Analiza fuzji genowych PML/RARA i CBFB/MYH11 w ostrej białaczce szpikowej

Transkrypt

1 PRACA ORYGINALNA Original Article Acta Haematologica Polonica 2009, 40, Nr 3, str EWELINA ŁAZARCZYK 1, KRYSTYNA SOSZYŃSKA 1, BARBARA MUCHA 1, KA- TARZYNA SKONIECZKA 1, JOANNA MARTENKA 1, MAŁGORZATA CAŁBECKA 3, GRAśYNA GADOMSKA 4, OLGA HAUS 1,2 Analiza fuzji genowych PML/RARA i CBFB/MYH11 w ostrej białaczce szpikowej Analysis of gene fusions PML/RARA and CBFB/MYH11 in acute myeloid leukemia 1 Katedra i Zakład Genetyki Klinicznej CM w Bydgoszczy, UMK w Toruniu Kierownik: Prof. dr hab. n. med. O. Haus 2 Katedra i Klinika Hematologii, Nowotworów Krwi i Transplantacji Szpiku AM we Wrocławiu Kierownik: Prof. dr hab. n. med. K. Kuliczkowski. 3 Specjalistyczny Szpital Miejski im. M. Kopernika Oddział Hematologii w Toruniu 4 Szpital Uniwersytecki nr 2 im. dr. J. Biziela Oddział Hematologii w Bydgoszczy STRESZCZENIE Powstanie fuzji genowych jest decydującym momentem w ukierunkowanej leukemogenezie. Specyficzną translokacją dla ostrej białaczki promielocytowej jest t(15;17) [1, 2, 3, 4], w wyniku której powstaje fuzja genowa PML/RARA [1, 2, 3, 4, 5]. Natomiast inwersja, inv(16) prowadzi do powstania fuzji CBFB/MYH11 charakterystycznej dla ostrej białaczki mielomonocytowej z zaburzeniami eozynocytopoezy [3, 6]. W przeprowadzonych badaniach obecność translokacji t(15;17)(q22;q21) i PML/RARA wykazano metodami cytogenetycznymi u 5 pacjentów na 38 analizowanych. Stosując technikę RT-PCR udało się wykryć ww. fuzję tylko u 3 pacjentów, a wykorzystując metody cytogenetyki klasycznej translokację u 2 chorych. W badaniu FISH obecność t(15;17) została potwierdzona u 5 pacjentów. Tę translokację zidentyfikowano techniką FISH u pięciu pacjentów, zaś techniką GTG tylko u 2, ze względu na złą jakość metafaz. Inwersję 16 wykryto metodami cytogenetyki klasycznej u 4 pacjentów na 38, co zostało potwierdzone w badaniu FISH. Stosując technikę RT-PCR udało się wykryć ww. fuzję tylko u 2 pacjentów. Przyczyną braku pozytywnego wyniku RT-PCR u 4 pacjentów z t(15;17) lub inv(16) stwierdzonymi w badaniu GTG i FISH, mogła być degradacja RNA pacjentów. W celu adekwatnego określenia zmian genetycznych istotnych w diagnozowaniu i prognozowaniu AML, nie naleŝy ograniczać się do wykonywania tylko jednej z ww. metod. SŁOWA KLUCZOWE: Ostra białaczka szpikowa Fuzje genowe Cytogenetyka klasyczna FISH RT-PCR SUMMARY The formation of gene fusions is a key moment in leukemogenesis. Some fusions are specific for subtypes of acute myeloid leukemia (AML). Translocation t(15;17)(q22;q21) which leads to PML/RARA gene fusion [1, 2, 3, 4, 5] is a specific cytogenetic change in acute promyelocytic leukaemia [1, 2, 3, 4]. Chromosome 16 inversion leads to CBFB/MYH11 fusion that is typical of acute myelomonocytic leukemia with hypereosinophilia [3, 6]. In our study, carried out in 38 pa-

2 634 E. ŁAZARCZYK i wsp. tients with AML we found t(15;17)(q22;q21) and PML/RARA in five cases using cytogenetic methods. Five patients were identified by FISH and only two by GTG banding, because of a poor quality of metaphases. However, by using RT-PCR technique we confirmed presence of the fusion gene in 3 patients only, what was probably caused by degradation of RNA probes of patients. Inversion of chromosome16 was found in 4 patients by GTG banding, what was confirmed by FISH. However, only in 2 patients we found this fusion by RT-PCR technique, what was probably also caused by RNA degradation. For identification of prognostically important genetic changes in AML we should use more than one method of analysis, especially at the diagnosis. KEY WORDS: Acute myeloid leukemia Gene fusions Conventional cytogenetics FISH RT-PCR WSTĘP Aberracje chromosomowe w komórkach szpiku chorych na ostrą białaczkę szpikową (AML) mogą być pierwotne lub wtórne. Pierwsze z nich są charakterystyczne dla transformacji nowotworowej i z reguły charakterystyczne lub specyficzne dla określonego typu nowotworu. Najczęściej występują jako pojedyncze, zrównowaŝone pod względem ilości materiału genetycznego zmiany [1, 7]. Aberracje wtórne