Amplifikacja genów w nowotworach układu krwiotwórczego

PRACA POGLĄDOWA Review Article Acta Haematologica Polonica 2009, 40, Nr 2, str. 313 319 OLGA HAUS 1,2, EWA DUSZEŃKO 2, ANNA JAŚKOWIEC 2, KATARZYNA SKONIECZKA 1 Amplifikacja genów w nowotworach układu krwiotwórczego Gene amplification in hematological malignancies 1 Katedra i Zakład Genetyki Klinicznej Collegium Medicum UMK w Bydgoszczy Kierownik: Prof. dr hab. n. med. O. Haus 2 Katedra i Klinika Hematologii, Nowotworów Krwi i Transplantacji Szpiku AM we Wrocławiu Kierownik: Prof. dr hab. n. med. K. Kuliczkowski STRESZCZENIE Zwiększenie liczby kopii genów jest w nowotworach układu krwiotwórczego zjawiskiem rzadkim (1 10%), w porównaniu z jego częstością w nowotworach narządowych (kilkadziesiąt %). MoŜe być ono zwiększeniem niewielkiego stopnia, 4 kopie genu, co wynika najczęściej z polisomii chromosomów, albo zwielokrotnieniem (amplifikacją), 5 kopii. Obecność 20 kopii genu to amplifikacja wysokiego stopnia. Amplifikacje genów w białaczkach dotyczą najczęściej onkogenów, genów biorących udział w regulacji cyklu komórkowego, genów oporności na cytostatyki. Cytogenetyczną manifestacją amplifikacji wysokiego stopnia są regiony barwiące się homogennie (HSR) oraz podwójne malutkie chromosomy (DMs), jednak w białaczkach amplifikacje genów najczęściej występują w obrębie zmienionych strukturalnie chromosomów np. olbrzymich markerów lub chromosomów pierścieniowych. Amplifikacja genów MLL i AML1 w ostrej białaczce szpikowej, niezaleŝnie od zaangaŝowania róŝnych genów, ma podobny obraz cytogenetyczny (złoŝony kariotyp, utraty ramion długich chromosomów 5 i 7, utrata jednej kopii TP53) i kliniczny (starszy wiek chorych, często poprzedzająca białaczkę terapia lekami alkilującymi, oporność na leczenie, złe rokowanie). SŁOWA KLUCZOWE: Amplifikacja genu MLL AML1 C-MYC Białaczka SUMMARY The increase of gene copy number is a rare event in blood malignancies (1-10%) in comparison with solid tumors (up to 100% cases). An increase may be of low level, 3-4 gene copies, what the most frequently results from chromosome polysomy. The presence of 5 gene copies is called amplification. This may be of low-medium level (5 20 copies) or high level ( 20). Gene amplifications in leukemia involve the most often oncogenes, cell cycle regulating genes, and cytostatics resistance genes. Cytogenetic manifestation of high level amplification are homogeneously staining regions (HSR) or double minute chromosomes (DM). However, in leukemias gene amplifications are situated mainly in structurally aberrant chromosomes, e.g. giant marker chromosomes or rings. MLL or AML1 amplification in acute myeloid leukemia (AML), although it involves different genes, has a similar cytogenetic (complex karyotype, losses of long arms of chromosomes 5 and 7, loss of one copy of TP53), as well as clinical (patients advanced age, frequent therapy with alkylating agents before the onset of AML, resistance to treatment, and poor prognosis) picture. KEY WORDS: Gene amplification MLL AML1 C-MYC Leukemia

