie w badaniach rutynowych W Polsce kontrolę fitosanitarną prowadzi Państwowa Inspekcja Ochrony Roślin i Nasiennictwa. Jej zadaniem jest między innymi monitorowanie i ocena stanu zagrożenia roślin uprawnych przez organizmy kwarantannowe. Procedury wykrywania i identyfikacji C. michiganensis subsp. sepedonicus stosowane rutynowo przez Wojewódzkie Inspektoraty Ochrony Roślin i Nasiennictwa obejmują test pośredniej immunofluorescencji (IFAS), test biologiczny oraz izolację bakterii na pożywkach półselektywnych. Jak dotąd opracowano dwie pożywki półselektywne do izolacji tego patogenu: NCP-88 zawierającą w składzie między innymi antybiotyki: siarczan polimyksyny B, kwas nalidiksowy oraz cykloheksimid oraz MTNA zawierającą trimetoprim, kwas nalidiksowy i amfoterycynę B (De la Cruz i in. 1992; Jansing, Rudolph 1998). Niestety, nie opracowano dotychczas dla C. michiganensis subsp. sepedonicus pożywki selektywnej. Ekstrakty z porażonych przez patogen bulw ziemniaka, z których najczęściej wykonuje się izolację, mogą zawierać wiele in-

2 26 Ziemniak Polski 2007 nr 1 nych gatunków bakterii saprofitycznych, charakteryzujących się szybkim wzrostem na pożywkach. Przy bezpośrednim posiewie ekstraktów na pożywkę półselektywną bakterie inne niż C. michiganensis subsp. sepedonicus, rozmnażające się znacznie szybciej, pokrywają całą jej powierzchnię, co uniemożliwia skuteczną izolację czystych szczepów patogenu. Izolacja na półselektywnej pożywce daje najlepsze efekty, gdy jest poprzedzona inokulacją roślin bakłażana ekstraktem, z którego izoluje się patogen. Zakażone rośliny bakłażana są dobrym środowiskiem dla selektywnego rozmnażania sprawcy bakteriozy pierścieniowej ziemniaka. Obecnie powszechnie stosowana jest metoda serologiczna immunofluorescencji pośredniej IFAS (De Boer, Copeman 1980). Technika immunoflurescencji umożliwia obserwację w mikroskopie fluorescencyjnym efektu reakcji serologicznej w postaci fluorescencji komórek bakteryjnych, jak również ocenę ich morfologii (kształt, wielkość, wzajemne ułożenie). Składa się z dwóch głównych etapów. W pierwszym etapie utrwalona na szkiełku podstawowym zawiesina bakterii traktowana jest surowicą zawierającą nieznakowane specyficzne przeciwciała anty- -Cms. Po inkubacji i wypłukaniu nadmiaru niezwiązanych przeciwciał w etapie drugim stosuje się znakowaną barwnikiem surowicę z przeciwciałami przeciwko nieznakowanym immunoglobulinom zastosowanym wcześniej. W pozytywnych preparatach widoczne są komórki bakteryjne o typowej morfologii, z fluoryzującą ścianą komórkową wyraźnie widoczną na ciemnym tle. Granice wykrywalności testu IFAS mieszczą się w zakresie komórek bakterii w 1 ml ekstraktu z tkanki ziemniaka. W niesprzyjających warunkach C. michiganensis subsp. sepedonicus rozmnaża się bardzo wolno w roślinie i może występować w stężeniu niższym, niż wynosi granica wykrywalności testu. Przy stosowaniu przeciwciał poliklonalnych dodatkową wadą testu IFAS jest możliwość występowania reakcji krzyżowych. Można je wyeliminować, stosując przeciwciała monoklonalne, co jednak zwiększa koszty badania (De Boer, Wieczorek 