wynikają z niestabilności genomu komórek nowotworowych i są najczęściej zmianami niespecyficznymi, niezrównowaŝonymi [7]. Ich pojawienie się w czasie progresji choroby świadczy o ewolucji klonu białaczkowego. W AML zmiany wtórne powstają najczęściej z zaangaŝowaniem chromosomów 1, 5, 7, 8, 9, 21, X i Y [1]. Na skutek pierwotnych translokacji lub inwersji dochodzi do powstania fuzji genowych. Geny zaangaŝowane w fuzje najczęściej kodują czynniki transkrypcyjne o zmienionej funkcji [1]. Do najczęściej spotykanych w AML aberracji strukturalnych naleŝą: translokacja t(8;21)(q22;q22) i fuzja genowa AML1/ETO, translokacja t(15;17)(q22;q21) i fuzja genowa PML/RARA, inwersja pericentryczna 16, inv(16)(p13q22) lub translokacja t(16;16)(p13;q22) i fuzja genowa CBFB/MYH11, rearanŝacje 11q23 i fuzje genowe z udziałem genu MLL [1, 5, 8, 9]. Celem podjętej pracy było wdroŝenie molekularnej metody analizy fuzji genowych PML/RARA i CBFB/MYH11 oraz zweryfikowanie otrzymanych wyników metodą cytogenetyki klasycznej oraz FISH. MATERIAŁ I METODY Materiał do badań stanowił szpik kostny pobrany od 38 pacjentów z AML w wieku od 18 do 77 lat (mediana wieku = 51), obu płci (19 kobiet, 19 męŝczyzn). Na badania uzyskano zgodę lokalnej Komisji Bioetycznej. Ponadto kaŝdy pacjent wyraŝał indywidualną, świadomą zgodę na badania. RT-PCR Do wykrywania fuzji PML/RARA i CBFB/MYH11 uŝyto metodę RT-PCR z zastosowaniem specyficznych starterów według sekwencji podanych w BIOMED. RNA izolowano z leukocytów szpiku z wykorzystaniem Trizol Reagent. Do syntezy cdna

3 Analiza fuzji genowych 635 uŝywano 1 µg RNA w obecności 200 U odwrotnej transkryptazy M-MLV RT w temperaturze 37 C przez 60 minut. Amplifikacje przeprowadzano stosując 1U Red Allegro Taq Polimeraza DNA (Novazym). Po wstępnej denaturacji (94 C, 5 minut) reakcję amplifikacji prowadzono według schematu: denaturacja 94 C przez 1 minutę, przyłączanie starterów 58 C przez 50 sekund (fuzja genowa PML/RARA) lub 60 C przez 50 sekund (fuzja genowa CB- FB/MYH11), wydłuŝanie łańcucha 72 C przez 1 minutę. Liczba cykli wynosiła 30. Kontrolę wewnętrzną stanowiła reakcja ze starterami dla β2-mikroglobuliny. Za kontrolę dodatnią słuŝyło RNA pacjentów z uprzednio stwierdzoną obecnością PML/RARA lub CBFB/MYH11 w badaniu RT-PCR, cytogenetyce klasycznej i FISH. Kontrolę negatywną stanowiło RNA od pacjentów, u których w ww. badaniach nie stwierdzono obecności badanych fuzji. RNA kontrolne zostało otrzymane z Katedry i Kliniki Hematologii, Nowotworów Krwi i Transplantacji Szpiku AM we Wrocławiu. Otrzymane produkty amplifikacji rozdzielano elektroforetycznie w 1,5% Ŝelu agarozowym w buforze 1 TBE w obecności bromku etydyny. W przypadku braku produktu reakcji RT-PCR przy obecności danej zmiany genetycznej w badaniu GTG i FISH przeprowadzono ponownie reakcję RT-PCR z ww. starterami. Metody cytogenetyki klasycznej Komórki szpiku kostnego poddawano krótkoterminowej (24 48 h) hodowli w standardowych warunkach. Równolegle prowadzono 1 hodowlę niestymulowaną (referencyjną) i 1 stymulowaną GM-CSF. Hodowle zatrzymywano, a preparaty cytogenetyczne utrwalano i barwiono stosując standardowe metody. U kaŝdego pacjenta metafazy analizowano w miarę moŝliwości po 20 w mikroskopie świetlnym. FISH fluorescencyjna hybrydyzacja in situ. Preparaty mikroskopowe przygotowywano według standardowych metod. Stosowano dwa rodzaje sond (firma Vysis): LSI PML/RARA t(15;17), Dual Color, Dual Fusion Translocation Probe oraz LSI CBFB, inv(16) Dual Color Probe (sonda typu split). Denaturację przeprowadzano na płycie grzewczej. Hybrydyzację przeprowadzano w cieplarce w 37 C. Po h odpłukiwano nadmiar sody i nakładano DAPI. U kaŝdego pacjenta analizowano w mikroskopie fluorescencyjnym łącznie 200 komórek (w stadium metafazy i interfazy) pod kątem obecności prawidłowych i nieprawidłowych sygnałów. WYNIKI Analiza molekularna z wykorzystaniem techniki RT-PCR Badanie obecności fuzji genowej PML/RARA. W grupie 38 chorych obecność fuzji genowej PML/RARA w postaci produktu amplifikacji o wielkości 381 pz (typ bcr1) wykryto u trzech (nr 27, 30 i 37) z podejrzeniem AML (Ryc. 1).

