Telomeraza jako cel terapii przeciwnowotworowej

diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics Diagn Lab 2014; 50(2): 159-167 Praca poglądowa Review Article Telomeraza jako cel terapii przeciwnowotworowej Telomerase as a target in cancer therapy Marta Kowalska, Natalia Lipińska, Aleksandra Romaniuk, Błażej Rubiś Katedra i Zakład Chemii Klinicznej i Diagnostyki Molekularnej, Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu Streszczenie: Telomeraza jest złożonym kompleksem rybonukleoproteinowym utworzonym przez podjednostkę katalityczną (htert, ang. human telomerase reverse transcriptase) o aktywności odwrotnej transkryptazy, cząsteczkę RNA (htr, z ang. human telomerase RNA ) stanowiącą matrycę dla syntezy telomerów oraz białka pomocnicze. Telomeraza odpowiedzialna jest za syntezę wielokrotnie powtórzonej sekwencji telomerowej 5 -TTAGGG-3 znajdującej się na końcach chromosomów. Enzym zapobiega tym samym skracaniu telomerów po każdym podziale komórkowym. Telomeraza wykrywana jest w około 85% nowotworów, podczas gdy w komórkach prawidłowych nie ulega ekspresji lub ekspresja ta jest wielokrotnie niższa. Obecnie trwają intensywne badania mające na celu wyciszenie ekspresji genów kodujących poszczególne podjednostki telomerazy, umożliwiające zahamowanie aktywności enzymu i wyeliminowanie komórek nowotworowych. Jedną z takich metod jest interferencja RNA, a szczególne nadzieje pokłada się w jej skuteczności w terapii skojarzonej. (Diagn Lab 2014; 50(2): 159-167) Summary: Telomerase is a specialized ribonucleoprotein complex consisted of telomerase reverse transcriptase (htert) which is a catalytic subunit, telomerase RNA (htr) used as a matrix template for telomere synthesis and accompanying proteins. Telomerase is responsible for the synthesis of telomeric repeats 5 -TTAGGG-3 localized at the ends of chromosomes. This mechanism prevents shortening of telomeres after each cell division. The enzyme is detected in about 85% of tumors, whereas it is not expressed in normal cells or the expression is significantly lower. Currently, intensive studies are conducted in order to identify the way of a specific downregulation of the key subunits of the complex that would result in inhibition of enzyme activity and cancer cells elimination. One of these methods is RNA interference which is especially promising when applied in an adjuvant therapy. (Diagn Lab 2014; 50(2): 159-167) Słowa kluczowe: telomeraza, telomery, nowotwór, regulacja aktywności, sirna, terapia genowa Key words: telomerase, telomere, cancer, activity regulation, sirna, gene therapy Wstęp Nieustający wzrost zachorowań na choroby nowotworowe, obserwowany szczególnie w krajach rozwijających się, stanowi poważny problem zarówno w sferze prewencji, jak i leczenia. Według danych WHO w 2012 roku z powodu choroby nowotworowej zmarło 8,2 miliona ludzi z czego około 30% zgonów można było zapobiec. Zgodnie z danymi Europejskiego raportu zdrowia z roku 2012, nowotwory zastąpiły choroby układu krążenia jako główną przyczynę przedwczesnych zgonów (poniżej 65 roku życia) w 28 z 53 państw Europejskiego Regionu WHO. Przewiduje się, że śmiertelność z powodu chorób nowotworowych będzie ciągle rosła i w 2030 roku wyniesie 13,1 miliona ludzi [1]. Wiele ośrodków badawczych na całym świecie dąży do odkrycia skutecznej i mało inwazyjnej metody walki z chorobą nowotworową. Obiecującym celem dla leków stosowanych w terapii przeciwnowotworowej wydaje się być telomeraza. Znaczny odsetek komórek nowotworowych wykazuje aktywność tego enzymu (ok. 85% typów nowotworów, a w przypadku raka gruczołowego 100%), podczas gdy w pozostałych rodzajach komórek (ok. 15%) długość telomerów nie jest utrzymywana, bądź wykazują one mechanizm alternatywnego wydłużania telomerów ALT (ang. alternative lenghtening of telomeres) [2]. Trwają liczne badania nad zahamowaniem aktywności telomerazy, a tym samym skróceniem długości telomerów i skierowaniem komórek nowotworowych na drogę starzenia i apoptozy. Wiele uwagi poświęca się mechanizmowi interferencji RNA. Jak wykazano, aktywność telomerazy jest warunkowana między innymi przez obecność kluczowej podjednostki białkowej htert (ang. human telomerase reverse transcriptase) [3]. Stąd wydaje się, że skuteczne zahamowanie ekspresji lub aktywności właśnie tej podjednostki może być jednym z potencjalnych punktów uchwytu dla terapii przeciwnowotworowych. 159

www.diagnostykalaboratoryjna.eu nie dostępu telomerazy może ograniczać syntezę telomerowego DNA. Choć kompleks wydaje się odpowiadać za negatywną regulację telomerazy, białka POT1 TPP1 mogą w pewnych warunkach również aktywować telomerazę. Sugeruje to, że białka, które są zaangażowane w tworzenie struktury telomeru są jednocześnie częścią pętli ujemnego sprzężenia zwrotnego, która w pośredni sposób reguluje mechanizm aktywności telomerazy i długość telomerów. Rycina 1. Model funkcjonowania telomerazy (wg [4], zmodyfikowano) Telomery zbudowane są z powtórzonej ok. 150 2000 razy sekwencji 5 -TTAGGG-3 połączonej z białkami towarzyszącymi TBP (z ang. telomere binding proteins). Klasyczny model budowy telomeru zakłada jego liniową budowę, zakończoną sekwencją bogatą w nukleotydy guaninowe zwaną kwadrupleksem G. Model przestrzenny składa się z dwóch pętli: mniejszej D i większej t, utworzonych przez białka kompleksu szelteryny. Telomeraza wiąże się z bogatym w guaninę końcem 3 nici i dobudowuje do niego sekwencję terminalną. Telomery Struktura Telomery stanowią element strukturalny chromosomów i zlokalizowane są na końcu każdej z chromatyd. Zakończenia telomerowe zbudowane są z łańcucha DNA połączonego z białkami wiążącymi telomer (TBP, ang. telomere binding proteins). Telomerowy DNA człowieka utworzony jest z wielokrotnie powtórzonej (150 2000 razy) sekwencji 5 -TTAGGG-3, nie zawiera genów i nie koduje białek [4]. Długość telomerów w komórkach zarodkowych człowieka waha się między 2 a 15 kpz [5]. Pierwszy model przedstawiający telomer zakładał, że ma on liniową budowę, składa się z białek oraz dwuniciowej struktury z wystającym końcem 3 (o długości ok. 150-200 pz) bogatym w nukleotydy guaninowe. Jednoniciowy koniec 3 tworzy strukturę zwaną kwadrupleksem G. Aktualny model przedstawia złożoną konformację przestrzenną, której podstawowymi elementami są pętla t oraz mniejsza pętla D (Ryc. 1) [4, 6]. Białka ochronne Zakończenia chromosomów są chronione przez szereg białek, które tworzą charakterystyczny kompleks zwany szelteryną (ang. shelterin). W skład tego kompleksu wchodzi 6 białkowych podjednostek. Wśród nich TRF1, TRF2 (ang. telomere repeat factor 1 i telomere repeat factor 2) oraz POT1 (ang. human protection of telomeres 1) są odpowiedzialne za rozpoznawanie powtórzeń telomerowych TTAGGG. Z kolei podjednostki TIN2 (ang. TRF1-interacting protein 2), TPP1 (ang. TINT1/PTOP/PIP1 protein) oraz Rap1 (ang. repressor- -activator protein 1) to białka stabilizujące kompleks. W przypadku zaburzenia tej struktury, telomerowy DNA traktowany jest przez mechanizmy naprawcze jako uszkodzony [7, 8]. Szelteryna zorganizowana jest w postaci struktury przestrzennej zwanej pętlą t na końcu chromosomu i poprzez blokowa- Funkcja telomerów oraz problem replikacji końca Główną funkcją telomerów jest ochrona przed utratą informacji genetycznej podczas replikacji komórki. Zapobiegają one również nieprawidłowej rekombinacji, fuzji chromosomów, czy ich degradacji w wyniku działania egzonukleaz [9]. Podczas każdego podziału komórkowego dochodzi do skrócenia sekwencji telomerowej o długość około 50 200 pz. W konsekwencji dochodzi do zmian w strukturze przestrzennej telomerów i tracą one możliwość formowania pętli t. Stanowi to, tzw. zegar biologiczny i uważane jest za jeden z głównych mechanizmów determinujących ilość podziałów komórkowych. Obserwacje prowadzone przez Leonarda Hayflick a, dotyczące komórek somatycznych (badania na hodowli fibroblastów) pozwoliły określić maksymalną liczbę podziałów (około 50), po przekroczeniu której komórki przestały się dzielić, pozostając jednak aktywne metabolicznie. Wyznaczony w ten sposób limit Hayflick a zależy od organizmu oraz od rodzaju tkanki, z której pochodzą badane komórki [6,10]. Jak wykazano, ograniczenie liczby podziałów zapobiega nagromadzeniu mutacji prowadzących do transformacji nowotworowej [11]. Funkcja telomerazy i telomerów wiąże się ściśle z problemem replikacji końca. W czasie replikacji przebiegającej w sposób semikonserwatywny nić opóźniona (powstająca w wyniku połączenia fragmentów Okazaki) po usunięciu startera RNA posiada niekompletny koniec 5. Powstała luka nie może zostać wypełniona, ponieważ polimerazy DNA odpowiedzialne za proces replikacji posiadają zdolność syntezy łańcucha polinukleotydowego jedynie w kierunku 5 3 (Ryc. 2) [12]. W komórkach nie wykazujących aktywności telomerazy, która posiada zdolność odbudowy końca 5, dochodzi do zmian w zarówno w długości, jak i w strukturze przestrzennej telomerów. W efekcie tracą one zdolność formowania pętli t. Aktywowane zostają szlaki wykrywające uszkodzenia DNA, a taka komórka wchodzi w fazę uśpienia (M1). Jeśli natomiast mutacje wystąpią w genach kodujących białka p53, prb, komórki będą się dalej dzielić, a telomery ulegną dalszemu skracaniu, aż do osiągnięcia fazy M2. W fazie tej dochodzi do licznych aberracji chromosomowych kierujących komórkę na drogę apoptozy. Białko p53 jest aktywowane w odpowiedzi na skracanie się telomerów i niestabilność genomu. Ograniczenie liczby podziałów zapobiega nagromadzeniu mutacji prowadzących do transformacji nowotworowej [13]. W niektórych 160

Diagn Lab 2014; 50(2): 159-167 komórkach (~1/10 7 ) po osiągnięciu fazy M2 może dochodzić do wtórnego przywrócenia aktywności telomerazy, co nadaje komórce charakter nieśmiertelności. Telomeraza Budowa i funkcje telomerazy Telomeraza jest kompleksem rybonukleoproteinowym złożonym z podjednostki katalitycznej o aktywności odwrotnej transkryptazy (htert), cząsteczki RNA (htr, ang. human telomerase RNA) oraz białek pomocniczych. RNA stanowi matrycę, na której syntetyzowany jest telomerowy DNA przy udziale odwrotnej transkryptazy [14, 15]. Podjednostka RNA występująca u ssaków ma długość 400-450 pz. Dla prawidłowego funkcjonowania wymaga zachowania filogenetycznie konserwatywnej struktury pierwszorzędowej i niekonserwatywnej struktury drugorzędowej, która wpływa na oddziaływanie z podjednostką katalityczną i tworzenie stabilnego kompleksu. W obrębie cząsteczki RNA można wyróżnić następujące motywy: matrycę, miejsce wiązania htert oraz sekwencję niezbędną do utworzenia miejsca aktywnego telomerazy [16, 17]. Gen kodujący podjednostkę katalityczną htert znajduje się na chromosomie 5 (5p15.33) i zbudowany jest z 16 eksonów i 15 intronów. Promotor genu kodującego podjednostkę katalityczną jest bogaty w pary GC, nie zawiera domen TATA i CAAT, oddziałuje z protoonkogenem c-myc oraz receptorami progesteronowymi i estrogenowymi. Podjednostka htert w regionie C-końcowym zawiera motyw odwrotnej transkryptazy i odgrywa kluczową rolę w regulacji aktywności telomerazy [18]. Zakładano, że w warunkach in vitro do prawidłowego funkcjonowania telomerazy wystarczą podjednostka htert oraz htr. Jednakże w warunkach in vivo niezbędny jest szereg białek ułatwiających funkcjonowanie enzymu. Wśród najważniejszych białek wymienić należy TEP1, p23, Hsp90 i dyskerynę. Podjednostka TEP1 (ang. telomerase associated Rycina 2. Skracanie końców liniowych chromosomów podczas replikacji (wg [12], zmodyfikowano) Polimerazy DNA biorące udział w procesie replikacji posiadają zdolność syntezy łańcucha DNA wyłącznie w kierunku 5 3. W związku z tym nić wiodąca syntezowana jest w sposób ciągły, natomiast nić opóźniona w postaci fragmentów Okazaki. Na końcu 5 nici opóźnionej pozostaje fragment DNA nieulegający powieleniu. W konsekwencji dochodzi do skrócenia sekwencji telomerowej o