1984). Pozytywne wyniki testu IFAS wymagają potwierdzenia w teście patogeniczności na oberżynie. Młode siewki inokuluje się ekstraktem z bulw przygotowanym w trakcie wykonywania testu IFAS, na odcinku łodygi pomiędzy liścieniami a pierwszym liściem, po czym rośliny inkubuje w ściśle określonych warunkach temperatury (optymalna 23ºC), przy wysokiej wilgotności i szesnastogodzinnym dniu. Wadą metody biologicznej jest jej czasochłonność, wymagane jest bowiem, aby test dla potwierdzenia obecności i wirulencji C. michiganensis subsp. sepedonicus trwał 40 dni. Granica wykrywalności testu na oberżynie mieści się również w zakresie komórek bakterii w 1 ml ekstraktu z tkanki ziemniaka. Bakterie C. michiganensis subsp. sepedonicus mogą występować w roślinach ziemniaka w bardzo niskim stężeniu, poniżej progu wykrywalności stosowanych obecnie rutynowo metod. Nowe techniki wykrywania i identyfikacji Techniki molekularne polegające na wykrywaniu amplifikowanego fragmentu genomu bakteryjnego z zastosowaniem starterów unikatowych dla danego patogenu (klasyczny PCR) są bardzo szybkie, czułe i specyficzne, ale mimo to nie stosuje się ich w rutynowych badaniach ze względu na słabą powtarzalność wyników (Alvarez 2004). Kolejnym krokiem w rozwoju metod detekcji było zmodyfikowanie klasycznego PCR i w efekcie opracowanie szczegółowego protokołu wykrywania C. michiganensis subsp. sepedonicus powodującego bakteriozę pierścieniową ziemniaka za pomocą metody określanej jako multiplexed PCR-ELISA (Mills, Russell 2003). Zarówno klasyczny PCR, jak i jego modyfikacja (PCR-ELISA) z zastosowaniem specyficznych starterów pozwala wykrywać nie tylko żywe, ale także martwe komórki C. michiganensis subsp. sepedonicus. Jest to główny powód, dla którego obie wymienione wyżej techniki nie są stosowane w badaniach rutynowych. Ich pozytywny wynik, podobnie jak w przypadku testu IFAS, wymaga potwierdzenia testem patogeniczności na oberżynie. Techniki molekularne tego typu mogą być zatem stosowane jedynie jako pomocnicze, potwierdzające wyniki uzyskane w teście IFAS.

3 Ziemniak Polski 2007 nr 1 27 Idealnym rozwiązaniem byłaby metoda pozwalająca nie tylko na wykrycie patogenu, ale również na określenie jego żywotności. Stwierdzenie, czy organizm wywołujący chorobę jest w stanie rozmnażać się i infekować rośliny gospodarza, jest niezbędne i konieczne w diagnostyce fitopatologicznej. W ostatnich latach adaptowano kilka molekularnych technik wykrywania i identyfikacji C. michiganensis subsp. sepedonicus, za pomocą których można stwierdzić, czy bakterie obecne w badanej próbie były żywe, czy martwe. Są to: fluorescencyjna hybrydyzacja in situ FISH (Li i in. 1997), BIO-PCR z zastosowaniem analizy przyrostu ilości produktu w czasie rzeczywistym Real-time PCR (Schaad i in. 1999) oraz metoda izotermicznej amplifikacji kwasu nukleinowego NASBA (Van Beckhoven i in. 2002). Klasyczny PCR Zaprojektowano szereg specyficznych starterów do amplifikacji fragmentów genomowego lub plazmidowego DNA C. michiganensis subsp. sepedonicus. Znanych jest wiele prac na temat zastosowania PCR do wykrywania