4 636 E. ŁAZARCZYK i wsp. Ryc. 1. Elektroforetyczny rozdział produktów reakcji RT-PCR przeprowadzonej ze specyficznymi starterami dla fuzji PML/RARA. ŚcieŜki: 1 3 materiał od pacjenta nr 1 z fuzją PML/RARA, 4 6 materiał od pacjenta nr 10 bez fuzji PML/RARA, 7 kontrola pozytywna, 8 kontrola negatywna reakcji, 9 marker wielkości (kbl), 1, 4, 7, 8 startery A1/B, 2, 5 startery A2/B, 3, 6 β-globina (370 pz), 1 i 7 fuzja PML/RARA (381 pz typ bcr1). Fig. 1. Electrophoresis of RT-PCR products with PML/RARA fusion specific starters. Lanes: 1-3 RNA of AML patient no 1 with PML/RARA gene fusion, 4-6 RNA of AML patient no 10 without PML/RARA gene fusion, 7 positive control, 8 negative control, 9 size marker (kbl), 1, 4, 7, 8 A1/B starters, 2, 5 A2/B starters, 3, 6 β-globin (370 bp), 1 i 7 PML/RARA fusion (381 bp bcr1 type). Ryc. 2. Elektroforetyczny rozdział produktów amplifikacji z zastosowaniem specyficznych starterów dla fuzji CBFB/MYH11. ŚcieŜki: 1 3, 4 6 materiał od pacjentów nr 13 i 14 z AML z fuzją CBFB/MYH11, 7 9 materiał od pacjenta nr 4 z AML bez fuzji CBFB/MYH11, 10 kontrola pozytywna, 11 kontrola negatywna, 12 marker wielkości (kbl), 1, 4, 7 startery A/B1, 2, 5, 8, 10, 11 startery A/B2, 3, 6, 9 β-globina (370 pz), 2, 5, 10 fuzja CBFB/MYH11 (418 pz typ A). Fig. 2. Electrophoresis of amplification products with CBFB/MYH11 fusion specific starters. Lanes: 1 3, 4 6 AML patients no 13 and 14 with CBFB/MYH11 gene fusion, 7 9 AML patient no 4 without CBFB/MYH11 gene fusion, 10 positive control, 11 negative control, 12 size marker (kbl), 1, 4, 7 A/B1 starters, 2, 5, 8, 10, 11 A/B2 starters, 3, 6, 9 β-globin (370 bp), 2, 5, 10 CBFB/MYH11 fusion (418 bp type A).

5 Analiza fuzji genowych 637 Ryc. 3. Kariogram komórki szpiku pacjenta nr 1: t(15;17)(q22;q21). Obraz prąŝków GTG. Strzałki wskazują nieprawidłowe chromosomy. Fig. 3. Karyotype of bone marrow (BM) cell of patient no 1: t(15;17)(q22;q21), GTG banding technique. The arrows indicate abnormal chromosomes. Ryc. 4. Metafaza komórki szpiku pacjenta nr 14: inv(16)(p13q22). Obraz prąŝków GTG. Strzałki wskazują prawidłowy i nieprawidłowy chromosom pary 16. Fig. 4. A metaphase of BM cell of patient no 14: inv(16)(p13q22) in GTG banding technique. Arrows indicate abnormal and normal chromosomes 16.