długość około 50 200 pz przy każdym podziale komórkowym. protein 1) łączy się z podjednostką htr i htert. Przypuszcza się, że pełni funkcję strukturalną i bierze udział w formowaniu kompleksu telomerazy [19]. Białka opiekuńcze p23 i Hsp należą do rodziny białek szoku cieplnego i są zasocjowane z podjednostką htert. Ich obecność jest niezbędna do funkcjonowania kompleksu i utrzymania prawidłowej konformacji przestrzennej. Dyskeryna (NAP57) natomiast zasocjowana jest z htr i odpowiada za wiązanie snorna (małe jąderkowe RNA, ang. small nucleolar RNA) [20]. Telomeraza, będąca polimerazą DNA zależną od RNA, wiąże się z końcem 3 telomerów i katalizuje reakcję dołączania krótkich sekwencji powtórzonych bogatych w guaninę. Dzięki temu zapobiega niezdolności mechanizmu replikacyjnego do pełnego powielania końców chromosomów [patrz wyżej] i tym samym przyczynia się do zachowania telomerów w ciągu całego życia komórki [21]. Wraz ze stopniem wydłużenia telomerów następuje spadek aktywności enzymu [22]. Regulacja aktywności telomerazy jest procesem kompleksowym, obejmuje, m.in. kontrolę transkrypcji, modyfikacje potranslacyjne, alternatywne składanie oraz szereg czynników aktywujących i hamujących. Duże znaczenie w regulacji aktywności kompleksu telomerazy mają również czynniki wpływające na fosforylację, składanie oraz transport poszczególnych podjednostek. Złożoność mechanizmów kontroli telomerazy jest badana w kontekście rozwoju nowotworu, jak i procesu starzenia [23]. Znaczenie telomerazy w nowotworach Komórki somatyczne zasadniczo nie wykazują aktywności telomerazy. Wyjątek stanowią tkanki samoodnawiające się, tj. komórki bazalnej warstwy naskórka, hematopoetyczne komórki macierzyste, aktywowane limfocyty oraz komórki krypt jelitowych. Telomeraza jest również aktywna w embrionalnych komórkach macierzystych (ESC, z ang. embryonic stem cells) oraz w komórkach linii płciowej [24]. Aktywność enzymu wykryto w fazach G1, S, G2 i M cyklu komórkowego. W fazie G0 jest ona tłumiona ze względu na niedobór czynników wzrostu, inhibicję kontaktową, czy indukcję procesu starzenia, bądź różnicowania. Zahamowanie ekspresji w fazie G0 jest zjawiskiem odwracalnym (poza komórkami ostatecznie zróżnicowanymi) [25, 26]. W komórkach nowotworowych do znaczącego wzrostu syntezy telomerazy dochodzi dopiero po rozpoczęciu niekontrolowanych podziałów, już po znacznej utracie podjednostek telomeru. Przywrócenie ekspresji i aktywności enzymatycznej telomerazy jest uznawane za krytyczny czynnik w procesie nowotworzenia. Zaktywowany kompleks telomerazy stabilizuje końce chromosomów, pozwalając tym samym na nabycie przez komórki nieśmiertelności [27]. Samo unieśmiertelnienie nie oznacza fenotypu nowotworowego, jednakże sprzyja uzyskaniu przez komórkę cech nowotworowych. Wykrycie aktywności telomerazy na wczesnym etapie rozwoju choroby możliwe jest w nowotworach piersi, głowy i szyi, płuca, skóry oraz pierwotnych nowotworach wątroby. Identyfikacja ekspresji genu TERT dopiero w bardziej zaawansowanych stadiach choroby możliwa jest w komórkach raka okrężnicy, trzustki czy tarczycy. Aktywność enzymu może stanowić również marker zmian resztkowych u chorych poddanych chemioterapii, dzięki czemu informuje o skuteczności prowadzonego leczenia [28]. 161

www.diagnostykalaboratoryjna.eu Na podstawie licznych badań można stwierdzić, iż aktywność telomerazy jest raczej markerem proliferacji niż transformacji nowotworowej. Im wyższy stopień agresywności i złośliwości nowotworu, tym wyższa jest aktywność telomerazy w komórkach. Ponadto wykazano, że im bardziej długość telomerów zbliżona jest do komórek prawidłowych, tym gorsze rokowanie przebiegu choroby [29]. Telomeraza pozostaje nadal kandydatem na specyficzny marker choroby nowotworowej w przypadku większości nowotworów. Potwierdzeniem tej koncepcji wydaje się nie malejąca liczba badań klinicznych z udziałem tego enzymu (clinicaltrials.org). Wyjątek stanowią komórki wykorzystujące mechanizm alternatywnego wydłużania telomerów (ang. alternative telomere lengthening, ALT) [30]. Metody blokowania aktywności telomerazy Podłoże molekularne dotyczące regulacji aktywności telomerazy w komórce jest złożone i stanowi wielopoziomo wy system nadzorujący. Mamy do czynienia z systemem obejmującym regulację na poziomie transkrypcji, potranskryp cyjnie oraz potranslacyjnie [23]. Wśród najbardziej istotnych i skutecznych strategii skierowanych przeciwko telomerazie w kontekście eliminacji komórek nowotworowych, można wymienić: inhibicję ekspresji podjednostek np.: antysensowne nukleotydy ASO (ang. antisense oligonucleotide); sirna (ang. small interfering RNA), inhibicję aktywności odwrotnej transkryptazy, immunoterapię, blokowanie dostępu telomerazy do telomeru; stabilizację G- -kwadrupleksu, terapię genową: wykorzystanie genów samobójczych lub genów wirusów onkolitycznych, będących pod kontrolą promotora genu htert. Najczęściej opisywaną i wykorzystywaną eksperymentalnie metodą blokowania aktywności telomerazy jest zahamowanie ekspresji genów kodujący poszczególne komponenty kompleksu. Prowadzi to do spadku aktywności telomerazy i w konsekwencji utraty zdolności do utrzymania stałej długości telomerów. Krytyczne skrócenie sekwencji telomerowych może dalej skutkować wejściem komórek na szlak apoptozy, co stanowi pożądany efekt terapii przeciwnowotworowych. Telomerazowe RNA jest obecne w komórkach niezależnie od poziomu aktywności telomerazy w przeciwieństwie do podjednostki htert, której ekspresja jest obniżona w komórkach prawidłowych i podwyższona w nowotworowych [18]. W związku z tym podjednostka htert wydaje się być lepszym celem, charakteryzującym się wyższą specyficznością niż łańcuch telomerazowego RNA. blokującym ekspresję części matrycowej telomerazy htr. Trwają badania nad jego wykorzystaniem w terapii zarówno nowotworów litych, jak i hematologicznych w tym: raka piersi, płuca, wątroby, prostaty i innych [32]. Blokowanie