314 O. HAUS i wsp. Badania genetyczne; cytogenetyczne, cytogenetyczno-molekularne (np. FISH) i molekularne, znalazły w ostatnich latach zasłuŝone miejsce wśród metod diagnostyki i monitorowania nowotworów układu krwiotwórczego. Świadczy o tym choćby nowy system klasyfikacji nowotworów hematologicznych WHO, oparty w znacznej mierze na ocenie genetycznych markerów poszczególnych chorób [1, 2]. Znane markery genetyczne, takie jak translokacja t(9;22) z fuzją genów BCR/ABL, inwersja inv(16)(p11q22) z rearanŝacją genu CBFB, czy wewnętrzna tandemowa duplikacja genu FLT3 (FLT3-ITD), i wiele innych, odgrywają rolę nie tylko w diagnostyce i monitorowaniu choroby, lecz równieŝ w ustalaniu rokowania, stanowiąc niezaleŝne czynniki rokownicze [1]. Uwaga genetyków hematoonkologicznych oraz hematologów skupia się głównie na aberracjach chromosomowych powodujących fuzje lub inne przegrupowania genowe, a ostatnio równieŝ na wewnątrzgenowych rearanŝacjach, z lub bez towarzyszących im aberracji. Niektóre z tych zmian są charakterystyczne lub nawet specyficzne dla określonych nowotworów, choć mogą równieŝ występować w nielicznych komórkach krwi u zupełnie zdrowych ludzi, u których dalsza obserwacja nie wykazuje Ŝadnych oznak choroby [3]. Obecność ściśle określonych zmian genetycznych w nowotworach stała się punktem wyjścia poszukiwania terapii na miarę leczenia skierowanego przeciw tym zmianom lub ich produktom białkowym [1]. Zwiększenie liczby kopii genów nie jest zjawiskiem tak dobrze poznanym w hematoonkologii, jak ww. rearanŝacje. Wynika to z jego rzadkości w nowotworach hematologicznych, w porównaniu z nowotworami narządowymi (np. amplifikacja N-MYC w neuroblastoma lub EGFR w glejakach) [4]. Jest to jednak zmiana genetyczna warta zainteresowania ze względu na jej znaczenie rokownicze i moŝliwość zastosowania leczenia skierowanego przeciw zwielokrotnionym genom. Zwiększenie liczby kopii genów moŝe być zwiększeniem niewielkim do czterech kopii genu albo jego zwielokrotnieniem (amplifikacją), czyli obecnością co najmniej 5 kopii genu albo segmentu DNA. MoŜna takŝe wyróŝnić amplifikację wysokiego stopnia, czyli obecność od 20 do kilkuset kopii genu [4, 5]. Niewielkie zwiększenie liczby kopii genów, <5, wynika z reguły z liczbowych aberracji chromosomów poliploidii (zwiększenie liczby kopii wszystkich chromosomów), lub aneuploidii (np. zwiększenie liczby kopii poszczególnych chromosomów) albo niezrównowaŝonych translokacji, połączonych z naddatkiem materiału genetycznego. W kaŝdym z tych przypadków zmiana dotyczy nienaruszonych chromosomów, całych ich ramion albo większych niŝ 20 Mb regionów chromosomowych. Jeśli do jej powstania niezbędne jest przerwanie ciągłości nici DNA (jak w translokacjach), zachodzi tylko pojedyncze złamanie chromosomu. Natomiast amplifikacja powstaje w wyniku złamań nici DNA na obu końcach amplifikowanego genu/sekwencji DNA (amplikonu) o długości mniejszej niŝ 20Mb, a następnie wielokrotnej replikacji zawartego między złamaniami odcinka. W obrębie amplikonów zlokalizowane są z reguły geny, których zwiększona ekspresja przyczynia się do nasilenia proliferacji komórek nowotworowych, zahamowania ich dojrzewania, wzmocnienia oporności na leki cytostatyczne, itd. [4, 6]. Genami najczęściej amplifi-

