(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Podobne dokumenty
(62) Numer zgłoszenia, z którego nastąpiło wydzielenie: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/IB04/000844

WYNALAZKI BIOTECHNOLOGICZNE W POLSCE. Ewa Waszkowska ekspert UPRP

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

starszych na półkuli zachodniej. Typową cechą choroby jest heterogenny przebieg

Promotor: prof. dr hab. Katarzyna Bogunia-Kubik Promotor pomocniczy: dr inż. Agnieszka Chrobak

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Inwestycja w przyszłość czyli znaczenie ochrony własności przemysłowej dla współczesnej biotechnologii

Agenda: Wynalazek jako własnośd intelektualna. Co może byd wynalazkiem. Wynalazek biotechnologiczny. Ochrona patentowa

POSTĘPY W LECZENIU PBL

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

PODSTAWY IMMUNOLOGII Komórki i cząsteczki biorące udział w odporności nabytej (cz. III): Aktywacja i funkcje efektorowe limfocytów B

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Leczenie biologiczne co to znaczy?

LEKI CHEMICZNE A LEKI BIOLOGICZNE

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Immunologia komórkowa

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

ROZPORZĄDZENIE KOMISJI (UE) / z dnia r.

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) (13) T3 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

oporność odporność oporność odporność odporność oporność

Inwestycja w przyszłość czyli znaczenie ochrony własności przemysłowej dla współczesnej biotechnologii

FOCUS Plus - Silniejsza ryba radzi sobie lepiej w trudnych warunkach

Część praktyczna: Metody pozyskiwania komórek do badań laboratoryjnych cz. I

PODSTAWY IMMUNOLOGII Komórki i cząsteczki biorące udział w odporności nabytej (cz.i): wprowadzenie (komórki, receptory, rozwój odporności nabytej)

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

PL B1. GENENTECH, INC., South San Francisco, US , US, 60/434, , US, 60/526,163

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

(96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) (13) T3 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Wybrane techniki badania białek -proteomika funkcjonalna

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

NON-HODGKIN S LYMPHOMA

Personalizacja leczenia w hematoonkologii dziecięcej

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Leki chemiczne a leki biologiczne

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Dane mikromacierzowe. Mateusz Markowicz Marta Stańska

Od probówki do pacjenta Ścieżka, którą podąża Mabion Maciej Wieczorek, Prezes Zarządu. Konferencja Wallstreet czerwca 2009, Zakopane

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Lp. tydzień wykłady seminaria ćwiczenia

Wybrane techniki badania białek -proteomika funkcjonalna

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) (13) T3 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Nowoczesne systemy ekspresji genów

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

(96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/US01/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) (13) T3 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

(96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Odporność nabyta: Nadzieja Drela Wydział Biologii UW, Zakład Immunologii

Rok akademicki:2017/2018

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Przedmiot: IMMUNOLOGIA Z IMMUNOPATOLOGIĄ Rok III Semestr V Wykłady 45 godzin Ćwiczenia 45 godzin Forma zaliczenia: Egzamin praktyczny i teoretyczny

Przewlekła białaczka limfocytowa

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Proteomika: umożliwia badanie zestawu wszystkich lub prawie wszystkich białek komórkowych

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) (13) T3 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) (13) T3 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

WNIOSEK O WYDANIE ZGODY NA ZAMKNIĘTE UŻYCIE GMO

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) (13) T3 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

PODSTAWY IMMUNOHISTOCHEMII. Determinanty antygenowe (epitopy) Surowice. Antygeny. Otrzymywanie przeciwciał poliklonalnych. poliwalentne monowalentne

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Materiał i metody. Wyniki

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt:

RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 1692182 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 0.11.04 04798998.3 (13) T3 (1) Int. Cl. C07K16/28 A61K39/39 (06.01) (06.01) (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej 07.04. Europejski Biuletyn Patentowy /14 EP 1692182 B1 (4) Tytuł wynalazku: Przeciwciała CD o zwiększonym powinowactwie wiązania z receptorem Fc oraz zwiększonej funkcji efektorowej () Pierwszeństwo: US017096P 0.11.03 (43) Zgłoszenie ogłoszono: 23.08.06 Europejski Biuletyn Patentowy 06/34 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono:.09. Wiadomości Urzędu Patentowego 09/ (73) Uprawniony z patentu: Roche Glycart AG, Schlieren, CH (72) Twórca (y) wynalazku: PL/EP 1692182 T3 UMANA Pablo, Zurich, CH BRÜNKER Peter, Hittnau, CH FERRARA KOLLER Claudia, Zug, CH SUTER Tobias, Windisch, CH PÜNTENER Ursula, Windisch, CH MÖSSNER Ekkehard, Kreuzlingen, CH (74) Pełnomocnik: Sulima Grabowska i Sierzputowska Biuro Patentów i Znaków Towarowych sp.j. rzecz. pat. Tykarski Wojciech 00-96 Warszawa skr. poczt. 6 Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

SGS-98/VAL EP 1 692 182 B1 Opis TŁO WYNALAZKU Dziedzina wynalazku [0001] Niniejszy wynalazek dotyczy cząsteczek wiąŝących antygen (ABM). W konkretnych postaciach niniejszy wynalazek dotyczy rekombinowanych przeciwciał monoklonalnych, a dokładnie humanizowanych przeciwciał specyficznych względem ludzkiego CD. Ponadto niniejszy wynalazek dotyczy cząsteczek kwasu nukleinowego kodujących takie ABM oraz wektorów i komórek gospodarzy zawierających takie cząsteczki kwasu nukleinowego. Wynalazek dotyczy takŝe sposobów wytwarzania ABM według wynalazku oraz sposobów stosowania tych ABM w leczeniu choroby. Ponadto niniejszy wynalazek dotyczy ABM o zmodyfikowanej glikozylacji, mających ulepszone właściwości terapeutyczne, włącznie z przeciwciałami o zwiększonym wiązaniu z receptorem Fc oraz zwiększonej funkcji efektorowej. Tło wynalazku Układ immunologiczny i przeciwciała przeciw-cd 1 2 [0002] Układ immunologiczny kręgowców, włącznie z ludźmi, składa się z szeregu narządów i typów komórek, które wykształciły się do dokładnego i specyficznego rozpoznawania, wiązania i niszczenia atakujących obcych drobnoustrojów ( antygenów ). Limfocyty odgrywają kluczową rolę w prawidłowym funkcjonowaniu układu immunologicznego. Komórki te są wytwarzane przez grasicę, śledzionę i szpik kostny (u osób dorosłych), i stanowią około % wszystkich białych ciałek krwi obecnych w krąŝeniu dorosłych ludzi. Istnieją dwie główne subpopulacje limfocytów: komórki T i komórki B. Komórki T są odpowiedzialne za odpowiedź, w której pośredniczą komórki, podczas gdy komórki B są odpowiedzialne za wytwarzanie przeciwciał (odporność humoralna). JednakŜe w typowej odpowiedzi immunologicznej komórki T i komórki B działają współzaleŝnie: komórki T są aktywowane, gdy receptor komórki T zwiąŝe się z fragmentami antygenu, które są związane z glikoproteinami głównego kompleksu zgodności tkankowej ( MHC ) na powierzchni komórki prezentującej antygen; taka aktywacja powoduje uwolnienie biologicznych przekaźników sygnału ( interleukin ), które stymulują komórki B do róŝnicowania i wytwarzania przeciwciał ( immunoglobulin ) przeciw temu antygenowi. [0003] KaŜda komórka B w organizmie gospodarza eksprymuje przeciwciało jednego