aktywności odwrotnej transkryptazy Inny inhibitor telomerazy, 3 -azydo-3 -deoksytymidyna (AZT) jest analogiem nukleozydowym. Ulegając stopniowej fosforylacji do aktywnych metabolitów, posiada zdolność do blokowania procesu odwrotnej transkrypcji i na zasadzie konkurencyjnej inhibicji z deoksynukleotydami powoduje przedwczesne zakończenie wydłużania łańcucha prowirusowego DNA i przerwanie replikacji [33]. W kombinacji z paklitakselem, AZT znacznie wzmacniał jego działanie, czyli skracanie telomerów oraz indukcję apoptozy. U myszy z ksenograftem raka krtani (FaDu) takie połączenie terapeutyczne doprowadziło do zmniejszenia wielkości guza resztkowego, wzrostu frakcji komórek apoptotycznych i wydłużenia czasu przeżycia, bez zwiększenia toksycznego wpływu na komórki prawidłowe. Brak efektu w telomerazo-ujemnych komórkach kostniakomięsaka Saos-2, oraz komórkach FaDu potraktowanych ASO htr, sugeruje, że obie substancje blokują aktywność telomerazy, ale w odmienny sposób [34]. Immunoterapia Z uwagi na fakt, że peptydy budujące telomerazę są swoistymi antygenami nowotworowymi, duże nadzieje wiąże się z zastosowaniem immunoterapii. Warto wspomnieć, że podjednostka htert, jako białko jądrowe, nie jest naturalnie obecna na powierzchni komórki ani wydzielana poza nią. Niemniej jednak, w komórkach o ekspresji htert, fragmenty lub peptydy powstałe po degradacji tego białka mogą być prezentowane na powierzchni komórek nowotworowych przez główny kompleks zgodności tkankowej klasy I (MHC I, z ang. major histocompatibility complex), przez co komórki te mogą stać się celem dla aktywowanych komórek układu odpornościowego. Strategia immunoterapii opiera sie więc na stymulacji układu immunologicznego pacjenta do atakowania komórek nowotworowych wykazujących ekspresję telomerazy. W efekcie peptydy pochodzące z podjednostki htert prezentowane są cytotoksycznym limfocytom T CD8+ przez MHC I. Dochodzi wówczas do lizy komórek nowotworowych pochodzących z różnych tkanek. Dodatkowo niektóre peptydy pochodzące z htert mogą być prezentowane w kontekście MHC II i aktywować limfocyty T pomocnicze (CD4+), które utrzymują i wzmacniają odpowiedź przeciwnowotworową [35]. Do najbardziej obiecujących szczepionek należą GV-1001, Vx-001 oraz GRNVAC1/2 (mechanizm działania opisano w Tabeli 1) [36-39]. Antysensowne nukleotydy Lu i wsp. [31] w swoich badaniach wykorzystali antysensowne oligonukleotydy, skierowane przeciwko htert i wykazali, że w komórkach raka płuc A549 prowadzą one do istotnego obniżenia ekspresji i aktywności telomerazy, skrócenia telomerów i indukcji starzenia. Po pozytywnych wynikach badań przedklinicznych został wprowadzony do badań klinicznych lek o nazwie handlowej imetelsat (GRN163L). Jest on antysensownym oligonukleotydem Blokowanie dostępu telomerazy do telomeru Zahamowanie aktywności telomerazy możliwe jest również poprzez stabilizację struktury G-kwadrupleksu zakończeń telomerowych, co utrudnia przyłączenie telomerazy. Wykazano, że pod wpływem stabilizatora G-kwadrupleksów o nazwie BRACO-19 dochodzi w komórkach raka szyjki macicy UXF1138L do indukowania spoczynku i apoptozy, oraz zmniejszenia ekspresji htert [40]. Aktywność przeciwnowotworową stabilizatorów G-kwa- 162

Diagn Lab 2014; 50(2): 159-167 drupleksów w badaniach in vitro wykazano również w liniach komórkowych m.in. raka piersi, cewki moczowej, trzustki, prostaty i czerniaka [41]. Terapia genowa Terapia genowa obejmuje terapeutyczne wykorzystywanie zarówno sekwencji całych genów, jak i krótszych, niekodujących sekwencji DNA lub RNA. Wymienia się dwie główne strategie terapeutyczne: (i) zastąpienie w komórkach wadliwie działających genów ich sprawnymi kopiami oraz (ii) blokowanie biosyntezy wadliwych produktów białkowych poprzez zmiany ekspresji genów [42]. W celu bezpośredniego niszczenia komórek nowotworowych wykorzystywane są m.in. geny samobójcze, kodujące enzymy umożliwiające przekształcenie nieaktywnego związku chemicznego w substancje toksyczną powodującą śmierć komórki. Plumb i wsp. [43] osiągnęli selektywny efekt pro-leku CB1954, wykorzystując sekwencje regulatorowe genów htert i htr do regulowania ekspresji metabolizującego go enzymu nitroreduktazy (NTR). W wyniku aktywności sekwencji promotorowych telomerazy w komórkach dochodzi do wzrostu produkcji nitroreduktazy, która z kolei doprowadza do zwiększenia metabolizmu pro-leku CB1954 i powstania jego formy aktywnej toksycznej dla komórek. Forma ta nie powstaje w komórkach prawidłowych, które nie są zdolne do metabolizmu pro-leku. Strategia enzymatycznej terapii pro-lekowej kierowanej genem (GDEPT, ang. Gene-directed enzyme pro-drug therapy) znacznie zwiększa skuteczność działania chemioterapeutyków w komórkach nowotworowych o wysokiej aktywności promotorów genów htert i htr oraz obniża toksyczność chemioterapeutyków wobec komórek prawidłowych. Kolejnym działaniem terapeutycznym skupiającym się na aktywności telomerazy w komórkach nowotworowych jest wykorzystanie wirusów onkolitycznych. Pierwsza faza badań klinicznych zmodyfikowanego adenowirusa typu 5, OBP-301 (Telomelizyny) wykazała dobrą tolerancję wśród pacjentów. Telomelizyna posiada w swoim genomie promotor htert, który kontroluje ekspresję genów wirusowych E1A i E1B. Podczas aktywacji promotora (htert) cały aparat komórkowy zmuszony jest do syntezy przede wszystkim białek wirusowych, co prowadzi do onkolitycznej śmierci komórek. Do produkcji białek wirusowych nie dochodzi zaś w komórkach prawidłowych ze względu na brak aktywacji promotora telomerazy. Badania in vitro potwierdziły wybiórczą infekcję i bezpośrednią lizę komórek nowotworowych poddanych działaniu OBP-301 [44]. Duże wyzwanie stanowi jednak sposób podania, największą skuteczność terapia osiąga przy podaniu miejscowym, a wprowadzenie bezpośrednio do krwiobiegu może powodować osłabienie wektorów wirusowych przez mechanizmy odporności. Tabela I. Główne kierunki badań nad wykorzystaniem