Amplikacja genów w nowotworach 315 kowanymi w białaczkach są: MLL, C-MYC, rzadziej inne onkogeny, ETS1, AML1, gen oporności wielolekowej MDR, lub inne geny oporności na cytostatyki, w tym geny enzymów docelowych dla cytostatyków, np. DHFR, oraz geny cyklu komórkowego [7]. Amplifikacja tych genów występuje zazwyczaj w zaawansowanych stadiach choroby i pociąga za sobą bardziej agresywny jej przebieg, zmniejszenie odsetka uzyskiwanych remisji oraz skrócenie całkowitego czasu przeŝycia chorych. Amplifikacja genów nie zawsze jednak powoduje ich zwiększoną ekspresję. Nie wiadomo, jaka jest przyczyna i mechanizm tego zjawiska, a jego związek z fenotypem choroby jest dopiero w trakcie badań [8]. Cytogenetyczną manifestacją amplifikacji genów mogą być struktury wewnątrzchromosomowe regiony barwiące się homogennie (homogeneously staining regions=hsr), albo zewnątrzchromosomowe podwójne malutkie chromosomy (double minute chromosomes=dmin=dm). Pierwsze z nich są rozdzielane symetrycznie do komórek potomnych wraz z chromosomami, w obrębie których są zlokalizowane, drugie jako struktury acentryczne nie przyłączają się do wrzeciona podziałowego i w potomnych komórkach występują w nierównych ilościach [4, 5]. Obie ww. struktury są widoczne w rutynowych preparatach chromosomów, natomiast identyfikacja zwielokrotnionej w ich obrębie sekwencji wymaga zastosowania metod cytogenetyki molekularnej; FISH z sondami dla najczęściej amplifikowanych genów w danym typie nowotworów, porównawczej hybrydyzacji genomowej (comparative genome hybridization=cgh) lub CGH do mikromacierzy (acgh). Amplifikacje genowe występują w kilkudziesięciu procentach przypadków nowotworów narządowych i tylko w kilku procentach przypadków nowotworów hematologicznych, nie zawsze będąc widoczne w postaci ww. struktur [4]. DMs znajdowane w białaczkach, najczęściej w ostrej białaczce szpikowej, AML, zazwyczaj zawierają zamplifikowany onkogen C-MYC [9]. Częstość występowania w AML amplifikacji ujawniającej się cytogenetycznie wynosi ok. 1% [10]. Stwierdzono, Ŝe amplifikacja określonych genów jest specyficzna dla poszczególnych linii komórkowych, co sprawia, Ŝe moŝe ona, obok specyficznych aberracji chromosomowych, stać się takŝe dobrym, diagnostycznym markerem genetycznym [4]. Na przykład, amplifikacja genu ABL1, powodująca dziesięciokrotny wzrost jego ekspresji, oraz jego fuzja z NUP214 występuje w jednym z podtypów ostrej białaczki limfoblastycznej T-komórkowej (T-ALL). W tym przypadku amplifikacja wydaje się wtórnym wydarzeniem w stosunku do fuzji genu, będąc jednak prawdopodobnie istotniejszą od niej zmianą w rozwoju T-ALL, wpływającą na bardziej agresywny przebieg choroby i związane z nim niekorzystne rokowanie. Znacznie rzadziej stwierdza się, w chorobach przebiegających z obecnością chromosomu Ph, amplifikację całej fuzji genowej genu ABL1, np. BCR/ABL, jako mechanizm obronny przed działaniem imatinibu [4, 8, 11]. Specyficzność amplifikacji określonych genów dla określonych typów ostrych białaczek (AL) daje szansę na zastosowanie w przyszłości leczenia skierowanego przeciw tym zamplifikowanym genom, jako skutecznej broni przeciw poszczególnym typom AL.