2 1 2 3 konkretnego typu i specyficzności, a róŝne komórki B eksprymują przeciwciała specyficzne względem róŝnych antygenów. Proliferacja komórki B i wytwarzanie przeciwciał powstają w wyniku reakcji na obcy antygen i zazwyczaj obydwie zanikają (lub zasadniczo spadają) po zneutralizowaniu obcego antygenu. JednakŜe czasami proliferacja konkretnej komórki B będzie trwale kontynuowana; taka proliferacja moŝe prowadzić do wytworzenia nowotworu określanego jako chłoniak z limfocytów B. [0004] Zarówno komórki T jak i komórki B zawierają białka powierzchniowe, które mogą zostać wykorzystane jako markery do ich odróŝnienia i identyfikacji. Jednym z takich markerów komórek B jest ludzki antygen róŝnicowania Bp3 ograniczony do limfocytów B, określany jako CD. CD jest eksprymowany podczas wczesnego rozwoju komórek pre-b i pozostaje do czasu zróŝnicowania w komórki plazmatyczne. W szczególności, cząsteczka CD moŝe regulować etap w procesie aktywacji, który jest wymagany do rozpoczęcia cyklu komórkowego i róŝnicowania oraz zazwyczaj jest eksprymowana na bardzo wysokim poziomie na neoplastycznych ( nowotworowych ) komórkach B. PoniewaŜ CD jest obecna na wysokim poziomie na złośliwych komórkach B, tj. takich komórkach B, których nieustająca proliferacja moŝe prowadzić do chłoniaka z limfocytów B, antygen powierzchniowy CD moŝe potencjalnie słuŝyć jako kandydat do ukierunkowania terapii do chłoniaków z limfocytów B. [000] W istocie rzeczy takie ukierunkowanie moŝna uogólnić w następujący sposób: przeciwciała specyficzne względem antygenu powierzchniowego komórek B CD są wprowadzane do organizmu pacjenta, przykładowo przez iniekcję. Te przeciwciała przeciw-cd specyficznie wiąŝą antygen powierzchniowy CD (pozornie) zarówno komórek normalnych, jak i nowotworowych komórek B; przeciwciało przeciw-cd związane z antygenem powierzchniowym CD moŝe doprowadzić do zniszczenia i ubytku nowotworowych komórek B. Ponadto środki chemiczne lub znaczniki radioaktywne wykazujące potencjał niszczenia nowotworu mogą zostać sprzęŝone z przeciwciałem przeciw-cd tak, Ŝe środek ten jest specyficznie dostarczany, np. do nowotworowych komórek B. Bez względu na rozwiązanie, głównym celem jest zniszczenie nowotworu: specyficzne rozwiązanie moŝe zostać wyznaczone przez konkretne przeciwciało przeciw-cd, które jest stosowane, a zatem dostępne rozwiązania ukierunkowania na antygen CD mogą się znacząco róŝnić. [0006] NiesprzęŜone przeciwciała monoklonalne (mab) mogą być przydatnymi lekami do leczenia nowotworów, na co wskazuje zatwierdzenie przez U.S. Food and Drug Administration leku Rituximab (Rituxan ; IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA, oraz Genentech Inc., San Francisco, CA) do leczenia CD-pozytywnego chłoniaka z limfocytów B o

3 1 2 3 niskim stopniu złośliwości lub grudkowego chłoniaka nieziarniczego, Trastuzumab (Herceptin ; Genentech Inc) do leczenia zaawansowanych nowotworów sutka (Grillo-Lopez, A.-J. i wsp., Semin. Oncol. 26:66-73 (1999); Goldenberg, M. M., Clin. Ther. 21:9-18 (1999)), Gemtuzumab (Mylotarg, Celltech/Wyeth-Ayerst) do leczenia nawracającej ostrej białaczki szpikowej oraz Alemtuzumab (CAMPATH, Millenium Pharmaceuticals/Schering AG) do leczenia przewlekłej białaczki limfocytowej z komórek B. Sukces tych produktów zaleŝy nie tylko od ich skuteczności, ale takŝe od ich wyróŝniających się profili bezpieczeństwa (Grillo-Lopez, A.-J. i wsp., Semin. Oncol. 26:66-73 (1999); Goldenberg, M. M., Clin. Ther. 21:9-18 (1999)). Pomimo osiągnięć uzyskanych dla tych leków, nadal obecnie istnieje duŝe zainteresowanie uzyskaniem wyŝszej specyficznej aktywności przeciwciał niŝ ta, którą się zazwyczaj uzyskuje przez terapię niesprzęŝonymi mab. Mysie przeciwciało monoklonalne, B-Ly1, jest innym przeciwciałem znanym jako specyficzne względem ludzkiego CD. (Poppema, S. i Visser, L., Biotest Bulletin 3: 131-139 (1987)). WO 03/11878 opisuje glikomodyfikację przeciwciał, z uŝyciem przykładowo C2B8 (rituksanu). Dokument ten nie wspomina o B-Ly1. Polyak i wsp., Blood (02), str. 326-3262 badali epitop(y), do których wiąŝą się róŝne przeciwciała przeciw-cd. Zastosowali oni całkowicie mysie B-Ly 1 jako jedno z panelu 16 przeciwciał w doświadczeniach badających reaktywność konkretnego regionu zewnętrznej pętli CD oraz badających zdolność do wywoływania homotypowej agregacji komórek i przemieszczenia CD w błonie komórkowej. JednakŜe nie dostarczali oni sekwencji B-Ly1 i nie wytworzyli białek fuzyjnych zawierających części sekwencji B-Ly1, takich jak chimeryczne, humanizowane lub glikomodyfikowane przeciwciała, które zachowują zdolność wiązania CD. Cragg i wsp., Blood (03), str. 4-2) skorelowali pośredniczoną przez dopełniacz lizę przez róŝne przeciwciała przeciw-cd, włącznie z rytuksymabem, z segregacją CD do raft lipidowych. Cragg i wsp. w swoim badaniu nawet nie zbadali całkowicie mysiego przeciwciała B-Ly1; raczej jedynie tylko odnieśli się oni do publikacji Polyak i Deans, która wskazuje, Ŝe B-Ly1 nie dostarcza CD do raft lipidowych. Davies i wsp., Biotechnology and Bioengineering - Combinatorial Chemistry (01), str. 288-294, eksprymowali szczurzy GnTIII w komórkach CHO eksprymujących rytuksymab. Nie wspominają oni nawet mysiego B-Ly1, nie wymieniając wytwarzania polipeptydów zawierających sekwencję B-Ly1 lub glikomodyfikowane przeciwciała typu II. US 03/0007097 dotyczy rekombinowanych przeciwciał koeksprymowanych z GnTIII, ale jedyny przykład wykonania dotyczy ekspresji GnTIII w komórkach eksprymujących

4 1 2 3 rytuksymab. Przeciwciało B-Ly1 nie jest ujawnione. WO 00/67796 dotyczy sposobów leczenia chorób autoimmunologicznych antagonistami, które wiąŝą się z markerami na komórce B (np. przeciwciała przeciw-cd). Przykłady dotyczą rytuksymabu. Przeciwciało B-Ly1 nie jest ujawnione. [0007] Wyniki wielu badań sugerują, Ŝe mechanizmy zaleŝne od receptora Fc znacząco przyczyniają się do działania cytotoksycznych przeciwciał przeciw nowotworom i wskazują, Ŝe optymalne przeciwciał przeciw nowotworom będzie preferencyjnie wiązać się z receptorami aktywującymi Fc oraz minimalnie z partnerem inhibitorowym FcγRIIB. (Clynes, R. A. i wsp., Nature Medicine 6(4):443-446 (00); Kalergis, A.M., oraz Ravetch, J. V., J. Exp. Med 19S(12):163-169 (czerwiec 02). Przykładowo wyniki co najmniej jednego badania sugerują, Ŝe receptor FcγRIIIa w szczególności jest silnie związany ze skutecznością terapii przeciwciałami (Cartron, G. i wsp., Blood 99(3):74-77 (luty 02)). Badanie to pokazuje, Ŝe pacjenci homozygotyczni pod względem FcγRIIIa odpowiadają lepiej na Rytuksymab niŝ pacjenci heterozygotyczni. Autorzy wywnioskowali, Ŝe ponadprzeciętna odpowiedź wynikała z lepszego wiązania przeciwciała z FcγRIIIa in vivo, co powodowało lepszą aktywność ADCC przeciw komórkom chłoniaka (Cartron, G. i wsp., Blood 99(3):74-77 (luty 02)). [0008] Opisano róŝne próby ukierunkowania na powierzchniowy antygen CD. Doniesiono, Ŝe mysie przeciwciało monoklonalne 1F (przeciwciało przeciw-cd) podawano w ciągłym wlewie doŝylnym pacjentom z chłoniakiem z limfocytów B. Jak opisano, do zmniejszenia liczby komórek nowotworowych w krąŝeniu wymagane były wysokie poziomy (>2 gramów) 1FS, a wyniki opisano jako przejściowe. Press i wsp., Monoclonal Antibody 1F (Przeciw-CD) Serotherapy of Human B cell Lymphomas Blood 69/2:84-91 (1987). Potencjalnym problemem w przypadku tego podejścia jest to, Ŝe w nie-ludzkich przeciwciałach monoklonalnych (np. mysich przeciwciałach monoklonalnych) zazwyczaj brak jest funkcji efektorowej, tj. nie są one zdolne między innymi do pośredniczenia w zaleŝnej od dopełniacza lizie komórek lub lizie ludzkich komórek docelowych przez zaleŝną od przeciwciał toksyczność komórkową lub fagocytozę pośredniczoną przez receptor Fc. Ponadto, nie-ludzkie przeciwciała monoklonalne mogą być rozpoznawane przez ludzkiego gospodarza jako obce białko; zatem, powtarzanie wstrzyknięć takich obcych przeciwciał moŝe doprowadzić do indukcji odpowiedzi immunologicznych prowadzących do szkodliwych reakcji nadwraŝliwości. W przypadku przeciwciał monoklonalnych pochodzenia mysiego jest to często określane jako odpowiedź ludzkiego przeciwciała przeciw-mysiego lub odpowiedź HAMA. Ponadto te obce przeciwciała mogą być atakowane przez układ immunologiczny gospodarza tak, Ŝe są one ostatecznie neutralizowane