6 638 E. ŁAZARCZYK i wsp. Ryc. 5. Metafaza komórki szpiku pacjenta nr 1 barwiona techniką FISH z sondą LSI PML/RARA t(15;17), Dual Color, Dual Fusion Translocation Probe. Strzałka zielona wskazuje sygnał pochodzący od prawidłowego genu PML. Strzałka czerwona sygnał prawidłowego genu RARA. Strzałki Ŝółte sygnały pochodzące od fuzji PML/RARA (chromosom 15) oraz RARA/PML (chromosom 17). Fig. 5. A metaphase of BM cell of patient no 1 in FISH technique with LSI PML/RARA t(15;17), Dual Fusion, Dual Color Translocation Probe. Green arrow shows normal signal of PML gene. Red arrow shows normal RARA gene signal. Yellow arrows show PML/RARA (chromosome 15) and RARA/PML (chromosome 17) gene fusions. Ryc. 6. Metafaza pacjenta nr 13 barwiona techniką FISH z sondą LSI CBFB, inv(16) Dual Color Probe. Strzałka Ŝółta wskazuje prawidłowy chromosom 16. Strzałka biała pericentryczną inwersję 16 (rozejście się sygnałów, zielonego i czerwonego pochodzących z dwóch fragmentów genu CBFB). Fig. 6. A metaphase of BM cell of patient no 13 in FISH technique with LSI CBFB, inv(16) Dual Color Probe. Yellow arrow indicates normal chromosome 16, white arrow pericentric inversion of chromosome 16 (separation of green and red signal from two fragments of CBFB gene).

7 Analiza fuzji genowych 639 Badanie obecności fuzji genowej CBFB/MYH11. Stosując technikę RT-PCR fuzję CBFB/MYH11 wykryto u dwóch pacjentów z podejrzeniem AML (nr 13 i 14). U obu badanych stwierdzono obecność produktu amplifikacji wielkości 418 pz (typ A) Ryc. 2. Analiza cytogenetyczna U 30 z 38 pacjentów (79%) uzyskano liczbę i jakość metafaz wystarczającą do analizy z uŝyciem metod cytogenetyki klasycznej. Z powodu słabej proliferacji komórek lub jej braku u 8 pacjentów nie udało się określić kariotypu nr 8, 23, 26, 27, 28, 30, 31 i 37. Prawidłowy kariotyp stwierdzono u 18 z 30 chorych nr 4, 5, 7, 11, 12, 15, 16, 17, 20, 21, 24, 25, 29, 33, 34, 35, 36 i 38 (60%) zaś aberracje chromosomowe u 12 nr 1, 2, 3, 6, 9, 10, 13, 14, 18, 19, 22 i 32 (40%). Translokacja t(15;17)(q22;q21), bez wtórnych aberracji, była obecna u 2 chorych (nr 1 i 9), co stanowi 16,6% wszystkich pacjentów, u których wykryto zmiany chromosomowe (Ryc. 3). Obecność inwersji pericentrycznej 16 stwierdzono u 4 chorych nr 2, 3, 13 i 14 (40%) (Ryc. 4). U chorego nr 3 obecna była równieŝ typowa dla inv(16) aberracja wtórna: trisomia chromosomu 22. Ponadto u chorego nr 6 podejrzewano inv(16) jako jedną z aberracji złoŝonego kariotypu: 42-45,XY,der(1),- 7,del(11)(q23),der(D)x2,?inv(16),i(17)(q10),DM [cp15]. U pięciu pozostałych chorych z nieprawidłowym kariotypem stwierdzono następujące aberracje: monosomię chromosomu 7 (nr 10), kariotyp mozaikowy z klonem z trisomią chromosomu 8 oraz subklon z tetrasomią tego chromosomu (nr 18), kariotyp zawierający 2 niezaleŝne nieprawidłowe