telomerazy jako celu terapeutycznego Podejście terapeutyczne Nazwa Cel Mechanizm działania Efekt Piśmiennictwo Antysensowne GRN163L htr Blokowanie ekspresji części Zahamowanie proliferacji [31, 32] nukleotydy ASO matrycowej telomerazy htr komórek nowotworowych/ Indukcja apoptozy Inhibitory aktywności AZT Proces elongacji Przedwczesne zakończenie wydłużania Indukcja stopniowego skracania [33,34] odwrotnej transkryptazy 3 -azydo-3 - deoksytymidyna łańcucha DNA łańcucha DNA przez kompetycyjne blokowanie procesu odwrotnej transkrypcji telomerów/ Zahamowanie proliferacji komórek nowotworowych Immunoterapia GV1001 Kilka klas HLA Stymulacja autologicznych Indukcja odpowiedzi [36] limfocytówt CD4+ immunologicznej Vx-001 HLA-A [37] GRNVAC1/2 Komórki dendrytyczne Prezentacja antygenu przez komórki dendrytyczne transfekowane mrna htert [38, 39] Stabilizatory G- -kwadrupleksu BRACO-1910 Jednoniciowy telomerowy DNA Blokowanie dostępu telomerazy do zakończeń telomerowych Indukcja erozji telomerów/ Hamowanie cyklu komórkowego [40, 41] Terapia genowa CB1954 Telomelizyna Komórki nowotworowe z wysoką aktywnością telomerazy (OBP-301) GDEPT; enzymatyczna terapia pro-lekowa kierowana genem Wprowadzenie genu chimerycznego (sekwencji kodującej białko proapoptotyczne pod kontrolą promotora genu htert) Liza komórek nowotworowych [43] [44] Modulatory ekspresji sirna wyciszające ekspresję htert htert Wprowadzenie sirna anti-tert przy wykorzystaniu wektorów wirusowych Spadek replikacji i wzrost apoptozy w komórkach nowotworowych/ wzrost wrażliwości na chemio- i radioterapię [51-55] 163

www.diagnostykalaboratoryjna.eu Jedną z najbardziej efektywnych i specyficznych metod blokowania telomerazy wydaje się być metoda wykorzystująca zjawisko interferencji RNA. Dobór odpowiedniej sekwencji, ale i odpowiedniego wektora, może w sposób wysoce selektywny doprowadzić do wyłączenia telomerazy w poszczególnych tkankach w tym w tkankach objętych zmianami nowotworowymi. Interferencja RNA Mechanizm interferencji RNA Interferencja RNA (RNAi) jest naturalnie występującym mechanizmem wyciszania genów zależnym od dwuniciowego RNA (dsr- NA, ang. double stranded RNA) po raz pierwszy zaobserwowanym u nicienia Caenorhabditis elegans. Wprowadzone do komórki długie cząsteczki dsrna rozpoznawane są przez enzym Dicer (RNaza III, helikaza) i następnie cięte do krótszych, jednoniciowych fragmentów o długości 21 25 nt (zwanych sirna), komplementarnych do sekwencji wyciszanego genu [45, 46]. sirna wiąże się z wielopodjednostkowym kompleksem białkowym RISC (ang. RNA-induced silencing complex) o aktywność endorybonukleazy. Zaktywowany kompleks zawiera jednoniciową cząsteczkę sirna. Po rozpoznaniu odpowiedniej cząsteczki sirna kompleks kieruje ją do komplementarnego mrna. Białko Argonauta, będące składnikiem kompleksu, posiada aktywność RNazy H i powoduje przecięcie cząsteczki mrna związanej z sirna. mrna genu docelowego ulega degradacji, w związku z czym dochodzi do wyciszenia jego ekspresji [47, 48] (ryc. 3). Wykorzystanie sirna w biologii i medycynie Odkrycie możliwości regulacji ekspresji genów przy użyciu egzogennego RNA stało się obiecującym narzędziem w biologii i medycynie. Wciąż trwają intensywne badania nad wykorzystaniem sirna w projektowaniu nowych leków, bądź wyciszaniu Rycina 3. Wybrane mechanizmy modulacji ekspresji htert w komórkach nowotworowych Trwałe wyciszenie ekspresji htert w komórkach nowotworowych prowadzi do zmniejszenia aktywności telomerazy, a w efekcie do krytycznego skrócenia długości telomerów w komórkach nowotworowych i skierowania ich na drogę apoptozy. Mechanizm wyciszenia telomerazy może również powodować szereg zmian w komórce prowadząc do jej śmierci w sposób niezależny od długości telomerów. genów odpowiedzialnych za rozwój wielu chorób. Badania kliniczne znajdujące się obecnie w I lub II fazie obejmują wykorzystanie sirna oraz jego prekursora shrna (ang. short-hairpin RNA) w terapii chorób wirusowych, metabolicznych, neurologicznych, chorób nerek, siatkówki oka oraz chorób nowotworowych [49]. Z zastosowaniem sirna wiąże się duże nadzieje ze względu na możliwość selektywnego działania na komórki nowotworowe i wybrane geny, w tym onkogeny takie jak bcr/abl, ras lub p53 [50]. Zwiększenie ilości komórek apoptotycznych po transfekcji specyficznym sirna zaobserwowano między innymi dla linii raka trzustki [51], płuca [52], czy szyjki macicy [53]. Strategie umożliwiające kliniczne zastosowanie sirna przeciwko telomerazie Celem dla sirna stały się również geny kodujące podjednostki telomerazy. Badania Ge i wsp. [52] wykazały, że wyciszenie ekspresji htert przy pomocy sirna prowadzi do spadku proliferacji i wzrostu apoptozy w komórkach raka płuca już po 48h od transfekcji. Podobnie w komórkach nowotworowych nerwiaka płodowego (ang. neuroblastoma) zaobserwowano istotne zmiany w cyklu komórkowym oraz wzrost liczby komórek apoptotycznych pod wpływem sirna skierowanego przeciwko telomerazie [54]. Inhibicja ekspresji zarówno htert jak i htr wydaje się mieć duże znaczenie w projektowaniu terapii w raku płaskonabłonkowym jamy ustnej. Badania z wykorzystaniem ksenograftów potwierdziły istotny wpływ wprowadzenia sirna na spadek proliferacji komórek nowotworowych. Ponadto dla tego rodzaju nowotworu najsilniejszy efekt przeciwnowotworowy obserwowano w komórkach z wyciszoną ekspresją podjednostki htr, nieco mniej skuteczne okazało się jednoczesne wyciszenie obu genów htert i htr oraz samej podjednostki htert [55]. Zastosowanie terapii sirna skierowanej przeciwko telomerazie zwiększa również wrażliwość komórek nowotworowych na terapię. Nieskuteczność chemioterapii często jest wynikiem zwiększenia poziomu białek z nadrodziny transporterów ABC co prowadzi do zjawiska zwanego opornością wielolekową (MDR, ang. multidrug resistance). Komórki nowotworowe wykazujące oporność na szereg chemioterapeutyków w połączeniu z inhibicją telomerazy mają szansę stać się ponownie celem terapii [56]. Według badań przeprowadzonych na linii nowotworowej pęcherza moczowego EJ28 jednoczesne połączenie sirna htert z takimi chemioterapeutykami jak cisplatyna i mitomycyna w ciągu 72 godzin wywołało redukcję liczby komórek nowotworowych o 50% i zwiększyło częstość apoptozy [57]. Zablokowanie ekspresji htert w komórkach linii raka szyjki macicy HeLa oraz raka okrężnicy HCT116 zwiększyło ich wrażliwość na cisplatynę, powodując wzrost frakcji komórek apoptotycznych [58]. Natomiast komórki raka piersi MCF7 i MDA- -MB-453 z wyciszonym genem htert lepiej reagowały na doksorubicynę [59]. 164