1 2 3 przed osiągnięciem swojego miejsca docelowego. [0009] Innym istotnym rozwiązaniem w ulepszaniu zdolności mysich przeciwciał monoklonalnych do skuteczności w leczeniu zaburzeń z komórek B było sprzęganie radioaktywnego znacznika lub toksyny z przeciwciałem tak, aby znacznik lub toksyna były umieszczane w miejscu nowotworu. Przykładowo, wymienione powyŝej przeciwciało 1F było znakowane jodem-131 ( 131 I ) i opisano ich ocenę biodystrybucji u dwóch pacjentów. Patrz Eary, J. F. i wsp., Imaging and Treatment of B-Cell Lymphoma J. Nuc. Med. 31/8:127-1268 (1990); patrz takŝe, Press, O. W. i wsp., Treatment of Refractory Non- Hodgkin's Lymphoma with Radiolabeled MB-1 (Przeciw-CD37) Antibody J. Clin. Onc. 7/8:27-38 (1989) (zaznaczono, Ŝe u jednego z pacjentów leczonych IF- znakowanym 131 I uzyskano częściową odpowiedź ); Goldenberg, D. M. i wsp., Targeting, Dosimetry and Radioimmunotherapy of B-Cell Lymphomas with Iodine-131-Labeled LL2 Monoclonal Antibody J. Clin. Onc. 9/4:48-64 (1991) (trzech z ośmiu pacjentów, którym podano wielokrotne wstrzyknięcia, rozwinęło odpowiedź HAMA); Appelbaum, F. R. Radiolabeled Monoclonal Antibodies in the Treatment of Non-Hodgkin's Lymphoma Hem.lOnc. Clinics of N. A. /:13-2 (1991) (praca przeglądowa); Press, O. W. i wsp. Radiolabeled-Antibody Therapy of B-Cell Lymphoma with Autologous Bone Marrow Support. New England J. Med 329/17: 1219-12223 (1993) (przeciwciała IF i Bl przeciw-cd znakowane jodem-131); oraz Kaminski, M. G. i wsp. Radioimmunotherapy of B-Cell Lymphoma with 131I Przeciw-B1 (Przeciw-CD) Antibody. New England J. Med 329/7(1993) (przeciwciało Bl przeciw-cd znakowane jodem-131; poniŝej Kaminski ). Toksyny (tj., środki chemioterapeutyczne takie jak doksorubicyna lub mitomycyna C) tak- Ŝe sprzęgani z przeciwciałami. Patrz, przykładowo, opublikowane zgłoszenie PCT WO 92/07466 (opublikowane 14 maja, 1992). [00] Chimeryczne przeciwciała zawierające części przeciwciał z dwóch lub większej liczby gatunków (np. myszy i człowieka) opracowano jako alternatywę sprzęŝonych przeciwciał. Przykładowo, Liu, A. Y. i wsp., Production of a Mouse-Human Chimeric Monoclonal Antibody to CD with Potent Fc-Dependent Biologic Activity J. Immun. 139/:321-326 (1987) opisuje mysio/ludzkie przeciwciało chimeryczne skierowane przeciw antygenowy CD. Patrz takŝe publikacja PCT nr WO 88/04936. Przykładowo rytuksymab (RITUXAN ), chimeryczne przeciwciało przeciw-cd, zostało zatwierdzone do leczenia chłoniaka nieziarniczego. [0011] Uwzględniając ekspresję CD przez chłoniaki z limfocytów B, antygen ten moŝna zastosować jako kandydata do ukierunkowania na takie chłoniaki. Zasadniczo takie ukierunkowanie moŝna uogólnić w następujący sposób: pacjentowi podaje się przeciwciała

6 1 2 specyficzne względem antygenu powierzchniowego komórek B. Te przeciwciała przeciw- CD specyficznie wiąŝą antygen CD (pozornie) zarówno normalnych, jak i złośliwych komórek B oraz przeciwciało związane z CD na powierzchni komórki powoduje zniszczenie i zmniejszenie ilości nowotworowych komórek B. Ponadto, do przeciwciała przeciw-cd moŝna pośrednio lub bezpośrednio przyłączać środki chemiczne, cytotoksyny oraz środki radioaktywne, tak, Ŝe środek jest wybiórczo dostarczany do komórek B eksprymujących antygen CD. W obydwu tych podejściach głównym celem jest zniszczenie nowotworu. Specyficzne rozwiązanie będzie zaleŝeć od konkretnego stosowanego przeciwciała przeciw-cd. Zatem wydaje się oczywiste, Ŝe róŝne rozwiązania przy ukierunkowaniu na antygen CD mogą się znacznie róŝnić. [0012] Przeciwciało rytuksymab (RITUXAN ) jest genetycznie zmodyfikowanym chimerycznym mysim przeciwciałem monoklonlanym zawierającym ludzką domenę stałą gamma 1, skierowanym przeciw ludzkiemu CD. Chimeryczne przeciwciało zawiera ludzkie domeny stałe gamma 1 i jest zidentyfikowane nazwą C2B8 w opisie patentowym U.S. nr 736137 (Andersen i wsp.) z 17 kwietnia, 1998, naleŝącym do IDEC Pharmaceuticals Corporation. RITUXAN jest zatwierdzony do leczenia pacjentów z nawracającym lub opornym CD-pozytywnym chłoniakiem nieziarniczym z limfocytów B o niskim stopniu złośliwości lub grudkowym. Badania in vitro mechanizmu działania wykazały, Ŝe RITU- XAN wykazuje cytotoksyczność zaleŝną od ludzkiego dopełniacza (CDC) (Reff i wsp., Blood 83(2): 43-44 (1994)). Ponadto, wykazuje on istotną aktywność w testach mierzących cytotoksyczność komórkową zaleŝną od przeciwciał (ADCC). Wykazano, Ŝe RITU- XAN wykazuje aktywność przeciw-proliferacyjną w testach inkorporacji tymidyny oraz ograniczoną zdolność bezpośredniego wywoływania apoptozy, podczas gdy przeciwciała przeciw-cd nie wykazują tej aktywności (Maloney i wsp., Blood 88 (): 637a (1996)). Glikozylacja przeciwciał [0013] Składnik oligosacharydowy moŝe znacząco wpłynąć na właściwości odnośnie skuteczności glikoproteiny terapeutycznej, włącznie ze stabilnością fizyczną, opornością na atak proteaz, oddziaływaniem z układem immunologicznym, farmakokinetyką i specyficzną aktywnością biologiczną. Takie właściwości mogą zaleŝeć nie tylko od obecności lub braku, ale takŝe od specyficznych struktur oligosacharydów. Związek pomiędzy strukturą oligosacharydu i funkcją glikoproteiny moŝna w pewnym stopniu uogólnić. Przykładowo, pewne struktury oligosacharydowe pośredniczą w szybszym klirensie glikoproteiny z krwioobiegu przez oddziaływanie ze specyficznymi białkami wiąŝącymi węglowodany, podczas gdy inne mogą być wiązane przez przeciwciała i wywoływać niepoŝądane reakcje