klony: z delecją części długich ramion chromosomu pary 5 oraz z obecnością trzech markerów nieznanego pochodzenia, a takŝe linię komórek o prawidłowym kariotypie (nr 19), t(8;21) (nr 22) oraz delecję części długiego ramienia chromosomu pary 7 del(7)(q33) (nr 32). FISH Stosując technikę FISH wyniki uzyskano u wszystkich 38 pacjentów. Fuzję PML/RARA wykryto u 5 z 38 pacjentów nr 1, 9, 27, 30 i 37 (13,2%), w tym u dwóch (nr 1 i 9), u których w badaniu GTG znaleziono t(15;17) i trzech (nr 27, 30 i 37), u których nie uzyskano metafaz nadających się do analizy (Ryc. 5). U pacjentów nr 9 i 30 stwierdzono delecję fuzji RARA/PML z chromosomu 17. Inwersję inv(16)(p13q22) stwierdzono u czterech z 38 badanych nr 2, 3, 13 i 14 (10,5%), co potwierdziło wynik badania techniką GTG (Ryc. 6). Nie stwierdzono obecności CBFB/MYH11 u chorego nr 6 z podejrzeniem tej aberracji w badaniu GTG. Podsumowując moŝna stwierdzić, Ŝe w badaniu GTG nie wykryto inv(16) lub t(15;17) w 3 przypadkach z powodu braku metafaz. Natomiast zmiany te wykryto po zastosowaniu techniki FISH i RT-PCR. Natomiast metodą RT-PCR nie wykryto fuzji

8 640 E. ŁAZARCZYK i wsp. genowych w 4 przypadkach, w których obecność aberracji stwierdzono metodami FISH i GTG (Tab. 1). Tabela 1. Zestawienie wyników badań RT-PCR, FISH i GTG u 38 chorych z ostrą białaczką szpikową Table 1. Results of RT-PCR, FISH and GTG analyses of 38 patients with acute myeloid leukemia Nr Typ Wyniki badań pacj. AML RT-PCR FISH Kariotyp PML/ RARA CBFB/ MYH11 t(15;17)/ PML/ RARA Inv(16)/ 5 CBFBsep 3 CBFB 1. M3 ( ) ( ) (+) ( ) 46,XY,t(15;17)(q22;q21) [6]/46,XY[10] 2. M2 ( ) ( ) ( ) (+) 46,XX,inv(16)(p13q22) [9]/46,XX[7] 3. M4 ( ) ( ) ( ) (+) 46,XY,inv(16)(p13q22) [8]/47,XY, inv(16)(p13q22),+22[3]/ 46,XY[3] 4. M2 ( ) ( ) ( ) ( ) 46,XX[20] 5. M5 ( ) ( ) ( ) ( ) 46,XY[20] 6. M5 ( ) ( ) ( ) ( ) ZłoŜony *, podejrzenie inv(16) 7. AML 1 ( ) ( ) ( ) ( ) 46,XY[25] 8. AML 1 ( ) ( ) ( ) ( ) b.w. 9. M3 ( ) ( ) (+) ( ) 46,XY,t(15;17)(q22;q21) [7]/46,XY[3] 10. M5 ( ) ( ) ( ) ( ) 45,XY,-7[12]/46,XY[3] 11. M5 ( ) ( ) ( ) ( ) 46,XX[20] 12. AML 1 ( ) ( ) ( ) ( ) 46,XX[23] 13. M4E 0 ( ) (+) ( ) (+) 46,XX,inv(16)(p13q22) [8]/46,XX[3] 14. M4 ( ) (+) ( ) (+) 46,XY,inv(16)(p13q22) [11]/46,XY[2] 15. M2 ( ) ( ) ( ) ( ) 46,XX[28] 16. AML 1 ( ) ( ) ( ) ( ) 46,XY[20] 17. M4 ( ) ( ) ( ) ( ) 46,XX[20] 18. AML 1 ( ) ( ) ( ) ( ) 47,XX,+8[3]/48,XX,+8,+8[1] 19. AML post MDS ( ) ( ) ( ) ( ) 46,XX,del(5)(q31)[4]/ 49,XX,+marx3[3]/ 46,XX[3] 20. AML 1 ( ) ( ) ( ) ( ) 46,XY[20] 21 AML 1 ( ) ( ) ( ) ( ) 46,XX[10] 22 M2 ( ) ( ) ( ) ( ) 46,XY,t(8;21)[20] 23 M2 ( ) ( ) ( ) ( ) b.w. 24 AML 1 ( ) ( ) ( ) ( ) 46,XY[20] 25 AML 1 ( ) ( ) ( ) ( ) 46,XX[10] 26 M2 ( ) ( ) ( ) ( ) b.w. 27 M3 (+) ( ) (+) ( ) b.w. 28 AML 1 ( ) ( ) ( ) ( ) b.w. 29 AML 1 ( ) ( ) ( ) ( ) 46,XX[20] 30 M3 (+) ( ) (+) ( ) b.w.