sprawcy bakteriozy pierścieniowej ziemniaka. Dotyczą one sposobu opracowania starterów do PCR, optymalizacji warunków jej przebiegu oraz porównania z innymi metodami (Schneider i in. 2003; Li, De Boer 1995; Lee i in. 1997; Hu i in. 1995; Firrao, Lozzi 1994; Pastrik, Rainer 1999). Ekstrakty z bulw ziemniaka zawierają dużo inhibitorów polimerazy DNA hamujących reakcję PCR i nie zawsze możliwych do usunięcia w trakcie izolacji DNA. Jest to istotny powód stosunkowo słabej powtarzalności wyników testów molekularnych. Multiplexed PCR-ELISA Technika łączy w sobie dwie metody: molekularną i serologiczną. Procedura opracowana przez Mills i Russell (2003) obejmuje dwa etapy. W pierwszym powiela się 3 specyficzne fragmenty genomu C. michiganensis subsp. sepedonicus różnej wielkości: 164, 193 i 205 nukletydów. Informacje dotyczące starterów przedstawiono w tabeli 1. Nazwa starteru Cms 6 Cms 7 A 47 A A47 B Sp 1f Sp 5r Cms 50 F Cms 50 R Cms 72 F Cms 72 R Cms 85 F Cms 85 R PSA-1 PSA-R Startery wykorzystywane do wykrywania Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus przy zastosowaniu PCR Region amplifikowanego DNA DNA plazmidowe DNA plazmidowe Region ITS Region ITS Region ITS Sekwencja starterów 5-3 CGC TCT CCC TCA CCA GAC TC TCC CGT GCT TGC CTG CGT TG CAC CCC TCG ACT GCG AGA AAC G TCC TCC GAG ACT TTC GGG ACG C CCT TGT GGG GTG GGA AAA TGT GAT CCA CCG GGT AAA GAG CGC GAT AGA AGA GG TCC TGA GCA ACG ACA AGA AAA AGT TCG AGT TGA TAG CAA TCC GTG TCT CGG ATT CAC GAT CAC C AAG ATC AGA AGC GAC CCG CC TCG CAC AGC CAA ATC CAG C CTC CTT GTG GGG TGG GAA AA TAC TGA GAT GTT TCA CTT CCC C Wielkość produktu (pz) Tabela 1 Piśmiennictwo W następnym etapie produkty amplifikacji wykrywa się za pomocą testu ELISA. Technika Multiplexed PCR-ELISA charakteryzuje się bardzo wysoką specyficznością, co wyklucza z dużym prawdopodobieństwem reakcje fałszywie pozytywne, ponadto metoda zawiera kontrolę amplifikacji. Polega ona na tym, że do mieszaniny reakcyjnej dodaje się fragment DNA o długości 253 par zasad (SA72), pochodzący z genomu ukwiału. Je-

4 28 Ziemniak Polski 2007 nr 1 go końce są komplementarne do starterów Cms 72 F i Cms 72 R, co powoduje, że jest on przez nie powielany. Zastosowanie starterów, które powielają zarówno matrycę SA72, jak i fragment genomu bakterii C. michiganensis subsp. sepedonicus, umożliwia w przypadku braku produktu specyficznego dla bakterii stwierdzenie, że warunki reakcji amplifikacji były poprawne. Doświadczenia wykonane przez amerykański zespół wykazały, że PCR-ELISA jest bardziej czuły od standardowego PCR z zastosowaniem elektroforetycznego rozdziału produktów, a także dokładniejszy w porównaniu z testami serologicznymi (Mills, Russell 2003). Real-time PCR Łańcuchowa reakcja polimerazy z analizą przyrostu ilości produktu w czasie rzeczywistym (Real-Time PCR) jest najnowszą techniką, wykorzystywaną także w fitopatologii do wykrywania wielu bakteryjnych patogenów roślin. Jej istotą jest użycie sond fluorescencyjnych w połączeniu z klasyczną łańcuchową reakcją polimerazy (PCR). Opracowano kilka rodzajów sond posiadających w swojej budowie