7 1 2 3 immunologiczne. (Jenkins i wsp., Nature Biotechnol. 14:97-81 (1996)). [0014] Komórki ssacze są korzystnymi gospodarzami do wytwarzania glikoprotein terapeutycznych, ze względu na ich zdolność do glikozylacji białek w postaci najbardziej odpowiedniej do stosowania u ludzi. (Cumming i wsp., Glycobiology 1:11- (1991); Jenkins i wsp., Nature Biotechnol. 14:97-81 (1996)). Bakterie bardzo rzadko glikozylują białka oraz tak jak u innych powszechnych gospodarzy, takich jak komórki droŝdŝowe, grzybów strzępkowych, owadzie i roślinne, pozwalają uzyskać wzory glikozylacji związane z szybkim klirensem z krwioobiegu, niepoŝądanymi reakcjami immunologicznymi oraz, w niektórych przypadkach, zmniejszoną aktywnością biologiczną. Wśród komórek ssaczych w dwóch ostatnich dziesięcioleciach najpowszechniej stosowano komórki jajnika chomika chińskiego (CHO). Oprócz zapewniania odpowiednich wzorów glikozylacji, komórki te pozwalają na stałe wytwarzanie genetycznie stabilnych, wysoce produktywnych klonalnych linii komórkowych. MoŜna je hodować do wysokich gęstości w prostych bioreaktorach, z uŝyciem poŝywek wolnych od surowicy i umoŝliwiają one na opracowanie bezpiecznych i powtarzalnych procedur biologicznych. Inne powszechnie stosowane komórki ssacze obejmują komórki nerki noworodków chomika (BHK), mysie komórki szpiczaka NS0- i SP2/0. Ostatnio zbadano takŝe wytwarzanie przez zwierzęta transgeniczne. (Jenkins i wsp., Nature Biotechnol. 14:97-81 (1996)). [001] Wszystkie przeciwciała zawierają struktury węglowodanów w konserwowanych pozycjach w regionach stałych łańcucha cięŝkiego, przy czym kaŝdy izotyp posiada odrębny wzór N-połączonych struktur węglowodanów, których zmienność wpływa na składanie białka, wydzielanie i aktywność funkcjonalną. (Wright, A. i Morrison, S. L., Trends Biotech. 1:26-32 (1997)). Struktura przyłączonego N-połączonego węglowodanu znacząco się róŝni zaleŝnie od stopnia obróbki oraz moŝe obejmować złoŝone oligosacharydy wysokomannozowe, wielokrotnie rozgałęzione, a takŝe dwuantenarne. (Wright, A., and Morrison, S. L., Trends Biotech. 1:26-32 (1997)). Zazwyczaj zachodzi heterogenna obróbka rdzeniowych struktur oligosacharydów przyłączonych do konkretnego miejsca glikozylacji tak, Ŝe nawet przeciwciała monoklonalne występują w wielu postaciach glikozylowanych. Podobnie wykazano, Ŝe główne róŝnice w glikozylacji białek powstają pomiędzy liniami komórkowymi i niewielkie obserwowane są nawet dla danej linii komórkowej hodowanej w innych warunkach hodowli. (Lifely, M. R. i wsp., Glycobiology (8):813-22 (199)). [0016] Jednym sposobem uzyskania duŝego wzrostu siły działania, przy jednoczesnym zachowaniu prostego sposobu wytwarzania oraz potencjalnym uniknięciu istotnych, niepo- Ŝądanych skutków ubocznych, jest wzmocnienie naturalnych funkcji efektorowych przeciwciał monoklonalnych, pośredniczonych przez komórki, przez zmodyfikowanie składni-

8 1 2 ka oligosacharydowego tak, jak opisano w Umaña, P. i wsp., Nature Biotechnol. 17:176-180 (1999) oraz opisie patentowym U.S. 6602684. Przeciwciała typu IgG1, przeciwciała najczęściej stosowane w immunoterapii nowotworów są glikoproteinami, które zawierają konserwowane miejsce N-glikozylacji w Asn297 w kaŝdej domenie CH2. ZłoŜone oligosacharydy dwuantenarne przyłączone do Asn297 są schowane pomiędzy domenami CH2, tworząc rozległe kontakty ze szkieletem polipeptydowym, a ich obecność jest zasadnicza dla pośredniczenia funkcji efektorowych przekazywanych przez przeciwciała, takich jak cytotoksyczność komórkowa zaleŝna od przeciwciał (ADCC) (Lifely, M. R. i wsp., Glycobiology :813-822 (199); Jefferis, R. i wsp., Immunol Rev. 163:9-76 (1998); Wright, A. i Morrison, S. L., Trends Biotechnol. 1:26-32 (1997)). [0017] Twórcy niniejszego wynalazku wcześniej wykazali, Ŝe nadekspresja w komórkach jajnika chomika chińskiego (CHO) β(1,4)-n-acetyloglukozaminylotransferazy III ( Gn- TIII ), glikozyltransferazy katalizującej tworzenie dwudzielnych oligosacharydów, zasadniczo zwiększa aktywność ADCC in vitro chimerycznego przeciwciała monoklonalnego przeciw nerwiakowi niedojrzałemu (chce7), wytwarzanego w zmodyfikowanych komórkach CHO. (Patrz Umaña, P. i wsp., Nature Biotechnol. 17:176-180 (1999); oraz międzynarodowa publikacja WO 99/4342. Przeciwciało chce7 naleŝy do duŝej klasy niesprzę- Ŝonych mab, które wykazują wysokie powinowactwo oraz specyficzność względem nowotworu, ale mają zbyt małą siłę działania, aby mogły być uŝyteczne klinicznie przy wytwarzaniu w standardowych handlowych liniach komórkowych, w których brak jest enzymu GnTIII (Umana, P. i wsp., Nature Biotechnol. 17:176-180 (1999)). Badanie to było pierwszym, w którym pokazano, Ŝe duŝy wzrost aktywności ADCC moŝna uzyskać przez modyfikację komórek wytwarzających przeciwciało tak, aby eksprymowały GnTIII, co takŝe doprowadziło do wzrostu proporcji związanych z regionem stałym (Fc) dwudzielnych oligosacharydów, włącznie z dwudzielnymi, niefukozylowanymi oligosacharydami, powyŝej poziomów znajdywanych w naturalnie występujących przeciwciałach. [0018] Nadal pozostaje potrzeba opracowania rozwiązań terapeutycznych ukierunkowanych na antygen CD do leczenia chłoniaków z limfocytów B u ssaków naczelnych, włącznie z, ale nie wyłącznie, ludźmi. STRESZCZENIE WYNALAZKU [0019] Stwierdzając ogromny potencjał terapeutyczny cząsteczek wiąŝących antygen (ABM), które wykazują specyficzność wiązania względem mysiego przeciwciała B-Ly1 i które zostały glikozmodyfikowane w celu zwiększenia powinowactwa wiązania z receptorem Fc oraz funkcji efektorowej, twórcy niniejszego wynalazku opracowali sposób wytwa-

9 1 2 3 rzania takich ABM. Między innymi, sposób ten obejmuje wytwarzanie rekombinowanych, chimerycznych przeciwciał oraz ich chimerycznych fragmentów. Skuteczność tych ABM jest jeszcze bardziej zwiększona przez modyfikację profilu glikozylacji regionu Fc przeciwciała. [00] Ujawniony jest izolowany polinukleotyd zawierający: (a) sekwencję wybraną z grupy obejmującej: SEQ ID NO.:, SEQ ID NO.: 6 i SEQ ID NO.:7. (CDR V H - 1 ); (b) sekwencję wybraną z grupy obejmującej: SEQ ID NO.:21, SEQ ID NO.:22 i SEQ ID NO.:23. (CDR V H-2 ); oraz SEQ ID NO:24. Ujawniony jest takŝe izolowany polinukleotyd zawierający SEQ ID NO.:8, SEQ ID NO.: 9 i SEQ ID NO.:. (CDR V L ). W jednej postaci kaŝdy z tych polinukleotydów koduje polipeptyd fuzyjny. [0021] Ujawniony jest ponadto izolowany polinukleotyd zawierający SEQ ID No.:3, izolowany polinukleotyd zawierający SEQ ID No.:4 lub izolowany polinukleotyd zawierający sekwencję wybraną z grupy obejmującej SEQ ID No:29; SEQ ID No:31; SEQ ID No:33; SEQ ID No:3; SEQ ID No:37; SEQ ID No:39; SEQ ID No:41; SEQ ID No:43; SEQ ID No:4; SEQ ID No:47; SEQ ID No:49; SEQ ID No.:1; SEQ ID No:3; SEQ ID No:; SEQ ID No:7; SEQ ID No:9; SEQ ID No:61; SEQ ID No:63; SEQ ID No:6; SEQ ID No:67; SEQ ID No:69; i SEQ ID No.:71. Ujawniony jest ponadto izolowany polinukleotyd zawierający SEQ ID No.:7. W jednej postaci takie polinukleotydy kodują polipeptydy fuzyjne. [0022] Opisany jest izolowany polinukleotyd zawierający sekwencję wykazującą co najmniej 80% identyczności z SEQ ID NO:3, przy czym wspomniany izolowany polinukleotyd koduje polipeptyd fuzyjny. W dodatkowym aspekcie wyszczególniony jest izolowany polinukleotyd zawierający sekwencję wykazującą co najmniej 80% identyczności z SEQ ID NO:4, przy czym wspomniany izolowany polinukleotyd koduje polipeptyd fuzyjny. Przedstawiony jest izolowany polinukleotyd zawierający sekwencję wykazującą co najmniej 80% identyczności z sekwencję wybraną z grupy obejmującej SEQ ID No:29; SEQ ID No:31; SEQ ID No:33; SEQ ID No:3; SEQ ID No:37; SEQ ID No:39; SEQ ID No:41; SEQ ID No:43; SEQ ID No:4; SEQ ID No:47; SEQ ID No:49; SEQ ID No:1; SEQ ID No:3; SEQ ID No:; SEQ ID No:7; SEQ ID No:9; SEQ ID No:61; SEQ ID No:63; SEQ ID No:6; SEQ ID No:67; SEQ ID No:69; i SEQ ID No:71, przy czym wspomniany izolowany polinukleotyd koduje polipeptyd fuzyjny. W dodatkowym aspekcie wspomniany jest izolowany polinukleotyd zawierający sekwencję wykazującą co najmniej 80% identyczności z SEQ ID NO:7, przy czym wspomniany izolowany polinukleotyd koduje polipeptyd fuzyjny. [0023] Ujawniony jest polinukleotyd zawierający SEQ ID NO:11 (cały łańcuch cięŝki) lub