Diagn Lab 2014; 50(2): 159-167 Otwiera to ogromne możliwości w kontekście przezwyciężania oporności wielolekowej, zwiększenia skuteczności terapii stosowanych do tej pory oraz obniżenia dawek leków. Ponadto wykazano, że komórki nowotworowe po uprzedniej transfekcji sirna htert reagują także lepiej na radioterapię [60]. W przyszłości skojarzenie sirna z chemioterapią, bądź radioterapią może zwiększać ich skuteczność i istotnie ograniczać skutki uboczne leczenia (Tab. I). Perspektywy Cząsteczki sirna wzbudzają duże zainteresowanie wśród naukowców zajmujących się terapią przeciwnowotworową z wykorzystaniem narzędzi molekularnych. Skuteczność w badaniach in vitro przyniosła efekt w postaci licznych badań klinicznych z zastosowaniem sirna [50]. Problemem ograniczającym możliwość aplikacji sirna w warunkach in vivo jest jego niestabilność w krwioobiegu oraz brak zdolności do przejścia przez błonę komórkową. Największym wyzwaniem związanym ze stosowaniem sirna jest jego dostarczenie do komórek docelowej tkanki lub organu, w której występuje ekspresja genu będącego celem sirna. Rozwiązaniem może być stosowanie bionanokapsułek czy liposomów, które są odporne na degradację enzymatyczną i zdolne do przenikania przez błonę komórkową [61]. Skuteczne może się okazać również dostarczanie sirna za pośrednictwem wirusów. Obecnie wyróżnić można kilka rodzajów wektorów wirusowych: retrowirusy, adenowirusy, lentiwirusy, wirusy towarzyszące adenowirusom (AAV ang. adenoassociated virus) i baculowirusy [62]. W terapii genowej planuje się podawanie gotowych cząsteczek sirna lub stosowanie wektorów umożliwiających stabilną ekspresję kasety shrna poprzez integrację wektora wirusowego do genomu gospodarza, albo w postaci wektora samoreplikującego. Wirth i wsp. [63] dowiedli, że adenowirus (Ad) z wprowadzonym promotorem htert (TERT-Ad) cechował się dużą selektywnością replikacji i rozprzestrzenienia infekcji tylko w komórkach linii nowotworowych z ekspresją htert. Pomimo, iż przeprowadzone badania wskazują na selektywność zmodyfikowanego adenowirusa, istnieje ryzyko wytworzenia silnej i niekontrolowanej odpowiedzi immunologicznej w organizmie gospodarza. Poza tym geny wprowadzone za pomocą tego typu nośników pozostają w jądrze komórkowym w postaci episomalnej, pozwala to na bardzo silną ekspresję, lecz tylko przez pewien czas, po którym dochodzi do całkowitego zaniku ekspresji transgenu. Stosowanie wektorów retrowirusowych wiąże się natomiast z dużym ryzykiem wystąpienia mutagenezy insercyjnej [64]. Nie można w żaden sposób kontrolować, w które miejsce w genomie wbuduje się wirus, który najczęściej wybiera regiony o dużej zawartości genów. Takie zjawisko może skutkować niekontrolowanymi zmianami w procesach komórkowych, aktywacją onkogenów, a nawet wtórną inicjacją nowotworu co istotnie ogranicza możliwość ich zastosowania w terapii [62]. Lepsze rozwiązanie wydają się stanowić wektory lentiwirusowe. Do ich zalet poza łatwością otrzymywania i stabilną ekspresją transgenu, należy również możliwość usunięcia sekwencji naturalnych i promotorowych, co ogranicza ryzyko wystąpienia mutagenezy [65]. Skuteczność wyciszania ekspresji htert przy użyciu wektorów lentiwirusowych potwierdzono między innymi w badaniach komórek raka płuca A549 [66]. Prowadzone obecnie badania kliniczne dotyczą głównie zastosowania lentiwirusów do skierowania odpowiedzi immunologicznej limfocytów T przeciwko specyficznym antygenom nowotworowym [67]. W badaniach in vivo na myszach wykazano, że przy użyciu wektorów lentiwirusowych możliwe jest skierowanie odpowiedzi limfocytów T CD8+ przeciwko komórkom nowotworowym wykazującym ekspresję htert [68]. Te obiecujące wyniki dają nadzieję na rychłe wprowadzenie do badań klinicznych zmodyfikowanych lentiwirusów, mających za zadanie bezpośrednio wyciszyć ekspresję telomerazy w komórkach nowotworowych lub też wykorzystać specyficzność antygenową telomerazy do ukierunkowania odpowiedzi immunologicznej. Ograniczenia terapii, której celem jest telomeraza Choć podwyższona aktywność telomerazy dotyczy głównie komórek nowotworowych, nie należy zapominać o komórkach prawidłowych, w tym komórkach macierzystych, wykazujących aktywność tego enzymu. Wyciszenie ekspresji telomerazy w tych ostatnich może doprowadzić do skrócenia długości telomerów i przyspieszonego starzenia komórek prawidłowych. Wykazano jednak, że telomery w komórkach prawidłowych są znacząco dłuższe niż w większości komórek nowotworowych (w komórkach nowotworowych najpierw dochodzi do skrócenia długości telomerów, a wtórnie aktywowana jest telomeraza), co czyni je mniej wrażliwymi na zahamowanie aktywności telomerazy [69]. Niemniej w planowaniu terapii należy również uwzględnić potencjalny wpływ na aktywność telomerazy w pozostałych komórkach organizmu. Podsumowanie Odkrycie telomerazy stanowiło duży krok w poznaniu funkcjonowania komórek nowotworowych i stało się podstawą wielu nowych strategii w walce z nowotworami, w tym terapii genowej i terapii z zastosowaniem sirna. W najbliższym czasie najważniejsze będzie zaprojektowanie skutecznych metod wprowadzenia interferujących cząsteczek RNA do komórek nowotworowych. Podane powyżej przykłady przeprowadzonych doświadczeń potwierdzają słuszność założenia, iż wyciszenie ekspresji podjednostki katalitycznej telomerazy przyczynia się do inaktywacji enzymu, a tym samym do hamowania proliferacji komórek nowotworowych w warunkach in vitro i skierowania ich na drogę apoptozy. Dodatkowo zaobserwowano, że połączenie mechanizmu interferencji RNA z lekami cytostatycznymi lub radioterapią zwiększa skuteczność dotychczas stosowanych terapii. Telomeraza wydaje się być dobrym celem terapii przeciwnowotworowej, ze względu na dużą specyficzność i możliwość zahamowania jej aktywności na różnych etapach. Należy jednak podkreślić, że większość wyników świadczących o skuteczności strategii hamowania telomerazy uzyskano tylko w warunkach in vitro, a podjęte badania kliniczne, które mogą lepiej odzwierciedlić wpływ zmian w poziomie aktywności telomerazy na cały organizm, są dopiero na początkowych etapach. Wyniki przeprowadzonych do tej pory badań prezentowanych w lite- 165