różne fluorochromy, typu TaqMan, Molecular Beacon, SYBR Green I i inne. Ich cechą wspólną jest połączenie z barwnikami fluorescencyjnymi, które wzbudzone emitują fale świetlne o odpowiedniej długości, gdy reakcja PCR przebiega prawidłowo, prowadząc do powstania specyficznego produktu. Natężenie emisji światła o odpowiedniej długości fali jest monitorowane i wzrasta proporcjonalne do ilości kopii amplifikowanej sekwencji DNA. Real-Time PCR ma wiele zalet, świadczących o jego wyższości nad klasycznym PCR: jest łatwiejszy do wykonania, mniej wrażliwy na zanieczyszczenia, będące przyczyną fałszywie pozytywnych wyników, i nie wymaga specjalistycznej aparatury do przeprowadzania elektroforetycznego rozdziału produktów amplifikacji. Optymalizacja warunków Real-Time PCR jest łatwiejsza w porównaniu z klasycznym PCR, może on być również zastosowany jako Multiplex- -PCR do wykrywania kilku patogenów jednocześnie (Alvarez 2004). Metoda Real-Time PCR ma jeszcze jedną bardzo ważną zaletę: możliwość ilościowego oznaczania matrycowego DNA w mieszaninie reakcyjnej, a tym samym oznaczania liczebności bakterii w badanej próbie. Poprzez eliminację etapu elektroforezy usunięto zagrożenie wynikające z użycia rakotwórczego bromku etydyny niezbędnego do wizualizacji DNA na żelu agarozowym. Stosowanie Real-time PCR ma również jedną zasadniczą wadę. Jest nią wysoka cena aparatury do przeprowadzania reakcji PCR i odczytu jej wyniku w czasie rzeczywistym, która uniemożliwia wykorzystanie tej techniki w małych laboratoriach diagnostycznych. Poprzedzenie amplifikacji Real-Time PCR etapem wzbogacania badanego ekstraktu, określanego mianem BIO-PCR, zwiększa czułość testu. W pierwszym etapie wykonuje się posiew części uzyskanego ekstraktu bakteryjnego na pożywkę półselektywną w celu namnożenia żywych bakterii. Po 48 lub 72 godzinach inkubacji w temperaturze optymalnej dla wzrostu C. michiganensis subsp. sepedonicus, wynoszącej 23ºC, kolonie wyrosłe na pożywce spłukuje się, a uzyskany ekstrakt analizuje Real-Time PCR (Schaad i in. 1999). Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) Hybrydyzacja in situ oraz metody immunocytochemiczne są technikami, które znalazły szerokie zastosowanie w wykrywaniu specyficznych sekwencji DNA, RNA, białek i innych biopolimerów w komórkach oraz określaniu ich dokładnej lokalizacji w przestrzeni. Opracowano metodę wykrywania C. michiganensis subsp. sepedonicus, która łączy fluorescencyjną hybrydyzaję in situ z pośrednią immunofluorescencją IFAS (Li i in. 1997). Identyfikacja bakterii odbywa się na podstawie dwóch różnych reakcji. Pierwsza z nich to klasyczna technika pośredniego immunofluorescencyjnego barwienia komórek bakterii C. michiganensis subsp. sepedonicus z użyciem zestawu dwóch przeciwciał monoklonalnych: anty-cms oraz koniugatu sprzężonego z izotiocyjanianem fluoresceiny. Druga reakcja polega na hybrydyzacji znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym (izotiocyjanianem tetrametylorodaminy) oligonukleotydowych sond z komplementarnymi fragmentami genu 16S rrna w komórkach C. michiganensis subsp. sepedonicus.