1 2 3 polinukleotydy wykazujące 80%, 8%, 90%, 9% lub 99% identyczności z SEQ ID NO:11, a takŝe polinukleotyd zawierający SEQ ID NO: 12 (cały łańcuch lekki) lub polinukleotydy wykazujące 80%, 8%, 90%, 9% lub 99% identyczności z SEQ ID NO:12. [0024] Ujawniony jest izolowany polinukleotyd kodujący chimeryczny polipeptyd o sekwencji SEQ ID No.:1. W jednej postaci polinukleotyd zawiera sekwencję kodującą polipeptyd o sekwencji SEQ ID No.:1 oraz sekwencję kodującą polipeptyd o sekwencji regionu Fc przeciwciała lub jego fragmentu z gatunku innego niŝ mysz. Opisany jest izolowany polinukleotyd kodujący polipeptyd chimeryczny o sekwencji wybranej z grupy obejmującej SEQ ID No:; SEQ ID No:32; SEQ ID No:34; SEQ ID No:36; SEQ ID No:38; SEQ ID No:40; SEQ ID No:42; SEQ ID No:44; SEQ ID No:46; SEQ ID No:48; SEQ ID No:0; SEQ ID No:2; SEQ ID No:4; SEQ ID No:6; SEQ ID No:8; SEQ ID No:60; SEQ ID No:62; SEQ ID No:64; SEQ ID No:66; SEQ ID No:68; SEQ ID No:70; i SEQ ID No:72. W jednej postaci polinukleotyd zawiera sekwencję kodującą polipeptyd o sekwencji wybranej z grupy obejmującej SEQ ID No:; SEQ ID No:32; SEQ ID No:34; SEQ ID No:36; SEQ ID No:38; SEQ ID No:40; SEQ ID No:42; SEQ ID No:44; SEQ ID No:46; SEQ ID No:48; SEQ ID No:0; SEQ ID No:2; SEQ ID No:4; SEQ ID No:6; SEQ ID No:8; SEQ ID No:60; SEQ ID No:62; SEQ ID. No:64; SEQ ID No:66; SEQ ID No:68; SEQ ID No:70; i SEQ ID No:72; oraz sekwencję kodującą polipeptyd o sekwencji regionu Fc przeciwciała lub jego fragmentu z gatunku innego niŝ mysz. [002] W jeszcze innym aspekcie ujawniony jest izolowany polinukleotyd kodujący polipeptyd chimeryczny o sekwencji SEQ ID No.:2. W jednej postaci polinukleotyd zawiera sekwencję kodującą polipeptyd o sekwencji SEQ ID No.:2; oraz sekwencję kodującą polipeptyd o sekwencji regionu Fc przeciwciała lub jego fragmentu z gatunku innego niŝ mysz. W jeszcze innym aspekcie opisany jest izolowany polinukleotyd kodujący polipeptyd chimeryczny o sekwencji SEQ ID No.:76. W jednej postaci polinukleotyd zawiera sekwencję kodującą polipeptyd o sekwencji SEQ ID No.:76; oraz sekwencję kodującą polipeptyd o sekwencji regionu Fc przeciwciała lub jego fragmentu z gatunku innego niŝ mysz. [0026] Wspomniany jest izolowany polinukleotyd zawierający sekwencję kodującą polipeptyd zawierający region V H mysiego przeciwciała B-Ly1, lub jego funkcjonalne warianty, oraz sekwencję kodującą polipeptyd o sekwencji regionu Fc przeciwciała lub jego fragmentu z gatunku innego niŝ mysz. W innym aspekcie wyszczególniony jest izolowany polinukleotyd zawierający sekwencję kodującą polipeptyd zawierający region V L mysiego przeciwciała B-Ly1, lub jego funkcjonalne warianty, oraz sekwencję kodującą polipeptyd o sekwencji regionu Fc przeciwciała lub jego fragmentu z gatunku innego niŝ mysz.

11 1 2 3 [0027] Wynalazek dotyczy ponadto wektora ekspresyjnego zawierającego jakiekolwiek opisane powyŝej izolowane polinukleotydy, oraz komórki gospodarza według zastrzeŝeń 12 do 17 zawierającej wektor ekspresyjny. W kolejnym aspekcie wynalazek dotyczy komórki gospodarza według któregokolwiek z zastrzeŝeń 12 do 17. [0028] Ujawniony jest izolowany polipeptyd zawierający: (a) sekwencję wybraną z grupy obejmującej: SEQ ID NO.:1, SEQ ID NO.: 16 i SEQ ID NO.:17. (CDR V H-1 ); (b) sekwencję wybraną z grupy obejmującej: SEQ ID NO.:2, SEQ ID NO.:26 i SEQ ID NO.:27 (CDR V H-2 ); oraz SEQ ID NO:28, przy czym wspomniany polipeptyd jest polipeptydem fuzyjnym. W innym aspekcie wyszczególnione są izolowany polipeptyd zawierający SEQ ID NO.:18, SEQ ID NO.: 19 i SEQ ID NO.:. (CDR V L ), przy czym wspomniany polipeptyd jest polipeptydem fuzyjnym. [0029] Ujawnione są chimeryczny polipeptyd zawierający sekwencję SEQ ID NO.: 1 lub jego wariant oraz chimeryczny polipeptyd zawierający sekwencję SEQ ID NO.:2 lub jego wariant. W jednej postaci którykolwiek z tych dwóch polipeptydów zawiera ponadto ludzki region Fc. Opisane są chimeryczny polipeptyd zawierający sekwencję wybraną z grupy obejmującej SEQ ID No:; SEQ ID No:32; SEQ ID No:34; SEQ ID No:36; SEQ ID No:38; SEQ ID No:40; SEQ ID No:42; SEQ ID No:44; SEQ ID No:46; SEQ ID No:48; SEQ ID No:0; SEQ ID No:2; SEQ ID No:4; SEQ ID No:6; SEQ ID No:8; SEQ ID No:60; SEQ ID No:62; SEQ ID No:64; SEQ ID No:66; SEQ ID No:68; SEQ ID No:70; i SEQ ID No:72, lub jej wariant oraz chimeryczny polipeptyd zawierający sekwencję SEQ ID NO.:76 lub jej wariant. W jednej postaci którykolwiek z tych dwóch polipeptydów zawiera ponadto ludzki region Fc. [00] Ujawnione są polipeptyd zawierający sekwencję wyprowadzoną z mysiego przeciwciała B-Ly1 i sekwencję wyprowadzoną z heterologicznego polipeptydu oraz cząsteczka wiąŝąca antygen zawierająca taki polipeptyd. Cząsteczka wiąŝąca antygen jest przeciwciałem. Przeciwciało jest humanizowane. [0031] Wyszczególnione są izolowany polipeptyd zawierający SEQ ID NO: 13 lub jej wariant oraz izolowany polipeptyd zawierający SEQ ID NO: 14. [0032] Ujawniona jest ABM, która jest zdolna do konkurowania z mysim przeciwciałem B-Ly1 o wiązanie CD oraz jest chimeryczna. W jednej postaci ABM jest przeciwciałem lub jego fragmentem. W kolejnej postaci ABM jest rekombinowanym przeciwciałem zawierającym region V H o sekwencji aminokwasowej wybranej z grupy obejmującej SEQ ID NO.: 1; SEQ ID No:; SEQ ID No:32; SEQ ID No:34; SEQ ID No:36; SEQ ID No:38; SEQ ID No:40; SEQ ID No:42; SEQ ID No:44; SEQ ID No:46; SEQ ID No:48; SEQ ID No:0; SEQ ID No:2; SEQ ID No:4; SEQ ID No:6; SEQ ID No:8; SEQ ID No:60;