www.diagnostykalaboratoryjna.eu raturze naukowej wskazują na ogromne możliwości wykorzystania telomerazy w projektowaniu nowych terapii celowanych oraz w poprawie skuteczności stosowanych dotychczas leków przeciwnowotworowych. Praca dofinansowana z projektów: 2011/03/B/NZ7/00512; SBN nr 502-05-03318432-50736. Piśmiennictwo 1. World Health Organisation: Facts sheets N297 Cancer, February 2014: http:// www.who.int/mediacentre/factsheets/fs297/en/ 2. Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR, et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science 1994; 266: 2011 2015. 3. Podlevsky JD, Chen JJ-L. It all comes together at the ends: telomerase structure, function, and biogenesis. Mutat Res 2012; 730: 3 11. 4. Lu W, Zhang I, Liu D et al. Telomeres structure, function, and regulation. Exp Cell Res 2013; 319: 133-141. 5. Kong CM, Lee XW, Wang X. Telomere shortening in human diseases. The FEBS Journal 2013; 280: 3180 3193. 6. Kowalska A, Kowalik A. Telomer i telomeraza w onkogenezie. Współczesna onkologia 2006; 10: 485-496. 7. Choi KH, Farrell AS, Lakamp AS et al. Characterization of the DNA binding specificity of Shelterin complexes. Nucleic Acids Res 2011; 39: 9206 9223. 8. Diotti R, Loayza D. Shelterin complex and associated factors at human telomeres. Nucleus 2011; 2: 119 135. 9. Martínez P, Blasco MA. Telomeric and extra-telomeric roles for telomerase and the telomere-binding proteins. Nat Rev Cancer 2011; 11: 161 176. 10. Hayflick L. The limited in vitro lifetime of human diploid cell strains. Exp Cell Res 1965; 37: 614 636. 11. Chin L, Artandi SE, Shen Q et al. p53 deficiency rescues the adverse effects of telomere loss and cooperates with telomere dysfunction to accelerate carcinogenesis. Cell 1999; 97: 527 538. 12. Shore D, Bianchi A. Telomere length regulation: coupling DNA end processing to feedback regulation of telomerase. EMBO J 2009; 28: 2309-2322. 13. Oeseburg H, de Boer RA, van Gilst WH et al. Telomere biology in healthy aging and disease. Pflugers Arch 2010; 459: 259-268. 14. Mason M, Schuller A, Skordalakes E. Telomerase structure function. Curr Opin Struct Biol 2011; 21: 92 100. 15. Saldanha SN, Andrews LG, Tollefsbol TO. Analysis of telomerase activity and detection of its catalytic subunit, htert. Anal Biochem 2003; 315: 1 21. 16. Roy J, Fulton TB, Blackburn EH. Specific telomerase RNA residues distant from the template are essential for telomerase function. Genes Dev 1998; 12: 3286 3300. 17. Laterreur N, Eschbach SH, Lafontaine DA, Wellinger RJ. A new telomerase RNA element that is critical for telomere elongation. Nucl Acids Res 2013; 41: 7713 7724. 18. Daniel M, Peek GW, Tollefsbol TO. Regulation of the human catalytic subunit of telomerase (htert). Gene 2012; 498: 135 146. 19. Chang JT-C, Chen Y-L, Yang H-T et al. Differential regulation of telomerase activity by six telomerase subunits. Eur J Biochem 2002; 269: 3442 3450. 20. Forsythe HL, Jarvis JL, Turner JW et al. Stable association of hsp90 and p23, but Not hsp70, with active human telomerase. J Biol Chem 2001; 276: 15571 15574. 21. Pfeiffer V, Lingner J. Replication of telomeres and the regulation of telomerase. Cold Spring Harb Perspect Biol 2013; DOI: 10.1101/cshperspect. 22. Shore D, Bianchi A. Telomere length regulation: coupling DNA end processing to feedback regulation of telomerase. EMBO J 2009; 28: 2309 2322. 23. Wojtyla A, Gladych M, Rubis B. Human telomerase activity regulation. Mol Biol Rep 2011; 38: 3339 3349. 24. Collins K, Mitchell JR. Telomerase in the human organism. Oncogene 2002; 21: 564 579. 25. Kazanowska B, Mikołajewska A, Reich A i wsp. Telomery i aktywność telomerazy w komórkach. Adv Clin Exp Med 2003; 12: 87 95. 26. Hornsby PJ. Cellular aging and cancer. Crit Rev Oncol Hematol 2011; 79: 189 195. 27. Shay JW, Wright WE. Telomerase therapeutics for cancer: challenges and new directions. Nat Rev Drug Discov 2006; 5: 577 584. 28. Hiyama E, Hiyama K. Telomerase as tumor marker. Cancer Lett 2003; 194: 221 233. 29. Gertler R, Rosenberg R, Stricker D et al. Telomere length and human telomerase reverse transcriptase expression as markers for progression and prognosis of colorectal carcinoma. J Clin Oncol 2004; 22: 1807 1814. 30. Conomos D, Pickett H, Reddel RR. Alternative lengthening of telomeres: remodeling the telomere architecture. Front Oncol 2013; 3: 27. 31. Lu H, Lei Z, Lu Z et al. Silencing tankyrase and telomerase promotes A549 human lung adenocarcinoma cell apoptosis and inhibits proliferation. Oncol Rep 2013; 30: 1745 1752. 32. Röth A, Harley CB, Baerlocher GM. Imetelstat (GRN163L)--telomerase-based cancer therapy. Recent Results Cancer Res 2010; 184: 221 234. 33. Mo Y, Gan Y, Song S et al. Simultaneous Targeting of Telomeres and Telomerase as a Cancer Therapeutic Approach. Cancer Res 2003; 63: 579 585. 34. Johnston JS, Johnson A, Gan Y et al. Synergy between 3 -azido-3 -deoxythymidine and paclitaxel in human pharynx FaDu cells. Pharm Res 2003; 20: 957 961. 35. Liu J-P, Chen W, Schwarer AP, Li H. Telomerase in cancer immunotherapy. Biochim Biophys Acta 2010; 1805: 35 42. 