316 O. HAUS i wsp. PoniŜej przedstawiono dwa przykłady amplifikacji genów MLL i AML1, jako jednych z głównych genów regulujących hematopoezę. Amplifikacja genu MLL w nowotworach linii mieloidalnej Amplifikacja regionu 11q23-q25 jest specyficzna dla AML. Głównym genem w tym amplikonie jest MLL. Jego amplifikacja pociąga za sobą takie same skutki biologiczne (m.in. zahamowanie róŝnicowania komórek, oraz akumulację niedojrzałych prekursorów), jak jego fuzje z innymi genami. Amplikon 11q23 zawiera często nie tylko gen MLL, ale i geny go flankujące; np. CCND1, ATM, ETS1. Dodatkowym kopiom MLL często towarzyszy, rozpoznawana na poziomie molekularnym, częściowa duplikacja tandemowa tego genu (partial tandem duplication = MLL-PTD) [6]. RearanŜacje genu MLL w AML i MDS, to w olbrzymiej przewadze jego fuzje z innymi genami. Nieco rzadziej występują rearanŝacje wewnątrzgenowe (np. MLL-PTD), a najrzadziej zwielokrotnienie liczby kopii MLL, przy czym amplifikacja wysokiego stopnia, ponad 20 kopii MLL, jest bardzo rzadkim zjawiskiem [7]. Najczęstszą cytogenetyczną manifestacją amplifikacji MLL są powtórzenia fragmentów chromosomu 11, typowo o układzie palindromicznym, często zawarte w olbrzymich markerach chromosomowych. Rzadziej występują chromosomy pierścieniowe (ring), jeszcze rzadziej typowe dla amplifikacji struktury - HSR oraz DMs [10, 12, 13]. Zamplifikowany MLL z reguły pozostaje w obrębie zmienionych fragmentów chromosomu 11, w odróŝnieniu od zamplifikowanego C-MYC, który umiejscawia się poza swoim locus [12]. Wspólnymi cechami chorych z AML z amplifikacją MLL jest starszy wiek w chwili ujawnienia się choroby (mediana 67 72 lata), przewaga płci Ŝeńskiej, częste poprzedzające leczenie lekami alkilującymi, zła odpowiedź na leczenie i krótki całkowity czas przeŝycia (średnio 2 6 miesięcy), złoŝony kariotyp komórek szpiku, z aberracjami strukturalnymi chromosomu 11 występującymi u prawie 100% chorych i aberracjami 5, obecnymi u 60 80% chorych. W około połowie przypadków występują aberracje 18q, delecja krótkiego ramienia chromosomu 17 z locus TP53, rzadziej utraty materiału długiego ramienia chromosomu 7 [12]. Obraz cytogenetyczny AML z amplifikacją MLL jest więc typowym obrazem wtórnej AML, mimo, Ŝe w części przypadków ta białaczka jest chorobą de novo. Wśród chorych z AML z amplifikacją MLL przewaŝa typ M5, nieco rzadziej występuje M4. Wśród chorych z MDS, najczęstszy jest RAEB- T. Zwielokrotnienie liczby kopii MLL zostało uznane w AML za nieprzypadkową, nawracającą aberrację, o niekorzystnym znaczeniu prognostycznym [5, 6, 10, 12]. Amplifikacja genu AML1 (RUNX1, CBFA) w ostrych białaczkach Głównymi rearanŝacjami AML1 w białaczkach są fuzje genowe AML1/ETO, TEL/AML1, i inne. Wydaje się, Ŝe w AML przewaŝają rearanŝacje [np. translokacja t(8;21)] i mutacje AML1 zmniejszające jego ekspresję, natomiast w ALL, zwłaszcza dziecięcej, przewaŝa zwiększenie ekspresji AML1, m.in. na skutek amplifikacji [14, 15].