9 Analiza fuzji genowych AML ( ) ( ) ( ) ( ) b.w. Post MDS 32 M2 ( ) ( ) ( ) ( ) 46,XY,del(7)(q33)[5]/ 46,XY[2] 33 AML 1 ( ) ( ) ( ) ( ) 46,XX[10] 34 AML 1 ( ) ( ) ( ) ( ) 46,XY[7] 35 M2 ( ) ( ) ( ) ( ) 46,XY[20] 36 M2 ( ) ( ) ( ) ( ) 46,XX[20] 37 M3 (+) ( ) (+) ( ) b.w. 38 M5a ( ) ( ) ( ) ( ) 46,XY[8] Legenda: AML 1 ostra białaczka szpikowa nieokreślonego typu; 5 CBFBsep3 CBFB rozdzielone sygnały z locus CBFB z powodu inwersji chromosomu 16; kariotyp złoŝony * 42-45,XY,der(1),-7,del(11)(q23),der(D)x2,?inv(16),i(17)(q10),DM[cp15]; b.w. brak wyniku badania; ( ) brak badanej zmiany; (+) obecność badanej zmiany. Legend: AML 1 general diagnosis of AML, without subtype diagnosis; 5 CBFBsep3 CBFB - separation of signals from locus of CBFB due to pericentric inversion of chromosome 16; complex karyotype * ,XY,der(1),-7, del(11)(q23), der(d)x2,?inv(16),i(17)(q10),dm[cp15]; b.w. no results, ( ) lack of investigated rearrangement; (+) presence of investigeted rearrangement. DYSKUSJA Translokacja t(15;17) według większości autorów jest specyficzna dla ostrej białaczki promielocytowej (APL) [1, 3, 5], chociaŝ w badaniach Allford i wsp. zmianę tę znaleziono u 1 pacjenta z rozpoznaniem AML-M1 i 1 z AML-M2 [9]. W naszych badaniach u wszystkich 5 pacjentów z tą translokacją lub fuzją PML/RARA rozpoznano AML-M3, co jest zgodne z wynikami większości prowadzonych na ten temat badań [1, 3, 5]. Inwersja inv(16), która najczęściej występuje w AML-M4E 0, została wykryta u 1 pacjenta (nr 13) z M4E 0, u 2 z M4 (nr 3 i 14) oraz u 1 z M2 (nr 2), co jest zgodne z danymi literaturowymi [3, 6]. Badania z wykorzystaniem cytogenetyki klasycznej mają duŝe znaczenie w hematoonkologii. Pozwalają one na analizę komórek proliferujących, a więc istotnych w procesie transformacji nowotworowej. Jest to metoda czasochłonna, zaleŝna od doświadczenia cytogenetyka, wymagająca uzyskania odpowiedniej liczby metafaz o dobrym rozproszeniu chromosomów i dobrej jakości prąŝków [1, 4]. Zdarza się, Ŝe krótkoterminowe hodowle komórek szpiku są nieefektywne, wówczas przeprowadzenie analizy cytogenetycznej metodą GTG staje się niemoŝliwe. Taka sytuacja miała równieŝ miejsce w niniejszej pracy; u 8 pacjentów nie uzyskano proliferacji komórek szpiku. W badanej grupie spośród 30 pacjentów, u których uzyskano wynik z uŝyciem metod cytogenetyki klasycznej, aberracje chromosomowe wykryto u 10 (33,3%). U pacjenta nr 6 negatywnego w badaniu RT-PCR pod kątem dwóch poszukiwanych fuzji, po wykonaniu analizy GTG podejrzewano obecność inwersji jednego z chromosomów pary 16. Nie zostało to potwierdzone badaniem FISH. W przypadkach wątpliwości

10 642 E. ŁAZARCZYK i wsp. w badaniu GTG zawsze naleŝy poszerzyć analizę o technikę FISH oraz RT-PCR albo inne metody molekularne. Do wykrywania i analizy zmian chromosomowych oraz powstałych w ich wyniku fuzji genowych coraz częściej stosuje się technikę FISH. Ma ona wiele zalet, m.in. krótki czas analizy, moŝliwość oceny odsetka komórek z badaną zmianą, moŝliwość wykonania analizy na komórkach interfazalnych w sytuacji, gdy nie udaje się uzyskać metafaz. Wówczas zawsze naleŝy potwierdzić wynik badania metodą molekularną (np. RT-PCR), gdyŝ interpretacja wyniku badania FISH wykonanego wyłącznie na komórkach interfazalnych moŝe nastręczać trudności i prowadzić do fałszywie dodatnich, albo fałszywie ujemnych wyników [4, 6, 10]. Wadą rutynowo stosowanej techniki FISH jest jej ukierunkowany charakter, który wymaga wcześniejszego określenia poszukiwanej zmiany chromosomowej, w celu dobrania odpowiedniej sondy molekularnej [5]. Technika ta z reguły nie pozwala na wykrycie zmian nieoczekiwanych, niezgodnych z wstępnymi załoŝeniami dotyczącymi kierunku badania. W przedstawionej analizie badań własnych technika FISH okazała się w 100% skuteczna zarówno w przypadku wykrywania t(15;17), jak równieŝ w przypadku