12 1 2 3 SEQ ID No:62; SEQ ID No:64; SEQ ID No:66; SEQ ID No:68; SEQ ID No:70; i SEQ ID No:72. W innej postaci ABM jest rekombinowanym przeciwciałem zawierającym region V L o sekwencji aminokwasowej wybranej z grupy obejmującej SEQ ID NO.: 2 i SEQ ID NO:76. ABM jest rekombinowanym przeciwciałem, które jest humanizowane. W innej postaci ABM jest rekombinowanym przeciwciałem zawierającym ludzki region Fc. W kolejnej postaci którakolwiek z ABM omówionych powyŝej moŝe być sprzęŝona z ugrupowaniem takim jak toksyna lub znacznik radioaktywny. [0033] Wynalazek dotyczy ponadto ABM według niniejszego wynalazku, wspomniana ABM zawiera zmodyfikowane oligosacharydy. W jednej postaci zmodyfikowane oligosacharydy wykazują obniŝoną fukozylację w porównaniu z niezmodyfikowanymi oligosacharydami. W innych postaciach, zmodyfikowane oligosacharydy są hybrydowe lub zło- Ŝone. W kolejnej postaci ABM zawiera zwiększoną proporcję niefukozylowanych oligosacharydów lub dwudzielnych, niefukozylowanych oligosacharydów w regionie Fc wspomnianej cząsteczki. W jednej postaci dwudzielne, niefukozylowane oligosacharydy są hybrydowe. W kolejnej postaci dwudzielne, niefukozylowane oligosacharydy są złoŝone. W jednej postaci co najmniej % oligosacharydów w regionie Fc wspomnianego polipeptydu jest niefukozylowana lub dwudzielna, niefukozylowana. W korzystniejszych postaciach co najmniej %, 3%, 40%, 4%, 0%, %, 60%, 6%, 70% lub 7% albo więcej oligosacharydów jest niefukozylowana lub dwudzielna, niefukozylowana. [0034] Ujawnione są polinukleotyd kodujący ABM omówione powyŝej oraz wektory ekspresyjne i komórki zawierające taki polinukleotyd. [003] Ujawniony jest sposób wytwarzania ABM, która jest zdolna do konkurowania z mysim przeciwciałem B-Ly1 o wiązanie z CD oraz, przy czym ABM jest chimeryczna; który to sposób obejmuje: (a) hodowanie komórki gospodarza zawierającej polinukleotyd kodujący ABM według niniejszego wynalazku w poŝywce, w warunkach umoŝliwiających ekspresję wspomnianego polinukleotydu kodującego wspomnianą ABM; oraz (b) odzyskanie wspomnianej ABM z powstałej hodowli. [0036] W innym aspekcie wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznej według zastrzeŝenia 18 zawierającej ABM według wynalazku. Bierze się pod uwagę, Ŝe kompozycja farmaceutyczna moŝe zawierać ponadto farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, adiuwant lub ich połączenie. [0037] W kolejnym aspekcie wynalazek moŝna zastosować w sposobie leczenia choroby, która moŝe być leczona przez obniŝenie poziomu komórek B. Sposób obejmuje podawanie terapeutycznie skutecznej ilości ABM według niniejszego wynalazku pacjentowi, będącemu człowiekiem, wymagającemu takiego leczenia. W korzystnej postaci choroba jest le-

13 1 2 3 czona przez podawanie ABM, która jest chimerycznym przeciwciałem lub chimerycznym fragmentem przeciwciała. [0038] Ujawniona jest komórka gospodarz zmodyfikowana tak, by eksprymowała co najmniej jedną cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd wykazujący aktywność GnTIII w ilości wystarczającej do zmodyfikowania oligosacharydów w regionie Fc wytwarzanym przez komórkę gospodarza, przy czym ABM jest zdolna do konkurowania z mysim przeciwciałem B-Ly1 o wiązanie CD oraz przy czym ABM jest chimeryczna. W jednej postaci polipeptyd wykazujący aktywność GnTIII jest polipeptydem fuzyjnym. W innej postaci ABM wytwarzana przez komórkę gospodarza jest przeciwciałem lub fragmentem przeciwciała. W kolejnej postaci ABM zawiera region równowaŝny z regionem Fc ludzkiej IgG. [0039] Opisany jest izolowany polinukleotyd zawierający co najmniej jeden region determinujący dopasowanie mysiego przeciwciała B-Ly1 lub wariant albo jego skróconą postać zawierającą co najmniej reszty determinujące specyficzność wspomnianego regionu determinującego dopasowanie, przy czym wspomniany izolowany polinukleotyd koduje polipeptyd fuzyjny. Korzystnie, takie izolowane polinukleotydy kodują polipeptyd fuzyjny, który jest cząsteczką wiąŝącą antygen. W jednej postaci polinukleotyd zawiera trzy regiony determinujące dopasowanie mysiego przeciwciała B-Ly1 lub ich warianty albo skrócone postacie zawierające co najmniej reszty determinujące specyficzność z kaŝdego z trzech regionów determinujących dopasowanie. W innej postaci polinukleotyd koduje cały region zmienny łańcucha lekkiego lub cięŝkiego chimerycznego (np. humanizowanego) przeciwciała. [0040] Ujawniona jest cząsteczka wiąŝąca antygen zawierająca co najmniej jeden region determinujący dopasowanie mysiego przeciwciała B-Ly1, lub ich warianty albo skrócone postacie zawierająca co najmniej reszty determinujące specyficzność dla wspomnianego regionu determinującego dopasowanie, oraz zawierająca sekwencję wyprowadzoną z heterologicznego polipeptydu. W jednej postaci cząsteczka wiąŝąca antygen zawiera trzy regiony determinujące dopasowanie mysiego przeciwciała B-Ly1, lub ich warianty albo skrócone postacie zawierające co najmniej reszty determinujące specyficzność kaŝdego z trzech regionów determinujących dopasowanie. W innym aspekcie cząsteczka wiąŝąca antygen zawiera region zmienny łańcucha lekkiego lub cięŝkiego przeciwciała. W jednej szczególnie korzystnej postaci cząsteczka wiąŝąca antygen jest chimerycznym, np. humanizowanym, przeciwciałem. Takie cząsteczki wiąŝące antygen moŝna stosować w leczeniu choroby, włącznie z chłoniakami z limfocytów B. [0041] Niniejszy wynalazek jest pierwszym znanym przypadkiem, w którym przeciwciało

14 1 2 3 przeciw-cd typu II zostało zmodyfikowane tak, aby wykazywało zwiększone funkcje efektorowe, takie jak ADCC, przy czym nadal zachowuje ono wysoką zdolność do apoptozy. Zgodnie z tym, niniejszy wynalazek dotyczy zmodyfikowanego przeciwciała przeciw- CD typu II o zwiększonej ADCC w wyniku wspomnianej modyfikacji oraz bez utraty zasadniczej zdolności do wywoływania apoptozy. W jednej postaci przeciwciała przeciw- CD typu II zostały zmodyfikowane tak, by zawierały zmieniony wzór glikozylacji w regionie Fc. W konkretnej postaci zmieniona glikozylacja obejmuje zwiększony poziom dwudzielnych złoŝonych reszt w regionie Fc. W innej konkretnej postaci zmieniona glikozylacja obejmuje obniŝony poziom reszt fukozy w regionie Fc. W innej postaci przeciwciała przeciw-cd typu II zostały poddane modyfikacji polipeptydu. Wynalazek dotyczy ponadto sposobów wytwarzania takich zmodyfikowanych przeciwciał typu II oraz sposobów stosowania takich przeciwciał do leczenia róŝnych zaburzeń z komórkami B, włącznie z chłoniakami z limfocytów B. [0042] Komórka gospodarz według niniejszego wynalazku moŝe zostać wybrana z grupy obejmującej, ale nie wyłącznie, komórkę CHO, komórkę BHK, komórkę NSO, komórkę SP2/0, komórkę szpiczaka YO, mysią komórkę szpiczaka P3X63, komórkę PER, komórkę PER.C6 lub komórkę hybrydomę. W jednej postaci komórka gospodarz według wynalazku zawiera ponadto wtransfekowany polinukleotyd zawierający polinukleotyd kodujący region V L mysiego przeciwciała B-Ly1 lub jego warianty oraz sekwencję kodującą odpowiednik regionu Fc ludzkiej immunoglobuliny. W innej postaci komórka gospodarz według wynalazku zawiera ponadto wtransfekowany polinukleotyd zawierający a polinukleotyd kodujący region V H mysiego przeciwciała B-Ly1 lub jego warianty oraz sekwencję kodującą odpowiednik regionu Fc ludzkiej immunoglobuliny. [0043] W kolejnym aspekcie wynalazek dotyczy komórki gospodarza wytwarzającej ABM wykazującą zwiększone powinowactwo do receptora Fc i/lub zwiększoną funkcję efektorową w wyniku modyfikacji jego oligosacharydów. W jednej postaci zwiększone powinowactwo wiązania dotyczy receptora Fc, w szczególności receptora FcγRIIIA. Brana tutaj pod uwagę funkcja efektorowa moŝe zostać wybrana z grupy obejmującej, ale nie wyłącznie, podwyŝszoną cytotokosyczność komórkową pośredniczono przez Fc; zwiększone wiązanie komórek NK; zwiększone wiązanie makrofagów; zwiększone wiązanie komórek wielojądrzastych; zwiększone wiązanie monocytów; zwiększone bezpośrednie przekazywanie sygnału wywołującego apoptozę; zwiększone dojrzewania komórki dendrytycznej; zwiększone prymowanie komórki T. [0044] W kolejnej postaci komórka gospodarz według niniejszego wynalazku zawiera co najmniej jeden kwas nukleinowy kodujący polipeptyd wykazujący aktywność GnTIII, któ-