Amplikacja genów w nowotworach 317 Dodatkowe kopie AML1 są obecne w dziecięcej ALL jako pierwotna zmiana genetyczna, dzięki częstej w tej białaczce polisomii chromosomu 21, występującej wraz z polisomiami innych chromosomów w obrębie hiperdiploidalnego >50 kariotypu, lub jako cecha izolowana. Niewielkie zwiększenie liczby kopii 21 występuje o wiele częściej niŝ amplifikacja tego genu [16, 17]. UwaŜa się, Ŝe obecność choćby jednej dodatkowej kopii chromosomu 21, występującej jako zmiana wrodzona (trisomia 21 w zespole Downa) lub nabyta, ma działanie leukemogenne [18]. Wysokiego stopnia amplifikacja AML1, występująca u pacjentów bez polisomii 21, jest rozpoznawana w 1.5% przypadków dziecięcej ALL, o określonym profilu. Dodatkowe kopie AML1 stwierdza się u ok. 25% dzieci z ALL, częściej z odpowiadającymi im zmianami cytogenetycznymi, rzadziej bez manifestacji cytogenetycznej [19]. Dodatkowe kopie lub zwielokrotnienie AML1 są rzadziej obserwowane w ALL dorosłych, zaś występowanie tych zmian w AML jest rzadkie. WiąŜe się ono z reguły z obecnością chromosomów markerowych o róŝnej wielkości. Ich powstanie jest zmianą wtórną w stosunku do częstych w AML translokacji genu AML1; tworzą się przewaŝnie z jednego z chromosomów powstałych w wyniku translokacji. Innym mechanizmem są w AML insercyjne translokacje genu lub zawierającej go sekwencji DNA, w róŝne miejsca genomu [15]. Dodatkowe kopie AML1 rozregulowują, zaleŝną od działania kompleksu białek CBF (CBFA+CBFB), ekspresję wielu genów wpływających na prawidłową hematopoezę, organizację cytoszkieletu, ruchliwość komórek mieloidalnych oraz proliferację komórek hematopoetycznych [1, 14, 16]. Zwielokrotnienie AML1 moŝe być widoczne na poziomie cytogenetycznym w postaci dodatkowych prawidłowych kopii chromosomu 21, lub w obrębie izochromosomów długich ramion 21, markerów, der(21), zawierających tandemowe powtórzenia AML1, albo chromosomów pierścieniowych. Opisywane są równieŝ wrodzone aberracje strukturalne chromosmomu 21 [np. r(21)], stanowiące podstawę do wtórnego zwielokrotnienia genu [15, 20]. Często jednak zmiana ta jest niewidoczna w rutynowym badaniu cytogenetycznym [19]. Obecność dodatkowych kopii AML1 jest w ALL niekorzystnym czynnikiem rokowniczym. W AML amplifikacja AML1 obserwowana jest u przewaŝnie u starszych osób, po terapii lekami alkilującymi, lub po MDS. W kariotypie, przewaŝnie złoŝonym, oprócz zmian związanych z amplifikacją, stwierdza się często aberracje strukturalne chromosomów 5 i 7 (najczęściej delecje długich ramion), którym towarzyszą mutacje genu TP53. Rokowanie jest niekorzystne. Nawet jeśli AML z amplifikacją AML1 nie jest białaczką wtórną, towarzyszące jej zmiany genetyczne są typowe dla t- AML [21]. Jak widać, mimo zaangaŝowania róŝnych genów, obecność dodatkowych kopii MLL i AML1 kojarzy się w ostrej białaczce szpikowej z podobnym obrazem cytogenetycznym i klinicznym, i zdecydowanie złym rokowaniem, które moŝe być związane zarówno z samą amplifikacją, jak i towarzyszącymi jej niekorzystnymi zmianami cytogenetycznymi.