36. Shaw VE, Naisbitt DJ, Costello E et al. Current status of GV1001 and other telomerase vaccination strategies in the treatment of cancer. Expert Rev Vaccines 2010; 9: 1007-1016. 37. Vetsika EK, Konsolakis G, Aggouraki D et al. Immunological responses in cancer patients after vaccination with the therapeutic telomerase-specific vaccine Vx-001. Cancer Immunol Immunother 2012; 61: 157-168. 38. Su Z, Dannull J, Yang BK, et al. Telomerase mrna-transfected dendritic cells stimulate antigen-specific CD8+ and CD4+ T cell responses in patients with metastatic prostate cancer. J Immunol 2005; 174: 3798 3807. 39. Di Persio JF, Collins Jr RH, Blum W, et al. Immune responses in AML patients following vaccination with GRNVAC1, autologous RNA transfected dendritic cells expressing telomerase catalytic subunit htert. ASH Annu Meeting Abstr 2009; 114: 633. 40. Burger AM, Dai F, Schultes CM et al. The G-quadruplex-interactive molecule BRACO-19 inhibits tumor growth, consistent with telomere targeting and interference with telomerase function. Cancer Res 2005; 65: 1489 1496. 41. Neidle S. Human telomeric G-quadruplex: the current status of telomeric G-quadruplexes as therapeutic targets in human cancer. FEBS J 2010; 277: 1118 1125. 42. Verma IM, Weitzman MD. Gene therapy: twenty-first century medicine. Annu Rev Biochem 2005; 74: 711 738. 43. Plumb JA, Bilsland A, Kakani R et al. Telomerase-specific suicide gene therapy vectors expressing bacterial nitroreductase sensitize human cancer cells to the pro-drug CB1954. Oncogene 2001; 20: 7797 7803. 44. Nemunaitis J, Tong AW, Nemunaitis M et al. A phase I study of telomerase- -specific replication competent oncolytic adenovirus (telomelysin) for various solid tumors. Mol Ther 2010; 18: 429 434. 45. Ye K, Malinina L, Patel DJ. Recognition of small interfering RNA by a viral suppressor of RNA silencing. Nature 2003; 426: 874 878. 46. Castel SE, Martienssen RA. RNA interference in the nucleus: roles for small RNAs in transcription, epigenetics and beyond. Nat Rev Genet 2013; 14: 100 112. 47. Moazed D. Small RNAs in transcriptional gene silencing and genome defence. Nature 2009; 457: 413 420. 48. Gavrilov K, Saltzman WM. Therapeutic sirna: principles, challenges, and strategies. Yale J Biol Med 2012; 85: 187 200. 49. Davidson BL, McCray PB. Current prospects for RNA interference-based therapies. Nat Rev Genet 2011; 12: 329 340. 50. Burnett JC, Rossi JJ, Tiemann K. Current progress of sirna/shrna therapeutics in clinical trials. Biotechnol J 2011; 6: 1130 1146. 51. Zhong YQ, Xia ZS, Fu YR et al. Knockdown of htert by SiRNA suppresses growth of Capan-2 human pancreatic cancer cell via the inhibition of expressions of Bcl-2 and COX-2. J Digest Dis 2010; 11: 176 184. 52. Ge L, Shao W, Zhang Y et al. RNAi targeting of htert gene expression induces apoptosis and inhibits the proliferation of lung cancer cells. Oncol Lett 2011; 2: 1121 1129. 53. Jian W, Chang-shan R. Mechanism of induction of apoptosis by sirna targeting htert in HeLa cells. Chin J Cancer Res 2008; 20: 115 120. 54. Tsai M-D, Chen P-R, Tien L-T et al. Nuclear condensation and cell cycle arrest induced by telomerase sirna in neuroblastoma cells. J Neurooncol 2013; 111: 265 272. 166

Diagn Lab 2014; 50(2): 159-167 55. Li Y, Li M, Yao G et al. Telomerase inhibition strategies by sirnas against either htr or htert in oral squamous cell carcinoma. Cancer Gene Ther 2011; 18: 318 325. 56. Majorek M, Guzenda P, Lamparska-Przybysz M i wsp. Krótkie interferujące RNA w onkologii. Współczesna onkologia 2006; 10: 367 372. 57. Kraemer K, Schmidt U, Fuessel S et al. Microarray analyses in bladder cancer cells: inhibition of htert expression down-regulates EGFR. Int J Cancer 2006; 119: 1276 1284. 58. Massard C, Zermati Y, Pauleau A-L et al. htert: a novel endogenous inhibitor of the mitochondrial cell death pathway. Oncogene 2006; 25: 4505 4514. 59. Dong X, Liu A, Zer C et al. sirna inhibition of telomerase enhances the anti- -cancer effect of doxorubicin in breast cancer cells. BMC Cancer 2009; 9: 133. 60. Davis ME, Zuckerman JE, Choi CHJ et al. Evidence of RNAi in humans from systemically administered sirna via targeted nanoparticles. Nature 2010; 464: 1067 1070. 61. Nishimura Y, Mieda H, Ishii J et al. Targeting cancer cell-specific RNA interference by sirna delivery using a complex carrier of affibody-displaying bio-nanocapsules and liposomes. J Nanobiotech 2013; 11: 19. 62. Musacchio T, Torchilin VP. sirna delivery: from basics to therapeutic applications. Front Bios 2013; 18: 58 79. 63. Wirth T, Zender L, Schulte B et al. A telomerase-dependent conditionally replicating adenovirus for selective treatment of cancer. Cancer Res 2003; 63: 3181 3188. 64. Józkowicz A, Dulak J. Nowe strategie wykorzystania wektorów plazmidowych i wirusowych w terapii genowej. Biotechnologia 2007; 3: 7 21. 65. Rothe M, Modlich U, Schambach A. Biosafety challenges for use of lentiviral vectors in gene therapy. Curr Gene Ther 2013; 13: 453 684. 66. Tang H, Ge L, Shao W et al. Effect of targeted silencing of htert mrna by lentivirus-mediated sirna on A549 lung cancer cells in vitro. Mol Biol Rep 2013; 40: 605 616. 67. Liechtenstein T, Perez-Janices N, Escors D. Lentiviral vectors for cancer immunotherapy and clinical applications. Cancers 2013; 5: 815 837. 68. Adotévi O, Mollier K, Neuveut C et al. Targeting human telomerase reverse transcriptase with recombinant lentivector is highly effective to stimulate antitumor CD8 T-cell immunity in vivo. Blood 2010; 115: 3025 3032. 69. Donate LE, Blasco M. Telomeres in cancer and ageing. Phil Trans R Soc B 2011; 366: 76 84. Adres do korespondencji: mgr Natalia Lipińska Katedra i Zakład Chemii Klinicznej i Diagnostyki Molekularnej UMP 60-355 Poznań, ul. Przybyszewskiego 49 tel. +48 61 8691549 e-mail: nlipinska@ump.edu.pl Zaakceptowano do publikacji: 23.04.2014 167

www.diagnostykalaboratoryjna.eu 168