inv(16). U 2 pacjentów (nr 9 i 30) w badaniu FISH wykryto jedynie fuzję PML/RARA przy braku RARA/PML, co jest zgodne z danymi literaturowymi, według których u 30% pacjentów z APL występuje delecja tej właśnie fuzji [2]. Cennym uzupełnieniem cytogenetyki klasycznej oraz FISH jest wykrywanie fuzji genowych powstających w wyniku t(15;17) oraz inv(16), albo innych fuzji, za pomocą RT-PCR [1, 4, 6]. Ze względu na wysoką czułość RT-PCR, moŝliwość określenia typu transkryptu oraz szybki czas wykonania i analizy wyniku badania, metoda ta znajduje szerokie zastosowanie w hematoonkologii [2, 3, 6, 11]. W przeprowadzonych badaniach RT-PCR ze starterami dla fuzji PML/RARA oraz CBFB/MYH11 pierwsza z tych zmian została wykryta u 3 pacjentów (nr 27, 30 i 37). Obecność róŝnych regionów, miejsc pęknięć genu PML powoduje moŝliwość powstania transkryptów typu bcr1, bcr2 lub bcr3. Produkt typu bcr1 wykryto przy uŝyciu starterów pary A1/B, u Ŝadnego z badanych pacjentów nie stwierdzono obecności transkryptu typu bcr2. Typ bcr3 moŝliwy jest do wykrycia przy uŝyciu starterów A2/B. W związku z tym nie powinno się stosować tylko jednej pary starterów. Natomiast nie wykryto fuzji PML/RARA u 2 pacjentów (nr 1, 9), u których t(15;17) uwidoczniona w badaniach GTG lub FISH. Wynikać to moŝe z faktu, Ŝe materiał uŝyty do badań pobrany był na heparynę, co nie jest właściwym sposobem pobierania materiału do badania molekularnego. Biorąc pod uwagę ten czynnik naleŝy przypuszczać, Ŝe niska skuteczność metody RT-PCR wynika z błędów przedanalitycznych. Obecność CBFB/MYH11 w RT-PCR stwierdzono u dwóch pacjentów z czterech inv(16) dodatnich w cytogenetyce klasycznej i w badaniu FISH. U obu badanych stwierdzono obecność produktu amplifikacji wielkości 418 pz (typ A), który jest najczęściej spotykanym typem tej fuzji [3]. Z badań prowadzonych przez Grimwade i wsp. wynika, iŝ na końcowy wynik reakcji RT-PCR ma wpływ wiele czynników. Wynik fałszywie dodatni uzyskuje się

11 Analiza fuzji genowych 643 z reguły w wyniku zanieczyszczenia analizowanej próbki materiałem genetycznym innego pacjenta dodatniego w danym teście PCR [11, 12]. W naszych badaniach nie było wyników fałszywie dodatnich. MoŜliwe są równieŝ wyniki fałszywie ujemne w przypadku słabej jakości RNA, uszkodzenia odwrotnej transkryptazy, zastosowania nieodpowiednich starterów, np. nie obejmujących wszystkich moŝliwych transkryptów [3]. W zaistniałej w naszych badaniach sytuacji (brak produktu reakcji RT-PCR przy obecności danej zmiany genetycznej w badaniu GTG i FISH), aby wykluczyć jako przyczynę negatywnego wyniku RT-PCR błędy laboratoryjne przeprowadzono ponownie reakcję RT-PCR ze starterami specyficznymi dla fuzji PML/RARA oraz ze starterami specyficznymi dla CBFB/MYH11. Wyniki powtórnych reakcji były negatywne. NaleŜy zaznaczyć, iŝ zastosowane w niniejszej pracy startery dla PML/RARA obejmowały wszystkie znane do tej pory transkrypty. Natomiast startery dla fuzji CB- FB/MYH spośród dziesięciu transkryptów nie obejmowały jednego, który spotykany jest sporadycznie. Najprawdopodobniej przyczyną niewykrycia w reakcji RT-PCR fuzji PML/RARA oraz CBFB/MYH11 była degradacja długo przechowywanego, lub niewłaściwie pobranego i transportowanego materiału. Stąd wniosek o konieczności właściwego transportu próbek, które mają być wykorzystane do badań molekularnych z zachowaniem rygorów czasowych i temperaturowych (maksymalnie do 24 h w temperaturze 4 8 C). Wyniki badań własnych potwierdzają spostrzeŝenia innych autorów, np. Mrózka i wsp., iŝ w analizie zmian genetycznych w AML nie naleŝy ograniczać się jedynie do wykonywania RT-PCR [6]. Z całości przeprowadzonych badań i analizy przypadków, w których albo technika GTG albo RT-PCR okazały się nieefektywne, moŝna wysnuć jeszcze jeden, najwaŝniejszy wniosek: Ŝadnej z trzech zastosowanych w niniejszej pracy metod nie powinno