1 1 2 3 ry jest funkcjonalnie połączony z elementem konstytutywnego promotora. [004] W innym aspekcie ujawniony jest sposób wytwarzania ABM w komórce gospodarzu, obejmujący: (a) hodowanie komórki gospodarza zmodyfikowanej tak, by eksprymowała co najmniej jeden polinukleotyd kodujący polipeptyd fuzyjny wykazujący aktywność GnTIII w warunkach pozwalających na wytwarzanie wspomnianej ABM oraz umoŝliwiających modyfikację oligosacharydów obecnych na regionie Fc wspomnianej ABM; oraz (b) izolację wspomnianej ABM; przy czym wspomniana ABM jest zdolna do konkurowania z mysim przeciwciałem B-Ly1 o wiązanie z CD oraz wspomniana ABM jest chimeryczna. W jednej postaci polipeptyd wykazujący aktywność GnTIII jest polipeptydem fuzyjnym, korzystnie zawierającym domenę katalityczną GnTIII oraz domenę lokalizacji w aparacie Golgiego heterologicznego polipeptydu, umiejscowionego w aparacie Golgiego, wybraną z grupy obejmującej domenę lokalizacji mannozydazy II, domenę lokalizacji β(1,2)-n-acetyloglukozaminylotransferazy I ( GnTI ), domenę lokalizacji mannozydazy I, domenę lokalizacji β(1,2)-n-acetyloglukozaminylotransferazy II ( GnTII ) i domenę lokalizacji α1-6 rdzeniowej fukozylotransferazy. Korzystnie domena lokalizacji w aparacie Golgiego pochodzi z mannozydazy II lub GnTI. [0046] W kolejnym aspekcie wynalazek dotyczy sposobu modyfikacji profilu glikozylacji przeciw-cd ABM wytworzonej przez komórkę gospodarza, obejmującego wprowadzenie do komórki gospodarza co najmniej jednego kwasu nukleinowego lub wektora ekspresyjnego według wynalazku. W jednej postaci ABM jest przeciwciałem lub jego fragmentem; korzystnie zawierającym region Fc IgG. Alternatywnie, polipeptyd jest białkiem fuzyjnym zawierającym region równowaŝny z regionem Fc IgG. [0047] W jednym aspekcie wynalazek dotyczy rekombinowanego, chimerycznego przeciwciała lub jego fragmentu, zdolnego do konkurowania z mysim przeciwciałem B-Ly1 o wiązanie CD oraz wykazującego obniŝoną fukozylację. [0048] W innym aspekcie niniejszy wynalazek dotyczy sposobu modyfikacji glikozylacji rekombinowanego przeciwciała lub jego fragmentu według wynalazku przez zastosowanie polipeptydu fuzyjnego wykazującego aktywność GnTIII oraz zawierającego domenę lokalizacji w aparacie Golgiego heterologicznego polipeptydu, umiejscowionego w aparacie Golgiego. W jednej postaci polipeptydy fuzyjne według wynalazku zawierają domenę katalityczną GnTIII. W innej postaci domena lokalizacji w aparacie Golgiego jest wybrana z grupy obejmującej: domenę lokalizacji mannozydazy II, domenę lokalizacji GnTI, domenę lokalizacji mannozydazy I, domenę lokalizacji GnTII i domenę lokalizacji α1-6 rdzeniowej fukozylotransferazy. Korzystnie domena lokalizacji w aparacie Golgiego pochodzi z mannozydazy II lub GnTI.

16 1 2 3 [0049] W jednej postaci sposób według wynalazku dotyczy wytwarzania rekombinowanego, chimerycznego przeciwciała lub jego fragmentu, ze zmodyfikowanymi oligosacharydami, przy czym wspomniane zmodyfikowane oligosacharydy wykazują obniŝoną fukozylację w porównaniu z niezmodyfikowanymi oligosacharydami. Według niniejszego wynalazku te zmodyfikowane oligosacharydy mogą być hybrydowe lub złoŝone. W innej postaci sposób według wynalazku dotyczy wytwarzania rekombinowanego, chimerycznego przeciwciała lub jego fragmentu wykazującego zwiększoną proporcję dwudzielnych, niefukozylowanych oligosacharydów w regionie Fc wspomnianego polipeptydu. W jednej postaci dwudzielne, niefukozylowane oligosacharydy są hybrydowe. W innej postaci dwudzielne, niefukozylowane oligosacharydy są złoŝone. W kolejnej postaci sposób według wynalazku dotyczy wytwarzania rekombinowanego, chimerycznego przeciwciała lub jego fragmentu zawierającego co najmniej % oligosacharydów dwudzielnych, niefukozylowanych w regionie Fc wspomnianego polipeptydu. W korzystniej postaci co najmniej % oligosacharydów w regionie Fc wspomnianego polipeptydu jest dwudzielna, niefukozylowana. W innej korzystniej postaci co najmniej 3% oligosacharydów w regionie Fc wspomnianego polipeptydu jest dwudzielna, niefukozylowana [000] W kolejnym aspekcie wynalazek dotyczy rekombinowanego, chimerycznego przeciwciała lub jego fragmentu, które wykazuje zwiększone powinowactwo wiązania z receptorem Fc i/lub zwiększoną funkcję efektorową w wyniku modyfikacji jego oligosacharydów. W jednej postaci zwiększone powinowactwo wiązania dotyczy aktywującego receptora Fc. W kolejnej postaci receptorem Fc jest receptor aktywujący Fcγ, w szczególności receptor FcγRIIIA. Brana tutaj pod uwagę funkcja efektorowa moŝe być wybrana z grupy obejmujące, ale nie wyłącznie, podwyŝszoną cytotoksyczność komórkową pośredniczono przez Fc; zwiększone wiązanie komórek NK; zwiększone wiązanie makrofagów; zwiększone wiązanie komórek wielojądrzastych; zwiększone wiązanie z monocytów; zwiększone bezpośrednie przekazywanie sygnału wywołującego apoptozę; zwiększone dojrzewanie komórek dendrytycznych; zwiększone prymowanie komórek T. [001] W innym aspekcie wynalazek dotyczy fragmentu rekombinowanego, chimerycznego przeciwciała wykazującego specyficzność wiązania z mysim przeciwciałem B-Ly1 i zawierającego region Fc, który jest zmodyfikowany tak, by wykazywał zwiększoną funkcję efektorową, wytworzonego według któregokolwiek ze sposobów według niniejszego wynalazku. [002] W innym aspekcie ujawnione jest białko fuzyjne, które zawiera polipeptyd zawierający sekwencję SEQ ID NO:1 i region równowaŝny z regionem Fc immunoglobuliny oraz zmodyfikowany tak, aby wykazywał podwyŝszoną funkcję efektorową, wytworzone we-