5 Ziemniak Polski 2007 nr 1 29 Połączenie dwóch technik w jednym teście świadczy niewątpliwie o wyższości metody FISH nad testem IFAS, w którym wykorzystuje się tylko znakowane fluorescencyjnie przeciwciała. Stosując odmienne barwniki fluorescencyjne dla sondy oligonukleotydowej i specyficznych przeciwciał, można odróżnić żywe komórki bakterii od martwych, ponieważ po śmierci komórki RNA jest szybko degradowane, a to uniemożliwia przyłączenie sond oligonukleotydowych. Różnice pomiędzy komórkami martwymi i żywymi można łatwo zauważyć w mikroskopie fluorescencyjnym sprzężonym z komputerowym systemem analizy obrazu. Komórki martwe będą wykazywały tylko fluorescencję w kolorze zielonym, wynikającym z przyłączenia specyficznych przeciwciał sprzężonych z izotiocyjanianem fluoresceiny. Żywe bakterie będą widoczne na obrazie mikroskopowym dzięki fluorescencji barwników z obu rodzajów sond. Izotermiczna amplifikacja sekwencji kwasu nukleinowego (NASBA) W krótkim czasie po śmierci komórki RNA jest degradowane przez wewnątrzkomórkowe rybonukleazy, czego nie obserwuje się w wypadku DNA. Pozwoliło to opracować metodę wykrywania żywych komórek określaną jako AmpliDet RNA, polegającą na wykrywaniu amplifikowanej sekwencji kwasu rybonukleinowego. Van Beckhoven i inni (2002) zaadaptowali AmpliDet RNA do wykrywania żywych komórek bakterii C. michiganensis subsp. sepedonicus. Metoda ta bazuje na izotermicznej amplifikacji sekwencji kwasów nukleinowych (NASBA) połączonej z analizą przyrostu ilości produktu w czasie rzeczywistym z zastosowaniem sondy typu Molecular Beacon. Istotą jest wykrywanie specyficznego fragmentu RNA, a nie DNA, jak w wypadku klasycznej reakcji PCR. NASBA opiera się na współdziałaniu trzech enzymów: odwrotnej transkryptazy AMV, rybonukleazy H oraz polimerazy T7 RNA. Matrycą do amplifikacji jest specyficzny fragment 16S rrna C. michiganensis subsp. sepedonicus, którego sekwencja w pierwszym etapie procesu, przy udziale odwrotnej transkryptazy AMV, jest przepisywana na sekwencję DNA. Powstaje w ten sposób nić hybrydowego RNA-DNA, w której nić RNA jest degradowana przez rybonukleazę H. Odwrotna transkryptaza AMV, ujawniając aktywność polimerazy DNA, przeprowadza proces enzymatycznego dobudowania drugiej nici DNA do nici DNA, powstałej na matrycy RNA. Polimeraza T7 RNA jest odpowiedzialna za transkrypcję sekwencji z podwójnej nici DNA na fragmenty RNA, które są wykrywane przez sondę molekularną. Sonda typu Molecular Beacon to odcinek DNA posiadający sekwencje komplementarne wobec siebie, dzięki którym tworzy strukturę tzw. spinki do włosów. Na obu końcach pojedynczej sondy związane są dwie cząsteczki, z których jedna jest fluorochromem, a druga wygaszaczem. Struktura spinki zbliża obie cząsteczki do siebie. W obecności światła o odpowiedniej długości fali fluorochrom na jednym końcu zostaje wzbudzony, lecz nie emituje światła, gdyż wygaszacz przechwytuje jego energię. W momencie gdy sonda hybrydyzuje do komplementarnej sekwencji RNA na amplifikowanym fragmencie, fluorochrom zostaje przestrzennie odizolowany od wygaszacza i emituje światło. Natężenie emisji światła o odpowiedniej długości fali jest monitorowane i proporcjonalne do ilości kopii badanej sekwencji RNA. NASBA jest obecnie najnowocześniejszą metodą wykrywania C. michiganensis subsp. sepedonicus, prawdopodobnie jej optymalizacja i przetestowanie na większej liczbie prób pozwoli na wdrożenie jej do rutynowych testów. Mimo stosowania różnych technik wykrycie C. michiganensis subsp. sepedonicus w materiale roślinnym nastręcza wielu trudności. Metoda IFAS oraz biologiczny test patogeniczności na oberżynie mają niedostateczną czułość, rzędu komórek bakterii w 1 ml ekstraktu z tkanki ziemniaka. Pozytywne wyniki testu IFAS muszą zostać potwierdzone testem patogeniczności, co wymaga dużych nakładów pracy i wydłuża okres diagnozy. Nowe metody wykrywania i identyfikacji C. michiganensis subsp. sepedonicus mają wyższą czułość w porównaniu z metodami stosowanymi obecnie rutynowo. Mała czasoi pracochłonność testów NASBA oraz BIO- PCR, a także możliwość wykrywania jedynie żywych bakterii C. michiganensis subsp. sepedonicus to bardzo ważne czynniki