się stosować indywidualnie. Zawsze naleŝy stosować przynajmniej jeszcze jedną metodę weryfikującą (np. FISH w stosunku do RT-PCR i GTG), a w badaniu diagnostycznym, przed podjęciem leczenia, najlepiej te trzy metody jednocześnie. Warto wykonywać cały panel badań u wszystkich chorych z AML niezaleŝnie od podejrzewanego podtypu [12], gdyŝ zdarzają się przypadki występowania fuzji PML/RARA u pacjentów z AML-M1 i z AML-M2 [9]. Natomiast obecność inwersji inv(16) opisywano równieŝ w innych niŝ w M4E 0 podtypach AML [6]. Taka sytuacja miała teŝ miejsce w prowadzonych przez nas badaniach, gdyŝ CBFB/MYH11 została wykryta u 1 pacjenta z AML-M2 (nr 2). Podsumowując moŝna stwierdzić, iŝ Ŝadna z zastosowanych w niniejszej pracy metod nie jest uniwersalna. Cytogenetyka klasyczna nadal pozostaje najbardziej referencyjną metodą, poniewaŝ pozwala na ocenę całości cytogenetycznego obrazu szpiku pacjenta. Natomiast FISH i RT-PCR stanowią jej cenne uzupełnienie i powinny być zawsze wykonywane w celu potwierdzenia lub wykluczenia obecności badanej zmiany genetycznej. Przeprowadzenie pełnej analizy pozwala na efektywną ocenę kariotypu pacjentów, co przyczynia się do ustalenia rozpoznania, zróŝnicowania podtypu AML, kwalifikacji pacjenta do odpowiedniej grupy ryzyka, wyboru właściwego sposobu jego leczenia oraz monitorowania.

12 644 E. ŁAZARCZYK i wsp. PIŚMIENNICTWO 1. Haus O. Zmiany cytogenetyczne i molekularne w ostrych białaczkach szpikowych. Diagn Lab. 2001; 37: Mistry AR, Pedersen EW, Solomon E, Grimwade D. The molecular pathogenesis of acute promyelocytic leukaemia: implications for the clinical management of the disease. Blood Rev., 2003; 17: van Dongen JJM, Macintyre EA, Gabert JA, Delabesse E, Rossi V, Saglio G, Gottardi E, Rambaldi A, Dotti G. Standarized RT-PCR analysis of fusion gene transcripts from chromosome aberrations in acute myeloid leukemia for detection of minimal residual disease. Leukemia, 1999; 13: Ejduk A., Majewski M., Seferyńska I., Pałynyczko G., Pieńkowska-Grela B., Warzocha K.: Znaczenie prognostyczne kompleksowej diagnostyki genetycznej u chorych na ostre białaczki szpikowe. Post Nauk Med, 2007; 20: Shivakumar S, Poonkhuzhali B, Gunasekaran S, Srivastava A, Chandy M. Cytogenetic, fluorescent in situ hybridization & reverse transcriptase-polimerase chain reaction analysis in acute promyelocytic leukemia patients. Indian J. Med. Res, 2002; 115: Mrózek K, Heinonen K, Bloomfield CD. Clinical importance of cytogenetics in acute myeloid leukemia. Best Pract. Res. Clin. Haematol., 2001; 14: Sąsiadek M, Schlade-Bartusiak K, Stembalska-Kozłowska A, Bielawska-Pohl A, Śmigiel R, Duś D. Niestabilność genetyczna w nowotworach. I. Niestabilność chromosomowa w nowotworach. Post. Biol. Komórki, 2003; 30: Mrózek K, Heerema NA, Bloomfield CD. Cytogenetics in acute leukemia. Blood Rev., 2004; 18: Allford S, Grimwade D, Langabeer S, Duprez E, Saurin A, Chatters S, Walker H, Roberts P, Rogers J, Bain B, Patterson K, McKernan A, Freemont P, Solomon E, Burnett A, Goldstone A, Linch D. Identification of the t(15;17) in AML FAB types other than M3: evaluation of the role of molecular screening for the PML/RARA rearrangement in newly diagnosed AML. Br J Haematol, 1999; 105: Grimwade D. The clinical significance of cytogenetic abnormalities in acute myeloid leukemia. Best Pract Res Clin Haematol, 2001; 14: Cyniak-Magierska A, Brzeziańska E, Lewiński A. Łańcuchowa reakcja polimerazy rodzaje, metodyka i zastosowanie. Endokr Pol, 2000; 51: Ejduk A, Majewski M, Warzocha K. Znaczenie prognostyczne aberracji genetycznych w ostrej białaczce szpikowej. Acta Haemat Pol, 2006; 37: Praca wpłynęła do Redakcji r. i została zakwalifikowana do druku r. Adres do korespondencji: Katedra i Zakład Genetyki Klinicznej Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera ul. M. Skłodowskiej-Curie Bydgoszcz