318 O. HAUS i wsp. PIŚMIENNICTWO 1. Haferlach T: Molecular genetic pathways as therapeutic targets in acute myeloid leukemia. ASH 2008. Educational Book, 400-411. 2. WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissue. WHO 2008. 3. Basecke J, Podleschny M, Clemens R, i wsp.: Lifelong persistence of AML associated MLL partial tandem duplications (MLL-PTD) in healthy adults. Leukemia Res 2006; 30: 1091-1096. 4. Myllykangas S, Bohling T, Knuutila S: Specifity, selection and significance of gene amplifications in cancer. Semin Oncol 2007; 17: 42-55. 5. Dolan M, McGlennen RC, Hirsch B: MLL amplification in myeloid malignancies: clinical, molecular, and cytogenetic findings. Cancer Genet Cytogenet 2002; 134: 93-101. 6. Pajuelo-Gamez JC, Cervera J, Garcia-Casado Z, i wsp.: MLL amplification in acute myeloid leukemia. Cancer Genet Cytogenet 2007; 174: 127-131. 7. Chowdhury T, Brady HJM: Insights from clinical studies into the role of MLL gene in infant and childhood leukemia. Blood Cell Molec Dis 2008; 40: 192-199. 8. Shannon KM: Resistance in the land of molecular cancer therapeutics. Cancer Cell 2002; 2: 99-102. 9. Rodon N, Sole F, Espinet B, i wsp.: A new case of acute nonlymphocytic leukemia (French- American-British subtype M1) with double minutes and c-myc amplification. Cancer Genet Cytogenet 2002; 132: 161-164. 10. Reddy KS, Parsons L, Mak L, i wsp.: Segmental amplification of 11q23 region identified by fluorescence in situ hybridization in four patients with myeloid disorders: a review. Cancer Genet Cytogenet 2001; 126: 139-146. 11. Kancha RK, von Bubnoff N, Miething C, Peschel C, Gotze KS, Duyster J: Imatinib and leptomycin B are effective in overcoming imatinib resistance due to Bcr-Abl amplification and clonal evolution, but not due to Bcr-Abl kinase domain mutation. Haematologica 2008; 93: 1718-1722. 12. Papenhausen PR, Griffin S, Tepperberg J: Oncogene amplification in transforming myelodysplasia. Experiment Molec Pathol 2005; 79: 168-175. 13. Smith A, Heaps LS, Sharma P, Jarvis A, Forsyth C: Abnormal dicentric chromosome with coamplification of sequences from chromosomes 11 and 19: a novel rearrangement in a patient with myelodysplastic syndrome transforming to acute myeloid leukemia. Cancer Genet Cytogenet 2001; 130: 29-32. 14. Michaud J, Simpson KM, Escher R, i wsp.: Integrative analysis of RUNX1 downstream pathways and target genes. BMC Genomics 2008; 9: 1-17. 15. Moosavi SA, Sanchez J, Adeyinka A: Marker chromosomes are a significant mechanism of highlevel RUNX1 gene amplification in hematologic malignancies. Cancer Genet Cytogenet 2009; 189: 24-28. 16. Garcia-Casado Z, Cervera J, Verdeguer A, i wsp.: High-level amplification of the RUNX1 gene in two cases of childhood acute lymphoblastic leukemia. Cancer Genet Cytogenet 2006; 170: 171-174. 17. Shin M-G, Choi H-W, Kim H-R, i wsp.: Tetrasomy 21 as a sole acquired abnormality without GATA1 gene mutation in pediatric acute megakaryoblastic leukemia: A case report and review of the literature. Leukemia Res 2008; 32: 1615-1619. 18. Israeli S, Rainis L, Hertzberg L, Smooha G, Birger Y: Trisomy of chromosome 21 in leukemogenesis. Blood Cell Molec Dis 2007; 39: 156-159. 19. Mikhail FM, Serry KA, Hatern N, i wsp.: AML1 gene over-expression in childhood acute lymphoblastic leukemia. Leukemia 2002; 16: 658-668.

Amplikacja genów w nowotworach 319 20. Streubel B, Valent P, Lechner K, Fonatsch C: Amplification of the AML1 (CBFA2) gene on ring chromosomes in a patient with acute myeloid leukemia and a constitutional ring chromosome. Cancer Genet Cytogenet 2001; 124: 42-46. 21. Podgornik H, Debeljak M, śontar D, Cernelc P, Velensek Prestor V, Jazbec J: RUNX1 amplification in lineage conversion of childhood B-cell acute lymphoblastic leukemia to acute myelogenous leukemia. Canncer Genet Cytogenet 2007; 178: 77-81. Praca wpłynęła do Redakcji 20.04.2009 r. i została zakwalifikowana do druku 30.04.2009 r. Adres do korespondencji: O. Haus Katedra i Zakład Genetyki Klinicznej CM UMK 85-094 Bydgoszcz ul. Curie-Skłodowskiej 9 e-mail: haus@cm.umk.pl