17 1 dług któregokolwiek ze sposobów według niniejszego wynalazku. [003] W innym aspekcie opisane jest białko fuzyjne, które zawiera polipeptyd o sekwencji SEQ ID NO:2 i region równowaŝny z regionem Fc immunoglobuliny oraz zmodyfikowany tak, by wykazywał zwiększoną funkcję efektorową, wytworzone według któregokolwiek ze sposobów według niniejszego wynalazku. [004] W jednym aspekcie niniejszy wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznej zawierającej rekombinowane, chimeryczne przeciwciało, wytworzone sposobami według niniejszego wynalazku i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. W innym aspekcie niniejszy wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznej zawierającej fragment rekombinowanego, chimerycznego przeciwciała wytworzonego którymkolwiek ze sposobów według niniejszego wynalazku i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. W innym aspekcie niniejszy wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznej zawierającej białko fuzyjne wytworzone sposobami według niniejszego wynalazku i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. [00] Wynalazek moŝna zastosować w sposobie leczenia choroby, którą moŝna leczyć przez obniŝenie poziomu komórek B, obejmującego podawanie terapeutycznie skutecznej ilości rekombinowanego, chimerycznego, przeciwciała lub jego fragmentu, wytworzonego sposobami według niniejszego wynalazku, pacjentowi, będącemu człowiekiem, który potrzebuje takiego leczenia. KRÓTKI OPIS FIGUR 2 [006] FIG 1. Sekwencja nukleotydowa (SEQ ID NO:2) i aminokwasowa (SEQ ID NO:1) regionu V H mysiego B-Ly1. [007] FIG 2. Sekwencja nukleotydowa (SEQ ID NO:4) i aminokwasowa (SEQ ID NO:3) regionu V L mysiego B-Ly1. [008] FIG 3. Wiązanie Rituximab (O) i ch-b_ly1 ( ) z CD na komórkach Raj i B chłoniaka. [009] FIG 4. ObniŜenie poziomu komórek B przez Rituximab (O) i ch-b_lyl ( ) w pełnej krwi w trzech róŝnych klasach genotypu FcγRIIIa-18V/F: (A) pełna krew od dawcy F/F, homozygotycznego względem receptora o niŝszym powinowactwie; (B) pełna krew od dawcy F/V, heterozygotycznego pod względem powinowactwa do receptora; oraz (C) pełna krew od dawcy OBJ./OBJ., homozygotycznego względem receptora o wyŝszym powinowactwie. [0060] FIG. Sekwencja nukleotydowa (SEQ ID NO:11) i aminokwasowa (SEQ ID N0:13) łańcucha cięŝkiego chimerycznego przeciwciała przeciw-cd. [0061] FIG 6. Sekwencja nukleotydowa (SEQ ID NO:12) i aminokwasowa (SEQ ID

18 1 2 3 NO:14) łańcucha lekkiego chimerycznego przeciwciała przeciw-cd. [0062] FIG 7. Sekwencje nukleotydowa i aminokwasowa CDR mysiego przeciwciała B- Ly1. (A) Przewidywane CDR dla regionu V H. (B) Przewidywane CDR dla regionu V L. [0063] FIG 8. Profil MALDI-TOF glikozmodyfikowanego, chimerycznego przeciwciała B-Ly1. (A) Tabela wyszczególniająca procenty poszczególnych pików; (B) Widmo glikozmodyfikowanego chimerycznego B-Ly1; (C) Widmo glikozmodyfikowanego chimerycznego B-Ly1 potraktowanego Endo-H. [0064] FIG 9. Wiązanie róŝnych humanizowanych przeciwciał przeciw-cd z komórkami Raji B. RóŜnice pomiędzy konstruktem B-HH2 oraz konstruktami B-HL8 i B-HL11 znajdują się w regionach zrębowych 1 i 2, przy czym wszystkie trzy CDR są identyczne. B-HL8 i B-HL11 zawierają sekwencje FR1 i FR2 wyprowadzone z ludzkiej klasy VH3, podczas, gdy cała sekwencja zrębowa B-HH2 pochodzi z ludzkiego VH1. B-HL11 jest pochodną B-HL8 z pojedynczą mutacją Glu/Gln, gdzie Gln jest resztą aminokwasową w konstrukcie B-HH2. Oznacza to, Ŝe zamiana Glu/Gln nie zmienia powinowactwa lub intensywności wiązania. Innymi róŝnicami pomiędzy B-HH2 i B-HL8 są reszty 14 FR, z których jedna lub większa liczba będzie wpływać na zachowanie wiązania antygenu przez to przeciwciało. [006] FIG. Wiązanie humanizowanego przeciwciała przeciw-cd BHL4-KV na komórkach docelowych Raji. Konstrukt B-HL4 jest wyprowadzony z przeciwciała B-HH2 przez zastąpienie FR1 z B-HH2 regionem z ludzkiej zarodkowej sekwencji VH1_4. Konstrukt ten wykazuje znacznie obniŝoną zdolność wiązania antygenu, pomimo tego, Ŝe zawiera róŝne aminokwasy tylko w trzech pozycjach w FR1. Reszty te są umiejscowione w pozycjach 2, 14 oraz według numeracji Kabata. Wśród nich pozycja wydaje się być pozycją o największym wpływie, poniewaŝ jest ona częścią CDR1 zdefiniowanej według Chothia. [0066] FIG 11. Porównanie zachowania wiązania pomiędzy B-HH1, B-HH2, B-HH3 i wyjściowym przeciwciałem B-lyl. Dane pokazują, Ŝe wszystkie przeciwciała wykazują podobną wartość EC0, ale konstrukt B-HH1 wiąŝe się z niŝszą intensywnością/stechiometrią niŝ warianty B-HH2 i B-HH3. B-HH1 moŝna odróŝnić od B-HH2 i B- HH3 przez ich częściowo ludzkie regiony CDR1 i CDR2 (definicja Kabata), a takŝe polimorfizm Ala/Thr w pozycji 28 (numeracja Kabata). Oznacza to, Ŝe pozycja 28, kompletny CDR1 i/lub kompletny CDR2, są istotne dla oddziaływania przeciwciało/antygen. [0067] FIG 12. Porównanie B-HL1, B-HH1 i przeciwciała wyjściowego B-lyl. Dane wykazały brak jakiegokolwiek powinowactwa wiązania w konstrukcie B-HL1 oraz około połowę intensywności/stechiometrii wiązania B-HH1 w porównaniu z B-ly1. Zarówno B-

19 1 2 3 HL1, jak i B-HH1, zaprojektowano w oparciu o akceptorowe regiony zrębowe wyprowadzone z ludzkiej klasy VH1. Wśród innych róŝnic, pozycja 71 (numeracja Kabata) konstruktu B-HL1 róŝni się uderzająco, co wskazuje na jej domniemana istotność w wiązaniu antygenu. [0068] FIG 13. Analiza fluorocytometryczna zdolności wiązania przeciwciała przeciw- CD z jego antygenem. Dane pokazały, Ŝe konstrukty B-HL2 i B-HL3 nie wykazują aktywności wiązania CD-. [0069] FIG 14. Apoptoza przeciwciał przeciw-cd na komórkach Z-138 MCL. [0070] FIG 1. Apoptoza przez przeciwciała przeciw-cd. Szczegóły testu: x komórek/studzienkę wysiano do 24-studzienkowych płytek ( x komórek/ml) w poŝywce hodowlanej. Do studzienek dodano mg odpowiedniego przeciwciała, PBS dla kontroli negatywnej lub mm kamptotecynę (CPT) jako kontrolę pozytywną. Próbki inkubowano przez noc (16 godz.), wybarwiono AnnV-FITC i analizowano metodą FACS. Test przeprowadzono w trzech powtórzeniach. (*): odjęto sygnał dla samego PBS (dla samego PBS uzyskano 8% oraz 2% AnnV+ dla komórek odpowiednio PR-1 i Z-138). Zastosowanymi przeciwciałami były: C2B8 (chimeryczne, nie-glikomodyfikowane); BHH2-KV1 (humanizowane, nie-glikomodyfikowane). Uwaga: test ten nie obejmuje dodatkowych komórek efektorowych, a tylko komórki docelowe plus przeciwciało lub kontrole. [0071] FIG 16. Uśmiercanie komórek docelowych przez przeciwciała przeciw-cd przez efektorowe komórki immunologiczne. Szczegóły testu: obniŝenie poziomu komórek B w normalnej pełnej krwi po całonocnej inkubacji i analizie pod względem CD 19+/CD3+ metodą FACS. ADCC z uŝyciem PBMC jako komórek efektorowych, 4 godziny inkubacji, 2:1 stosunek komórka efektorowa:docelowa, uśmiercanie komórek docelowych zmierzono przez zatrzymywanie kalceiny względem lizy detergentem (0%) oraz lizy bez przeciwciała (0%). Zastosowane przeciwciała: C2B8 (chimeryczne, nie-glikomodyfikowane); BHH2-KV1-wt (humanizowane, nie-glikomodyfikowane z BHH2-KV1); BHH2-KV1-GE (humanizowane, glikomodyfikowane z BHH2-KV1). [0072] FIG 17. Profil MALDI/TOF-MS Fc-oligosacharydów uwolnionych przez PNGazę F z niezmodyfikowanego, nie-glikomodyfikowanego humanizowanego przeciwciała BHH2-KV1 IgG1 B-ly1 przeciw-ludzkiemu CD. [0073] FIG 18. Profil MALDI/TOF-MS Fc-oligosacharydów uwolnionych przez PNGazę F z glikomodyfikowanego humanizowanego przeciwciała BHH2-KV1g1 IgG1 B-ly1 przeciw-ludzkiej CD. Glikomodyfikację przeprowadzono przez koekspresję w komórkach gospodarzach genów przeciwciała oraz genu kodującego enzym o aktywności katalitycznej β-1,4-n-acetyloglukozaminylotransferazy III (GnT-III).