6 30 Ziemniak Polski 2007 nr 1 świadczące o ich wyższości nad stosowanymi dziś rutynowo metodami. Standaryzacja metod pozwoliłaby znacznie skrócić czas diagnozy patogenu. Ma to szczególne znaczenie w przypadkach, gdy konieczne jest szybkie zbadanie materiału pod kątem obecności sprawcy bakteriozy pierścieniowej ziemniaka. Nowo opracowane metody diagnostyczne wymagają jeszcze poprawienia wielu szczegółów, ale można już jednoznacznie stwierdzić, że są one doskonałym narzędziem do badań epidemiologicznych. NASBA i BIO- PCR będą zapewne w przyszłości stosowane jako dodatkowe testy wykrywania C. michiganensis subsp. sepedonicus, a być może zastąpią stosowany obecnie rutynowo test IFAS oraz test patogeniczności na oberżynie. Literatura 1. Alvarez A.M Integrated approaches for detection of plant pathogenic bacteria and diagnosis of bacterial diseases. Ann. Rev. Phytopathol. 42: ; 2. De Boer S.H., Copeman R.J Bacterial ring rot testing with the indirect fluorescent antibody staining procedure. Am. Pot. J. 57: ; 3. De Boer S.H., Wieczorek A Production of monoclonal antibodies to Corynebacterium sepedonicum. Phytopathology 74: ; 4. De la Cruz A.R., Wiese M.V., Schaad N.W A semiselective agar medium for isolation of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus from potato tissues. Plant Dis. 76, ; 5. Dyrektywa Rady Wspólnoty Europejskiej 93/85/EEC z dnia 4 października 1993 dotycząca zwalczania bakteriozy pierścieniowej ziemniaka; 6. EPPO/CABI Quarantine Pests for Europe. Second edition: ; 7. Firrao G.R., Lozzi R Identification of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus using polymerase chain reaction. Can. J. Microbiol. 40: ; 8. Hu X., Lai F.M., Reddy A.S.N., Ishimaru C.A Quantitative detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus by polymerase chain reaction. Phytopathology 85(12): ; 9. Jansing H., Rudolph K Physiological capabilities of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus and development of a semiselective medium Z. Pflanzenkrankh. Pflanzensch. 105(6): ; 10. Lee I.M., Bartoszczyk I.M., Gundersen D.E., Mogen D., Davis R.E Nested PCR for ultrasensitive detection of the potato ring rot bacterium, Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Appl. Environ. Microbiol. 63: ; 11. Li X., De Boer S.H Selection of polymerase chain reaction primers from an RNA intergenic spacer region for specific detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Phytopathology 85: ; 12. Li X., De Boer S.H., Ward L.J Improved microscopic identification of Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus cells by combining in situ hybridization with immunofluorescence. Lett. Appl. Microbiol. 24: ; 13. Mills D., Russell B.W Parameters for specific detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato stems and tubers by multiplexed PCR-ELISA. Am. J. Potato Res. 80: ; 14. Pastrik K.H., Rainey F.A Identification and differentiation of Clavibacter michiganensis subspecies by polymerase chain reaction-based techniques. J. Phytopath. 147: ; 15. Rozp. MRiRW z dn. 13 kwietnia 2004 r. w sprawie szczegółowych sposobów postępowania przy zwalczaniu i zapobieganiu rozprzestrzenianiu się bakterii Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Dz. U. Nr 75, poz. 709; 16. Schaad N.W., Berthier- Schaad Y., Sechler A., Knorr D Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by BIO-PCR and an automated real-time detection system. Plant Dis. 83: ; 17. Schneider B.J., Zhao J.L., Orser C.D Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus by DNA amplification. FEMS Microbiol. Lett. 109: ; 18. Van Beckhoven J.R.C.M., Stead D.E., van der Wolf J.M Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus by AmpliDet RNA, a new technology based on real time monitoring of NASBA amplicons with a molecular beacon. J. Appl. Microbiol. 93: